JP2003085533A - 個数計数方法、そのためのプログラム、記録媒体および個数計数装置 - Google Patents
個数計数方法、そのためのプログラム、記録媒体および個数計数装置Info
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- JP2003085533A JP2003085533A JP2001272798A JP2001272798A JP2003085533A JP 2003085533 A JP2003085533 A JP 2003085533A JP 2001272798 A JP2001272798 A JP 2001272798A JP 2001272798 A JP2001272798 A JP 2001272798A JP 2003085533 A JP2003085533 A JP 2003085533A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】信頼性が高く，生菌数を迅速で正確に計数す
る． 【解決手段】測定対象を通過した光をエリアセンサで受
け，エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を２値
化して順次に２値化画像を得る．基準となる２値化画像
を画像記憶手段に記憶する．基準となる２値化画像を得
た後に得た２値化画像の中に所定の画素連結領域をそれ
ぞれ内部に含む判定領域を設定する．基準となる２値化
画像で判定領域に対応する比較領域の中に存在する画素
連結領域の個数を計数する．その比較領域内で計数され
た個数が０または１のとき，比較領域を判定領域で置き
換え，その個数が２以上のとき，比較領域を維持して，
画像記憶手段に記憶された２値化画像を更新する．画像
記憶手段に記憶された２値化画像の中の画素連結領域の
個数を計数する．
る． 【解決手段】測定対象を通過した光をエリアセンサで受
け，エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を２値
化して順次に２値化画像を得る．基準となる２値化画像
を画像記憶手段に記憶する．基準となる２値化画像を得
た後に得た２値化画像の中に所定の画素連結領域をそれ
ぞれ内部に含む判定領域を設定する．基準となる２値化
画像で判定領域に対応する比較領域の中に存在する画素
連結領域の個数を計数する．その比較領域内で計数され
た個数が０または１のとき，比較領域を判定領域で置き
換え，その個数が２以上のとき，比較領域を維持して，
画像記憶手段に記憶された２値化画像を更新する．画像
記憶手段に記憶された２値化画像の中の画素連結領域の
個数を計数する．
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は，個数計数方法，そ
のためのプログラム，記録媒体および個数計数装置に関
し，特に，コロニー数の計数に適したものに関する．
のためのプログラム，記録媒体および個数計数装置に関
し，特に，コロニー数の計数に適したものに関する．
【０００２】
【従来の技術】一般生菌数は，食品の検査試料1 ｇまた
は1 ｍｌ中に生存する微生物の数を表し，食品の微生物
汚染の指標として用いられる．生菌数の計数は，通常，
混釈法で行われている．混釈法では生菌の試料と標準寒
天培地をシャーレでよく混ぜ，35℃で48時間培養した後
に，増殖して形成されたコロニーの数を目視あるいはコ
ロニーカウンターを用いて計数する．
は1 ｍｌ中に生存する微生物の数を表し，食品の微生物
汚染の指標として用いられる．生菌数の計数は，通常，
混釈法で行われている．混釈法では生菌の試料と標準寒
天培地をシャーレでよく混ぜ，35℃で48時間培養した後
に，増殖して形成されたコロニーの数を目視あるいはコ
ロニーカウンターを用いて計数する．
【０００３】しかしながら，混釈法には以下の問題があ
る．まず，肉眼でコロニーを確認できるまで長時間の培
養を要すること．次に，人間が目視で計数するのは能率
的でないこと．また，コロニーカウンターでの計数も，
試料内の菌濃度が高い場合には長時間の培養の結果コロ
ニー同士が重なってしまい，計数が困難であったり不正
確であったりする問題がある．
る．まず，肉眼でコロニーを確認できるまで長時間の培
養を要すること．次に，人間が目視で計数するのは能率
的でないこと．また，コロニーカウンターでの計数も，
試料内の菌濃度が高い場合には長時間の培養の結果コロ
ニー同士が重なってしまい，計数が困難であったり不正
確であったりする問題がある．
【０００４】混釈法に対して，DNA を使用した方法や抗
原抗体反応を利用した方法等が提唱されている．これら
