CN102565395A - 用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：I、将包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与所述样品反应，得到反应液；II、用暗场显微镜观察步骤I)得到的反应液，得到暗场散射图像，图像分析所述暗场散射图像，得到所述待测细菌数量。本发明的实验证明，本发明的方法由于采用抗体修饰的金纳米颗粒作为探针进行暗场散射成像，并采用自动化图像识别技术，因此灵敏度高，特异性强，检测速度快，适用于大肠杆菌的快速、灵敏检测。

Description

用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用包被抗体的金纳米颗粒检测细菌数量的方法。

背景技术

食物和水中大肠杆菌的检测对于食品卫生而言意义重大。我国现行的对于食品中大肠杆菌的检测标准GB 4789.3-2010采用了基于鉴别培养的计数检测法，其中包括大肠菌群MPN计数法以及大肠菌群平板计数法两种检测方法。这两种检测方法均需要相当长的培养时间，如MPN法需4天，平板计数法需3天，因而不适合食品样品，尤其是鲜活产品的快速检测。在快速检测方法方面，目前研究较多的ELISA、免疫磁珠富集、免疫层析等免疫方法以及基于PCR的系列检测法(如旨在快速分析的实时PCR、注重多种细菌同时检测的多重PCR、可区分死菌与活菌的逆转录PCR以及针对表达特定毒素细菌的免疫PCR等)虽然可以缩短检测步骤所需时间，在若干分钟至若干小时之内即可完成样品的分析检测，但其均为基于校准曲线的检测方法，受细菌个体一致性较差的影响，检测限仍然较高。故采用上述方法针对实际样品进行检测时仍需要对样品进行较为复杂的预处理和培养增菌，检测所需总时间依然较长。此外，ELISA等免疫方法及PCR系列方法所使用的试剂或仪器昂贵，检测成本高，不适合大规模推广使用。

因此发现一种灵敏、快速、成本低的检测方法成为研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测待测样品中待测细菌数量的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

I、将包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与待测样品反应，得到反应液；

II、先用暗场显微镜观察步骤I)得到的反应液，得到暗场散射图像，再将所述暗场散射图像进行图像分析，即得到所述待测样品中的待测细菌数量。

上述方法的步骤II)中，所述图像分析包括如下步骤：

1)将所述暗场散射图像由sRGB色彩空间转换至L*A*B*色彩空间，得到L*A*B*色彩空间图像；

2)将步骤1)得到的L*A*B*色彩空间图像的所有像素进行亮度阈值运算，得到非背景像素和背景像素；

所述亮度阈值运算具体为先设定亮度阈值给定值，再将所述所有像素的亮度值与所述亮度阈值给定值比较，大于所述亮度阈值给定值的像素为非背景像素，小于所述亮度阈值给定值的为背景像素；将所述背景像素设为纯黑色；

3)将步骤2)得到的非背景像素采用八连通的洪泛算法进行分割，得到所有八连通的子区域列表，然后将所述非背景像素间距离小于或等于给定距离r的子区域合并为同一子区域，得到多个包含单一连续形状的子图像；

4)对于每一个步骤3)得的子图像采用色彩比较算法，得到所述子图像中的非背景像素与给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值，提取与任一给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于给定的色彩容差阈值的非背景像素像素点为金纳米颗粒通道，然后将所述子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像的二值图像和金纳米颗粒通道二值图像；

所述将所述子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像的二值图像和金纳米颗粒通道二值图像，具体采用的方法为对于所述子图像以及所述金纳米颗粒通道中的每一个像素，将颜色为纯黑色的像素视为0，其它颜色的像素视为1，从而得到相应的二值图像；

5)包括如下步骤：

A)将步骤4)得到的子图像的二值图像用步骤3)所述r值执行r/2次图像膨胀运算，得到整体图像；

上述图像膨胀运算的具体目的为将步骤3)得到的子图像中的各个视为连续但并不直接相连的图像部分相连接成为一个连通的整体，以使图像收缩运算的结果能够正确反应步骤3)对于子图像的连续性的设定；

B)将步骤A得到的整体图像进行图像收缩，得到收缩后的子图像的二值图像；

上述图像收缩直至单次收缩操作不将任何非背景像素置为背景像素。图像收缩步骤完成后，无孔洞的图像变换为处于其质心或接近质心的单个像素，而含有孔洞的图象变换为连通的环，环上像素处于所有孔洞和距离它们最近的外边界的中点。

C)采用四连通洪泛算法填充步骤B得到的收缩后子图像的二值图像的背景像素，得到四连通的背景区域列表，从所述四连通的背景区域列表中选出不与所述收缩后子图像的二值图像边缘相通的背景区域，则其边界即对应一个非背景像素组成的环形；

该环形可能为待测细菌的骨架图像；

D)对步骤C得到的每一个环形进行如下a)、b)和c)的处理：

a)计算所述环形的周长、轴比与方位角；

b)对所述环形进行霍夫变换，变换结果的峰值即为所述环形中的直线参数列表；

c)先提取所述步骤3)得到的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值的所有像素点，计算每一所述像素点的色彩值分别与所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值和给定的待测细菌的特征色彩值的差值，若所述像素点的色彩值与任一所述所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于差值给定值1，则所述像素点为符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点；若所述像素点的色彩值与所述给定的待测细菌的特征色彩值的差值小于差值给定值2，则所述像素点为符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点；得到符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点和符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点；

再计算所述符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例和所述符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例，分别得到金纳米颗粒的像素比例和待测细菌的像素比例；

所述所有像素点为所述子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值的所有像素点；

E)分析上述D)的处理结果，选取符合如下条件的子图像作为含有待测细菌的子图像：

所述如下条件包括(1)和(2)：

(1)所述子图像的二值图像中存在环形，且所述环形的周长大于环形周长给定值，所述环形的轴比小于环形轴比给定值，

(2)所述金纳米颗粒的像素比例和所述待测细菌的像素比例的和大于像素比例给定值；

F)提取步骤E)得到的所述含有待测细菌的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于所述距离给定值的所有像素点作为待测细菌图像；

