CN107644210A - 基于图像处理的微生物数量估算方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于数字图像处理领域的应用，具体地说是针对显微镜下拍摄的细菌培养皿图像采用一定的处理步骤，使得处理后的二值图像中的像素数可用于估算培养皿内的细菌数量的基于图像处理的微生物数量估算方法，基于图像的二值化处理，提出了一种全新的微生物数量测定方法，此方法不需要对细菌本身进行实验，而是对显微镜下拍摄的培养皿图像进行处理，属于一种间接测定微生物数量的方法，本发明中应用非局部均值(NL‑means)去噪算法，对于同一培养皿的不同时间拍摄的细菌图像的统计结果比较稳定，不因细菌位置的改变而产生较大误差，适应性较强。
Description
技术领域：
本发明属于数字图像处理领域的应用，具体地说是针对显微镜下拍摄的细菌培养皿图像采用一定的处理步骤，使得处理后的二值图像中的像素数可用于估算培养皿内的细菌数量的基于图像处理的微生物数量估算方法。
背景技术：
目前常用的测定微生物数量的方法有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、测定细胞重量法、测定细胞总氮量或总碳量等。
显微镜直接计数法是取一定体积的样品细胞悬液置于计数器的计数室内，用显微镜观察计数的一种快速、直观的方法，常用计数器有血球计数板、Petroff Hausser计菌器和Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数。但是，这种方法需要人工进行计数。
平板菌落计数法根据每个活的细菌能长出一个菌落的原理，将待测样品经适当稀释之后，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成一个单菌落。统计菌落数，即可换算出样品中的含菌数。该方法被广泛用于生物制品、食品、饮料和水的含菌指数的检测。但是此方法操作较繁琐，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，
光电比浊法由菌悬液的透光量间接测定细菌的数量。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，因此可以用样品液所测得的光密度得到样品菌液浓度。此法简便快捷，但是光密度受到多种因素的影响，且颜色太深的样品或其他具有吸光值的物质不能用此法测定。
测定细胞重量法分为湿重法和干重法。湿重法系单位体积培养物经离心后将湿菌体进行称重；干重法系单位体积培养物经离心后，以清水洗净放人干燥器加热烘干，使之失去水分然后称重。此法是测定丝状真菌生长量的一种常用方法，适用于含菌量高、不含或少含非菌颗粒性杂质的环境或培养条件。
测定细胞总氮量或总碳量的方法，是基于氮、碳是细胞的主要成分，含量较稳定，因此测定氮、碳的含量可以推知细胞的质量。此法适用于固体或液体条件下细胞浓度较高的样品，但是操作程序较复杂。
可见，现有的微生物数量测定方法操作都比较繁琐，需要使用生物学实验的方法进行测定，且因为有相当数量的步骤需要人工操作，若测定有害细菌数量则对于实验者具有一定的潜在危险。另外，每种方法对于所测定微生物都有着特殊的要求，难以用计算机快速实现。
发明内容：
本发明的目的是针对细菌培养皿的照片进行二值化处理，将细菌主体与培养液背景进行分离，准确地将细菌主体转化为处理后二值图像中白色部分，然后计算所有细菌总像素数和单个细菌平均像素数，最后估算出培养皿中细菌的数量。
