CN104651462A - 基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，所述方法包括：利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。本发明的稻瘟病菌孢子检测方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持，也可为田间自动监测稻瘟病菌提供技术参考。

Description

基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法

技术领域

本发明涉及一种稻瘟病菌孢子检测方法，尤其是一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，属于稻瘟病检测技术领域。

背景技术

选育和种植抗性品种是防控稻瘟病的有效措施，在稻瘟病室内抗性鉴定中，病菌悬浮液中孢子的数量是影响抗性鉴定结果的重要因素，当悬浮液中的孢子数量不符合接种要求时，将会错误地评估水稻品种的抗性等级；此外，稻瘟病的发生及病害的严重程度与一定区域内病菌(分生孢子)的数量密切相关。因此，研究快速、准确的稻瘟病菌孢子检测方法无论对稻瘟病的抗性鉴定还是田间病害监测都具有重要意义。

病菌的常用检测方法有平板菌落计数法、显微镜下人工计数法、比浊法和流式细胞仪测定法等。平板菌落计数法的成本低，但其劳动强度大、检测耗时长；显微镜下人工计数法适用于体积较大菌体的检测，对于个体较小的菌体操作工作量和误差较大；比浊法成本较高，适用于菌体分散良好且干扰少的细菌；流式细胞仪测定法检测速度快，精度高，但设备仪器昂贵。

目前，在植物病菌孢子检测方面，通常是操作人员根据显微镜下病菌孢子的形态特征完成检测和计数，由于显微图像中孢子个体小、数量大、杂质多，利用人工计数方法费时费力，且易造成较大计数误差。因此，为了提高稻瘟病菌孢子检测的准确率和自动化水平，需要研究＝一种简便、准确、高效的孢子检测和计数方法。

虽然显微图像处理技术检测稻瘟病菌的研究未见报道，但是已有一些学者利用显微图像技术检测其他植物病原菌的研究：1)Chesmore等(Chesmore D，Bernard T，InmanA J，et al..Image analysis for the identification of the quarantine pest Tilletia indica[J].EPPO Bulletin，2003，33(3)：495-499.)利用病害图像研究小麦印度腥黑穗病孢子和黑麦草腥黑穗病菌孢子的分类，该研究从病害图像中自动定位孢子，并提取其周长、表面积、突起数及突起的大小、最大(小)半径和圆形度等相关参数作为分类依据；2)张俊祥等(张俊祥，肖茜，方呈祥，等.噬菌斑电子图像的计算机处理及其自动计数[J].中国病毒学，2003，18(4)：387-390.)将噬菌斑制成电子图像，抽取图像中有代表性的区域，利用分水岭算法对图像进行分割处理，将相连的噬菌斑分割成单独的噬菌斑，然后利用区域生长法进行计数；3)张荣标等(张荣标，黄义振，孙晓军，等.基于图像处理的圆褐固氮菌浓度快速检测方法[J].农业机械学报，2012，43(10)：174-178.)通过对圆褐固氮菌微视图像的采集、预处理、分割和特征提取，运用SVM进行识别、分类和计数，获取圆褐固氮菌的浓度，实现了圆褐固氮菌活性的快速检测；4)邓继忠等(邓继忠，李敏，袁之报，等.基于图像识别的小麦腥黑穗病害特征提取与分类[J].农业工程学报，2012(03)：172-176.)利用小麦腥黑穗病害显微图像，采用图像分析与识别技术进行了小麦的矮腥、印度腥及网腥3类病害的分类识别。通过分析，从病害孢子图像的16个形状和纹理特征中，选择长轴、短轴、等价椭圆短轴、周长、面积和熵6个典型特征用于分类，并基于线性核函数建立支持向量机模型，对这3种小麦腥穗病害进行分类鉴定，总体识别率达到82.9％；5)李小龙等(李小龙，马占鸿，孙振宇，等.基于图像处理的小麦条锈病菌夏孢子模拟捕捉的自动计数[J].农业工程学报，2013(2)：199-206.)利用孢子捕捉器捕捉小麦条锈病菌夏孢子，运用显微镜照相技术获得孢子图像，对图像进行基于最近邻插值法的缩放处理、基于K-means聚类算法的分割处理、形态学操作修饰和分水岭分割等一系列的处理，实现夏孢子的自动计数和标记。