6)将步骤4)中的所述金纳米颗粒通道二值图像，用八连通的洪泛算法对其中的每一非背景像素进行填充，得到单一金纳米颗粒的图像列表；计算所述单一金纳米颗粒的图像列表中的每一个连续图形的周长和轴比，去掉所述每一个连续图形的周长小于连续图形周长给定值1或所述每一个连续图形的轴比小于连续图形轴比给定值1的图形，将剩余图形作为金纳米颗粒图像；

7)将每一个步骤3)得到的所述子图像通过步骤6)得到的金纳米颗粒图像和通过步骤5)得到的待测细菌图像叠合，

若所述金纳米颗粒图像与所述待测细菌图像的距离小于或等于距离给定值1，则所述子图像为与所述特异抗体结合的所述待测细菌；统计所有子图像的数量，即为所述待测样品中与所述特异抗体结合的所述待测细菌的数量；

若所述金纳米颗粒图像与所述待测细菌图像的距离大于距离给定值1或所述金纳米颗粒图像中不包含任何非背景像素，则所述子图像为未结合所述特异抗体的所述待测细菌；统计所有子图像数量，即为所述待测样品中未结合所述特异抗体的所述待测细菌的数量。

上述步骤II)中，

步骤2)中，所述亮度阈值给定值根据图像曝光情况选定，所述亮度阈值给定值的确定，为选取满足高于背景亮度且同时不影响待测细菌的图像的值作为亮度阈值给定值，使待测细菌图像经过阈值运算后图像边缘仍保持细菌的形状；

步骤3)中，所述给定距离r根据自动识别效果选定，所述给定距离r的确定，是对自动识别的结果进行调整，使单个待测细菌图像被包含至一个子图像中；

步骤4)中，所述色彩比较算法采用CIE Delta E 2000，

所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为所述暗场散射图像中金纳米颗粒的主要颜色作为特征色彩值；

所述给定的色彩容差阈值根据图像自动识别效果选定，所述给定的色彩容差阈值的确定，是使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上；

步骤5)的D的步骤c中，所述距离给定值为待测细菌细胞膜在暗场散射图像中的厚度的一半；

所述计算方法为CIE Delta E 2000色彩差值算法；

所述给定的待测细菌的特征色彩值为所述暗场散射图像中的待测细菌的主要颜色作为特征色彩值；

所述差值给定值1根据图像自动识别效果选定，所述差值给定值1的确定，是使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上；

所述差值给定值2根据图像自动识别效果选定，所述差值给定值2的确定，是使自动识别的结果与细菌图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占细菌图像像素数量的一半以上；

步骤5)的E中，所述如下条件还包括：所述环形的霍夫变换的结果存在峰值，则所述环形的方位角与所述霍夫变换的峰值相吻合；

所述(1)中，所述环形周长给定值与环形轴比给定值根据待测细菌的暗场散射图像而选定，所述环形周长给定值与环形轴比给定值是通过待测细菌的平均尺寸计算周长给定值和轴比给定值；

步骤F)中，所述距离给定值根据细菌细胞膜在图像中的厚度选定，所述距离给定值为待测细菌细胞膜在暗场散射图像中的厚度的一半；

步骤6)中，所述连续图形的周长给定值1及连续图形的轴比给定值1根据单个金纳米颗粒探针的散射图像选定，所述连续图形的周长给定值1和所述连续图形的轴比给定值1通过单个金纳米颗粒的平均尺寸计算周长和轴比给定值。

上述步骤II)中，步骤4)中，所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为选取金纳米颗粒图像中占比最大的颜色作为特征色彩值；

步骤5)的D的步骤c中，所述给定的待测细菌的特征色彩值为选择细菌图像中占比最大的颜色作为特征色彩值。

上述方法的步骤I)中，所述反应为将所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与所述待测样品混合，所述混合的温度为10℃-40℃，所述混合的时间为10min-60min；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒为将待测细菌特异抗体包被到金纳米颗粒溶胶中，得到包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒。

具体方法如下：

1)每量取2mL浓度为10mg/mL的氯金酸水溶液，加入192mL去离子水，加热沸腾后加入6mL浓度为38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液，加热反应至溶液呈酒红色，得到小粒径金纳米颗粒溶胶(粒径为13nm)；再量取2.4mL浓度为0.1mg/mL的氯金酸水溶液，加入上述得到的0.05mL小粒径金纳米颗粒溶胶以及0.1mL浓度为40mmol/L的盐酸羟胺水溶液，振荡混合2min，溶液颜色呈紫红色；最后向所述溶液中加入0.1mL浓度为10mg/mL的氯金酸水溶液，振荡混合5min，溶液最终呈砖红色，得到金纳米颗粒溶胶(经TEM检测粒径为80nm)；

2)将步骤1)得到的金纳米颗粒溶胶与等体积的含有质量分数为2％的Tween-20的0.01mol/L PBS溶液(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g溶于1L去离子水，pH 7.4)混合，振荡30min，得到稳定金纳米颗粒溶胶；

3)每称取5mg 11-MUDA(11-巯基十一烷酸)，溶于40mL乙醇，得到11-MUDA乙醇溶液；

4)将步骤3)得到的11-MUDA乙醇溶液与由步骤2)得到的稳定金纳米颗粒溶胶按1∶2的体积比混匀，继续振荡反应4h；再在9000rpm的转速下离心5min，弃去上清液收集沉淀，用去离子水洗涤所述沉淀并使用80W超声处理15s，以使金纳米颗粒沉淀充分分散；再重复离心洗涤5次后将金纳米颗粒用去离子水定容至稳定金纳米颗粒溶胶体积的1/2，超声分散后备用，得到表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶；

5)每量取3mL由步骤4)得到的表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶，加入0.1mL EDC和NHS的水溶液(EDC和NHS的混合水溶液为将EDC和NHS溶于水中，得到混合水溶液，EDC和NHS在混合水溶液的终浓度均为1mmol/L)，振荡反应30min，得到反应液1，再向反应液1中加入兔抗大肠杆菌DH5α抗体溶液(购自北京博奥森生物技术有限公司，货号为bs-2033R，兔抗大肠杆菌DH5α抗体原始抗体药品为干粉，含抗体1mg，使用10mL 0.01mol/L PBS溶液稀释后于-20℃分装保存，每个小包装含抗体量为0.05mg，终浓度为0.1mg/mL，按2mL表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶对应0.05mg抗体的比例加入)，振荡反应4h；待反应结束后在9000rpm的转速下离心5min，之后弃去上清液收集沉淀，用去离子水洗涤沉淀并超声分散；再重复洗涤3次后用0.01mol/L PBS溶液重新定容至原体积，超声分散备用，得到包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒。