本发明基于图像的二值化处理，提出了一种全新的微生物数量测定方法。此方法不需要对细菌本身进行实验，而是对显微镜下拍摄的培养皿图像进行处理，属于一种间接测定微生物数量的方法。本发明基于四条假设：(1)拍摄的培养皿图像是清晰、完整的，拍摄角度是从上往下的，没有过多的倾斜；(2)培养皿轮廓是圆形的；(3)培养皿较浅，图像中细菌基本上是平铺的，重叠部分较少；(4)细菌与培养液有颜色对比，即细菌不是透明的。基于以上四条假设，将培养皿图像经过去噪、去除背景处理，通过三角形法确定阈值后进行二值化，获得了清晰的二值图像，准确地对细菌主体进行了提取，即二值图像中白色部分为细菌，黑色部分为背景。然后统计二值图像中白色像素，除以由细菌样本求得的平均单个细菌像素数，即可得到培养皿中细菌数量的估计值。
本发明采用的技术方案如下：
一种基于图像处理的微生物数量估算方法，其特征在于包括以下各步骤：
第一步：读取原始图像I，进行灰度化处理得到灰度图像I0；
第二步：去除图像中培养皿边缘外的部分：找到培养皿轮廓圆的半径和圆心，将边缘轮廓部分灰度置0，设处理后图像为I1；
第三步：用非局部均值滤波算法对I1进行去噪处理，设去噪后的图像为I2。其具体步骤为：
(1)假设当前被处理的像素点为i，设Ωi为以像素i为中心的搜索窗口，大小为D×D。设搜索区域中某像素为j，Ni、Nj分别表示以i、j为中心的邻域窗口，大小为d×d。由邻域Ni内像素的灰度值构成的向量表示为
(2)用和之间的相似性来度量i和j的相似性：根据公式(1)计算两邻域窗口之间的高斯加权欧式距离：
其中Ga表示标准差为a的高斯核，表示矩阵对应元素相乘。和越相似，则L2越小，用高斯核加权的目的是使邻域中距离中心像素越远的像素造成的影响越小；
(3)利用公式(2)计算描述像素i、j相似度的权值w(i,j)：
其中，
Z(i)为权值的归一化系数，而h为图像的平滑参数。参数h控制高斯函数的衰减程度来控制权值的大小，从而控制平滑噪声的程度，h越小，高斯函数变化越显著，细节保留程度比较高，但会残留过多的噪声点；h越大，高斯函数变化越平缓，去噪水平越高，但同时也会导致图像越模糊。
(4)基于相似性的度量，利用公式(4)得到像素i的估计值
第四步：去除背景，以消除光照不均匀对图像造成的影响，具体步骤为：
(1)背景估计：对于I2中的像素i，选取其w×w的邻域内亮度最高的48个点，在这48个点中去除最亮的点，将剩余47个点的灰度平均值作为像素i处的背景值，设估计出的背景图像为Ib；
(2)分段对比度补偿及背景亮度规范化：设F＝255为规范化背景的亮度，
逐行逐列扫描I2图像；若Ib(x,y)＞I2(x,y)，则按公式(5)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F-k*[Ib(x,y)-I2(x,y)] (5)
若按公式(5)计算出的I3(x,y)≥0.75F则直接输出I3(x,y)，否则按公式(6)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝0.75F (6)
若Ib(x,y)≤I2(x,y)，则按公式(7)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F (7)
其中，k(x,y)的物理意义是背景与物体对比度放大的倍数。它是一个连续分段的线性函数，根据公式(8)计算k(x,y)：
其中A1、A2、A3、B1、B2为待定系数，应根据具体图像补偿效果进行选取，另外，设置前景像素的最小灰度值为0.75F是为了使前景像素的灰度值相差很小。
第五步：对去除背景后的图像I3进行二值化处理，设二值化后的图像为I4。具体步骤为：
(1)用三角形法确定对I3进行二值化的阈值：I3灰度直方图为单峰，意味着前景和背景的分界并不是很清晰，此时的二值化阈值可由三角形法确定。在拍摄的培养皿图像中，细菌属于前景部分，具有较低的灰度值，且前景的像素点少于背景的像素点。此时认为直方图主要的峰对应背景灰度值。找到直方图的第一个非零点，和峰值点连成一条直线，亮点范围内的灰度分布曲线上距离这条直线最远的点对应的灰度值除以255即为二值化的阈值。
(2)应用上一步骤中确定的阈值对图像I3进行二值化：灰度高于阈值的被置为1，灰度低于阈值的被置为0，即
