CN107619851A - 一种利用磁性纳米探针肉眼直接计数大肠杆菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法，该方法是将大肠杆菌抗体和包被有蛋白A的磁珠进行偶联，构建具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针；用该探针捕获待测样品中的大肠杆菌，在暗场显微镜下观察结果。本发明构建了结合大肠杆菌的磁探针，建立了大肠杆菌快速检测体系。基于磁探针的暗场显微镜肉眼观察方法具有简便、快速，无需特殊设备等特点，可用于实地现场鉴定样品中是否含有大肠杆菌。

Description

一种利用磁性纳米探针肉眼直接计数大肠杆菌的方法

技术领域

本发明属于病原体检测领域，具体涉及一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法。

背景技术

大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常被称为大肠杆菌，为埃希氏菌属的代表菌种。有鞭毛及动力，为无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。自1885年Esherich发现大肠埃希氏菌以来，人们通常将其认作肠道菌群中的正常组成部分。直到1982年，Riley和Remis等首次发现大肠杆菌具有致病性。致病性大肠杆菌是重要的腹泻病原之一，属于人畜共患病原体，严重危害人类的公共卫生健康。大肠杆菌在环境中广泛存在，可通过水源、畜禽产品和环境中的各种其它因素如动物接触、公共环境污染等进行传播造成疾病暴发。研究表明，饮用水、食品中大肠杆菌的数量，可作为其安全程度的重要指标。因此，大肠杆菌的检测具有重要的公共卫生意义。

传统大肠杆菌检测主要有两种方法，一种需要进过提取分离培养，细菌形态鉴定等步骤较为繁琐。然而，这种技术具有局限性，多种细菌并不具可供鉴定的形态学特征；细菌培养技术本身会引入很大的误差，重复性低。传统的大肠杆菌检测方法耗时较长且操作复杂，不适合进行食品检疫等大批量样品的检测。医疗中，如果检测时间过长也可能会导致诊治的延迟。另外一种，实时荧光定量PCR，可将细菌样品的特异性DNA进行扩增，同时进行荧光定量检测。但这种方法极易产生非特异性产物，从而形成假阳性结果。除此之外，PCR检测需要具有专业的实验技术和仪器，需要专业的技术人员，限制了其在基层工作中的使用。

发明内容

本发明的目的在于建立一种利用暗场显微镜肉眼观察大肠杆菌的快速检测方法，该方法能够对环境中的大肠杆菌进行快速诊断和检测，缩短检测周期，简化检测过程，提高检测手段的普遍适用性，利于实地现场检测，从而快速、准确、敏感、简便地检测大肠杆菌的存在，及时防控，意义重大。

本发明首先将抗体和磁珠进行偶联，构建具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针。此探针利用抗原抗体的特异性反应，可紧密结合大肠杆菌，该复合物在磁场的作用下做定向运动，从而达到分离大肠杆菌的作用，在暗场显微镜下可形成清晰为肉眼所见的金黄色衣壳状结构。

本发明采用的技术方案如下：

一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法，该方法是将商品化大肠杆菌抗体和商品化包被有蛋白A的磁珠进行亲和偶联获得磁探针，然后以此探针对环境中大肠杆菌进行捕获，然后在暗场显微镜下观察结果。

本发明具体的步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠进行清洗，获得分散性较均一的纳米级磁珠；

(2)抗体的偶联：将大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠混合，亲和偶联后获得具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针；

(3)将步骤(2)中磁探针与待测样本孵育一段时间，得混合液；

(4)磁分离上述混合液，用PBS重悬混合物后，滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

优选地，所述方法，步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠与含有BSA的PBS溶液进行混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于含有BSA的PBS溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于含有BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将商品化大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠按照质量比为1:1-2:5混合，常温孵育1-6h；然后磁分离洗涤未结合抗体，最后用含BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获大肠杆菌的磁探针；

(3)用步骤(2)构建好的磁探针对待测样品中的大肠杆菌进行捕获，所述磁探针添加量为每100μL样本溶液加入50-100μL磁探针；

(4)取步骤(3)中的混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜观察。

本发明中，步骤(1)所述磁珠是直径为纳米级的磁颗粒。

步骤(1)所述磁珠清洗所用的BSA的浓度为1％，每次清洗的时间为5min，清洗次数为3次。

步骤(2)所述抗体和磁珠偶联时间为30-60min。

步骤(3)所述样品，为水样、乳制品和粪便样品。

步骤(3)所述磁探针捕获大肠杆菌的时间为30-60min。

更优选地，所述方法，具体步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将商品化包被有蛋白A的磁珠与含1％BSA的PBS溶液进行混合，磁分离后，弃上清，重悬于含1％BSA的PBS溶液中，超声5min后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于含1％BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将商品化兔抗大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠按照质量比为4:5混合，进行亲和偶联，混合溶液在Mixer中室温下旋转振荡孵育1-6h，磁分离后，弃上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异性捕获大肠杆菌能力的磁探针；

(3)利用步骤(2)中偶联了大肠杆菌抗体的磁探针对样品中的大肠杆菌进行捕获，所述磁探针添加量为每100μL捕获体系中添加50-100μL磁探针，混合溶液在Mixer中室温下旋转振荡孵育30-60min，磁分离后，弃上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中；

