CN105771015A - 一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法，该材料由多孔石墨烯、硅微球、硅基底三种材料组成，以静电吸附自组装而成三维阵列结构，经过对石墨烯和硅微球表面进行化学改性，分别修饰固定用于细胞捕获的E‑selectin蛋白分子和配体，实现了强化细胞识别的仿生结构；该材料可集成于微流控芯片中，增强芯片对循环肿瘤细胞的识别和捕获，提高分离效率并有利于对捕获细胞的检测分析；改变固定的识别配体，也可用于对不同类型细胞的有效捕获，可从外周血样中识别并捕获稀有的肿瘤细胞。

Description

一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备 方法

【技术领域】

本发明涉及一种外周血细胞处理的纳米功能材料，具体涉一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法。

【背景技术】

循环肿瘤细胞是从原有肿瘤组织脱落后内渗进入血液循环系统，并随血液在体内循环的肿瘤细胞。尽管人们对癌转移的机理和过程仍缺乏清楚的认识，但循环肿瘤细胞的作用与癌变转移有着直接的联系，已经得到了一致确认。因此，循环肿瘤细胞的数量和形态都可作为患者的病情发展预判依据，如病情的确诊、术后监测、病理学研究等。然而，要从外周血样中获取肿瘤细胞却是非常困难的。主要原因有两个：数量稀少、表面特异分子异构。因此，使用过滤法、梯度离心法、免疫磁珠分选法都无法获得满意的细胞回收率和纯度。

为了获取满意的回收率和纯度，研究人员开始采用微流控芯片和纳米功能材料，期望以大通量的处理方式获取足够数量目标细胞。纳米材料表面积大，可以固定大量的识别配体，并利用识别配体与细胞表面特异性分子受体的亲和性识别。同时纳米结构能够改善细胞在其表面上的粘附，保证捕获固定可靠。利用纳米材料增强对细胞的识别，如纳米点阵列、自组装纳米柱、纳米线、纳米纤维表面、三维海绵状纳米结构等，使用材料多种多样。使用纳米材料强化捕获，已经成为稀有细胞分离的研究热点和发展趋势。

相比较基于细胞尺寸差异的过滤法和筛选法，特异性分子识别法可取得更高的回收率和纯度。同样与普通结构表面相比，纳米结构材料可以显著增强对目标 细胞的识别。纳米材料增强识别的原理有两个，一是超高的表面积，在其表面可布置大量的识别配体；另一个是纳米结构能够增加细胞在其表面的粘附性，保证捕获稳固。在已使用的纳米点、纳米线阵列结构应用中，已经验证了纳米结构材料的优异特性，但仍存在识别选择性差、纯度不高的问题。

【发明内容】

本发明的目的是提供一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料及其制备方法，实现大通量、无标记、高效率的稀有循环肿瘤细胞的分离，增强对目标细胞的捕获可靠性。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，由多孔石墨烯、硅微球以及硅基底材料自组装而成；利用表面化学改性，分别在多孔石墨烯和硅微球上固定E-selectin蛋白分子和识别配体，用于对循环肿瘤细胞的识别和捕获。

进一步，多孔石墨烯形成多孔石墨烯层，多孔石墨烯层上的小孔直径为5～8微米，硅微球直径为3～5微米，硅微球镶嵌于多孔石墨烯层的小孔上。

进一步，所述硅基底材料为单晶硅片或玻璃基底，并在其表面上制作有增强对多孔石墨烯和硅微球吸附的纳米金层，形成金阵列结构。

进一步，所述纳米金层为10～20纳米。

进一步，所述多孔石墨烯和硅微球表面布置有连接体，E-selectin蛋白分子和识别配体通过连接体固定在多孔石墨烯和硅微球上。

进一步，所述连接体包括琼脂糖、纤维素、生物素、链霉亲合素和聚酰胺树形大分子。

进一步，所述识别配体是与细胞表面表现的特异分子的亲和标记物，包括各 种抗体和核酸适配体。

一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料制备方法，包括以下步骤：

第一步，制作多孔石墨烯材料，先制作多孔结构模板，再用化学合成法在其上制备多孔石墨烯，在硅基底材料上制作纳米金层，采用剥离法或刻蚀法，在硅基底材料上形成金阵列；

第二步，将多孔石墨烯转移到硅基底材料上，多孔石墨烯的孔与金阵列对准，使用化学极化在金表面感生出正电荷，并在硅微球表面产生负电荷，利用电荷的吸附力，将硅微球吸附并固定于金表面上，获得三维纳米结构；