上述方法的步骤I)中，所述待测样品为待测细菌的培养液；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒在所述反应液中的终浓度为0.005nmol/L-0.05nmol/L，在本发明的实施例中具体为0.035nmol/L；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒中所述待测细菌特异抗体和所述金纳米颗粒的配比为1g∶14nmol-6g∶14nmol，在本发明的实施例中具体为5g∶14nmol；

上述方法的步骤I)中，所述待测细菌的培养液为将所述待测细菌在发酵培养基中培养得到的培养液；所述发酵培养基为LB培养基；所述发酵的时间为18h-24h，所述发酵的温度为37℃；

所述待测细菌特异抗体为兔抗大肠杆菌DH5α抗体；

所述待测细菌为大肠杆菌，所述待测细菌具体为DH5α；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒中所述金纳米颗粒溶胶的粒径为80nm。

步骤II)中，所述暗场散射图像的曝光时间为20ms-100ms；

步骤1)中，所述色彩空间转换中设定的白点值为D65，其D65白点以CIE XYZ色彩空间表示为(X，Y，Z)＝(0.9505，1.0000，1.0890)；

步骤2)中，所述亮度阈值给定值在本发明的实施例中具体为10；

步骤3)中，所述给定距离r在本发明的实施例中具体为2像素；

步骤4)中，所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为RGB(239，220，152)和RGB(155，133，87)，

所述给定的色彩容差阈值为15；

步骤5)的D的步骤c中，所述距离给定值为3像素；

所述给定的待测细菌的特征色彩值选取RGB(37，44，36)；

所述差值给定值1为15；

所述差值给定值2为10；

步骤5)的E中所述(1)中，在本发明的实施例中，环形周长给定值和环形轴比给定值按环形周长分段给出，所述环形周长为30像素-50像素时，对应的环形轴比给定值为0.4或所述环形周长为大于或等于50像素时，对应的环形的轴比给定值为0.3；

所述(2)中，所述像素比例给定值根据金纳米颗粒以及细菌的色彩通道匹配情况选定，通常应大于50％，在本发明的实施例中，所述像素比例给定值具体为60％；

步骤F)中，所述距离给定值为3；

步骤6)中，所述连续图形的周长给定值1为10像素，所述连续图形的轴比给定值1为0.7；

步骤7)中，所述距离给定值1通常可选择0像素，若金纳米颗粒色彩通道匹配效果较差(具体体现为人工判断细菌表面连接有金纳米颗粒，但所述金纳米颗粒图像与所述待测细菌图像并不重叠)，可选择正的数值，以使自动识别结果与人工判断相吻合；在本发明的实施例中，所述距离给定值1为0像素。

上述步骤II)中步骤5)的D的步骤a)中，所述环形包围形成形状的周长、轴比与方位角采用以下算法计算：

对于周长，考察所述环形包围形成的形状中的每一个2×2的像素区域是否匹配以下模式，统计各个模式的匹配数量：

周长 $p=Q_1+2Q_2+4Q_4+\sqrt{2}{Q}_D$

对于轴比与方位角，采用空间矩的方法计算；设所述环形包围形成的形状宽度为J，高度为K，F(j，k)为点(j，k)处的值(0或1)，则所述环形包围形成形状的重心为：

$\stackrel{\‾}{x}=\frac{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{jF}(j,k)}{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}F(j,k)},$ $\stackrel{\‾}{y}=\frac{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{kF}(j,k)}{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}F(j,k)}$

定义U(2，0)、U(0，2)和U(1，1)为：

$U\left(\mathrm{2,0}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}{(j-\stackrel{\‾}{x})}^{2}F(j,k)$

$U\left(\mathrm{0,2}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}{(k-\stackrel{\‾}{y})}^{2}F(j,k)$

$U\left(\mathrm{1,1}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}(j-\stackrel{\‾}{x})(k-\stackrel{\‾}{y})F(j,k)$

则长轴与短轴的特征值按以下公式计算：

${\mathrm{\λ}}_1=\frac{1}{2}[U\left(\mathrm{2,0}\right)+U\left(\mathrm{0,2}\right)]+\frac{1}{2}{[U{\left(\mathrm{2,0}\right)}^2+U{\left(\mathrm{0,2}\right)}^2-2U\left(\mathrm{2,0}\right)U\left(\mathrm{0,2}\right)+4U{\left(\mathrm{1,1}\right)}^2]}^{1/2}$

${\mathrm{\λ}}_2=\frac{1}{2}[U\left(\mathrm{2,0}\right)+U\left(\mathrm{0,2}\right)]-\frac{1}{2}{[U{\left(\mathrm{2,0}\right)}^2+U{\left(\mathrm{0,2}\right)}^2-2U\left(\mathrm{2,0}\right)U\left(\mathrm{0,2}\right)+4U{\left(\mathrm{1,1}\right)}^2]}^{1/2}$

长轴特征值λ_M＝max{λ₁，λ₂}，短轴特征值λ_N＝min{λ₁，λ₂}；

轴比 $R=\frac{{\mathrm{\λ}}_N}{{\mathrm{\λ}}_M},$ 方位角 $\mathrm{\θ}=\arctan \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_M-U\left(\mathrm{0,2}\right)}{U\left(\mathrm{1,1}\right)}\right);$

本发明的实验证明，本发明采用抗体修饰的金纳米颗粒作为探针进行暗场散射成像，并采用自动化图像识别技术，可以实现对于待测细菌的定性检测以及自动化计数识别，且相比现有的鉴别培养检测技术，具有检测速度快(检测所需总时间仅为30～60min)、灵敏度高(可实现单细菌检测)、自动化程度高(自动化图像分析及计数)及特异性强等优点，而所使用的仪器及试剂成本低于ELISA和PCR类方法；

