CN111368643B - 一种大肠杆菌动态生长监测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种大肠杆菌动态生长监测方法。本发明提供一种将大肠杆菌菌落图像与前时刻图像实现配准的方法，使两幅图像角度一致，得到各菌落的质心位置，进而快速得到培养皿中的菌落数目；可定位到每个菌落，统计各菌落在该生长时刻的大小，颜色信息，根据培养时间计算出生长速度，判断菌落在各个时间节点处于哪一生长阶段，进而得到生长曲线；提供一种使用回归模型根据菌落延迟期时间，对数期内的生长速率两个变量值预测菌液浓度，与传统计数法得到的浓度做对比，筛选出实验过程中的错误样本；基于菌落生长的特征，建立回归模型可较精确的预测大肠杆菌菌液浓度，相比于易受外界环境干扰的传统计数法，本方法更精确，得到的数据可靠性更高。

Description

一种大肠杆菌动态生长监测方法
技术领域
本发明涉及生物医学图像处理领域，主要涉及一种大肠杆菌菌落动态生长监测跟踪预测菌液浓度方法。
背景技术
大肠杆菌菌落分析在食品，生物监测，医疗机构等领域有着基本且重要的作用。在食品卫生质量检测领域，常用来分析样品中所含对人体危害严重的大肠杆菌含量，根据细菌数目的多少可作为食品质量标准可反映出新鲜度和卫生状况。在医疗领域，研究人员可提取病人排泄物样本，根据中样本中相关大肠杆菌数目协助医生快速判断病人的病因以及病人病情的严重程度。
随着科技的发展，数字图像处理技术日趋成熟，应用的领域也愈加广泛，将图像处理技术应用于菌落分析，是目前实现自动化智能化的大趋势，这不仅减少人工操作，一定程度上还提高了处理速度和识别准确率。
常用的菌落分析技术是对培养皿上的菌落进行计数，由计数结果计算菌液浓度，计数结果的准确性取决于粘连菌落分割效果，国内外学者研究了很多粘连菌落分割的算法，比如早些年的周莹莉使用迭代阈值法计算最佳阈值对图像进行阈值分割；陆宗琪利用像素属性找到粘连区域连接线上的像素点实现粘连菌落分割，但缺点是适用范围较窄；以及近几年张立新提出的使用一种改进的水平集算法和极坐标空间下凹点检测结合的分割算法，且该算法还适用于多种菌种混合的样本识别；随着深度学习的广泛应用，也有学者基于神经网络，模糊算法等对图像分割，但这种算法需要对庞大的数据库进行训练，采集样本菌落图像有很大难度。
目前的菌落图像处理多是分析菌落生长过程中的某一静态图像，极少学者研究菌落生长过程中的动态变化，而本发明监测大肠杆菌菌落在生长过程中的生长速度，形态，颜色等特征变化，根据生长特征回归预测菌液浓度，同时在图像采集时同时拍摄菌落部分和标记菌落信息的培养皿盖，在菌落分析的同时对标记信息进行识别，保证了分析结果和标记的关联性。
发明内容
本发明提供一个监测大肠杆菌(DH5α)菌落动态生长，回归预测原菌液浓度的方法，图像采集主要基于一个可自动调节的拍摄装置，同时对培养皿内的菌落和人工标记信息的培养皿盖子进行拍摄，图像传输到上位机系统，根据装置上键入的培养时间对图像进行相应处理。本发明基于大肠杆菌在固体培养基上的生长特征，采用大肠杆菌动态生长的跟踪参数回归与分析的方法，实时跟踪大肠杆菌培养过程中各个生长时期下的菌落参数特征值，通过各状态下的菌落直径，数目变化，颜色矩等特征参数的提取对大肠杆菌的初始浓度进行回归分析，通过减少硬件需求，尽可能降低成本，解决现有技术的操作繁琐，技术难度大的问题，并且在菌落分析的同时对培养皿上人工标记的信息进行识别和检查，确保得到的菌落信息与其对应标记的关联性，多重方法进行计数校准，减少输出结果混乱的问题。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案：一种监测菌落动态生长的方法，本方法基于以下装置：
该装置包括摄像机、置物台、输入面板；所述置物台上下方均设有led灯,用以光照射置物台；置物台四周设有四个方向的可移动挡板，通过电机驱动可移动挡板移动，使得刚好放置培养皿及其盖子；
所述摄像机位于置物台的正上方，用于获取置物台上培养皿及其盖子的图像；摄像机将拍摄到的图像传输到上位机系统；
所述输入面板用于输入培养皿规格与拍照指令，并传送至控制模块；输入培养时间传送至上位机系统用于标记拍摄的图像；
所述控制模块收到拍照指令，控制摄像机进行拍摄；收到培养皿规格数据，控制电机驱动调整可移动挡板距离。
一种监测菌落动态生长的方法包括以下步骤：
步骤(1)、根据装置输入面板上键入的培养皿规格调整可移动挡板，调整完成键入培养时间，将含有菌落的培养皿与标记培养浓度和编号的培养皿盖并排放置在置物台拍照区域进行拍照；图像以jpg格式自动上传到上位机系统。系统对图像进行裁剪，裁剪为菌落培养皿图像和标记图像。
1.1操作者在拍摄装置面板上调整装置属性键入培养皿的规格(直径大小)，系统根据预设的该直径大小对应的培养皿盖的直径大小，自动调整放置待拍摄物体的平台上的四个挡板的距离至正好将培养皿(即菌落培养皿)及标有标记的盖子(即人工标记培养皿盖)并排放置于四个挡板中，培养皿在左，盖子在右，确保动态监测过程中拍摄该批次样本各时刻图像时周围光线，距离摄像头的距离一致，减少外界拍摄环境对系统识别造成的误差。