第六步：对二值图像进行形态学滤波。由于图像中细菌部分有很多孔洞、较窄的间断和细长的沟壑，同时背景部分还有很多细小的孤立点噪声，为了尽量保持细菌部分完整并消除噪声，对图像I4进行先闭运算后开运算的操作，具体步骤为：
(1)对二值化后图像I4求反；
I5＝～I4 (9)
(2)选择尺寸为5的圆盘结构元se1进行多次闭运算；
I6＝imclose(I5,se1) (10)
(3)选择尺寸为2的圆盘结构元se2进行多次开运算；
I7＝imopen(I6,se2) (11)
第七步：将图像边缘外部分进一步去除；
第八步：选取10个有代表性的细菌图像样本A1～A10，根据公式(12)～(15)分别计算其所占像素数后求平均像素数average，再统计整幅图像中所有细菌所占像素数total，除以每个细菌平均像素数，最终得到原图像中的细菌总数n。
本发明优点在于：
1、使用二值图像中白色像素数统计细菌个数，提出了一种全新的间接统计显微镜下微生物数量的思路，易于计算机实现，相比于传统的微生物计数方法，大大减轻了人工负担和排除了潜在的危险；
2、本发明中引入的去除边缘措施可使拍摄的含容器外缘的照片无需经过局部放大的预处理就可以直接进行统计；
3、本发明中应用非局部均值(NL-means)去噪算法，对于保留细菌主体、去除培养液中的杂质噪声有着很好的效果；
4、基于自适应的背景估计和局部对比度补偿的去背景处理算法，可以较精确地提取出细菌主体，对于拍摄设备的对比度、拍摄时的光照条件没有很高的要求；
5、本发明提出的方法对于同一培养皿的不同时间拍摄的细菌图像的统计结果比较稳定，不因细菌位置的改变而产生较大误差，适应性较强。
附图说明
图1为本发明的完整流程图；
图2为去背景处理中局部对比度补偿算法的流程图；
图3-1至图3-4为显微镜下拍摄的4幅细菌培养皿原图像；
图4-1至图4-4为三角形法确定二值化阈值的操作示意图；
图5-1至图5-4为本发明处理后的细菌二值图像。
图6为本发明中用于计算平均像素数的10个细菌样本图像。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明做详细说明。
实例1：本实例分别针对不同时间拍摄的2幅同一培养皿照片(图3-1、图3-2)进行细菌统计，具体过程如下所示。
1：读取原始图像I，进行灰度化处理得到灰度图像I0；
2：去除图像中培养皿边缘外的部分：找到培养皿轮廓圆的半径和圆心，将边缘轮廓部分灰度置0，设处理后图像为I1；
3：用非局部均值滤波算法对I1进行去噪处理，设去噪后的图像为I2。其具体步骤为：
(1)假设当前被处理的像素点为i，设Ωi为以像素i为中心的搜索窗口，大小为5×5。设搜索区域中某像素为j，Ni、Nj分别表示以i、j为中心的邻域窗口，大小为2×2。Ni内像素构成的灰度值向量表示为v(Ni)＝{v(i),i∈Ni}；
(2)用v(Ni)和v(Nj)之间的相似性来度量i和j的相似性：根据公式(1)计算两邻域窗口之间的高斯加权欧式距离：
其中Ga表示标准差为2的高斯核，表示矩阵对应元素相乘；
(3)利用公式(2)计算描述像素i、j相似度的权值w(i,j)：
其中，
Z(i)为权值的归一化系数，而h为图像的平滑参数。本实例中取h＝10；
(4)基于相似性的度量，利用公式(4)得到像素i的估计值
4：去除背景，以消除光照不均匀对图像造成的影响，具体步骤为：
(1)背景估计：对于I2中的像素i，选取其31×31的邻域内亮度最高的48个点，在这48个点中去除最亮的点，将剩余47个点的灰度平均值作为像素i处的背景值，设估计出的背景图像为Ib；
(2)分段对比度补偿及背景亮度规范化：设F＝255为规范化背景的亮度，
逐行逐列扫描I2图像；若Ib(x,y)＞I2(x,y)，则按公式(5)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F-k*[Ib(x,y)-I2(x,y)] (5)