本发明方法的优点具体体现在：为降低检测限，可采用暗场光散射成像法对细菌进行成像计数，实现单细菌检测；而为了对细菌进行选择性识别，可引入包被抗体的金纳米颗粒作为暗场光散射探针，利用其可吸附于特定细菌表面的特性以及金纳米颗粒探针与细菌散射光颜色的区别实现对于特定细菌的选择性检测；成像计数法基于图像识别来检测单个细菌，对于细菌个体形状的变化有一定适应能力，避免了基于校准曲线的检测方法的固有缺陷；另外，暗场光散射成像可使用普通光学显微镜实现，普通钨灯光源即可满足照明需求，商用彩色CCD即可完成彩色图像的采集，仪器成本低、易维护。金纳米颗粒的合成与抗体包被步骤较为简单，所需试剂亦不昂贵。

附图说明

图1为粒径为80nm的金纳米颗粒探针暗场散射图像

图2为大肠杆菌DH5α、BL21和Rosetta的暗场散射图像

图3为大肠杆菌DH5α与抗体修饰的金纳米探针反应结果

图4为大肠杆菌BL21与抗体修饰的金纳米探针反应结果

图5为大肠杆菌Rosetta与抗体修饰的金纳米探针反应结果

图6为原始暗场散射图像截图(左)和图像分割结果(右)

图7为表面连接金纳米颗粒探针的大肠杆菌的原始图像(a)、金色彩通道图像(b)、大肠杆菌色彩通道图像(c)以及图像收缩结果(d)

图8为表面未连接金纳米颗粒探针的大肠杆菌的原始图像(a)、金色彩通道图像(b)、大肠杆菌色彩通道图像(c)以及图像收缩结果(d)

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大肠杆菌数量检测

一、检测样品的预处理

1、包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒的制备

1)量取2mL浓度为10mg/mL的氯金酸水溶液，加入192mL去离子水，加热沸腾后加入6mL浓度为38.8mmol/L的柠檬酸钠水溶液，加热反应至溶液呈酒红色，得到粒径为13nm的小粒径金纳米颗粒溶胶；再量取2.4mL浓度为0.1mg/mL的氯金酸水溶液，加入上述得到的0.05mL粒径为13nm的金纳米颗粒溶胶以及0.1mL浓度为40mmol/L的盐酸羟胺水溶液，振荡混合2min，溶液颜色呈紫红色；最后向所述溶液中加入0.1mL浓度为10mg/mL的氯金酸水溶液，振荡混合5min，溶液最终呈砖红色，得到粒径为80nm金纳米颗粒溶胶(经TEM检测粒径为80nm)；

2)将步骤1)得到的粒径为80nm金纳米颗粒溶胶与等体积的含有质量分数为2％的Tween-20的0.01mol/L PBS溶液(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄0.24g溶于1L去离子水，pH 7.4)混合，振荡30min，得到稳定金纳米颗粒溶胶；

3)称取5mg 11-MUDA(11-巯基十一烷酸)，溶于40mL乙醇，得到11-MUDA乙醇溶液；

4)将步骤3)得到的11-MUDA乙醇溶液与由步骤2)得到的稳定金纳米颗粒溶胶按1∶2的体积比混匀，继续振荡反应4h；再在9000rpm的转速下离心5min，弃去上清液收集沉淀，用去离子水洗涤所述沉淀并使用80W超声处理15s，以使金纳米颗粒沉淀充分分散；再重复离心洗涤5次后将金纳米颗粒用去离子水定容至稳定金纳米颗粒溶胶体积的1/2，超声分散后备用，得到表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶；

5)量取3mL由步骤4)得到的表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶，加入0.1mL EDC和NHS的水溶液(EDC和NHS的混合水溶液为将EDC和NHS溶于水中，得到混合水溶液，EDC和NHS在混合水溶液的终浓度均为1mmol/L)，振荡反应30min，得到反应液1，再向反应液1中加入兔抗大肠杆菌DH5α抗体溶液(购自北京博奥森生物技术有限公司，货号为bs-2033R。原始抗体药品为干粉，含抗体1mg，使用10mL 0.01mol/L PBS溶液稀释后于-20℃分装保存，每个小包装含抗体量为0.05mg，终浓度为0.1mg/mL，按2mL表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶对应0.05mg抗体的比例加入，即抗体与表面修饰有11-MUDA的金纳米颗粒溶胶的配比为5g∶14nmol)，振荡反应4h；待反应结束后在9000rpm的转速下离心5min，之后弃去上清液收集沉淀，用去离子水洗涤沉淀并超声分散；再重复洗涤3次后用0.01mol/L PBS溶液重新定容至原体积，超声分散备用，得到包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒，即为金纳米颗粒光学探针。

2、大肠杆菌培养液的制备

将大肠杆菌DH5α、BL21和Rosetta(均购自北京全式金生物技术有限公司)，三种菌株分别在LB培养基中于37℃发酵培养20h，得到母液，然后将母液稀释至OD600为0.25，分别得到稀释后DH5α菌液、稀释后BL21菌液和稀释后Rosetta菌液。

3、检测前预处理

分别量取0.5mL上述2得到的稀释后DH5α菌液、稀释后BL21菌液和稀释后Rosetta菌液，均加入0.5mL上述1得到的包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒溶胶，在室温(25℃)下用摇床以100rpm的转速振荡反应30min，得到反应液。

包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与细菌的数量比160个∶1cfu，该包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒在所述反应液中的终浓度为0.035nmol/L。

二、检测

1、暗场显微镜下观察

取10μL反应液点样，在暗场显微镜下观察，得到暗场散射图像，图像的曝光时间均为50ms。以包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒、稀释后DH5α菌液、稀释后BL21菌液和稀释后Rosetta菌液为对照。

结果如图1-3所示，图1为包被大肠杆菌特异抗体的金纳米颗粒的暗场散射图像，可见金纳米颗粒探针的散射光主要呈黄色至红色。

图2(由于大肠杆菌菌液稀释液直接成像效果不太好，该图选用的是大肠杆菌与表面仅修饰11-MUDA的金纳米颗粒反应结果图，仅修饰11-MUDA的金纳米颗粒不与大肠杆菌发生相互作用，所以不影响大肠杆菌的形貌)为稀释后DH5α菌液、稀释后BL21菌液和稀释后Rosetta菌液的暗场散射图像，可以看出，三种菌株的形态无明显差别，其暗场散射图像均为中空棒状，单个菌体的表观长度为1-5μm，宽度为1μm。