の方法は迅速法と呼ばれ，数分あるいは数時間で細菌を
検出できる利点がある．しかしながら，迅速法の多くは
菌の種類の同定を主な目的としており，死んだ菌にも反
応するなど，生菌数の計数に関しては信頼性に問題があ
る．
原抗体反応を利用した方法等が提唱されている．これら
の方法は迅速法と呼ばれ，数分あるいは数時間で細菌を
検出できる利点がある．しかしながら，迅速法の多くは
菌の種類の同定を主な目的としており，死んだ菌にも反
応するなど，生菌数の計数に関しては信頼性に問題があ
る．
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は，このような
従来の課題に着目してなされたもので，信頼性が高く，
なおかつ，生菌数を迅速で正確に計数することができる
個数計数方法，そのためのプログラム，記録媒体および
個数計数装置を提供することを目的としている．
従来の課題に着目してなされたもので，信頼性が高く，
なおかつ，生菌数を迅速で正確に計数することができる
個数計数方法，そのためのプログラム，記録媒体および
個数計数装置を提供することを目的としている．
【０００６】
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に，本発明に係る個数計数方法は，測定対象を通過した
光をエリアセンサで受け，前記エリアセンサが所定時間
ごとに取得した画像を２値化して順次に２値化画像を得
る２値化ステップと，基準となる前記２値化画像を画像
記憶手段に記憶する画像記憶ステップと，基準となる前
記２値化画像を得た後に得た前記２値化画像の中に所定
の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定領域を設定す
る領域設定ステップと，基準となる前記２値化画像で前
記判定領域に対応する比較領域の中に存在する前記画素
連結領域の個数を計数する領域内計数ステップと，前記
領域内計数ステップで計数された個数が０または１のと
き，前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記領域
内計数ステップで計数された個数が２以上のとき，前記
比較領域を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前
記２値化画像を更新する更新ステップと，前記画像記憶
手段に記憶された前記２値化画像の中の前記画素連結領
域の個数を計数する個数計数ステップとを，有すること
を特徴とする．
に，本発明に係る個数計数方法は，測定対象を通過した
光をエリアセンサで受け，前記エリアセンサが所定時間
ごとに取得した画像を２値化して順次に２値化画像を得
る２値化ステップと，基準となる前記２値化画像を画像
記憶手段に記憶する画像記憶ステップと，基準となる前
記２値化画像を得た後に得た前記２値化画像の中に所定
の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定領域を設定す
る領域設定ステップと，基準となる前記２値化画像で前
記判定領域に対応する比較領域の中に存在する前記画素
連結領域の個数を計数する領域内計数ステップと，前記
領域内計数ステップで計数された個数が０または１のと
き，前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記領域
内計数ステップで計数された個数が２以上のとき，前記
比較領域を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前
記２値化画像を更新する更新ステップと，前記画像記憶
手段に記憶された前記２値化画像の中の前記画素連結領
域の個数を計数する個数計数ステップとを，有すること
を特徴とする．
【０００７】本発明に係るプログラムは，測定対象を通
過した光を受けたエリアセンサが所定時間ごとに取得し
た画像を２値化して順次に２値化画像を得る２値化手段
と，基準となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段
と，基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値
化画像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む
判定領域を設定する領域設定手段と，基準となる前記２
値化画像で前記判定領域に対応する比較領域の中に存在
する前記画素連結領域の個数を計数する領域内計数手段
と，前記領域内計数手段で計数された個数が０または１
のとき，前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記
