CN114317675A - 基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法及系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，包括以下步骤：步骤S1:获取制备琼脂平板，并获取平板菌落图像；步骤S2:对平板菌落图像采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像后续各个时间点与背景图的差分结果，并预处理，得到训练集；步骤S3:构建并训练DetectionNet二分类检测网络；步骤S4:将待测创面样本的平板菌落图像输入训练后的分类检测网络，确定样品中不同种类细菌类型。本发明对培养早期的细菌具有精准的定性和定量能力，有效提高检测效率。

Description

基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法及系统
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法及系统。
背景技术
创面上最常见的有害病原菌包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, AB)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus, SA)和大肠杆菌(Escherichia coli, EC)。目前临床上常用的病原菌定量检测方法有三种，分别是平板培养计数法、分子生物学检测法和免疫学检测法。聚合酶链反应和特异性抗原-抗体相互作用的免疫检测，大大提高了检测灵敏度，但无法避免产生假阳性结果，并且检测成本昂贵。细菌培养计数是临床检测细菌的金标准，它具有成本低的效益，但这种传统的基于细菌培养的检测方法需要细菌菌落长到一定肉眼可见的大小，因此检测细菌耗时长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，实现对培养早期的细菌具有精准的定性和定量能力，有效提高检测效率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1:获取制备琼脂平板，并获取平板菌落图像；
步骤S2:对平板菌落图像采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像后续各个时间点与背景图的差分结果，并预处理，得到训练集；
步骤S3:构建并训练DetectionNet二分类检测网络；
步骤S4:将待测创面样本的平板菌落图像输入训练后的分类检测网络，确定样品中不同种类细菌类型。
进一步的，所述步骤S1具体为：
步骤S1:使用微波炉加热融化的LB琼脂培养基，取培养基倒入无Costar 6孔平板，静置凝固后待用;
步骤S2:加入稀释预设倍数的铜绿假单胞菌PA、鲍曼不动杆菌AB、金黄色葡萄球菌SA和大肠杆菌EC的单一菌液，一个孔加入一种细菌，使用涂布棒涂匀菌液，倒置放入培养箱中培养；
步骤S3:培养后的Costar 6孔平板转移至高内涵成像分析系统Operetta CLS中继续培养，设定培养温度和图像的捕获参数，进行连续菌落图像的捕获。
进一步的，所述步骤S2具体为：采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像各个时间点的灰度差分结果，采用傅里叶变换，低通滤波算法，OpenCV的Threshold算法获取二值化图像; 采用8邻近规则进行连通区域标记杂质和菌落，划分训练集与独立测试集。
进一步的，所述采用8邻近规则进行连通区域标记杂质和菌落，具体为：在邻近像素中，若有像素已被标记，则继承其label值，否则记为新label值；标记过程中记录每个label值之间的父节点关系；基于label值得父节点的关系表重映射每个label的根节点;基于重映射根节点表，进行第二轮label标记，将子节点label值用根节点label值覆盖，获取区域连通结果;统计每个连通区域像素数，低于预设像素的区域被丢弃。将最终区域连通结果在原图上分割出矩形候选菌落图。
进一步的，所述ClassificationNet多分类网络基于PyTorch的预训练ResNet50网络构建。
进一步的，所述待测创面样本的平板菌落图像获取，具体为：检测SA使用CHROMager Staph aureus培养基，检测PA使用CHROMager Pseudomonas培养基，检测EC使用CHROMager ECC培养基，检测AB使用CHROMager Acinetobacter培养基；取微波炉加热融化的选择性琼脂培养基（CHROMager），培养基倒入无菌6孔平板，静置凝固后待用；并基于步骤S1-S2，获取待测创面样本的平板菌落图像。