1.2挡板调整好后，放置培养皿及其盖子，在面板上时间属性键入样本培养时间t(以分钟为单位)，放置待拍摄培养皿及其盖子，摄像机根据输入的拍摄指令开始拍摄，然后将拍摄后的图像以jpg格式实时传输到上位机系统进行处理；
1.3系统根据培养皿和盖子的直径比例对图像进行裁剪，得到待分析的菌落培养皿和待识别的人工标记培养皿盖两部分，分别记为菌落图像、标记图像。
步骤(2)、使用OCR自动识别字符系统提取标记图像中的字符，与训练集中的存储的字符特征进行模式匹配，得到培养皿上标记的信息，如编号，稀释梯度等；根据识别的标记信息对相应菌落图像进行标记序号。
2.1根据以下公式(1)，对步骤1标记图像进行灰度转换，得到灰度图：
Gray(i，j)＝R(i，j)*0.299+G(i，j)*0.587+B(i，j)*0.114   式(1)
其中Gray(i,j)为灰度化后的灰度图像中第i行和第j列的像素点的灰度值，R(i,j)，G(i,j)，B(i,j)分别为原彩色图像的中第i行和第j列的像素点的红色，绿色，蓝色的分量值，0.299，0.587，0.114分别为各像素点三分量的权值。
2.2采用最大外接矩形法从步骤2.1灰度图分割出文字区域，将分割后的文字区域分辨率缩放为128*128，再使用半径为3的圆结构元素进行腐蚀，得到预处理后的标记图像。
2.3根据OCR识别系统和事先训练好的数字特征文件，对步骤2.2所述的预处理后标记图像进行模式匹配，在数字特征文件中寻找与待识别数字特征相似度最高的样本，输出样本值，即可得到人工标记的信息内容。
2.4系统根据识别到的标记信息自动判别之前是否存储过该标记信息，若无，则将对应的菌落图像标记为初始时刻图像，序号为1，初始时刻图像即菌落长到直径约为0.5-1mm时拍摄的菌落图像；若有，则根据该标记信息已存图像数目给菌落图像标记相应序号。
步骤(3)、对步骤(1)菌落图像使用canny算子检测图像边缘，通过hough变换检测圆，存储检测圆里半径最小的圆心位置和半径，根据圆心位置和半径去除图像中的培养皿边缘；并进行阈值分割。
3.1对步骤(1)得到的菌落图像根据步骤2.1转换为灰度图像；
3.2对上述灰度图像进行中值滤波处理，得到菌落去噪后的灰度图像；取7*7的滑动窗口从图像左上端开始，每个窗口内所有像素灰度值替换为窗口内像素原灰度值的中间值，得到经平滑处理的去噪灰度图像。
3.3使用canny算子检测图像中的边缘：
先使用高斯滤波器平滑图像，然后使用canny算子模板计算每个像素点的梯度强度和方向，通过非极大值抑制消除杂散响应，应用双阈值检测来确定真实的和潜在的边缘，抑制孤立的弱边缘完成边缘检测。
3.4根据经验预设大于菌落小于培养皿边缘的圆的半径范围，使用霍夫变换从图像最左边的像素点出发，按从上到下，从左到右的顺序，遍历图像所有像素点，检测到符合要求的边缘圆，保存半径最小的圆心位置和半径，保存培养皿边缘内菌落边缘外的像素点位置信息。
3.5根据霍夫变换检测保存的圆心位置和半径将步骤3.1去噪后的灰度图像上圆外区域设0，圆内像素值保持不变，得到去除培养皿边缘的菌落灰度图像。
3.6统计步骤3.4存储的像素点的灰度值，取出现概率最大的灰度值，即培养皿内培养基的灰度值，培养基上灰度值基本相同，以该值为阈值，对步骤3.5得到的灰度图像进行阈值分割，高于阈值的像素点设为1，低于阈值的设为0，即得到菌落的二值图像。
步骤(4)、计算二值图像中各菌落区域质心点坐标和面积，根据区域离散性选择性保存独立菌落质心位置，得到质心点叠加到步骤3.5的灰度图像中的叠加图。
4.1通过几何矩算法在上述步骤3.6所述的菌落二值图像中获取各菌落的区域质心点及区域面积，并计算该图像区域离散性，其中所述的区域质心点是指区域像素值的中心点，x方向上该点上下像素和相等，y方向上左右像素和相等；具体是：
1)通过几何矩算法计算当前时刻菌落二值图像各区域质心点坐标和区域方向，根据公式(2)计算区域离散性，即最大弦长与面积之比，公式如下：
Figure BDA0002382615610000051
其中，(xi，yi)表示为区域各像素点坐标，
Figure BDA0002382615610000052
表示区域质心坐标，A(S)表示区域面积。
2)对于该培养皿动态监测的初始时刻图像进行如下处理：若区域离散性大于1.4，则该区域标记为粘连区域，然后根据该区域基于主方向上的水平和垂直两个方向上的最大距离之间的倍数n，则按四舍五入法以长轴为基准将区域分割为n等份；获取分割后各菌落区域的质心点位置，再计算各区域离散性，直至离散性均正常，得到仅包含区域质心点的图像；
例如：大肠杆菌菌落形态为圆形，若出现粘连菌落即链状菌落，其表现为椭圆形，因此可根据区域离散性判断该区域是否为粘连菌落。