領域内計数手段で計数された個数が２以上のとき，前記
比較領域を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前
記２値化画像を更新する更新手段と，前記画像記憶手段
に記憶された前記２値化画像の中の前記画素連結領域の
個数を計数する個数計数手段として，コンピュータを機
能させることを特徴とする．本発明に係るコンピュータ
読み取り可能な記録媒体は，本発明に係るプログラムを
記録したものであることを特徴とする．
過した光を受けたエリアセンサが所定時間ごとに取得し
た画像を２値化して順次に２値化画像を得る２値化手段
と，基準となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段
と，基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値
化画像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む
判定領域を設定する領域設定手段と，基準となる前記２
値化画像で前記判定領域に対応する比較領域の中に存在
する前記画素連結領域の個数を計数する領域内計数手段
と，前記領域内計数手段で計数された個数が０または１
のとき，前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記
領域内計数手段で計数された個数が２以上のとき，前記
比較領域を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前
記２値化画像を更新する更新手段と，前記画像記憶手段
に記憶された前記２値化画像の中の前記画素連結領域の
個数を計数する個数計数手段として，コンピュータを機
能させることを特徴とする．本発明に係るコンピュータ
読み取り可能な記録媒体は，本発明に係るプログラムを
記録したものであることを特徴とする．
【０００８】本発明に係る個数計数装置は，光源と，測
定対象を通過した前記光源の光を受けるエリアセンサ
と，前記エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を
２値化して順次に２値化画像を得る２値化手段と，基準
となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段と，基準
となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画像の
中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定領域
を設定する領域設定手段と，基準となる前記２値化画像
で前記判定領域に対応する比較領域の中に存在する前記
画素連結領域の個数を計数する領域内計数手段と，前記
領域内計数手段で計数された個数が０または１のとき，
前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記領域内計
数手段で計数された個数が２以上のとき，前記比較領域
を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前記２値化
画像を更新する更新手段と，前記画像記憶手段に記憶さ
れた前記２値化画像の中の前記画素連結領域の個数を計
数する個数計数手段とを，有することを特徴とする．
定対象を通過した前記光源の光を受けるエリアセンサ
と，前記エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を
２値化して順次に２値化画像を得る２値化手段と，基準
となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段と，基準
となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画像の
中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定領域
を設定する領域設定手段と，基準となる前記２値化画像
で前記判定領域に対応する比較領域の中に存在する前記
画素連結領域の個数を計数する領域内計数手段と，前記
領域内計数手段で計数された個数が０または１のとき，
前記比較領域を前記判定領域で置き換え，前記領域内計
数手段で計数された個数が２以上のとき，前記比較領域
を維持して，前記画像記憶手段に記憶された前記２値化
画像を更新する更新手段と，前記画像記憶手段に記憶さ
れた前記２値化画像の中の前記画素連結領域の個数を計