一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测系统,包括处理器、存储器以及存储在所述存储器上的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，具体执行如权利要求1-6任一项所述的定性和定量不同创面细菌的检测方法中的步骤。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明对创面样品中的细菌的定量检测具有很高的精确度，与临床金标准相比，培养7h的菌落达到了约90%的计数准确率，大大缩短了细菌的检出时间，，并且具有同时且高通量的分类多种细菌的良好效果，也能有效的排除样本中死亡细菌和杂质的干扰。
附图说明
图1是本发明一实施例中高内涵细胞成像仪捕获孔板上细菌菌落的实验步骤；
图2是本发明一实施例中检测和分类细菌菌落的机器学习算法步骤；
图3是本发明一实施例中基于机器学习定性和定量创面上不同种类细菌的工作流程示意图；
图4是本发明一实施例中检测神经网络对鲍曼不动感菌(AB)、大肠杆菌 (EC)、铜绿假单胞菌(PA)和金黄色葡萄球菌(SA)进行生长菌落检测的定量检测效果；
图5是本发明一实施例中分类神经网络对鲍曼不动感菌(AB)、大肠杆菌 (EC)、铜绿假单胞菌(PA)和金黄色葡萄球菌(SA)的分类检测效果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。
请参照图1，本发明提供一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，包括以下步骤：
步骤S1:获取制备琼脂平板，并获取平板菌落图像；
步骤S2:对平板菌落图像采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像后续各个时间点与背景图的差分结果，并预处理，得到训练集；
步骤S3:构建并训练DetectionNet二分类检测网络；
步骤S4:将待测创面样本的平板菌落图像输入训练后的分类检测网络，确定样品中不同种类细菌类型。
在本实施例中，细菌菌落的图像数据收集实验流程如图1，主要包括以下步骤：
（1）琼脂层的注入量
选用无菌透明的Costar 6孔板、Costar 12孔板和Costar 24孔板制备琼脂平板，要求制备的琼脂平板透明轻薄。实验得到三种孔板的最佳注入量分别为：Costar 6孔板的琼脂注入量为1.6mL，Costar 12孔板的琼脂注入量为350uL、Costar 24孔板的琼脂注入量为100uL。
（2）孔板的选择
通过高内涵成像分析系统Operetta CLS扫描和成像细菌菌落，由于表面张力在琼脂平板边缘的琼脂总是形成曲面，从而使边缘的菌落图像失真，因此选择上述面积较大的孔板在菌落计数方面的误差更小，选定Costar 6孔板。
（3）琼脂平板的制备
使用微波炉加热融化的LB琼脂培养基，取1.6mL培养基倒入无菌Corning3516-6孔平板，静置凝固后待用。
（4）菌液涂布
加入40uL稀释合适倍数的PA、AB、SA和EC的单一菌液，一个孔加入一种细菌，使用涂布棒涂匀菌液，倒置放入培养箱培养中37℃培养2h。
（5）高内涵成像系统扫描细菌菌落
将上述培养后的6孔板转移至高内涵成像分析系统Operetta CLS中继续培养，设定培养温度和图像的捕获参数，进行连续菌落图像的捕获。
成像系统参数的设置：培养温度：37℃
放大倍数：5倍
拍摄间隔：1ms
边缘覆盖：20%
焦距调节层：- 40um
捕获时间：30min /次，12h
（6）琼脂平板上单一细菌菌落的延时图像的收集
获取菌落时序连续图像，时间范围为：2-14h，每间隔0.5h拍摄一张图像，每个时序的菌落图像写上不同的培养时间的标记，作为机器学习的图像训练集和图像盲测集。
（7）琼脂平板上混合细菌菌落的延时图像的收集
检测SA使用CHROMager Staph aureus培养基，检测PA使用CHROMagerPseudomonas培养基，检测EC使用CHROMager ECC培养基，检测AB使用CHROMagerAcinetobacter培养基。取1.6mL微波炉加热融化的选择性琼脂培养基（CHROMager），培养基倒入无菌6孔平板，静置凝固后待用。后续操作如上述（2-6）所述。
在本实施例中，参考图2，图像的自动处理，具体如下：
根据连续拍摄的菌落图像，将原图像数据集以灰度图方式读入；将第2小时图像作为背景图，分别将第2.5小时、3小时、3.5小时......至14小时图像，采用OpenCV的absdiff差分算法获取后续各个时间点与背景图的差分结果;
基于差分图像，进行傅里叶变换后的高通滤波与低通滤波、二值化操作后获取噪声消除后的二值化差分图；基于TowPass区域连通算法分割二值化差分图中所有的候选菌落；
基于灰度图的差分结果进行傅里叶变换操作，并使其高频中心化，获取图像频率数据；基于图像频率数据首先采用低通滤波算法，通过阈值设置为150。再采用高通滤波算法，通过阈值设置为1。将滤波降噪结果采用傅里叶反变换算法获取反变换图像;基于OpenCV的Threshold算法对反变换图像进行二值化操作，二值化阈值为178，获取二值化图像;