若按公式(5)计算出的I3(x,y)≥0.75F则直接输出I3(x,y)，否则按公式(6)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝0.75F (6)
若Ib(x,y)≤I2(x,y)，则按公式(7)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F (7)
其中，k(x,y)的物理意义是背景与物体对比度放大的倍数。它是一个连续分段的线性函数，根据公式(8)计算k(x,y)：
根据补偿效果，本实例中依经验选取A1＝20，A2＝100，A3＝200，B1＝2.5，B2＝1.0。
5：对去除背景后的图像I3进行二值化处理，设二值化后的图像为I4。具体步骤为：
(1)用三角形法确定对I3进行二值化的阈值：找到直方图的第一个非零点，和峰值点连成一条直线，亮点范围内的灰度分布曲线上距离这条直线最远的点对应的灰度值为249，249/255＝0.97647059即为二值化的阈值。
(2)应用上一步骤中确定的阈值对图像I3进行二值化：灰度高于阈值的被置为1，灰度低于阈值的被置为0，即
6：对二值图像进行形态学滤波。对图像I4进行先闭运算后开运算的操作，具体步骤为：
(4)对二值化后图像I4求反；
I5＝～I4 (9)
(5)选择尺寸为5的圆盘结构元se1进行多次闭运算；
I6＝imclose(I5,se1) (10)
(6)选择尺寸为2的圆盘结构元se2进行多次开运算；
I7＝imopen(I6,se2) (11)
7：将图像边缘外部分进一步去除；
8：选取10个有代表性的细菌图像样本A1～A10，根据公式(12)～(15)分别计算其所占像素数后求平均像素数average，再统计整幅图像中所有细菌所占像素数total，除以每个细菌平均像素数，最终得到原图像中的细菌总数n。
图3-1中average＝1.0407×103，n＝127.3431即细菌数量估算值为127。
图3-2中average＝1.0407×103，n＝126.8156即细菌数量估算值为127。
实例2：本实例分别针对不同时间拍摄的2幅同一培养皿照片(图3-3、图3-4)进行细菌统计，具体过程如下所示。
1：读取原始图像I，进行灰度化处理得到灰度图像I0；
2：去除图像中培养皿边缘外的部分：找到培养皿轮廓圆的半径和圆心，将边缘轮廓部分灰度置0，设处理后图像为I1；
3：用非局部均值滤波算法对I1进行去噪处理，设去噪后的图像为I2。其具体步骤为：
(1)假设当前被处理的像素点为i，设Ωi为以像素i为中心的搜索窗口，大小为5×5。设搜索区域中某像素为j，Ni、Nj分别表示以i、j为中心的邻域窗口，大小为2×2。Ni内像素构成的灰度值向量表示为v(Ni)＝{v(i),i∈Ni}；
(2)用v(Ni)和v(Nj)之间的相似性来度量i和j的相似性：根据公式(1)计算两邻域窗口之间的高斯加权欧式距离：
其中Ga表示标准差为2的高斯核，表示矩阵对应元素相乘；
(3)利用公式(2)计算描述像素i、j相似度的权值w(i,j)：
其中，
Z(i)为权值的归一化系数，而h为图像的平滑参数。本实例中取h＝10；
(4)基于相似性的度量，利用公式(4)得到像素i的估计值
4：去除背景，以消除光照不均匀对图像造成的影响，具体步骤为：
(1)背景估计：对于I2中的像素i，选取其31×31的邻域内亮度最高的48个点，在这48个点中去除最亮的点，将剩余47个点的灰度平均值作为像素i处的背景值，设估计出的背景图像为Ib；
(2)分段对比度补偿及背景亮度规范化：设F＝255为规范化背景的亮度，
逐行逐列扫描I2图像；若Ib(x,y)＞I2(x,y)，则按公式(5)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F-k*[Ib(x,y)-I2(x,y)] (5)