数する個数計数手段とを，有することを特徴とする．
【０００９】本発明において，例えば，前記光源はレー
ザー装置またはＬＥＤから成り，前記測定対象は細菌培
地から成り，前記エリアセンサはＣＣＤから成る．
ザー装置またはＬＥＤから成り，前記測定対象は細菌培
地から成り，前記エリアセンサはＣＣＤから成る．
【００１０】
【発明の実施の形態】以下，図面に基づき，本発明の実
施の形態について説明する．図１乃至図１０は，本発明
の実施の形態を示している．本発明の実施の形態では，
本発明に係る個数計数方法，そのためのプログラム，記
録媒体および個数計数装置について，コロニー増殖過程
逐次計測による混釈法での生菌数高速自動計数法，その
ためのプログラム，記録媒体および個数計数装置に特定
して説明する．この計数法は，CCD 投影型顕微鏡を用い
た方法である．
施の形態について説明する．図１乃至図１０は，本発明
の実施の形態を示している．本発明の実施の形態では，
本発明に係る個数計数方法，そのためのプログラム，記
録媒体および個数計数装置について，コロニー増殖過程
逐次計測による混釈法での生菌数高速自動計数法，その
ためのプログラム，記録媒体および個数計数装置に特定
して説明する．この計数法は，CCD 投影型顕微鏡を用い
た方法である．
【００１１】この計数法は，一般生菌数の計数方法とし
て混釈法を採用し，コロニー増殖過程を顕微鏡で逐次拡
大計測し，コンピュータで画像処理することで早期にコ
ロニー数を計数する方法である．この計数法では，コロ
ニーにレーザー等の光を照射してCCD エリアセンサでコ
ロニーの陰影像を拡大観測する方法，および，培地を入
れる容器の結露を防ぐ構造を考案することにより，計測
の自動化を実現した．大腸菌による実験の結果，従来の
方法では48時間の計測が必要であったのに対して，8 時
間で計測が可能となった．
て混釈法を採用し，コロニー増殖過程を顕微鏡で逐次拡
大計測し，コンピュータで画像処理することで早期にコ
ロニー数を計数する方法である．この計数法では，コロ
ニーにレーザー等の光を照射してCCD エリアセンサでコ
ロニーの陰影像を拡大観測する方法，および，培地を入
れる容器の結露を防ぐ構造を考案することにより，計測
の自動化を実現した．大腸菌による実験の結果，従来の
方法では48時間の計測が必要であったのに対して，8 時
間で計測が可能となった．
【００１２】この計数法では，培養開始時から，試料を
顕微鏡で拡大して観測し，一定時間間隔で逐次画像情報
としてコンピュータに取り込む．適当な画像処理を行う
ことにより，増殖して大きくなったコロニーから順次検
出され，新たに検出されるコロニーが無くなった時に総
生菌数が確定する．従って，培養開始時間から短時間で
生菌数を確定することが可能である．また，コロニーが
重ならない段階から観測するために，正確な計数が可能
である．
顕微鏡で拡大して観測し，一定時間間隔で逐次画像情報
としてコンピュータに取り込む．適当な画像処理を行う
ことにより，増殖して大きくなったコロニーから順次検
出され，新たに検出されるコロニーが無くなった時に総
生菌数が確定する．従って，培養開始時間から短時間で
生菌数を確定することが可能である．また，コロニーが
重ならない段階から観測するために，正確な計数が可能
である．
【００１３】上記処理は，完全自動化が図られている．
ところで，自動化において2 つの問題が浮上した．ひと
つは，コロニーを拡大する顕微鏡に関する．焦点型光学
顕微鏡は，寒天培地中のいろいろな深度に分布する各コ
ロニーに焦点を合わせる必要があるために，特に寒天培
地が厚い場合には，自動化の観点からは不向きである．
本実施の形態では，CCD エリアセンサを用いた投影型顕
微鏡（以下CCD 投影型顕微鏡とする）を考案し，自動計
測を可能にした．他のひとつは，インキュベータ内でコ
ロニーを増殖させる容器に関する．混釈法で用いる通常
のシャーレの場合，シャーレの蓋の内側が結露し，計測
の障害となる．本稿では容器の構造を工夫して，長時間
の連続計測を可能にした．
ところで，自動化において2 つの問題が浮上した．ひと
つは，コロニーを拡大する顕微鏡に関する．焦点型光学
顕微鏡は，寒天培地中のいろいろな深度に分布する各コ
ロニーに焦点を合わせる必要があるために，特に寒天培
地が厚い場合には，自動化の観点からは不向きである．
本実施の形態では，CCD エリアセンサを用いた投影型顕
微鏡（以下CCD 投影型顕微鏡とする）を考案し，自動計
測を可能にした．他のひとつは，インキュベータ内でコ
ロニーを増殖させる容器に関する．混釈法で用いる通常
のシャーレの場合，シャーレの蓋の内側が結露し，計測
の障害となる．本稿では容器の構造を工夫して，長時間
の連続計測を可能にした．