通常稻瘟病菌孢子在显微镜下人工计数时，放大倍数为10×10，此时，孢子中间部位透明，只含有边界信息，而有时边界信息并不清晰，给图像处理带来很大困难。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述现有技术的缺陷，提供了一种基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，该方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持。

本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：

基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，所述方法包括：制备孢子悬浮液；利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。

作为一种实施方案，所述稻瘟病菌孢子图像检测系统包括显微镜、摄像机和计算机，所述计算机中装有NIS-Elements BR图像采集软件，所述摄像机与计算机连接；

所述利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像，具体如下：

用无菌的细口滴管将稀释的孢子悬浮液在载玻片中央滴1小滴，盖上清洁干燥的盖玻片，将载玻片放置在显微镜的载物台上，选用放大倍数为10×10下观察，找到目标区域，调节摄像机安装位置，使图像正确显示在计算机的显示器中，选择与显微镜相适应的场景模式以及设置白平衡，通过计算机的图像采集软件采集稻瘟病菌孢子显微图像。

作为一种实施方案，所述利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，具体包括以下步骤：

1)图像光照校正

1.1)图像分块：将图像I(i，j)进行M×N分块，其中M＝N＝4；

1.2)估算图像背景的灰度：计算每个图像块的像素灰度均值μ和标准差σ，然后以max(min，μ-3σ)作为该区域的背景灰度；其中min为该区域像素的最小灰度值；

1.3)图像光照不均匀校正：从原始图像中减去步骤2)计算出的背景灰度图像，以校正光照不均匀；

2)中值滤波

采用3×3型滤波模板对光照校正后图像进行中值滤波处理；

3)边缘检测

采用Canny算子进行图像边缘检测，包括：3.1)用高斯滤波器平滑图像；3.2)利用一阶偏导的有限差分来计算梯度的幅值和方向，得到梯度图像；3.3)对梯度幅值进行非极大值抑制；3.4)用双阈值算法检测并且连接边缘；

4)形态学运算

根据孢子形态特征，采用8×8的圆盘结构元素对边缘检测后的二值图像进行形态学闭运算，孢子内外环空洞均被填充，形成一个封闭的孢子区域；然后采用8×8的圆盘结构元素进行形态学开运算，去除图像中目标物上比结构元素小的突刺和无用边界，切断细长搭接而起到分离作用。

作为一种实施方案，所述梯度图像的阈值通过模糊C均值算法确定，并作为Canny边缘检测的高阈值，包括以下步骤：

a、将二维空间的梯度图像矩阵转化为一维空间进行处理，将样本分为两类，即孢子与背景，设定聚类预定数目c＝2；

b、将梯度图像的灰度值随机分为两类，计算每类的重心，将这些重心作为每类的初始聚类中心，用伪随机数生成法产生隶属度初始矩阵值，μ_j(x_i)是第i个样本对于第j类的隶属度函数，聚类损失函数定义为：

$J_f=\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^b{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2---\left(1\right)$

其中，A、B分别为图像的长度和宽度；m_j为聚类中心；b是控制聚类结果的模糊程度常数，设定b＝2；

$\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=1(i=\mathrm{1,2}...,A\×B)---\left(2\right)$

在式(2)的等式条件下求式(1)的极小值，令J_f对m_j和μ_j(x_i)的偏导数为0，得到：

$m_j=\frac{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^2{x}_i}{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}(j=\mathrm{1,2})---\left(3\right)$