图3为稀释后DH5α菌液与抗体修饰的金探针反应结果，可见绝大多数大肠杆菌表面均吸附了大量金纳米颗粒，说明金纳米颗粒光学探针对大肠杆菌DH5α产生了响应。

图4为稀释后BL21菌液与抗体修饰的金探针反应结果，图5为稀释后Rosetta菌液与抗体修饰的金探针反应结果，均可以看出，大部分大肠杆菌BL21和Rosetta表面均无金纳米颗粒吸附，说明金纳米颗粒光学探针对于大肠杆菌BL21及Rosetta均无响应。

2、图像分析

对于暗场散射图像的分析从色彩与形状两个方面进行。由于金纳米颗粒在暗场显微镜下呈黄色至红色，而大肠杆菌呈白色，因而通过提取特定色彩范围的图像可有效识别金纳米颗粒。同时，金纳米颗粒在散射图像中以圆形或椭圆形的形态为主，而大肠杆菌呈长度不一，宽度较为固定的中空杆型，故可通过形状特征对二者进行识别。

对于大肠杆菌图像的自动化识别包含参数的选定以及自动化批处理这两个过程。由于不同成像参数下得到的图像在亮度、对比度以及色彩等方面可能存在较大差异，因此在对同一批次成像参数下获取的图像进行自动化识别之前，首先需要通过对于一幅或几幅图像的人工辅助调节来确定上述识别算法中的若干参数。

将上述的图3(稀释后DH5α菌液与抗体修饰的金探针反应结果)进行如下图像分析，该暗场散射图像的曝光时间为50ms：

1)色彩空间转换

由于显微镜采集得到的暗场散射图像在计算机中以sRGB色彩空间的格式保存，为进行后续图像处理，需将暗场散射图像由sRGB色彩空间转换至L*A*B*色彩空间。由于后续的图像处理并不要求获取像素的真实颜色，故可任意选择L*A*B*色彩空间的白点值。此处选择D65白点值进行色彩空间转换，以CIE XYZ色彩空间表示为(X，Y，Z)＝(0.9505，1.0000，1.0890)。将图3由sRGB色彩空间转换至L*A*B*色彩空间，得到L*A*B*色彩空间图像。

2)亮度阈值运算

考虑到显微镜采集得到的图像整体亮度会随光源强度及拍摄条件而产生变化，故先对步骤1)得到的L*A*B*色彩空间图像的所有像素进进行亮度阈值运算，将一定亮度以下的像素置为纯黑色，得到非背景像素和背景像素；便于后续的二值化形状分析。

具体如下：设定亮度阈值给定值为10(根据图像曝光情况选定，应尽可能高于背景亮度，同时不影响大肠杆菌的图像，使待测细菌图像经过阈值运算后图像边缘仍保持细菌的形状)，再将所述所有像素的亮度值与所述亮度阈值给定值比较，大于所述亮度阈值给定值的像素为非背景像素，小于所述亮度阈值给定值的为背景像素；将所述背景像素设为纯黑色；

结果见图6-左，可以看出，原始暗场散射图像分辨率较高。

3)图像分割

通过图像分割，可将包含多个连续形状的原始图像转换为一系列仅包含单一连续形状的子图像，从而便于形状识别。连续形状的查找采用扩展的洪泛(flood fill)算法，其中的连通性判断将任意两个距离小于给定半径的像素视为连续。

具体如下：将步骤2)得到的非背景像素采用八连通的洪泛算法进行分割，得到所有八连通的子区域列表，然后将所述非背景像素间距离小于或等于给定距离r(根据自动识别效果选定，应使单个待测细菌图像(图像边缘可能不连续)被包含至一个子图像中，此例中为2像素)的子区域合并为同一子区域，得到多个包含单一连续形状的子图像；结果如图6-右，为经过图像分割之后的截图，其中每一个独立连通的区域均用绿色方框标出。

由图6可见其中有两个大肠杆菌图像，其中偏右侧较长的大肠杆菌表面连有金纳米颗粒，而偏左侧较小的大肠杆菌表面无金纳米颗粒。

4)金纳米颗粒通道提取及二值化

对于每一个步骤3)得的子图像采用色彩比较算法，得到子图像中的非背景像素与给定的金纳米颗粒的特征色彩值(RGB(239，220，152)和RGB(155，133，87))的差值，提取与任一给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于给定的色彩容差阈值(15)的非背景像素点为金纳米颗粒通道，然后将子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像的二值图像和金纳米颗粒通道二值图像；

为了更准确的进行色彩范围的选取，色彩比较算法采用CIE Delta E 2000。

所述色彩比较算法的给定的金纳米颗粒的特征色彩值为所述暗场散射图像中金纳米颗粒的主要颜色，可选取金纳米颗粒图像中占比最大的颜色作为特征色彩值，所述给定的色彩容差阈值根据图像自动识别效果选定，应使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上。具体采用的方法为对于所述子图像以及所述金纳米颗粒通道中的每一个像素，将颜色为纯黑色的像素视为0，其它颜色的像素视为1，从而得到相应的二值图像。

5)大肠杆菌形态检测

A)将步骤4)得到的子图像的二值图像用步骤3)所述r值执行r/2次图像膨胀运算，得到整体图像；

上述图像膨胀运算的具体目的为将步骤3)得到的子图像中的各个视为连续但并不直接相连的图像部分相连接成为一个连通的整体，以使图像收缩运算的结果能够正确反应步骤3)对于子图像的连续性的设定；

B)将步骤A得到的整体图像进行图像收缩(方法具体参考文献W.K.Pratt and I.Kabir，“Morphological Binary Image Processing with a Local Neighborhood PipelineProcessor”，Computer Graphics，Tokyo，1984中所描述的算法)直至单次收缩操作不将任何非背景像素置为背景像素，得到收缩后的子图像的二值图像；

上述图像收缩直至单次收缩操作不将任何非背景像素置为背景像素。图像收缩步骤完成后，无孔洞的图像变换为处于其质心或接近质心的单个像素，而含有孔洞的图象变换为连通的环，环上像素处于所有孔洞和距离它们最近的外边界的中点。

C)采用四连通洪泛算法填充步骤B得到的收缩后子图像的二值图像的背景像素，得到四连通的背景区域列表，从四连通的背景区域列表中选出不与收缩后子图像的二值图像边缘相通的背景区域，则其边界即对应一个非背景像素组成的环形；该环形可能为待测细菌的骨架图像；