【００１４】以下に，大腸菌E . coli (ATCC25922)の増
殖過程を計測し，本方法の有効性を確認した結果を示
す．まず， CCD投影型顕微鏡について説明する．CCD 投
影型顕微鏡の原理は，光源から光を被写体に照射し，被
写体の陰影像をCCD エリアセンサでとらえ，コンピュー
タへ画像情報として伝送するものである．光源には，レ
ーザー，あるいは点光源としてLED を用いる．原理の模
式図を図１に示す．
殖過程を計測し，本方法の有効性を確認した結果を示
す．まず， CCD投影型顕微鏡について説明する．CCD 投
影型顕微鏡の原理は，光源から光を被写体に照射し，被
写体の陰影像をCCD エリアセンサでとらえ，コンピュー
タへ画像情報として伝送するものである．光源には，レ
ーザー，あるいは点光源としてLED を用いる．原理の模
式図を図１に示す．
【００１５】1 画素のサイズが数μｍのCCD エリアセン
サを用いた場合，例えば1 μｍ四方の大きさの細菌がい
るとして，何回か分裂増殖してコロニーサイズが画素サ
イズより大きくなれば，原理的には陰影像としてコロニ
ーが検出され，コロニーが目視可能になるまで増殖する
より早い段階でコロニーを識別できると期待される．
サを用いた場合，例えば1 μｍ四方の大きさの細菌がい
るとして，何回か分裂増殖してコロニーサイズが画素サ
イズより大きくなれば，原理的には陰影像としてコロニ
ーが検出され，コロニーが目視可能になるまで増殖する
より早い段階でコロニーを識別できると期待される．
【００１６】また，この顕微鏡を用いれば，数ｍｍ程度
の厚さの寒天培地中のいろいろな深度に分布するコロニ
ーを各コロニーに焦点を合わせることなく同時に観測可
能である．このことは，焦点型光学顕微鏡と比較して計
測の自動化において利点となる．
の厚さの寒天培地中のいろいろな深度に分布するコロニ
ーを各コロニーに焦点を合わせることなく同時に観測可
能である．このことは，焦点型光学顕微鏡と比較して計
測の自動化において利点となる．
【００１７】作成した個数計数装置の構成を図２に示
す．この個数計数装置は，CCD 投影型顕微鏡システムと
して構成されている．システムはCCD エリアセンサ１，
光源２として用いるレーザーあるいはLED ，パーソナル
コンピュータ（パソコン）３，および，CCD エリアセン
サ１からの画像データをパソコン３に取得するインター
フェース４で構成される．パソコン３には，生菌数高速
自動計数法のためのプログラム（ソフトウェア）が組み
込まれている．
す．この個数計数装置は，CCD 投影型顕微鏡システムと
して構成されている．システムはCCD エリアセンサ１，
光源２として用いるレーザーあるいはLED ，パーソナル
コンピュータ（パソコン）３，および，CCD エリアセン
サ１からの画像データをパソコン３に取得するインター
フェース４で構成される．パソコン３には，生菌数高速
自動計数法のためのプログラム（ソフトウェア）が組み
込まれている．
【００１８】次に，培養容器５について説明する．生菌
は以下の手順で培養する．試料をシャーレに1 ｍｌ入
れ，これに約50℃に保温した15〜20ｍｌの標準寒天培地
を加える．シャーレを充分揺り動かして試料と培地を混
和する．通常は，この状態でシャーレを静置して培地を
凝固させるのが一般的で，凝固させた後，培地の乾燥を
抑える目的でシャーレに蓋をし，35℃のインキュベータ
内で48時間培養する．
は以下の手順で培養する．試料をシャーレに1 ｍｌ入
れ，これに約50℃に保温した15〜20ｍｌの標準寒天培地
を加える．シャーレを充分揺り動かして試料と培地を混
和する．通常は，この状態でシャーレを静置して培地を
凝固させるのが一般的で，凝固させた後，培地の乾燥を
抑える目的でシャーレに蓋をし，35℃のインキュベータ
内で48時間培養する．
【００１９】しかしこの方法では，培地の水分がシャー
レの蓋の内側に結露するため，計測時に逐一シャーレの
蓋を取り除く必要がある．これは自動化の際の障害とな
る．また，蓋を取るときシャーレの位置が動く可能性が
高く，同一領域のコロニー成長過程の計測が困難とな
る．
レの蓋の内側に結露するため，計測時に逐一シャーレの
蓋を取り除く必要がある．これは自動化の際の障害とな
る．また，蓋を取るときシャーレの位置が動く可能性が
高く，同一領域のコロニー成長過程の計測が困難とな
る．
【００２０】本実施の形態では，以下の構造の培地容器
５を考案することにより，培地の乾燥とシャーレの結露
を共に防ぎ，長時間の連続自動計測を実現した．容器全
体の構造を図３に示す．構造の要点の第1 は，計測する
領域の培地表面が空気層に接触しないように密閉する点
である．第2 は，全ての培地表面を密閉しないで，空気