${\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=\frac{(1/{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2)}{\underset{k=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}(1/{\left|\right|x_i-m_k\left|\right|}^2)}---\left(4\right)$

c、用当前的聚类中心根据式(4)计算隶属度函数，用当前的隶属度函数按式(3)更新计算各类聚类中心，当损失函数的数值不再发生变化时，就得到了孢子和背景的正确聚类中心和各个像素点的隶属度函数；比较各个像素所属的类别是孢子或者是背景，找到属于孢子类像素的最大灰度值和属于背景的最小灰度值，将两个数值加和后平均，就得到梯度图像的分割阀值，即Canny边缘检测的高阈值t_h1，其中t_h2＝0.4t_h1，δ＝3。

作为一种实施方案，所述形状特征参数包括椭圆度、复杂度和目标物最小外接矩形宽度，利用椭圆度、复杂度和目标物最小外接矩形宽度提取出只含孢子的二值图像，所述椭圆度其中，A为目标物面积，a、b分别为椭圆的长半轴和短半轴长度；所述复杂度其中，A和P分别表示目标物的面积和周长。

作为一种实施方案，所述采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，具体如下：

首先利用距离变换将只含孢子的二值图像转化为灰度图像，然后通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，使得每个孢子内部形成一个局部极小值，最后应用分水岭算法对粘连孢子进行分离。

作为一种实施方案，所述通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，具体为：选用大小为11×11模板的高斯滤波器，其高斯分布参数δ＝20，对距离变换后的图像进行平滑，对相邻近的局部极小值进行平滑合并。

本发明相对于现有技术具有如下的有益效果：

1、本发明的稻瘟病菌孢子检测方法提出了背景分块提取法校正显微图像光照不均匀的问题，解决了不均匀的光照会在检测到的图像中产生背景噪声而影响图像的检测精度和分析结果的问题。

2、本发明的稻瘟病菌孢子检测方法通过自适应FCM-Canny边缘检测、形态学闭开运算等图像处理方法对孢子图像进行处理，同时根据孢子和主要杂质的形态特征，综合复杂度、椭圆度、最小外接矩形宽度等形状特征参数，提取出只含孢子的图像(粘连孢子和非粘连的单个孢子)。

3、本发明的稻瘟病菌孢子检测方法提出了一种改进分水岭算法(DT-GF-WA方法)用来分离粘连孢子，并进行孢子数量统计：首先距离变换方法将只含孢子的二值图像转化为灰度图像，然后通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，使得每个孢子内部形成一个局部极小值，解决了传统距离变换后直接应用分水岭算法容易导致错误过分割的问题，最后应用分水岭算法对粘连孢子进行分离对粘连孢子进行有效分割。

4、本发明的稻瘟病菌孢子检测方法通过试验结果表明，在测试的100幅孢子显微图像中，每幅图像的孢子数目范围为20～70个，孢子检测的平均准确率为98.5％，能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持，也可为田间自动监测稻瘟病菌提供技术参考。