3)处理后续培养过程中其他时刻拍摄的培养皿菌落图像时，只需保存离散性小于1.4的区域质心点，即独立未粘连菌落区域的质心。
4.2将质心点叠加到步骤3.5得到的灰度图中，并保存质心点位置信息。
步骤(5)、菌落生长过程中区域范围逐渐增大，颜色也会发生细微的变化，而每个独立菌落的质心位置基本不发生变化，因此以质心点为特征点对当前时刻菌落图像进行配准:将当前时刻菌落图像旋转至与上一时刻即存储的标记序号较当前图像小1的菌落图像方向相同，使菌落区域质心部分基本重合(重合率达95％以上)，然后利用上一时刻菌落图像的质心位置更新当前时刻菌落图像的质心位置，进而获取各独立菌落培养至该时间段的颜色，面积特征信息。
5.1基于SURF算法思想，利用梯度直方图和邻域主方向构造特征描述算子。
对当前时刻菌落图像和上一时刻菌落图像均做如下处理：
1)以图像的菌落区域质心点为中心，角度为60°的扇形滑动窗口统计窗口内小波响应值总和。以步长为0.2弧度旋转滑动窗口，再次统计小波响应值总和，总和最大的方向即为主方向。
小波响应值的计算如下：以图像的菌落区域质心点作为中心，半径6S(S＝1.2*L/9为质心点的尺度，L为图像高斯卷积得到的高斯尺度空间)的圆形邻域内，计算质心点在X方向和Y方向的Haar小波响应运算(其中haar小波模板长度为4S)得到小波响应值；并以质心点为中心对小波响应值进行高斯加权。
2)沿上述特征点的主方向选取一个正方形框，边长为20S，划分为16个区域，每个区域统计25个像素点的水平和垂直方向的Haar小波响应dy和dx；以质心点为中心，对dy和dx进行高斯加权计算，得到每个区域的4维特征矢量，因此每个质心点的描述子由64维特征矢量组成。
5.2利用前后两个时刻图像的各质心点的特征矢量，根据公式(3)筛选出欧氏距离最近与次近的质心点，然后计算最近欧氏距离和次近欧氏距离的比值，若大于给定阈值则认为最近欧氏距离的质心点为误匹配，并剔除该匹配对，若否则作为前后两个时刻图像的特征匹配对，直至找到图像的所有匹配对，即可实现图像配准。
Figure BDA0002382615610000061
其中
Figure BDA0002382615610000062
为上一时刻i-1保存的菌落图像Ii-1的特征点α和当前时刻i待配准的菌落图像Ii的特征点β的特征描述子；
Figure BDA0002382615610000063
分别为两个特征点α和β特征描述子的j维特征矢量。
5.3将当前时刻的菌落图像更新为配准后的图像作为下一时刻配准的基准图像，同时将配准后当前时刻菌落图像的各质心点对应区域的面积，颜色信息同上一时刻该区域存储的信息以及当前时刻的培养时间对应保存在一起，并制作菌落的生长曲线；若当前时刻出现新长出来的菌落，即独立菌落质心点数增加，则将增加的质心点更新在初始时刻图像中。
步骤(6)、重复上述步骤对后续培养时刻的培养皿进行拍照和处理，最后得到各独立菌落动态的生长特征，根据菌落的生长曲线获得菌落对数期内的生长速率，由生长速率判断菌落的生长期；拍摄初始时刻图像时在拍摄装置面板键入的培养时间即该批次菌落的延迟期时间；将延迟期时间和对数期内的生长速率两个特征量传送到提前训练的回归模型预测菌液浓度；由最后输出的初始时刻图像上质心点个数作为培养皿上菌落数目的粗略估计，再根据OCR识别的标记稀释梯度，计算出菌液的大致浓度，与预测值做对比。
6.1建立回归模型：训练集为对多个浓度不同的菌液(浓度已知)样本制成的培养皿进行动态监测得到对应样本的两个自变量：延迟期时间x1和对数期内的生长率x2，样本因变量为菌液浓度y。
设回归方程为h(x)＝a0+a1x1+a2x2，a0，a1和a2为回归系数，该方程即为回归模型的函数表达式。由回归方程得到回归模型的损失函数：
Figure BDA0002382615610000071
m为训练集样本总数，h(x(i))为第i个样本的自变量输入到回归方程h(x)得到的预测值，y(i)为第i个样本的实际菌液浓度。损失函数J(a0，a1，a2)是将预测值和真实值之间的差值平方和除以2m，表示预测值和真实值之间的差距，使损失函数J(a0，a1，a2)最小即可得到回归方程h(x)中的回归系数，进而得到建立的回归模型。
6.2将延时期时间、生长速率这两个变量按照相应特征分类归一化到[0,1]区间内，归一化后的数据传送到回归模型中，得到该样本对应预测菌液浓度r1。
6.3将更新菌落质心点的初始时刻图像中质心点个数作为可接受误差范围内培养皿样本中的菌落数目N，根据公式(5)计算传统方法获得的实测菌液浓度r2，其中M为步骤2识别的人工标记的稀释梯度；
Figure BDA0002382615610000081
根据经验，若r2和r1的误差率大于阈值20％(误差率为两浓度之间的平方差和平均数的百分比)，则判定该样本实验操作过程中有问题，导致菌落数变小；若误差率低于20％，则该样本操作无误，可用于后续其他实验。
本发明在监测大肠杆菌菌落动态生长特征，预测菌液浓度，观测细菌耐药性或者受生长环境的影响有着重大意义。