層と接触する培地領域をつくる点である．この構造によ
り，空気層と接触する培地領域は結露するが，密閉した
培地領域は長時間の連続自動計測が可能である．計測領
域の培地を空気層に接触しないように密閉することは，
コロニーサイズの均一化を促し，コロニー数の計数の精
度を向上させる効果をも併せ持つことを述べておく．
５を考案することにより，培地の乾燥とシャーレの結露
を共に防ぎ，長時間の連続自動計測を実現した．容器全
体の構造を図３に示す．構造の要点の第1 は，計測する
領域の培地表面が空気層に接触しないように密閉する点
である．第2 は，全ての培地表面を密閉しないで，空気
層と接触する培地領域をつくる点である．この構造によ
り，空気層と接触する培地領域は結露するが，密閉した
培地領域は長時間の連続自動計測が可能である．計測領
域の培地を空気層に接触しないように密閉することは，
コロニーサイズの均一化を促し，コロニー数の計数の精
度を向上させる効果をも併せ持つことを述べておく．
【００２１】次に，コロニー数計数アルゴリズムについ
て説明する．まず，基本アルゴリズムは，以下のとおり
である．インキュベータ内にCCD 投影型顕微鏡と被写体
を設置する．CCD システムからはインキュベータの外部
に設置されたパソコン３の入力ボードに対して常に画像
情報を伝送する．ソフトウェアで入力ボードを制御し，
一定時間間隔で画像データを取得する．画像を取得する
毎に以下の画像処理を行う．
て説明する．まず，基本アルゴリズムは，以下のとおり
である．インキュベータ内にCCD 投影型顕微鏡と被写体
を設置する．CCD システムからはインキュベータの外部
に設置されたパソコン３の入力ボードに対して常に画像
情報を伝送する．ソフトウェアで入力ボードを制御し，
一定時間間隔で画像データを取得する．画像を取得する
毎に以下の画像処理を行う．
【００２２】(1) 画像の平滑化等の基礎処理を，あらか
じめ設定したパラメータで行う． (2) 画像を2 値化する． (3) 2 値化された画像の連結領域の個数をコロニー数と
して計数する．
じめ設定したパラメータで行う． (2) 画像を2 値化する． (3) 2 値化された画像の連結領域の個数をコロニー数と
して計数する．
【００２３】(1) の画像の平滑化は，光源２にレーザー
を用いる場合に行う．(2) の画像の2 値化では，判別分
析法を用いてしきい値を自動決定する．判別分析法は，
濃度値の集合を2 つのクラスに分けたときクラス間の分
離が最も良くなるようにしきい値を求めるものである．
を用いる場合に行う．(2) の画像の2 値化では，判別分
析法を用いてしきい値を自動決定する．判別分析法は，
濃度値の集合を2 つのクラスに分けたときクラス間の分
離が最も良くなるようにしきい値を求めるものである．
【００２４】ところでグレースケール画像に対して判別
分析法を用いると，必ずあるしきい値が決定される．従
って，(1) で得た画像に対してそのま判別分析法を用い
た場合，培養初期段階でコロニーが増殖していない画像
でも，培地領域の僅かな階調の変化がコロニーと識別さ
れてしまうという不都合が生じる．これを避けるために
(2) の処理では，(1) で得た画像の適当な微小領域をコ
ロニー参照系と考えて意図的に画素値を0 に置換し，そ
の後に，判別分析法を用いる．その結果，コロニーが成
長していない培養初期でも，参照領域がコロニーと識別
され，参照領域以外は培地として正しく識別される．
分析法を用いると，必ずあるしきい値が決定される．従
って，(1) で得た画像に対してそのま判別分析法を用い
た場合，培養初期段階でコロニーが増殖していない画像
でも，培地領域の僅かな階調の変化がコロニーと識別さ
れてしまうという不都合が生じる．これを避けるために
(2) の処理では，(1) で得た画像の適当な微小領域をコ
ロニー参照系と考えて意図的に画素値を0 に置換し，そ
の後に，判別分析法を用いる．その結果，コロニーが成
長していない培養初期でも，参照領域がコロニーと識別
され，参照領域以外は培地として正しく識別される．
【００２５】(3) でのコロニー数の計数では参照領域を
除外して処理する．また，必要に応じて，あらかじめ指
定した適当な処理により，小さいコロニーはノイズとみ
なし除外する．
除外して処理する．また，必要に応じて，あらかじめ指
定した適当な処理により，小さいコロニーはノイズとみ
なし除外する．
【００２６】次に，重なったコロニーを分離識別するア
ルゴリズムについて説明する．菌濃度が高い場合は，コ
ロニーの成長に伴ってコロニー陰影像が重なる場合があ
る．本実施の形態では，コロニーの成長過程を継続して
観測するために，コロニーが重なる以前の画像情報を利