由于大肠杆菌的暗场散射图像为中空杆型，故一个完整的大肠杆菌在收缩操作后应成为一个环。

D)对步骤C得到的每一个环形进行如下处理：

a)计算所述环形的周长、轴比与方位角；

对于周长，考察所述环形包围形成的形状中的每一个2×2的像素区域是否匹配以下模式，统计各个模式的匹配数量：

周长 $p=Q_1+2Q_2+4Q_4+\sqrt{2}{Q}_D$

对于轴比与方位角，采用空间矩的方法计算；设所述环形包围形成的形状宽度为J，高度为K，F(j，k)为点(j，k)处的值(0或1)，则所述环形包围形成形状的重心为：

$\stackrel{\‾}{x}=\frac{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{jF}(j,k)}{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}F(j,k)},$ $\stackrel{\‾}{y}=\frac{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}\mathrm{kF}(j,k)}{\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}F(j,k)}$

定义U(2，0)、U(0，2)和U(1，1)为：

$U\left(\mathrm{2,0}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}{(j-\stackrel{\‾}{x})}^{2}F(j,k)$

$U\left(\mathrm{0,2}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}{(k-\stackrel{\‾}{y})}^{2}F(j,k)$

$U\left(\mathrm{1,1}\right)=\underset{j=1}{\overset{J}{\mathrm{\Σ}}}\underset{k=1}{\overset{K}{\mathrm{\Σ}}}(j-\stackrel{\‾}{x})(k-\stackrel{\‾}{y})F(j,k)$

则长轴与短轴的特征值按以下公式计算：

${\mathrm{\λ}}_1=\frac{1}{2}[U\left(\mathrm{2,0}\right)+U\left(\mathrm{0,2}\right)]+\frac{1}{2}{[U{\left(\mathrm{2,0}\right)}^2+U{\left(\mathrm{0,2}\right)}^2-2U\left(\mathrm{2,0}\right)U\left(\mathrm{0,2}\right)+4U{\left(\mathrm{1,1}\right)}^2]}^{1/2}$

${\mathrm{\λ}}_2=\frac{1}{2}[U\left(\mathrm{2,0}\right)+U\left(\mathrm{0,2}\right)]-\frac{1}{2}{[U{\left(\mathrm{2,0}\right)}^2+U{\left(\mathrm{0,2}\right)}^2-2U\left(\mathrm{2,0}\right)U\left(\mathrm{0,2}\right)+4U{\left(\mathrm{1,1}\right)}^2]}^{1/2}$

长轴特征值λ_M＝max{λ₁，λ₂}，短轴特征值λ_N＝min{λ₁，λ₂}；

轴比 $R=\frac{{\mathrm{\λ}}_N}{{\mathrm{\λ}}_M},$ 方位角 $\mathrm{\θ}=\arctan \left(\frac{{\mathrm{\λ}}_M-U\left(\mathrm{0,2}\right)}{U\left(\mathrm{1,1}\right)}\right);$

b)对所述环形进行霍夫变换(Hough transform)，变换结果的峰值即为环形中的直线参数列表；

分析环中是否含有与环的轴向接近平行的两条直线。

c)先提取所述步骤3)得到的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值(此例中为3)的所有像素点，用CIE Delta E 2000色彩差值算法计算每一所述所述像素点的色彩值分别与给定的金纳米颗粒的特征色彩值(选取RGB(239，220，152)和RGB(155，133，87)两种颜色作为金的特征颜色)和给定的大肠杆菌的特征色彩值(为暗场散射图像中的待测细菌的主要颜色，可选择细菌图像中占比最大的颜色作为特征色彩值，选取RGB(37，44，36)颜色作为大肠杆菌的特征颜色)的差值，若所述像素点的色彩值与任一金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于15(差值给定值1，根据图像自动识别效果选定，应使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上)，则认为该像素点的颜色符合金纳米颗粒的特征；若所述像素点的色彩值与大肠杆菌的特征色彩值的差值小于10(差值给定值2，根据图像自动识别效果选定，应使自动识别的结果与大肠杆菌图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占大肠杆菌图像像素数量的一半以上)，则认为该像素点的颜色符合大肠杆菌的特征；由此可得到符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点和符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点；再计算所述符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例和所述符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例，分别得到金纳米颗粒的像素比例和待测细菌的像素比例；

所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为暗场散射图像中的金纳米颗粒的主要颜色，所述给定的待测细菌的特征色彩值为暗场散射图像中的待测细菌的主要颜色，所述所有像素点为所述子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值的所有像素点；

E)分析上述D)的处理结果，选取符合如下条件的子图像作为含有大肠杆菌的子图像：

(1)所述子图像的二值图像中存在环形，且环形周长大于周长给定值，轴比小于轴比给定值；对于此例中的环形图像，所述环形周长给定值与环形轴比给定值根据待测细菌的暗场散射图像而选定，按环形周长分段给出，当环形周长为30像素-50像素时，对应的环形轴比给定值为0.4；当环形周长为大于或等于50像素时，对应的环形的轴比给定值为0.3；

若所述霍夫变换的结果存在峰值，还需要满足环形的方位角与霍夫变换的峰值相吻合的条件。

以图6-右中部的两个子图像为例，对于偏右的图像，其后续分析结果如图7所示。对图7-d的收缩结果进行Hough变换，得到其中可能从属于大肠杆菌的直线参数(表1)。计算收缩后图像的形状因子，可得图像周长为152像素，短轴与长轴之比为0.026，长轴与纵轴之间夹角为141°，与Hough变换结果相吻合。

表1大肠杆菌收缩图像中的直线检测结果表

对于图6-右中偏左的图像识别分析结果如图8所示。可见未从原始图像中提取出任何符合金的色彩特征的像素，而基本上全部像素被提取至大肠杆菌色彩通道中。由于菌体形貌较小，因此对图8-d的收缩结果进行Hough变换后没有检测到可能从属于大肠杆菌的直线参数。计算收缩后图像的形状因子，可得图像周长为41像素，短轴与长轴之比为0.241，长轴与纵轴之间夹角为153°。