本发明的优点是：(1)提供了一种拍摄大肠杆菌菌落装置，上下均有灯光照射，使培养皿整体光照均匀，不会产生光斑，可以自动调节拍摄区域，保证每次拍摄与摄像头之间的距离，周围灯光相同，降低外界环境对后期处理造成的影响；装置上配由面板方便设置装置参数及向系统输入拍摄图像的培养时间，便于整理菌落的动态生长信息；
(2)在对菌落进行分析的同时，使用OCR自动字符识别系统对菌落培养皿盖上标记的编号，稀释度等信息进行识别，根据设定的标记区域大小，自动确定字符的位置，可快速准确地识别出标记信息，根据识别结果对同一培养皿不同时刻的图像进行排序并标记序号，同时保证了各培养皿动态监测过程中获取的信息与培养皿之间的关联性，避免数据过多造成的结果混乱；
(3)在菌落图像处理过程中提供了霍夫变换检测圆的方法快速去除培养皿边缘，剔除培养皿边界圆对菌落识别的影响；对菌落进行阈值分割过程中，通过边缘检测确定图像中非菌落的区域，提取该区域灰度值作为阈值，得到的二值化结果保证了菌落轮廓的完整性，提高后期统计菌落区域面积的精确度；
(4)提供一种将菌落图像与前时刻图像实现配准的方法，使两幅图像角度一致，得到各菌落的质心位置，进而快速得到培养皿中的菌落数目；可定位到每个菌落，统计各菌落在该生长时刻的大小，颜色信息，根据培养时间计算出生长速度，判断菌落在各个时间节点处于哪一生长阶段，进而得到生长曲线；
(5)提供一种使用回归模型根据菌落延迟期时间，对数期内的生长速度，质点数三个变量值预测菌液浓度，与传统计数法得到的浓度做对比，筛选出实验过程中的错误样本；液体培养对数期内的浓度越大的菌液活性越好，转移到固体培养基上后，适应能力快，延迟期短，且对数期内分裂速度较低浓度的快，因此菌落面积增长速度较高，但到后期由于浓度高的菌落数目也多，导致培养基中的营养物质消耗过快，从而生长速度降低，本方法基于大肠杆菌菌落生长的特征，建立了一个回归模型可较精确的预测菌液浓度，相比于易受外界环境干扰的传统计数法，本方法更精确，得到的数据可靠性更高。
附图说明
图1为本实施例提供的系统总流程图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例公开一种采用大肠杆菌动态生长的跟踪参数回归与分析的方法，实时跟踪大肠杆菌培养过程中各个生长时期下的菌落参数特征值，通过各状态下的菌落直径，数目变化，颜色矩等特征参数的提取对大肠杆菌的初始浓度进行回归分析。在本发明实施例中，大肠杆菌液体培养的培养基为LB肉汤，固体培养基为LB琼脂，培养皿规格为90*15mm，菌落培养环境均为37℃，软件平台是MATLAB R2016a和LabVIEW 2017，使用拍照装置采集菌落生长过程中培养皿及编号盖并排放置的彩色图像。参照图1，为本发明实施例提供的一种对菌落动态监测分析及识别菌落培养皿编号方法的工作流程示意图，包括以下步骤：
步骤(1)、根据装置输入面板上键入的培养皿规格调整可移动挡板，调整完成键入培养时间，将含有菌落的培养皿与标记培养浓度和编号的培养皿盖并排放置在置物台拍照区域进行拍照；图像以jpg格式自动上传到上位机系统。系统对图像进行裁剪，裁剪为菌落培养皿图像和标记图像。
1.1操作者在拍摄装置面板上调整装置属性键入培养皿的规格(直径大小)，系统根据预设的该直径大小对应的培养皿盖的直径大小，自动调整放置待拍摄物体的平台上的四个挡板的距离至正好将培养皿(即菌落培养皿)及标有标记的盖子(即人工标记培养皿盖)并排放置于四个挡板中，培养皿在左，盖子在右，确保动态监测过程中拍摄该批次样本各时刻图像时周围光线，距离摄像头的距离一致，减少外界拍摄环境对系统识别造成的误差。
1.2挡板调整好后，放置培养皿及其盖子，在面板上时间属性键入样本培养时间t(以分钟为单位)，放置待拍摄培养皿及其盖子，摄像机根据输入的拍摄指令开始拍摄，然后将拍摄后的图像以jpg格式实时传输到上位机系统进行处理；
1.3系统根据培养皿和盖子的直径比例对图像进行裁剪，得到待分析的菌落培养皿和待识别的人工标记培养皿盖两部分，分别记为菌落图像、标记图像。
步骤(2)、使用OCR自动识别字符系统提取标记图像中的字符，与训练集中的存储的字符特征进行模式匹配，得到培养皿上标记的信息，如编号，稀释梯度等；根据识别的标记信息对相应菌落图像进行标记序号。
2.1根据以下公式(1)，对步骤1标记图像进行灰度转换，得到灰度图：
Gray(i，j)＝R(i，j)*0.299+G(i，j)*0.587+B(i，j)*0.114   式(1)
其中Gray(i,j)为灰度化后的灰度图像中第i行和第j列的像素点的灰度值，R(i,j)，G(i,j)，B(i,j)分别为原彩色图像的中第i行和第j列的像素点的红色，绿色，蓝色的分量值，0.299，0.587，0.114分别为各像素点三分量的权值。
2.2采用最大外接矩形法从步骤2.1灰度图分割出文字区域，将分割后的文字区域分辨率缩放为128*128，再使用半径为3的圆结构元素进行腐蚀，得到预处理后的标记图像。