若按公式(5)计算出的I3(x,y)≥0.75F则直接输出I3(x,y)，否则按公式(6)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝0.75F (6)
若Ib(x,y)≤I2(x,y)，则按公式(7)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F (7)
其中，k(x,y)的物理意义是背景与物体对比度放大的倍数。它是一个连续分段的线性函数，根据公式(8)计算k(x,y)：
根据补偿效果，本实例中依经验选取A1＝20，A2＝100，A3＝200，B1＝2.5，B2＝1.0。
5：对去除背景后的图像I3进行二值化处理，设二值化后的图像为I4。具体步骤为：
(1)用三角形法确定对I3进行二值化的阈值：找到直方图的第一个非零点，和峰值点连成一条直线，亮点范围内的灰度分布曲线上距离这条直线最远的点对应的灰度值为248，248/255＝0.97254902即为二值化的阈值。
(2)应用上一步骤中确定的阈值对图像I3进行二值化：灰度高于阈值的被置为1，灰度低于阈值的被置为0，即
6：对二值图像进行形态学滤波。对图像I4进行先闭运算后开运算的操作，具体步骤为：
(7)对二值化后图像I4求反；
I5＝～I4 (9)
(8)选择尺寸为5的圆盘结构元se1进行多次闭运算；
I6＝imclose(I5,se1) (10)
(9)选择尺寸为2的圆盘结构元se2进行多次开运算；
I7＝imopen(I6,se2) (11)
7：将图像边缘外部分进一步去除；
8：选取10个有代表性的细菌图像样本A1～A10，根据公式(12)～(15)分别计算其所占像素数后求平均像素数average，再统计整幅图像中所有细菌所占像素数total，除以每个细菌平均像素数，最终得到原图像中的细菌总数n。
图3-3中average＝1.0407×103，n＝112.3042即细菌数量估算值为112。
图3-4中average＝1.0407×103，n＝114.7593即细菌数量估算值为115。
本发明相对于现有技术，具有以下优点：(1)使用二值图像中白色像素数统计细菌个数，提出了一种全新的间接统计显微镜下微生物数量的思路，易于计算机实现，相比于传统的微生物计数方法，大大减轻了人工负担和排除了潜在的危险；(2)本发明中引入的去除边缘措施可使拍摄的含容器外缘的照片无需经过局部放大的预处理就可以直接进行统计；(3)本发明中应用非局部均值(NL-means)去噪算法，对于保留细菌主体、去除培养液中的杂质噪声有着很好的效果；(4)基于自适应的背景估计和局部对比度补偿的去背景处理算法，可以较精确地提取出细菌主体，对于拍摄设备的对比度、拍摄时的光照条件没有很高的要求；(5)本发明提出的方法对于同一培养皿的不同时间拍摄的细菌图像的统计结果比较稳定，不因细菌位置的改变而产生较大误差，适应性较强。
Claims (1)
1.一种基于图像处理的微生物数量估算方法，其特征在于包括以下各步骤：
第一步：读取原始图像I，进行灰度化处理得到灰度图像I0；
第二步：去除图像中培养皿边缘外的部分：找到培养皿轮廓圆的半径和圆心，将边缘轮廓部分灰度置0，设处理后图像为I1；
第三步：用非局部均值滤波算法对I1进行去噪处理，设去噪后的图像为I2，其具体步骤为：
步骤3-1：假设当前被处理的像素点为i，设Ωi为以像素i为中心的搜索窗口，大小为D×D，设搜索区域中某像素为j，Ni、Nj分别表示以i、j为中心的邻域窗口，大小为d×d，由邻域Ni内像素的灰度值构成的向量表示为
步骤3-2：用和之间的相似性来度量i和j的相似性：根据公式(1)计算两邻域窗口之间的高斯加权欧式距离：
其中Ga表示标准差为a的高斯核，表示矩阵对应元素相乘，和越相似，则L2越小，用高斯核加权的目的是使邻域中距离中心像素越远的像素造成的影响越小；