(2)金纳米颗粒的像素比例和所述大肠杆菌的像素比例的和大于像素比例给定值(此例中为60％，根据金纳米颗粒以及细菌的色彩通道匹配情况选定，通常应大于50％)；

对于图6-右中偏右的图像，其环形周边像素中，符合金的色彩特征的像素占4％，符合大肠杆菌色彩特征的像素占89％。依照大肠杆菌的判定条件，将该图像判断为大肠杆菌。

对于图6-右中偏左的图像，其环形周边像素中，无符合金的色彩特征的像素，符合大肠杆菌色彩特征的像素占100％。故根据大肠杆菌的判定条件将该图像判断为大肠杆菌。

F)提取步骤E)得到的所述含有大肠杆菌的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值(根据细菌细胞膜在图像中的厚度选定，可选择细菌细胞膜厚度的一半作为所述距离给定值；此例中为3像素)的所有像素点作为大肠杆菌图像；

6)金纳米颗粒形态检测

将步骤4)中的金纳米颗粒通道二值图像，用八连通的洪泛算法对其中的每一非背景像素进行填充，得到单一金纳米颗粒的图像列表；计算所述列表中的每一个连续图形的周长和轴比，去掉所述周长小于连续图形周长给定值1(此例中为10像素，根据单个金纳米颗粒探针的散射图像的平均尺寸计算)或所述轴比小于连续图形轴比给定值1(此例中为0.7，根据单个金纳米颗粒探针的散射图像的平均尺寸计算)的图形，将剩余图形作为金纳米颗粒图像；

对于图6-右中偏右的图像，金的色彩通道图像(图7-b)的计算结果表明其符合金纳米颗粒特征。

7)检测结果合并

将每一个步骤3)得到的子图像通过步骤6)得到的金纳米颗粒图像和通过步骤5)得到的待测细菌图像叠合，，判断其位置关系，若所述金纳米颗粒图像与所述大肠杆菌图像的距离小于或等于距离给定值1(此例中为0像素)，则所述子图像为与所述特异抗体结合的所述大肠杆菌；统计所有子图像的数量，即为与所述特异抗体结合的所述大肠杆菌的数量；

若所述金纳米颗粒图像与所述大肠杆菌图像的距离大于或等于距离给定值1，或所述金纳米颗粒图像中不包含任何非背景像素，则所述子图像为未结合所述特异抗体的所述大肠杆菌；统计所有子图像数量，得到未结合所述特异抗体的所述大肠杆菌的数量。

对于图6-右中偏右的图像，叠合图7-b与图7-d，图7-b中的金纳米颗粒图像与图7-d的环形重合，故图像为表面连有金纳米颗粒的大肠杆菌。

对于图6-右中偏左的图像，由于未从原始图像中提取出任何符合金的色彩特征的像素，因而图像为表面未连有金纳米颗粒的大肠杆菌。

对于同一批次实验采集的全部图像的自动识别结果如下：上述的图3(稀释后DH5α菌液与抗体修饰的金探针反应结果)经过图像分析(程序识别)，以将图3进行人工分析(肉眼观察)的结果为对照，具体对比见表2：

人工识别连有探针为肉眼识别与所述特异抗体探针结合的DH5α数量；

人工未识别连有探针为肉眼识别未与所述特异抗体探针结合的DH5α数量；

程序识别连有探针为图形分析与所述特异抗体探针结合的DH5α数量；

程序未识别连有探针为图形分析未与所述特异抗体探针结合的DH5α数量；

探针漏检未识别探针为人工识别为表面连有探针的细菌被程序识别为表面未连探针的细菌的数量；

假阳性数杂质识别为菌为人工识别为杂质但被程序识别为细菌的数量；

总识别率为程序识别出的菌的总数/人工识别出的菌的总数，其中程序识别出的菌的总数为程序识别连有探针与程序未识别连有探针的菌数和；

表2大肠杆菌DH5α经图像分析的细菌数量结果表(单位为个)

可以看出，本发明的方法可以检测大肠杆菌的数量，而且与人工识别相比，同样可以达到较高的识别率。

Claims (7)

1.一种检测待测样品中待测细菌数量的方法，包括如下步骤：

I、将包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与待测样品反应，得到反应液；

II、先用暗场显微镜观察步骤I)得到的反应液，得到暗场散射图像，再将所述暗场散射图像进行图像分析，即得到所述待测样品中的待测细菌数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

步骤II)中，所述图像分析包括如下步骤：

1)将所述暗场散射图像由sRGB色彩空间换至L*A*B*色彩空间，得到L*A*B*色彩空间图像；

2)将步骤1)得到的L*A*B*色彩空间图像的所有像素进行亮度阈值运算，得到非背景像素和背景像素；

所述亮度阈值运算具体为先设定亮度阈值给定值，再将所述所有像素的亮度值与所述亮度阈值给定值比较，大于所述亮度阈值给定值的像素为非背景像素，小于所述亮度阈值给定值的为背景像素；

3)将步骤2)得到的非背景像素采用八连通的洪泛算法进行分割，得到所有八连通的子区域列表，然后将所述非背景像素间距离小于或等于给定距离r的子区域合并为同一子区域，得到多个包含单一连续形状的子图像；

4)对于每一个步骤3)得的子图像采用色彩比较算法，得到所述子图像中的非背景像素与给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值，提取与任一给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于给定的色彩容差阈值的非背景像素像素点为金纳米颗粒通道，然后将所述子图像和所述金纳米颗粒通道分别转换为子图像二值图像和金纳米颗粒通道二值图像；

5)包括如下步骤：

A)将步骤4)得到的子图像二值图像用步骤3)所述r值执行r/2次图像膨胀运算，得到整体图像；

B)将步骤A)得到的整体图像进行图像收缩，得到收缩后的子图像二值图像；

C)采用四连通洪泛算法填充步骤B)得到的收缩后子图像二值图像的背景像素，得到四连通的背景区域列表，从所述四连通的背景区域列表中选出不与所述收缩后子图像的二值图像边缘相通的背景区域，则其边界即对应一个非背景像素组成的环形；