2.3根据OCR识别系统和事先训练好的数字特征文件，对步骤2.2所述的预处理后标记图像进行模式匹配，在数字特征文件中寻找与待识别数字特征相似度最高的样本，输出样本值，即可得到人工标记的信息内容。
2.4系统根据识别到的标记信息自动判别之前是否存储过该标记信息，若无，则将对应的菌落图像标记为初始时刻图像，序号为1，初始时刻图像即菌落长到直径约为0.5-1mm时拍摄的菌落图像；若有，则根据该标记信息已存图像数目给菌落图像标记相应序号。
步骤(3)、对步骤(1)菌落图像使用canny算子检测图像边缘，通过hough变换检测圆，存储检测圆里半径最小的圆心位置和半径，根据圆心位置和半径去除图像中的培养皿边缘；并进行阈值分割。
3.1对步骤(1)得到的菌落图像根据步骤2.1转换为灰度图像；
3.2对上述灰度图像进行中值滤波处理，得到菌落去噪后的灰度图像；取7*7的滑动窗口从图像左上端开始，每个窗口内所有像素灰度值替换为窗口内像素原灰度值的中间值，得到经平滑处理的去噪灰度图像。
3.3使用canny算子检测图像中的边缘：
先使用高斯滤波器平滑图像，然后使用canny算子模板计算每个像素点的梯度强度和方向，通过非极大值抑制消除杂散响应，应用双阈值检测来确定真实的和潜在的边缘，抑制孤立的弱边缘完成边缘检测。
3.4根据经验预设大于菌落小于培养皿边缘的圆的半径范围，使用霍夫变换从图像最左边的像素点出发，按从上到下，从左到右的顺序，遍历图像所有像素点，检测到符合要求的边缘圆，保存半径最小的圆心位置和半径，保存培养皿边缘内菌落边缘外的像素点位置信息。
3.5根据霍夫变换检测保存的圆心位置和半径将步骤3.1去噪后的灰度图像上圆外区域设0，圆内像素值保持不变，得到去除培养皿边缘的菌落灰度图像。
3.6统计步骤3.4存储的像素点的灰度值，取出现概率最大的灰度值，即培养皿内培养基的灰度值，培养基上灰度值基本相同，以该值为阈值，对步骤3.5得到的灰度图像进行阈值分割，高于阈值的像素点设为1，低于阈值的设为0，即得到菌落的二值图像。
步骤(4)、计算二值图像中各菌落区域质心点坐标和面积，根据区域离散性选择性保存独立菌落质心位置，得到质心点叠加到步骤3.5的灰度图像中的叠加图。
4.1通过几何矩算法在上述步骤3.6所述的菌落二值图像中获取各菌落的区域质心点及区域面积，并计算该图像区域离散性，其中所述的区域质心点是指区域像素值的中心点，x方向上该点上下像素和相等，y方向上左右像素和相等；具体是：
1)通过几何矩算法计算当前时刻菌落二值图像各区域质心点坐标和区域方向，根据公式(2)计算区域离散性，即最大弦长与面积之比，公式如下：
Figure BDA0002382615610000121
其中，(xi，yi)表示为区域各像素点坐标，
Figure BDA0002382615610000122
表示区域质心坐标，A(S)表示区域面积。
2)对于该培养皿动态监测的初始时刻图像进行如下处理：若区域离散性大于1.4，则该区域标记为粘连区域，然后根据该区域基于主方向上的水平和垂直两个方向上的最大距离之间的倍数n，则按四舍五入法以长轴为基准将区域分割为n等份；获取分割后各菌落区域的质心点位置，再计算各区域离散性，直至离散性均正常，得到仅包含区域质心点的图像；
例如：大肠杆菌菌落形态为圆形，若出现粘连菌落即链状菌落，其表现为椭圆形，因此可根据区域离散性判断该区域是否为粘连菌落。
3)处理后续培养过程中其他时刻拍摄的培养皿菌落图像时，只需保存离散性小于1.4的区域质心点，即独立未粘连菌落区域的质心。
4.2将质心点叠加到步骤3.5得到的灰度图中，并保存质心点位置信息。
步骤(5)、菌落生长过程中区域范围逐渐增大，颜色也会发生细微的变化，而每个独立菌落的质心位置基本不发生变化，因此以质心点为特征点对当前时刻菌落图像进行配准:将当前时刻菌落图像旋转至与上一时刻即存储的标记序号较当前图像小1的菌落图像方向相同，使菌落区域质心部分基本重合(重合率达95％以上)，然后利用上一时刻菌落图像的质心位置更新当前时刻菌落图像的质心位置，进而获取各独立菌落培养至该时间段的颜色，面积特征信息。
5.1基于SURF算法思想，利用梯度直方图和邻域主方向构造特征描述算子。
对当前时刻菌落图像和上一时刻菌落图像均做如下处理：
1)以图像的菌落区域质心点为中心，角度为60°的扇形滑动窗口统计窗口内小波响应值总和。以步长为0.2弧度旋转滑动窗口，再次统计小波响应值总和，总和最大的方向即为主方向。
小波响应值的计算如下：以图像的菌落区域质心点作为中心，半径6S(S＝1.2*L/9为质心点的尺度，L为图像高斯卷积得到的高斯尺度空间)的圆形邻域内，计算质心点在X方向和Y方向的Haar小波响应运算(其中haar小波模板长度为4S)得到小波响应值；并以质心点为中心对小波响应值进行高斯加权。
2)沿上述特征点的主方向选取一个正方形框，边长为20S，划分为16个区域，每个区域统计25个像素点的水平和垂直方向的Haar小波响应dy和dx；以质心点为中心，对dy和dx进行高斯加权计算，得到每个区域的4维特征矢量，因此每个质心点的描述子由64维特征矢量组成。