附图说明

图1为本发明实施例1的稻瘟病菌孢子检测方法流程示意图。

图2为本发明实施例1的稻瘟病菌孢子图像检测系统结构示意图。

图3为本发明实施例1的稻瘟病菌孢子灰度图像显示图。

图4为本发明实施例1在光照校正后的图像显示图。

图5a为传统的Otsu-Canny边缘检测结果图。

图5b为本发明实施例1提出的FCM-Canny边缘检测结果图。

图6a～图6d为本发明实施例1在FCM-Canny边缘检测后的局部图像显示图。

图7a～图7d为本发明实施例1进行形态学闭运算结果图。

图8a～图8d为本发明实施例1进行形态学开运算结果图。

图9a～图9d为本发明实施例1在特征提取后孢子二值图像显示图。

图10a～图10d为传统的距离变换后直接应用分水岭算法对粘连孢子的分割结果图。

图11a～图11d为本发明实施例1提出的改进分水岭算法对粘连孢子的分割结果图。

具体实施方式

实施例1：

如图1所示，本实施例的稻瘟病菌孢子检测方法，包括以下步骤：

一、制备孢子悬浮液

获取多个单孢分离培养菌株(来自广东籼稻品种)，单孢分离培养菌株在含酵母淀粉培养基试管里培养7～10d后，转接到玉米粒培养基上扩大培养10～13d，待菌丝长满玉米粒，用无菌水洗去玉米粒表面的菌丝，将玉米粒置于消毒的搪瓷盘(尺寸为25×19×2cm)中，在搪瓷盘上面覆盖1层湿纱布，在日光灯下光照培养3～4d；用无菌水洗下附在玉米粒上的孢子，用2层细纱网滤去玉米残渣；然后用水稀释，制备不同浓度的孢子悬浮液。

二、获取孢子显微图像

孢子悬浮液中的孢子显微图像利用稻瘟病菌孢子图像检测系统进行获取，所述稻瘟病菌孢子图像检测系统如图2所示，包括计算机1、显微镜(Eclipse 80i，Nikon，Japan)3和摄像机4，所述计算机1中装有NIS-Elements BR图像采集软件2，所述摄像机和显微镜分别与计算机连接；孢子显微图像的获取过程如下：

用无菌的细口滴管将稀释的孢子悬浮液在载玻片中央滴1小滴，盖上清洁干燥的盖玻片，将载玻片放置在显微镜的载物台上，选用放大倍数为10×10下观察，找到目标区域，调节摄像机安装位置，使图像正确显示在计算机的显示器中，选择与显微镜相适应的场景模式以及设置白平衡，调节白平衡的方法是在捕获标本切片透明区域图像的同时，按White Balance(WB)按钮，然后通过计算机的图像采集软件采集稻瘟病菌孢子显微图像。在显微镜下，分别对制作的40片稻瘟病菌孢子临时玻片进行图像采集，每片随机选取3个视野，共获得120幅显微图像样本，其中20幅用于孢子特征统计，其余100幅图像用于结果测试，每幅图像孢子数目范围为20～70个，图像分辨率为150dpi，bmp格式，24位图，RGB颜色空间模式，由于显微图像中孢子与背景无颜色特征差异，因此将RGB图像其转化为灰度图像处理，如图3所示，孢子显微图像中含有孢子(单个孢子和粘连孢子)、菌丝、随机噪声、椒盐噪声和杂质等，在图3中，1为随机噪声，2为杂质，3为单个孢子，4为粘连孢子，5为菌丝，6为椒盐噪声。

三、对孢子显微图像进行处理

对孢子显微图像进行处理包括图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算，具体如下：

1)图像光照校正

在显微图像产生过程中，常出现光源在景物上照射不均匀的现象，至使光照强的部分较亮，光照弱的部分较暗；另一方面，在图像生成和传输的过程中，经常会引起脉冲噪声，从而导致图像呈现出随机分布的黑白相间的噪声点，光照不均匀所产生的噪声会和图像中的有用信号混合在一起，影响图像分割的准确率。

本实施例采用分块背景提取法对图像进行光照校正，在进行背景提取时，通常选取区域最小值来实现，然而对于本实施例中的显微图像而言，其区域中的最小值往往为噪声污染点，其亮度并不能代表背景亮度。因此，本实施例的计算区域中像素亮度的均值和标准差，然后根据其统计值进行背景灰度计算，这样有利于排除噪声点的干扰，具体包括以下步骤：

1.1)图像分块：将图像I(i，j)进行M×N分块，其中M＝N＝4；

1.2)估算图像背景的灰度：计算每个图像块的像素灰度均值μ和标准差σ，然后以max(min，μ-3σ)作为该区域的背景灰度；其中min为该区域像素的最小灰度值；

1.3)图像光照不均匀校正：从原始图像中减去步骤2)计算出的背景灰度图像，以校正光照不均匀；

用以上方法进行光照校正的图像如图4所示，由于原始图像减去了不均匀的背景图像致使校正后的图像整体偏暗，但是却有效地改善了图像亮度的不均匀，有利于后续的图像处理。

2)中值滤波

采用3×3型滤波模板对光照校正后图像进行中值滤波处理，消除了部分椒盐噪声，同时对菌丝也有较好的平滑作用；

3)边缘检测

采用Canny算子进行图像边缘检测，包括：3.1)用高斯滤波器平滑图像；3.2)利用一阶偏导的有限差分来计算梯度的幅值和方向，得到梯度图像；3.3)对梯度幅值进行非极大值抑制；3.4)用双阈值算法检测并且连接边缘；