采用8邻近规则，进行第一轮连通区域标记。在邻近像素中，若有像素已被标记，则继承其label值，否则记为新label值。标记过程中记录每个label值之间的父节点关系；基于label值得父节点的关系表重映射每个label的根节点;基于重映射根节点表，进行第二轮label标记，将子节点label值用根节点label值覆盖，获取区域连通结果;统计每个连通区域像素数，低于50像素的区域被丢弃。将最终区域连通结果在原图上分割出矩形候选菌落图。
在本实施例中，基于深度学习DetectionNet网络从候选菌落图像中识别出杂质与真实菌落图像，并统计菌落数量。首先对矩形候选菌落图进行标记，标记类别分别为杂质、菌落。基于标记数据，划分训练集与独立测试集；基于PyTorch的预训练ResNet50网络构建DetectionNet二分类检测网络，检测真实菌落图像，并统计菌落数量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (7)

1.一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1:获取制备琼脂平板，并获取平板菌落图像；
步骤S2:对平板菌落图像采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像后续各个时间点与背景图的差分结果，并预处理，得到训练集；
步骤S3:构建并训练DetectionNet二分类检测网络；
步骤S4:将待测创面样本的平板菌落图像输入训练后的分类检测网络，确定样品中不同种类细菌类型。
2.根据权利要求1所述的基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：
步骤S1:使用微波炉加热融化的LB琼脂培养基，取培养基倒入无Costar 6孔平板，静置凝固后待用;
步骤S2:加入稀释预设倍数的铜绿假单胞菌PA、鲍曼不动杆菌AB、金黄色葡萄球菌SA和大肠杆菌EC的单一菌液，一个孔加入一种细菌，使用涂布棒涂匀菌液，倒置放入培养箱培养中培养；
步骤S3:培养后的Costar 6孔平板转移至高内涵成像分析系统Operetta CLS中继续培养，设定培养温度和图像的捕获参数，进行连续菌落图像的捕获。
3.根据权利要求1所述的基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：采用OpenCV的absdiff差分算法获取平板菌落图像各个时间点的灰度差分结果，采用傅里叶变换，低通滤波算法，OpenCV的Threshold算法获取二值化图像;采用8邻近规则进行连通区域标记杂质和菌落，划分训练集与独立测试集。
4.根据权利要求3所述的基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，所述采用8邻近规则进行连通区域标记杂质和菌落，具体为：在邻近像素中，若有像素已被标记，则继承其label值，否则记为新label值；标记过程中记录每个label值之间的父节点关系；基于label值得父节点的关系表重映射每个label的根节点;基于重映射根节点表，进行第二轮label标记，将子节点label值用根节点label值覆盖，获取区域连通结果;统计每个连通区域像素数，低于预设像素的区域被丢弃;将最终区域连通结果在原图上分割出矩形候选菌落图。
5.根据权利要求1所述的基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，所述ClassificationNet多分类网络基于PyTorch的预训练ResNet50网络构建。
6.根据权利要求1所述的基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测方法，其特征在于，所述待测创面样本的平板菌落图像获取，具体为：检测SA使用CHROMager Staph aureus培养基，检测PA使用CHROMager Pseudomonas培养基，检测EC使用CHROMager ECC培养基，检测AB使用CHROMager Acinetobacter培养基；取微波炉加热融化的选择性琼脂培养基（CHROMager），培养基倒入无菌6孔平板，静置凝固后待用；并基于步骤S1-S2，获取待测创面样本的平板菌落图像。
7.一种基于机器学习定性和定量不同创面细菌的检测系统,其特征在于，包括处理器、存储器以及存储在所述存储器上的计算机程序，所述处理器执行所述计算机程序时，具体执行如权利要求1-6任一项所述的定性和定量不同创面细菌的检测方法中的步骤。
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