5.2利用前后两个时刻图像的各质心点的特征矢量，根据公式(3)筛选出欧氏距离最近与次近的质心点，然后计算最近欧氏距离和次近欧氏距离的比值，若大于给定阈值则认为最近欧氏距离的质心点为误匹配，并剔除该匹配对，若否则作为前后两个时刻图像的特征匹配对，直至找到图像的所有匹配对，即可实现图像配准。
Figure BDA0002382615610000131
其中，
Figure BDA0002382615610000132
为上一时刻i-1保存的菌落图像Ii-1的特征点α和当前时刻i待配准的菌落图像Ii的特征点β的特征描述子；
Figure BDA0002382615610000133
分别为两个特征点α和β特征描述子的j维特征矢量。
5.3将当前时刻的菌落图像更新为配准后的图像作为下一时刻配准的基准图像，同时将配准后当前时刻菌落图像的各质心点对应区域的面积，颜色信息同上一时刻该区域存储的信息以及当前时刻的培养时间对应保存在一起，并制作菌落的生长曲线；若当前时刻出现新长出来的菌落，即独立菌落质心点数增加，则将增加的质心点更新在初始时刻图像中。
步骤(6)、重复上述步骤对后续培养时刻的培养皿进行拍照和处理，最后得到各独立菌落动态的生长特征，根据菌落的生长曲线获得菌落对数期内的生长速率，由生长速率判断菌落的生长期；拍摄初始时刻图像时在拍摄装置面板键入的培养时间即该批次菌落的延迟期时间；将延迟期时间和对数期内的生长速率两个特征量传送到提前训练的回归模型预测菌液浓度；由最后输出的初始时刻图像上质心点个数作为培养皿上菌落数目的粗略估计，再根据OCR识别的标记稀释梯度，计算出菌液的大致浓度，与预测值做对比。
6.1建立回归模型：训练集为对多个浓度不同的菌液(浓度已知)样本制成的培养皿进行动态监测得到对应样本的两个自变量：延迟期时间x1和对数期内的生长率x2，样本因变量为菌液浓度y。
设回归方程为h(x)＝a0+a1x1+a2x2，a0，a1和a2为回归系数，该方程即为回归模型的函数表达式。由回归方程得到回归模型的损失函数：
Figure BDA0002382615610000141
m为训练集样本总数，h(x(i))为第i个样本的自变量输入到回归方程h(x)得到的预测值，y(i)为第i个样本的实际菌液浓度。损失函数J(a0，a1，a2)是将预测值和真实值之间的差值平方和除以2m，表示预测值和真实值之间的差距，使损失函数J(a0，a1，a2)最小即可得到回归方程h(x)中的回归系数，进而得到建立的回归模型。
6.2将延时期时间、生长速率这两个变量按照相应特征分类归一化到[0,1]区间内，归一化后的数据传送到回归模型中，得到该样本对应预测菌液浓度r1。
6.3将更新菌落质心点的初始时刻图像中质心点个数作为可接受误差范围内培养皿样本中的菌落数目N，根据公式(5)计算传统方法获得的实测菌液浓度r2，其中M为步骤2识别的人工标记的稀释梯度；
Figure BDA0002382615610000142
根据经验，若r2和r1的误差率大于阈值20％(误差率为两浓度之间的平方差和平均数的百分比)，则判定该样本实验操作过程中有问题，导致菌落数变小；若误差率低于20％，则该样本操作无误，可用于后续其他实验。
本发明实施例取大肠杆菌液体培养过程中对数期内三个不同培养时间段的菌液，分别进行稀释，取10-4，10-5，10-6，10-7四个稀释梯度对三种浓度菌液进行涂布培养，每个梯度三个实验组，对实验培养皿进行动态监测，动态监测过程中通过OCR识别的标记信息保证培养皿与标记的稀释梯度和编号的关联性，实现对每一个培养皿上的菌落的动态监测，避免菌落图像与其对应的标记信息混淆；三种浓度菌液选取个数为30-300的稀释梯度作为实验组，三种浓度菌液选择的稀释梯度分别为10-4，10-4，10-5，得到预测浓度，取各浓度的平均值。采用传统计数方法对培养皿进行计数，各稀释梯度取剔除误差率大于10％的实验组后的均值，再乘以稀释梯度，得到菌液浓度，同本发明提供的方法预测的浓度进行对比。表1显示了三种浓度下使用传统计数法得到的浓度与本发明方法预测的浓度对比结果，两种方法的结果相差不多，误差在可接受范围内，且传统计数法需要大量的实验数据，计数结果易受人为主观影响，同时需要规避实验操作过程中造成的误差；而本发明提供的方法仅需对一个培养皿动态监测即可估测出浓度，不受实验操作等人为主观影响。
表1本发明方法与传统方法结果比较
Figure BDA0002382615610000151

Claims (5)