Canny算子的性能主要是由3个参数决定的，即高斯滤波分布参数δ，以及跟踪过程中所需要的两个阈值t_h1，t_h2；增加δ可以降低检测过程中对噪声的敏感性，但如果过大，将会丢失图像的某些细节信息，使目标边缘变得模糊；高阈值t_h1控制着梯度图中作边缘检测的起始点的性质，其值越小，保留的边缘信息越多，但混杂的噪声也就越多；随着t_h1的增加，可以抑制噪声，然而有可能丢失边缘信息；低阈值t_h2控制着检测中终止点的性质，其值越小，保留的边缘信息越多，边缘越连续；随着t_h2的增加，边缘特征减少，边缘可能断裂。传统的Canny边缘检测参数的选取通常是根据经验获得。

关于Canny边缘检测阈值的自动选取多采用Otsu方法(最大类间方差法)在梯度图像上获得，然而在本实施例中，孢子的梯度图像直方图并未呈现明显的双峰特性，因此，梯度图像的阈值通过模糊C均值(fuzzy c-means algorithm，FCM)算法确定，并作为Canny边缘检测的高阈值，包括以下步骤：

a、将二维空间的梯度图像矩阵转化为一维空间进行处理，将样本分为两类，即孢子与背景，因此，设定聚类预定数目c＝2；

b、将梯度图像的灰度值随机分为两类，计算每类的重心，将这些重心作为每类的初始聚类中心，用伪随机数生成法产生隶属度初始矩阵值，μ_j(x_i)是第i个样本对于第j类的隶属度函数，聚类损失函数定义为：

$J_f=\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^b{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2---\left(1\right)$

其中，A、B分别为图像的长度和宽度；m_j为聚类中心；b是控制聚类结果的模糊程度常数，设定b＝2；模糊C均值方法要求一个样本对各个聚类的隶属度之和为1；

$\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=1(i=\mathrm{1,2}...,A\×B)---\left(2\right)$

在式(2)的等式条件下求式(1)的极小值，令J_f对m_j和μ_j(x_i)的偏导数为0，得到：

$m_j=\frac{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^2{x}_i}{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}(j=\mathrm{1,2})---\left(3\right)$

${\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=\frac{(1/{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2)}{\underset{k=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}(1/{\left|\right|x_i-m_k\left|\right|}^2)}---\left(4\right)$

c、用当前的聚类中心根据式(4)计算隶属度函数，用当前的隶属度函数按式(3)更新计算各类聚类中心，当损失函数的数值不再发生变化时，就得到了孢子和背景的正确聚类中心和各个像素点的隶属度函数；比较各个像素所属的类别是孢子或者是背景，找到属于孢子类像素的最大灰度值和属于背景的最小灰度值，将两个数值加和后平均，就得到梯度图像的分割阀值，即Canny边缘检测的高阈值t_h1，其中t_h2＝0.4t_h1，δ＝3。应用Otsu方法和本实施例提出的FCM方法自动确定阈值后对图4同一部位Canny边缘检测结果对比如图5a和图5b所示，可以看出应用FCM-Canny边缘检测后，菌丝和部分杂质被有效滤除，便于图像的后续分析。

为说明问题，选取了部分经FCM-Canny边缘检测后的局部图像放大显示，如图6a～图6d所示，边缘检测后图像中的部分菌丝、杂质和随机噪声被有效滤除，由于孢子边缘有一定宽度，因此经边缘检测后形成内外两个边缘，而菌丝和杂质则一般只有一个边缘。