D)对步骤C)得到的每一个环形进行如下a)、b)和c)的处理：

a)计算所述环形周长、轴比与方位角；

b)对所述环形进行霍夫变换，变换结果的峰值即为所述环形中的直线参数列表；

c)先提取所述步骤3)得到的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于距离给定值的所有像素点，计算每一所述像素点的色彩值分别与所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值和给定的待测细菌的特征色彩值的差值，若所述像素点的色彩值与任一所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值的差值小于差值给定值1，则所述像素点为符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点；若所述像素点的色彩值与所述给定的待测细菌的特征色彩值的差值小于差值给定值2，则所述像素点为符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点；再计算所述符合给定的金纳米颗粒的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例和所述符合给定的待测细菌的特征色彩值的像素点占所述所有像素点的比例，分别得到金纳米颗粒的像素比例和待测细菌的像素比例；

E)分析上述D)的处理结果，选取符合如下条件的子图像作为含有待测细菌的子图像：

所述如下条件包括(1)和(2)：

(1)所述子图像的二值图像中存在环形，且所述环形的周长大于环形周长给定值，所述环形的轴比小于环形轴比给定值，

(2)所述金纳米颗粒的像素比例和所述待测细菌的像素比例的和大于像素比例给定值；

F)提取步骤E)得到的所述含有待测细菌的子图像中与所述环形上像素的距离小于或等于所述距离给定值的所有像素点作为待测细菌图像；

6)将步骤4)中的所述金纳米颗粒通道二值图像，用八连通的洪泛算法对其中的每一非背景像素进行填充，得到单一金纳米颗粒的图像列表；计算所述单一金纳米颗粒的图像列表中的每一个连续图形的周长和轴比，去掉所述每一个连续图形的周长小于连续图形周长给定值1或所述每一个连续图形的轴比小于连续图形轴比给定值1的图形，将剩余图形作为金纳米颗粒图像；

7)将每一个步骤3)得到的所述子图像通过步骤6)得到的金纳米颗粒图像和通过步骤5)得到的待测细菌图像叠合，

若所述金纳米颗粒图像与所述待测细菌图像的距离小于或等于距离给定值1，则所述子图像为与所述特异抗体探针结合的所述待测细菌；统计所有子图像的数量，即为所述待测样品中与所述特异抗体结合的所述待测细菌的数量；

若所述金纳米颗粒图像与所述待测细菌图像的距离大于距离给定值1，或所述金纳米颗粒图像中不包含任何非背景像素，则所述子图像为未结合所述特异抗体的所述待测细菌；统计所有子图像数量，即为所述待测样品中未结合所述特异抗体探针的所述待测细菌的数量。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步骤II)中，

步骤2)中，所述亮度阈值给定值的确定，为选取满足高于背景亮度且同时不影响待测细菌的图像的值作为亮度阈值给定值；

步骤3)中，所述给定距离r的确定，是对自动识别的结果进行调整，使单个待测细菌图像被包含至一个子图像中；

步骤4)中，所述色彩比较算法采用CIE Delta E 2000，

所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为所述暗场散射图像中金纳米颗粒的主要颜色作为特征色彩值；

所述给定的色彩容差阈值的确定，是使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上；

步骤5)的D)的步骤c)中，所述距离给定值为待测细菌细胞膜在暗场散射图像中的厚度的一半；

所述计算方法为CIE Delta E 2000色彩差值算法；

所述给定的待测细菌的特征色彩值为所述暗场散射图像中的待测细菌的主要颜色作为特征色彩值；

所述差值给定值1的确定，是使自动识别的结果与金纳米颗粒图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占金纳米颗粒图像像素数量的一半以上；

所述差值给定值2的确定，是使自动识别的结果与细菌图像的形状特征相吻合，且识别结果的像素数量占细菌图像像素数量的一半以上；

步骤5)的E)中，所述如下条件还包括：所述环形的霍夫变换的结果存在峰值，则所述环形的方位角与所述霍夫变换的峰值相吻合；

所述(1)中，所述环形周长给定值与环形轴比给定值均是通过待测细菌的平均尺寸计算；

所述(2)中，所述像素比例给定值大于50％，

步骤6)中，所述连续图形的周长给定值1和所述连续图形的轴比给定值1均通过单个金纳米颗粒的平均尺寸计算。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

步骤II)中，步骤4)中，所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为选取金纳米颗粒图像中占比最大的颜色作为特征色彩值；

步骤5)的D)的步骤c)中，所述给定的待测细菌的特征色彩值为选择细菌图像中占比最大的颜色作为特征色彩值。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

步骤I)中，所述反应为将所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒与所述待测样品混合，所述混合的温度为10℃-40℃，所述混合的时间为10min-60min；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒为将待测细菌特异抗体包被到金纳米颗粒溶胶中，得到包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：。

步骤I)中，所述待测样品为待测细菌的培养液；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒在所述反应液中的终浓度为0.005nmol/L-0.05nmol/L；

所述包被待测细菌特异抗体的金纳米颗粒中所述待测细菌特异抗体和所述金纳米颗粒的配比为1g∶14nmol-6g∶14nmol。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：。

步骤I)中，所述待测细菌的培养液为将所述待测细菌在发酵培养基中培养得到的培养液；

所述待测细菌特异抗体为兔抗大肠杆菌DH5α抗体；

所述待测细菌为大肠杆菌，所述待测细菌具体为DH5α；

步骤II)中，所述暗场散射图像的曝光时间为20ms-100ms；

步骤1)中，所述色彩空间转换中设定的白点值为D65；

步骤2)中，所述亮度阈值给定值为10；

步骤3)中，所述给定距离r为2像素；

步骤4)中，所述给定的金纳米颗粒的特征色彩值为RGB(239，220，152)和RGB(155，133，87)，

所述给定的色彩容差阈值为15；

步骤5)的D)的步骤c)中，所述距离给定值为3像素；

所述给定的待测细菌的特征色彩值选取RGB(37，44，36)；

所述差值给定值1为15；

所述差值给定值2为10；

步骤5)的E)中所述(1)中，所述环形周长为30像素-50像素时，对应的环形轴比给定值为0.4；或所述环形周长为大于或等于50像素时，对应的环形的轴比给定值为0.3；

所述(2)中，所述像素比例给定值为50％-100％；

步骤F)中，所述距离给定值为3；

步骤6)中，所述连续图形的周长给定值1为10像素，所述连续图形的轴比给定值1为0.7；

步骤7)中，所述距离给定值1为0像素或正值。

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