1.一种大肠杆菌动态生长监测方法，基于以下装置包括摄像机、置物台、输入面板；所述置物台上下方均设有led灯,用以光照射置物台；置物台四周设有四个方向的可移动挡板，通过电机驱动可移动挡板移动，使得刚好放置培养皿及其盖子；所述摄像机位于置物台的正上方，用于获取置物台上培养皿及其盖子的图像；摄像机将拍摄到的图像传输到上位机系统；所述输入面板用于输入培养皿规格与拍照指令，并传送至控制模块；输入培养时间传送至上位机系统用于标记拍摄的图像；所述控制模块收到拍照指令，控制摄像机进行拍摄；收到培养皿规格数据，控制电机驱动调整可移动挡板距离；其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、获得拍摄机得到的含有大肠杆菌菌落的培养皿与含标记信息的培养皿盖图像，然后裁剪为菌落培养皿图像和标记图像；
步骤(2)、使用OCR自动识别字符系统提取标记图像中的字符，与训练集中事先存储的字符特征进行模式匹配，得到培养皿上的标记信息，包括编号、稀释梯度；根据识别的标记信息对相应菌落图像进行标记序号；
步骤(3)、对步骤(1)菌落图像使用canny算子检测图像边缘，通过hough变换检测圆，存储检测圆里半径最小的圆心位置和半径，根据圆心位置和半径去除图像中的培养皿边缘，得到去除培养皿边缘的菌落灰度图像；然后对灰度图像进行阈值分割，得到菌落的二值图像；
步骤(4)、计算步骤(3)二值图像中各菌落区域质心点坐标和面积，根据区域离散性选择性保存独立菌落质心位置，得到质心点叠加到步骤(3)灰度图像中的叠加图；
步骤(5)、菌落生长过程中区域范围逐渐增大，颜色也会发生细微的变化，而每个独立菌落的质心位置基本不发生变化，因此以质心点为特征点对当前时刻菌落图像进行配准:将当前时刻菌落图像旋转至与上一时刻即存储的标记序号较当前图像小1的菌落图像方向相同，使菌落区域质心部分基本重合，然后利用上一时刻菌落图像的质心位置更新当前时刻菌落图像的质心位置，进而获取各独立菌落培养至该时间段的颜色，面积特征信息；
5.1基于SURF算法思想，利用梯度直方图和邻域主方向构造特征描述算子；
对当前时刻菌落图像和上一时刻菌落图像均做如下处理：
1)以图像的菌落区域质心点为中心，角度为60°的扇形滑动窗口统计窗口内小波响应值总和；以步长为0.2弧度旋转滑动窗口，再次统计小波响应值总和，总和最大的方向即为主方向；
小波响应值的计算如下：以图像的菌落区域质心点作为中心，半径6S的圆形邻域内，S＝1.2*L/9为质心点的尺度，L为图像高斯卷积得到的高斯尺度空间，计算质心点在X方向和Y方向的Haar小波响应运算得到小波响应值，其中haar小波模板长度为4S；并以质心点为中心对小波响应值进行高斯加权；
2)沿上述特征点的主方向选取一个正方形框，边长为20S，划分为16个区域，每个区域统计25个像素点的水平和垂直方向的Haar小波响应dy和dx；以质心点为中心，对dy和dx进行高斯加权计算，得到每个区域的4维特征矢量，因此每个质心点的描述子由64维特征矢量组成；
5.2利用前后两个时刻图像的各质心点的特征矢量，根据公式(3)筛选出欧氏距离最近与次近的质心点，然后计算最近欧氏距离和次近欧氏距离的比值，若大于给定阈值则认为最近欧氏距离的质心点为误匹配，并剔除该匹配对，若否则作为前后两个时刻图像的特征匹配对，直至找到图像的所有匹配对，即可实现图像配准；
Figure FDA0004114857270000021
其中
Figure FDA0004114857270000022
为上一时刻i-1保存的菌落图像Ii-1的特征点α和当前时刻i待配准的菌落图像Ii的特征点β的特征描述子；
Figure FDA0004114857270000023
分别为两个特征点α和β特征描述子的j维特征矢量；
5.3将当前时刻的菌落图像更新为配准后的图像作为下一时刻配准的基准图像，同时将配准后当前时刻菌落图像的各质心点对应区域的面积，颜色信息同上一时刻该区域存储的信息以及当前时刻的培养时间对应保存在一起，并制作菌落的生长曲线；若当前时刻出现新长出来的菌落，即独立菌落质心点数增加，则将增加的质心点更新在初始时刻图像中；
步骤(6)、重复上述步骤对后续培养时刻的培养皿进行拍照和处理，最后得到各独立菌落动态的生长特征，根据菌落的生长曲线获得菌落对数期内的生长速率，由生长速率判断菌落的生长期；拍摄初始时刻图像时在拍摄装置面板键入的培养时间即该批次菌落的延迟期时间；将延迟期时间和对数期内的生长速率两个特征量传送到提前训练的回归模型预测菌液浓度；
6.1建立回归模型：训练集为对多个浓度不同的菌液样本制成的培养皿进行动态监测得到对应样本的两个自变量：延迟期时间x1和对数期内的生长率x2，样本因变量为菌液浓度y；
设回归方程为h(x)＝a0+a1x1+a2x2，a0，a1和a2为回归系数，该方程即为回归模型的函数表达式；由回归方程得到回归模型的损失函数：
Figure FDA0004114857270000031
m为训练集样本总数，h(x(i))为第i个样本的自变量输入到回归方程h(x)得到的预测值，y(i)为第i个样本的实际菌液浓度；损失函数J(a0，a1，a2)是将预测值和真实值之间的差值平方和除以2m，表示预测值和真实值之间的差距，使损失函数J(a0，a1，a2)最小即可得到回归方程h(x)中的回归系数，进而得到建立的回归模型；