4)形态学运算

根据孢子形态特征，采用8×8的圆盘结构元素对边缘检测后的二值图像(图6a～图6d)进行形态学闭运算，结果如图7a～图7d所示，可以看出，经过闭运算后，图6a～图6d的孢子内外环空洞均被填充，形成一个封闭的孢子区域；部分噪声点和细长菌丝的边界宽度小，因此也被填充并形成封闭区域。

而对于边界宽度较大的菌丝和噪声，所选圆盘结构元素大小不足以将其填充，即依然形成一段边界，采用8×8的圆盘结构元素进行形态学开运算，去除图像中目标物上比结构元素小的突刺和无用边界，切断细长搭接而起到分离作用，如图8a～图8d所示。

四、提取出只含孢子的显微图像

由于单个孢子在形状上呈洋梨形或倒棍棒形，近似椭圆，因此，可以使用形状特征椭圆度进行描述。椭圆度(E)表示的是目标区域接近椭圆形状的程度，在孢子显微图像中，单个孢子呈椭圆状，椭圆度是用来识别单个孢子的重要参数，椭圆度的计算如下式：

$E=\frac{A}{\mathrm{\πab}}---\left(5\right)$

其中，A为目标物面积，a、b分别为椭圆的长半轴和短半轴长度；

复杂度(C)在一定程度上描述了物体的紧凑性，如果复杂度过大，则说明该目标是菌丝体或者是其他杂质，复杂度的计算如下式：

$C=\frac{P^2}{4\mathrm{\πA}}---\left(6\right)$

其中，A和P分别表示目标物的面积和周长。

对于本实施例中显微图像中的杂质而言，主要包括形状复杂的菌丝(选取形状特征复杂度进行去除)，圆形杂质(选取形状特征椭圆度去除)和细长形杂质(选取形状特征目标物最小外接矩形宽度W进行去除)。因此，本实施例综合采用复杂度、椭圆度与目标物最小外接矩形宽度3个形状特征对孢子特征进行描述与提取。

在20幅孢子显微图像样本中选取30个单个孢子、30个粘连孢子和50个杂质，对椭圆度E、复杂度C、最小外接矩形宽度W进行统计，确定参数范围组合为0.85＜E＜1.33、C＜2.1、W＞20。保留同时满足上述条件的前景目标，对不能同时满足上述条件的前景目标，将其像素值全部置为0。图9a～图9d为特征提取后孢子二值图像显示图，与图6a～图6d对比可知，图6a～图6d中杂质已被完全去除，图9a～图9d中只保留了孢子(粘连孢子和单个孢子)。

五、对图像中的粘连孢子进行分离

经特征提取后，图像中只含孢子，但通常这些孢子中会存在相互粘连的情况，而且以两个孢子相互粘连最为常见，3个以上孢子相互粘连的情况则相对较少。当稻瘟病菌悬浮液中孢子数量越多，获取的孢子图像中孢子间越容易粘连，给分割带来很大困难，如果粘连的孢子没被分离，它将被当作一个目标处理，使得计数结果小于实际结果。因此，要对显微图像孢子进行准确计数，必须分离粘连孢子，以便逐个标记并统计数目。

本实施例提出改进分水岭算法对图像中粘连孢子进行分离：首先利用距离变换(Distance Transformation，DT)将只含孢子的二值图像转化为灰度图像，然后通过高斯滤波(Gaussian Filtering，GF)对孢子图像边缘进行平滑，使得每个孢子内部形成一个局部极小值，最后应用分水岭算法(Watershed Algorithm，WA)对粘连孢子进行分离；其中，通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，具体为：选用大小为11×11模板的高斯滤波器，其高斯分布参数δ＝20，对距离变换后的图像进行平滑，对相邻近的局部极小值进行平滑合并。