(4)取步骤(3)中的10μL混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜下观察。本发明的有益效果：

本发明提供的利用暗场显微镜肉眼观察大肠杆菌的快速检测方法，核心技术为磁探针分离技术。利用磁探针检测大肠杆菌，不需要特殊的实验仪器，只需要磁力分离器和暗场显微镜就可完成实验；在检测过程中，只需要包被有大肠杆菌的特异性抗体，利用抗原抗体间特异性结合就能完成实验，室温下就可以操作，不要特殊的实验条件；在短时间内就可完成检测，且具有较高的灵敏度，适用于实地现场作业。

附图说明

图1免疫磁珠检测大肠杆菌原理示意图；

图2验证磁珠与兔抗大肠杆菌多克隆抗体结合的SDS-PAGE图；其中Marker为预染蛋白标记，1为20ug 200nm磁珠；2为2ug大肠杆菌抗体上样量；3为20ug磁珠和2ug抗体结合后的上样量；

图3大肠杆菌普通显微镜图；

图4磁探针与大肠杆菌结合的暗场显微镜图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做更进一步地解释，但本发明不受实施例的限制。

对大肠杆菌的检测，包括如下步骤：

一、材料

包被有蛋白A的磁珠购自美国Creative Diagnostics公司；兔抗大肠杆菌多克隆抗体购自美国Thermo Fisher公司；大肠杆菌为实验室保存菌种，血清型为O78；磁力分离器购自美国Promega公司；Hula Mixer购自life technology公司(挪威)；超声仪购自中国昆山市超声仪器有限公司。

二、实验方法

实验具体流程如附图1所示，具体步骤如下：

1.磁珠的清洗

将100μL商品化包被有蛋白A的直径为200nm磁珠加入500μL含1％BSA的PBS的1.5mL离心管中，超声振荡5min，混匀，放入磁力分离器上，待磁颗粒吸附完全，弃去上清；再向离心管中加入500μL含1％BSA的PBS，重复操作三次；再次加入100μL含1％BSA的PBS，超声振荡，充分混匀，待用；

2.抗体的偶联

将15μL商品化兔抗大肠杆菌抗体和步骤1中清洗后的100μL磁珠混合，进行亲和偶联，超声振荡混匀后，在Mixer中室温下旋转振荡孵育2h；结合反应完成后，放入磁力分离器中，待吸附完全，弃去上清，然后用含1％BSA的PBS溶液洗涤，重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获能力的磁探针；

3.抗体偶联效率的测定

取与包被蛋白A的磁珠偶联前后的抗体溶液，SDS-PAGE法检测磁珠与抗体偶联效率：置于95℃左右的沸水中变性5min，离心10s，120V SDS-PAGE电泳，结果如附图2所示，磁珠能较高效率捕获大肠杆菌抗体。

4.磁探针对大肠杆菌的捕获

取100μL兔抗大肠杆菌抗体包被的磁探针与100μL待测样品在Mixer中室温下旋转振荡孵育60min；结合反应完成后，放入磁力分离器中，待吸附完全，加入500μL的PBS洗涤探针，重复操作三次，加入50μL PBS重悬磁探针。

5.结果观察

在普通明场显微镜下观察大肠杆菌如同附图3中所示，呈现短杆状形态，但较难与其它类似杆菌区别。

将步骤4中的混合液10μL，滴加到载玻片上，如附图4所示，在暗场显微镜下，可清晰看到大肠杆菌周围或者部分区域呈现出金黄色光亮。

Claims (7)

1.一种利用暗场显微镜肉眼直接观察大肠杆菌的方法，其特征在于，将大肠杆菌抗体和包被有蛋白A的磁珠进行偶联，构建具有特异性捕获大肠杆菌的磁探针；用该探针捕获待测样品中的大肠杆菌，在暗场显微镜下观察结果。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠进行清洗获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠混合，进行亲和偶联，获得具有特异捕获大肠杆菌能力的磁探针；

(3)将步骤(2)中磁探针与待测样本孵育一段时间，得混合液；

(4)磁分离上述混合液，用PBS重悬混合物后，滴加到载玻片上，暗场显微镜下观察。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，步骤如下：

(1)磁珠的清洗：将包被有蛋白A的磁珠与含有BSA的PBS溶液进行混合，磁分离后静置，弃上清，重悬于含有BSA的PBS溶液中，超声后磁分离，弃上清，洗涤后重悬于含有BSA的PBS溶液中，获得分散性较均一的磁珠；

(2)抗体的偶联：将商品化大肠杆菌抗体和步骤(1)中清洗后的磁珠按照质量比为1:1-2:5混合，常温孵育1-6h；然后磁分离洗涤未结合抗体，最后用含BSA的PBS溶液洗涤后重悬于PBS溶液中，获得具有特异捕获大肠杆菌的磁探针；

(3)用步骤(2)构建好的磁探针对待测样品中的大肠杆菌进行捕获，所述磁探针添加量为每100μL样本溶液加入50-100μL磁探针；

(4)取步骤(3)中的混合液滴加到载玻片上，暗场显微镜下观察。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磁珠是纳米级磁颗粒。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述磁珠清洗所用的BSA的浓度为1％，每次清洗的时间为5min，清洗次数为3次。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述样品为水样、乳制品和粪便样。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述磁探针捕获大肠杆菌的时间为30-60min。