第三步，对石墨烯表面和硅微球表面分别进行改性处理，并布置不同的连接体，在连接体上分别固定E-selectin蛋白分子和肿瘤细胞识别配体，完成三维仿生纳米材料的制备。

本发明的三维的结构纳米材料，利用自组装工艺将不同尺度的特征材料结合起来，实现多尺度的功能组合。在多孔石墨烯的中间，嵌入大量的硅微球阵列，形成复杂的三维表面形貌。石墨烯材料的大表面积及强吸附性，可以在其表面上固定大量的识别分子配体。三维的结构能够增强细胞的粘附，保证了对捕获细胞的可靠固定。利用E-selectin蛋白分子的特殊性能，仿生结构能够有效增加细胞与识别配体之间的相互作用，提高选择性，减少错选、漏选的问题。因此，三维仿生纳米材料具有更高的选择性和可靠性，能够更高效地实现对目标细胞的识别和捕获。集成于微流控芯片内，可实现对大通量的处理方式，提高处理效率，保证了细胞检测分析的有效性。

三维仿生纳米功能材料，可用于识别和捕获外周血样中的特定目标细胞。主要用途在于从经过预处理得到的白细胞溶液中获取循环肿瘤细胞，根据识别策略 不同可分为正向选择和负向选择。前者在硅微球上固定肿瘤细胞的识别配体，将其捕获后固定于材料表面，识别结束后需要释放出过程以获得目标细胞。负向选择时则是用相应配体固定白细胞，而直接获得肿瘤细胞对象。

本发明采用三维纳米结构，使用三维仿生式结构将白细胞的干扰进一步降低，并将目标细胞的识别配体突出布置。这样白细胞会在仿生表面滚动而不影响识别，而突出的识别配体则可更多的接触到循环肿瘤细胞，提高接触机率亦即提高细胞的回收率。同时使用硅微球可以增强细胞粘附，防止随流体冲刷流失。由此可见，采用三维的识别结构，可以同时提高细胞识别的回收率和纯度。

【附图说明】

图1三维仿生纳米材料结构示意图

图2三维纳米结构的制备过程示意图

图2a)多孔石墨烯制备；图2b)基底材料上沉积纳米金层；图2c)静电吸附自组装

图3纳米结构横截面示意图

图中：1硅基底材料，2多孔石墨烯，3硅微球，4纳米金层，21连接体，22E-selectin蛋白分子，32识别配体。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

本发明的三维结构的纳米功能材料，可用于外周血样中循环肿瘤细胞的识别和有效捕获。整个结构由三层材料组成，分别是硅基底材料1、多孔石墨烯2、硅微球3。三种材料通过自组装工艺结合在一起，形成一个复杂的三维阵列结构。 采用化学改性后，在石墨烯表面和硅微球表面分别固定固定E-selectin蛋白分子22和细胞识别用识别配体32，即可实现一种仿生作用，提高对稀有肿瘤细胞对象的识别能力，增强对捕获细胞的粘附固定。利用化学方法，打开识别配体与细胞表面受体之间的结合，即可将细胞从纳米材料表面释放出来。纳米功能材料可集成于微流控芯片中，对经过芯片预处理的外周血样进行细胞分离。二者的配合使用可实现大通量、无标记、高效率稀有肿瘤细胞的捕获。

如图1和3所示，硅基底材料1可使用硅片或玻璃，在其表面上沉积10～20纳米的纳米金层4，形成阵列结构。多孔石墨烯层上的小孔直径为5～8微米，硅微球直径为3～5微米，硅微球镶嵌于多孔石墨烯层的小孔上，纳米金阵列的功能是为了便于静电吸附组装，提高硅微球与基地材料的结合力。

进一步，多孔石墨烯2和硅微球3表面布置有连接体21，E-selectin蛋白分子22和识别配体32通过连接体21固定在多孔石墨烯2和硅微球3上；连接体21包括琼脂糖、纤维素、生物素、链霉亲合素和聚酰胺树形大分子。

所述识别配体32是与细胞表面表现的特异分子的亲和标记物，包括各种抗体和核酸适配体。石墨烯层主要功能是利用其吸附性，在表面上固定大量的连接体21和E-selectin蛋白分子22。蛋白分子可使白细胞在其上翻滚，降低细胞的移动速度，增加了目标细胞与识别配体的接触机率。石墨烯亦可吸附细胞，强化捕获后的粘附效果。硅微球镶嵌与多孔石墨烯中间，共同形成三维多尺度结构。硅微球阵列可改变细胞的流动状态，促进细胞与材料表面的相互接触。微球表面固定有循环肿瘤细胞识别配体，提高识别的选择性。硅微球与石墨烯共同作用，能够增强细胞在其结构表面的粘附，保证捕获可靠。石墨烯表面和微球表面需要使用不同的连接体，以固定不同的作用物。