图10a～10d为距离变换后直接应用分水岭算法的分割结果图(DT-WA)，尽管在粘连线处分割正确，但由于距离变换后在一些孢子内部产生多个局部极小值，即在非粘连孢子中也出现了分割线，导致了错误的过分割。图11a～11d为运用本实施例提出的改进分水岭算法(DT-GF-WA方法)对粘连孢子分割结果，经过距离变换和高斯滤波处理后的图像在每个孢子处只有一个局部极小值。这样就不会出现虚假的分割线，从而消除过分割。经过比较可以看出改进的分水岭算法不仅成功分割了粘连孢子，并且解决了粘连孢子的过分割问题，从而实现粘连孢子的准确分离。

六、实现孢子的检测和数量统计

采用本实施例提出的孢子检测方法对100幅稻瘟病菌孢子显微图像进行测试，然后与显微镜下人工识别和计数结果进行对照(每幅图像由一人识别和计数，另一人复核)，测试自动检测和计数的准确率。由人工统计的第i幅图像的孢子数为N_i，由计算机正确检测的第i幅图像孢子数为M_i，准确率定义为：

${\∂}_i=\frac{M_i}{N_i}\×100\%,i=\mathrm{1,2},...,100---\left(7\right)$

平均准确率定义为：

${\∂}_p=\frac{{\∂}_1+{\∂}_2+...{\∂}_i+...{\∂}_n}{n},n=100---\left(8\right)$

孢子检测与计数结果如下表1所示：

表1孢子检测与计数结果表

在测试的100幅孢子显微图像中，每幅图像中的孢子数目范围为20～70个，孢子的正确检测率在87.5％～100％之间，检测的平均准确率为98.5％；其中检测准确率为100％的图像有76幅，检测准确率为90～100％的图像有19幅，检测准确率为80～90％的图像有5幅。

分析影响分类精度原因主要由于部分杂质的形态与孢子相似，在孢子特征提取时容易将这类杂质错误地判定为孢子，影响识别精度；当粘连孢子的接触线长度超过单个孢子的宽度时，容易造成局部极小值点间的距离小于结构元素的长度，那么两个孢子会被分割成一个孢子，引起漏分割现象。

综上所述，本发明的稻瘟病菌孢子检测方法能实现稻瘟病菌孢子数量的快速、准确的自动检测，可为稻瘟病室内抗性鉴定过程提供技术支持。

以上所述，仅为本发明专利较佳的实施例，但本发明专利的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明专利所公开的范围内，根据本发明专利的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都属于本发明专利的保护范围。

Claims (7)

1.基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于所述方法包括：利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像；然后利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，并结合形状特征参数，提取出只含孢子的显微图像；最后采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，进而实现显微图像中孢子的检测和数量统计。

2.根据权利要求1所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述稻瘟病菌孢子图像检测系统包括计算机、显微镜和摄像机，所述计算机中装有NIS-Elements BR图像采集软件，所述摄像机与计算机连接；

所述利用稻瘟病菌孢子图像检测系统获取孢子悬浮液中的孢子显微图像，具体如下：

用无菌的细口滴管将稀释的孢子悬浮液在载玻片中央滴1小滴，盖上清洁干燥的盖玻片，将载玻片放置在显微镜的载物台上，选用放大倍数为10×10下观察，找到目标区域，调节摄像机安装位置，使图像正确显示在计算机的显示器中，选择与显微镜相适应的场景模式以及设置白平衡，通过计算机的图像采集软件采集稻瘟病菌孢子显微图像。

3.根据权利要求1所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述利用图像光照校正、中值滤波、边缘检测、形态学运算对孢子显微图像进行处理，具体包括以下步骤：