用して，重なったコロニーを分離識別することが可能で
ある．各コロニーが成長して検出される時間は，コロニ
ーの場所によって異なる．コロニーの成長過程の情報を
利用するためには，培地それぞれの場所でのコロニー成
長に注目する必要がある．
ルゴリズムについて説明する．菌濃度が高い場合は，コ
ロニーの成長に伴ってコロニー陰影像が重なる場合があ
る．本実施の形態では，コロニーの成長過程を継続して
観測するために，コロニーが重なる以前の画像情報を利
用して，重なったコロニーを分離識別することが可能で
ある．各コロニーが成長して検出される時間は，コロニ
ーの場所によって異なる．コロニーの成長過程の情報を
利用するためには，培地それぞれの場所でのコロニー成
長に注目する必要がある．
【００２７】重なったコロニーを分離識別するために，
基本アルゴリズムの処理(2) に続いて以下の処理を行
う．この処理は，計測開始時に取得する画像の処理と，
その後に継続的に取得する画像の処理とで異なる．処理
の流れを図４に示す．第1 取得画像に対しては以下の処
理を行う．2 値化された画像を，コロニー識別画像とし
て記憶する．コロニー識別画像は最も正確なコロニー情
報をもつ画像と考え，以後，新しく画像が取得される毎
に以下のアルゴリズムで更新していく．
基本アルゴリズムの処理(2) に続いて以下の処理を行
う．この処理は，計測開始時に取得する画像の処理と，
その後に継続的に取得する画像の処理とで異なる．処理
の流れを図４に示す．第1 取得画像に対しては以下の処
理を行う．2 値化された画像を，コロニー識別画像とし
て記憶する．コロニー識別画像は最も正確なコロニー情
報をもつ画像と考え，以後，新しく画像が取得される毎
に以下のアルゴリズムで更新していく．
【００２８】第2 取得画像以後の取得画像に対しては，
まず，2 値化された画像からコロニー数N を計数する．
各コロニーを内部に含むN 個の微小領域S i （i ＝1 〜
N ）それぞれについて以下の処理を行う．
まず，2 値化された画像からコロニー数N を計数する．
各コロニーを内部に含むN 個の微小領域S i （i ＝1 〜
N ）それぞれについて以下の処理を行う．
【００２９】(i) コロニー識別画像の対応する領域S i
内に存在するコロニー数n を計数する． (ii)n が0 の場合は，領域S i に新しくコロニーが生成
したと判定する．n が1 の場合は，領域S i のコロニー
は以前から検出されていたコロニーと判定する．いずれ
の場合も，新規取得画像の領域S i の画像をコロニー識
別画像の領域Si に埋め込み，コロニー識別画像を更新
する． (iii) ｎが２以上の場合は，以前から検出されていたｎ
個のコロニーが重なって領域Ｓi に１個のコロニーを形
成したと判定する．コロニー識別画像の領域Ｓi は変更
しない．
内に存在するコロニー数n を計数する． (ii)n が0 の場合は，領域S i に新しくコロニーが生成
したと判定する．n が1 の場合は，領域S i のコロニー
は以前から検出されていたコロニーと判定する．いずれ
の場合も，新規取得画像の領域S i の画像をコロニー識
別画像の領域Si に埋め込み，コロニー識別画像を更新
する． (iii) ｎが２以上の場合は，以前から検出されていたｎ
個のコロニーが重なって領域Ｓi に１個のコロニーを形
成したと判定する．コロニー識別画像の領域Ｓi は変更
しない．
【００３０】これらの処理を行ったコロニー識別画像に
基づいてコロニー数を計数し，その時点で検出されたコ
ロニー数とする．コロニーが重なる場合も，重なる領域
は重なる以前の画像情報を用いるため，正確な個数が得
られる．これらの処理を図５にフローチャートで示す．
また，その処理を行う構成をブロック図で図６に示す．
基づいてコロニー数を計数し，その時点で検出されたコ
ロニー数とする．コロニーが重なる場合も，重なる領域
は重なる以前の画像情報を用いるため，正確な個数が得
られる．これらの処理を図５にフローチャートで示す．
また，その処理を行う構成をブロック図で図６に示す．
【００３１】次に，ノイズを除去するアルゴリズムにつ
いて説明する．CCD 投影型顕微鏡の陰影像には，培養初
期から確認されて培養後も変化しないノイズが認められ
ることがある．これらのノイズは，培養開始時に取得し
た画像を参照画像とし，画像の差分をとることで除去可
能である．画像処理は，第１取得画像以外の画像に対し
て行うこととし，基本アルゴリズムの(1) の処理に先立
って，次の処理を行う．取得画像と，参照画像の差分を
とり，差分画像を以後の処理対象画像とする．
いて説明する．CCD 投影型顕微鏡の陰影像には，培養初
期から確認されて培養後も変化しないノイズが認められ