步骤3-3：利用公式(2)计算描述像素i、j相似度的权值w(i,j)：
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其中，
Z(i)为权值的归一化系数，而h为图像的平滑参数，参数h控制高斯函数的衰减程度来控制权值的大小，从而控制平滑噪声的程度，h越小，高斯函数变化越显著，细节保留程度比较高，但会残留过多的噪声点；h越大，高斯函数变化越平缓，去噪水平越高，但同时也会导致图像越模糊；
步骤3-4：基于相似性的度量，利用公式(4)得到像素i的估计值
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第四步：去除背景，以消除光照不均匀对图像造成的影响，具体步骤为：
步骤4-1：背景估计：对于I2中的像素i，选取其w×w的邻域内亮度最高的48个点，在这48个点中去除最亮的点，将剩余47个点的灰度平均值作为像素i处的背景值，设估计出的背景图像为Ib；
步骤4-2：分段对比度补偿及背景亮度规范化：设F＝255为规范化背景的亮度，逐行逐列扫描I2图像；若Ib(x,y)＞I2(x,y)，则按公式(5)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F-k*[Ib(x,y)-I2(x,y)] (5)
若按公式(5)计算出的I3(x,y)≥0.75F则直接输出I3(x,y)，否则按公式(6)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝0.75F (6)
若Ib(x,y)≤I2(x,y)，则按公式(7)计算I3(x,y)：
I3(x,y)＝F (7)
其中，k(x,y)的物理意义是背景与物体对比度放大的倍数，它是一个连续分段的线性函数，根据公式(8)计算k(x,y)：
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其中A1、A2、A3、B1、B2为待定系数，应根据具体图像补偿效果进行选取，另外，设置前景像素的最小灰度值为0.75F是为了使前景像素的灰度值相差很小；
第五步：对去除背景后的图像I3进行二值化处理，设二值化后的图像为I4，具体步骤为：
步骤5-1：用三角形法确定对I3进行二值化的阈值：I3灰度直方图为单峰，意味着前景和背景的分界并不是很清晰，此时的二值化阈值可由三角形法确定，在拍摄的培养皿图像中，细菌属于前景部分，具有较低的灰度值，且前景的像素点少于背景的像素点，此时认为直方图主要的峰对应背景灰度值，找到直方图的第一个非零点，和峰值点连成一条直线，亮点范围内的灰度分布曲线上距离这条直线最远的点对应的灰度值除以255即为二值化的阈值；
步骤5-2：应用上一步骤中确定的阈值对图像I3进行二值化：灰度高于阈值的被置为1，灰度低于阈值的被置为0，即：
第六步：对二值图像进行形态学滤波，由于图像中细菌部分有很多孔洞、较窄的间断和细长的沟壑，同时背景部分还有很多细小的孤立点噪声，为了尽量保持细菌部分完整并消除噪声，对图像I4进行先闭运算后开运算的操作，具体步骤为：
步骤6-1：对二值化后图像I4求反；
I5＝～I4 (9)
步骤6-2：选择尺寸为5的圆盘结构元se1进行多次闭运算；
I6＝imclose(I5,se1) (10)
步骤6-3：选择尺寸为2的圆盘结构元se2进行多次开运算；
I7＝imopen(I6,se2) (11)
第七步：将图像边缘外部分进一步去除；
第八步：选取10个有代表性的细菌图像样本A1～A10，根据公式(12)～(15)分别计算其所占像素数后求平均像素数average，再统计整幅图像中所有细菌所占像素数total，除以每个细菌平均像素数，最终得到原图像中的细菌总数n。
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