1)图像光照校正

1.1)图像分块：将图像I(i，j)进行M×N分块，其中M＝N＝4；

1.2)估算图像背景的灰度：计算每个图像块的像素灰度均值μ和标准差σ，然后以max(min，μ-3σ)作为该区域的背景灰度；其中min为该区域像素的最小灰度值；

1.3)图像光照不均匀校正：从原始图像中减去步骤1.2)计算出的背景灰度图像，以校正光照不均匀；

2)中值滤波

采用3×3型滤波模板对光照校正后图像进行中值滤波处理；

3)边缘检测

采用Canny算子进行图像边缘检测，包括：3.1)用高斯滤波器平滑图像；3.2)利用一阶偏导的有限差分来计算梯度的幅值和方向，得到梯度图像；3.3)对梯度幅值进行非极大值抑制；3.4)用双阈值算法检测并且连接边缘；

4)形态学运算

根据孢子形态特征，采用8×8的圆盘结构元素对边缘检测后的二值图像进行形态学闭运算，孢子内外环空洞均被填充，形成一个封闭的孢子区域；然后采用8×8的圆盘结构元素进行形态学开运算，去除图像中目标物上比结构元素小的突刺和无用边界，切断细长搭接而起到分离作用。

4.根据权利要求3所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述梯度图像的阈值通过模糊C均值算法确定，并作为Canny边缘检测的高阈值，包括以下步骤：

a、将二维空间的梯度图像矩阵转化为一维空间进行处理，将样本分为两类，即孢子与背景，设定聚类预定数目c＝2；

b、将梯度图像的灰度值随机分为两类，计算每类的重心，将这些重心作为每类的初始聚类中心，用伪随机数生成法产生隶属度初始矩阵值，μ_j(x_i)是第i个样本对于第j类的隶属度函数，聚类损失函数定义为：

$J_f=\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^b{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2---\left(1\right)$

其中，A、B分别为图像的长度和宽度；m_j为聚类中心；b是控制聚类结果的模糊程度常数，设定b＝2；

$\underset{j=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=1(i=\mathrm{1,2}...,A\×B)---\left(2\right)$

在式(2)的等式条件下求式(1)的极小值，令J_f对m_j和μ_j(x_i)的偏导数为0，得到：

$m_j=\frac{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}{\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}^2{x}_i}{\underset{i=1}{\overset{A\×B}{\mathrm{\Σ}}}\left[{\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)\right]}(j=\mathrm{1,2})---\left(3\right)$

${\mathrm{\μ}}_j\left(x_i\right)=\frac{(1/{\left|\right|x_i-m_j\left|\right|}^2)}{\underset{k=1}{\overset{2}{\mathrm{\Σ}}}(1/{\left|\right|x_i-m_k\left|\right|}^2)}---\left(4\right)$

c、用当前的聚类中心根据式(4)计算隶属度函数，用当前的隶属度函数按式(3)更新计算各类聚类中心，当损失函数的数值不再发生变化时，就得到了孢子和背景的正确聚类中心和各个像素点的隶属度函数；比较各个像素所属的类别是孢子或者是背景，找到属于孢子类像素的最大灰度值和属于背景的最小灰度值，将两个数值加和后平均，就得到梯度图像的分割阀值，即Canny边缘检测的高阈值t_h1，其中t_h2＝0.4t_h1，δ＝3。

5.根据权利要求3所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述形状特征参数包括椭圆度、复杂度和目标物最小外接矩形宽度，利用椭圆度、复杂度和目标物最小外接矩形宽度提取出只含孢子的二值图像，所述椭圆度其中，A为目标物面积，a、b分别为椭圆的长半轴和短半轴长度；所述复杂度其中，A和P分别表示目标物的面积和周长。

6.根据权利要求5所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述采用改进分水岭算法对粘连孢子进行分离，具体如下：

首先利用距离变换将只含孢子的二值图像转化为灰度图像，然后通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，使得每个孢子内部形成一个局部极小值，最后应用分水岭算法对粘连孢子进行分离。

7.根据权利要求6所述的基于显微图像分析的稻瘟病菌孢子检测方法，其特征在于：所述通过高斯滤波对孢子图像边缘进行平滑，具体为：选用大小为11×11模板的高斯滤波器，其高斯分布参数δ＝20，对距离变换后的图像进行平滑，对相邻近的局部极小值进行平滑合并。