6.2将延时期时间、生长速率这两个变量按照相应特征分类归一化到[0，1]区间内，归一化后的数据传送到回归模型中，得到该样本对应预测菌液浓度r1。
2.如权利要求1所述的一种大肠杆菌动态生长监测方法，其特征在于步骤(2)具体是：
2.1根据以下公式(1)，对步骤1标记图像进行灰度转换，得到灰度图：
Gray(i，j)＝R(i，j)*0.299+G(i，j)*0.587+B(i，j)*0.114   式(1)
其中Gray(i，j)为灰度化后的灰度图像中第i行和第j列的像素点的灰度值，R(i，j)，G(i，j)，B(i，j)分别为原彩色图像的中第i行和第j列的像素点的红色，绿色，蓝色的分量值，0.299，0.587，0.114分别为各像素点三分量的权值；
2.2采用最大外接矩形法从步骤2.1灰度图分割出文字区域，将分割后的文字区域分辨率缩放为128*128，再使用半径为3的圆结构元素进行腐蚀，得到预处理后的标记图像；
2.3根据OCR识别系统和事先训练好的数字特征文件，对步骤2.2所述的预处理后标记图像进行模式匹配，在数字特征文件中寻找与待识别数字特征相似度最高的样本，输出样本值，即可得到人工标记的信息内容；
2.4根据识别到的标记信息判别之前是否存储过该标记信息，若无，则将对应的菌落图像标记为初始时刻图像，序号为1，初始时刻图像即菌落长到直径为0.5-1mm时拍摄的菌落图像；若有，则根据该标记信息已存图像数目给菌落图像标记相应序号。
3.如权利要求1或2所述的一种大肠杆菌动态生长监测方法，其特征在于步骤(3)具体是：
3.1对步骤(1)得到的菌落图像转换为灰度图像；
3.2对上述灰度图像进行中值滤波处理，得到菌落去噪后的灰度图像；取7*7的滑动窗口从图像左上端开始，每个窗口内所有像素灰度值替换为窗口内像素原灰度值的中间值，得到经平滑处理的去噪灰度图像；
3.3使用canny算子检测图像中的边缘：
先使用高斯滤波器平滑图像，然后使用canny算子模板计算每个像素点的梯度强度和方向，通过非极大值抑制消除杂散响应，应用双阈值检测来确定真实的和潜在的边缘，抑制孤立的弱边缘完成边缘检测；
3.4根据经验预设大于菌落小于培养皿边缘的圆的半径范围，使用霍夫变换从图像最左边的像素点出发，按从上到下，从左到右的顺序，遍历图像所有像素点，检测到符合要求的边缘圆，保存半径最小的圆心位置和半径，保存培养皿边缘内菌落边缘外的像素点位置信息；
3.5根据霍夫变换检测保存的圆心位置和半径将步骤3.1去噪后的灰度图像上圆外区域设0，圆内像素值保持不变，得到去除培养皿边缘的菌落灰度图像；
3.6统计步骤3.4存储的像素点的灰度值，取出现概率最大的灰度值，即培养皿内培养基的灰度值，培养基上灰度值基本相同，以该值为阈值，对步骤3.5得到的灰度图像进行阈值分割，高于阈值的像素点设为1，低于阈值的设为0，即得到菌落的二值图像。
4.如权利要求3所述的一种大肠杆菌动态生长监测方法，其特征在于步骤(4)具体是：
4.1通过几何矩算法在上述步骤3.6所述的菌落二值图像中获取各菌落的区域质心点及区域面积，并计算该图像区域离散性，具体是：
1)通过几何矩算法计算当前时刻菌落二值图像各区域质心点坐标和区域方向，根据公式(2)计算区域离散性，即最大弦长与面积之比，公式如下：
Figure FDA0004114857270000051
其中，(xi，yi)表示为区域各像素点坐标，
Figure FDA0004114857270000052
表示区域质心坐标，A(S)表示区域面积；
2)对于初始时刻菌落图像进行如下处理：若区域离散性大于1.4，则该区域标记为粘连区域，然后根据该区域基于主方向上的水平和垂直两个方向上的最大距离之间的倍数n，则按四舍五入法以长轴为基准将区域分割为n等份；获取分割后各菌落区域的质心点位置，再计算各区域离散性，直至离散性均正常，得到仅包含区域质心点的图像；
3)处理后续培养过程中其他时刻拍摄的培养皿菌落图像时，保存离散性小于1.4的区域质心点，即独立未粘连菌落区域的质心；
4.2将上述质心点叠加到步骤3.5得到的灰度图中，并保存质心点位置信息。
5.如权利要求1或2或4任一所述的一种大肠杆菌动态生长监测方法，其特征在于还包括步骤(7)、验证；
由最后输出的初始时刻图像上质心点个数作为培养皿上菌落数目的粗略估计，再根据OCR识别的标记稀释梯度，计算出菌液的大致浓度，与预测值做对比，具体是：
将更新菌落质心点的初始时刻图像中质心点个数作为可接受误差范围内培养皿样本中的菌落数目N，根据公式(5)计算传统方法获得的实测菌液浓度r2，其中M为步骤(2)识别的人工标记的稀释梯度；
Figure FDA0004114857270000053
若r2和r1的误差率大于阈值20％，则判定该样本实验操作过程中有问题，导致菌落数变小；若误差率低于20％，则该样本操作无误。
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