如图2所示，为本发明纳米材料的制备过程。

参考图2a)，首先制作多孔石墨烯材料。目前大面积石墨烯的制作多采用化学合成法。因此，需要先制作多孔结构模板，再用化学合成法在其上制备石墨烯材料。

如图2b)，硅基底材料上制作纳米金阵列，可以采用剥离法或刻蚀法，在基底材料上形成金阵列。接着需要将多孔石墨烯转移到基底材料上，保证二者的孔与金阵列对准。

如图3，再使用化学极化在金表面感生出正电荷，并在硅微球表面产生负电荷。利用电荷的吸附力，可将硅微球吸附并固定于金表面上，获得三维纳米结构。接着，需要对石墨烯表面和微球表面分别进行改性处理，并布置不同的连接体。最后在连接体上分别固定E-selectin蛋白分子和肿瘤细胞识别配体，完成功能材料的制作。

为了避免化学改性时，石墨烯和硅微球表面上连接体之间相互干扰，可将硅微球的表面连接体在静电组装前就布置完成。即在化学极化表面负电荷的过程中，同时进行连接体的布置。连接体可使用纤维素、生物素、链霉亲合素等。化学改性在表面上产生大量的羟基、羧基等基团，与连接体上的氨基相遇后产生化学键缩合，从而将其固定于表面上。同样的原理，可实现对大蛋白分子、抗体、核酸等分子的固定。

本发明的三维结构的纳米功能材料，适用于从血细胞混合液中识别和捕获循环肿瘤细胞。相比其他捕获结构，三维仿生材料具有显著的性能优势，强化了对目标细胞的识别和粘附。仿生式结构可以使白细胞在其表面缓慢滚动，增细胞加识别配体与目标的接触机率，提高识别的选择性。制作工艺简单，实现三维纳米 结构，能够增强细胞在其表面上的粘附，保证了捕获的可靠性。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定专利保护范围。

Claims (8)

1.一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：由多孔石墨烯(2)、硅微球(3)以及硅基底材料(1)自组装而成；利用表面化学改性，分别在多孔石墨烯(2)和硅微球(3)上固定E-selectin蛋白分子(22)和识别配体(32)，用于对循环肿瘤细胞的识别和捕获。

2.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：多孔石墨烯(2)形成多孔石墨烯层，多孔石墨烯层上的小孔直径为5～8微米，硅微球直径为3～5微米，硅微球镶嵌于多孔石墨烯层的小孔上。

3.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：所述硅基底材料(1)为单晶硅片或玻璃基底，并在其表面上制作有增强对多孔石墨烯(2)和硅微球(3)吸附的纳米金层(4)，形成金阵列结构。

4.如权利要求1所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：所述纳米金层(4)厚度为10～20纳米。

5.如权利要求1、2、3或4所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：所述多孔石墨烯(2)和硅微球(3)表面布置有连接体(21)，E-selectin蛋白分子(22)和识别配体(32)通过连接体(21)固定在多孔石墨烯(2)和硅微球(3)上。

6.如权利要求5所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：所述连接体(21)包括琼脂糖、纤维素、生物素、链霉亲合素和聚酰胺树形大分子。

7.如权利要求5所述的用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料，其特征在于：所述识别配体(32)是与细胞表面表现的特异分子的亲和标记物，包括各种抗体和核酸适配体。

8.一种用于循环肿瘤细胞捕获的三维仿生纳米材料制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，制作多孔石墨烯材料，先制作多孔结构模板，再用化学合成法在其上制备多孔石墨烯(2)，在硅基底材料(1)上制作纳米金层(4)，采用剥离法或刻蚀法，在硅基底材料(1)上形成金阵列；

第二步，将多孔石墨烯(2)转移到硅基底材料(1)上，多孔石墨烯(2)的孔与金阵列对准，使用化学极化在金表面感生出正电荷，并在硅微球(3)表面产生负电荷，利用电荷的吸附力，将硅微球(3)吸附并固定于金表面上，获得三维纳米结构；

第三步，对石墨烯表面和硅微球表面分别进行改性处理，并布置不同的连接体，在连接体上分别固定E-selectin蛋白分子和肿瘤细胞识别配体，完成三维仿生纳米材料的制备。