ることがある．これらのノイズは，培養開始時に取得し
た画像を参照画像とし，画像の差分をとることで除去可
能である．画像処理は，第１取得画像以外の画像に対し
て行うこととし，基本アルゴリズムの(1) の処理に先立
って，次の処理を行う．取得画像と，参照画像の差分を
とり，差分画像を以後の処理対象画像とする．
【００３２】
【実施例】〔実験方法〕陰影画像の取得および解析に
は，図２に示したシステムおよび図３に示した培養容器
を用いて行う．光源には白色LED を用いる．CCD エリア
センサは，市販の対角1/3 インチ白黒CCD カメラのレン
ズを除去して使用した．素子数は768 ×494 （有効画
素），1素子のサイズは8.4 μm ×9.8 μm である．
は，図２に示したシステムおよび図３に示した培養容器
を用いて行う．光源には白色LED を用いる．CCD エリア
センサは，市販の対角1/3 インチ白黒CCD カメラのレン
ズを除去して使用した．素子数は768 ×494 （有効画
素），1素子のサイズは8.4 μm ×9.8 μm である．
【００３３】CCD エリアセンサから出力されたNTSC信号
はビデオキャプチャボード（商品名：National Instru
ments (NI) 社IMAQ-1408 ）を用いて取り込む方式を採
用した．取得画像の画素数は640 ×480 で各画素が8 ビ
ットのグレースケール階調をもつ．システムの制御と画
像処理のプログラミングは，市販のソフトウェア（NI社
の商品名：LabVIEW とIMAQ Vision ）を用いた．
はビデオキャプチャボード（商品名：National Instru
ments (NI) 社IMAQ-1408 ）を用いて取り込む方式を採
用した．取得画像の画素数は640 ×480 で各画素が8 ビ
ットのグレースケール階調をもつ．システムの制御と画
像処理のプログラミングは，市販のソフトウェア（NI社
の商品名：LabVIEW とIMAQ Vision ）を用いた．
【００３４】CCD エリアセンサとシャーレの距離が接近
しているために，インキュベータの温度を35℃に設定す
るとCCD エリアセンサの発熱でシャーレ内の培地が35℃
よりも上昇する．そのため，コロニーの増殖が妨げられ
るので，インキュベータの温度を30℃と設定した．培養
に用いた標準寒天培地の厚さは5mm である．画像は15分
間隔で取得した．
しているために，インキュベータの温度を35℃に設定す
るとCCD エリアセンサの発熱でシャーレ内の培地が35℃
よりも上昇する．そのため，コロニーの増殖が妨げられ
るので，インキュベータの温度を30℃と設定した．培養
に用いた標準寒天培地の厚さは5mm である．画像は15分
間隔で取得した．
【００３５】次に，基本アルゴリズムを用いた結果につ
いて説明する．コロニーを計数する前に，小さいコロニ
ーをノイズとして除去する目的で，2値化された画像の
全ての画素に対して侵食処理（erosion ）をm 回施し，
その後に拡散処理（dilation）をm 回行う．ここで侵食
処理は，着目する画素の8 近傍画素のいずれかが培地の
白ならば着目する画素を白に変換する．拡散処理は着目
する画素の8 近傍画素のいずれかがコロニーの黒ならば
着目する画素を黒に変換する．この連結処理で，例えば
1 辺の画素数が2m個の黒い正方形のコロニー像は除去さ
れ，除去されなかったコロニーはもとの形状を保持す
る．ここではm=2 とした．
いて説明する．コロニーを計数する前に，小さいコロニ
ーをノイズとして除去する目的で，2値化された画像の
全ての画素に対して侵食処理（erosion ）をm 回施し，
その後に拡散処理（dilation）をm 回行う．ここで侵食
処理は，着目する画素の8 近傍画素のいずれかが培地の
白ならば着目する画素を白に変換する．拡散処理は着目
する画素の8 近傍画素のいずれかがコロニーの黒ならば
着目する画素を黒に変換する．この連結処理で，例えば
1 辺の画素数が2m個の黒い正方形のコロニー像は除去さ
れ，除去されなかったコロニーはもとの形状を保持す
る．ここではm=2 とした．
【００３６】図７に検出されたコロニーの数を培養開始
からの時間の関数として示す．コロニーは6 時間後から
急に検出され始める．8 時間後以降のコロニー数はほぼ
一定であることから，8 時間でほぼ全てのコロニーが検
出されたことを表している．コロニー数の変化を詳細に
みると，8 時間15分にコロニー数がいったん減少し，そ
の後また増大する現象が確認される．コロニー数の減少
はロニーが重なったことに起因し，増大は新たなコロニ
ーが検出されたことによる．
からの時間の関数として示す．コロニーは6 時間後から
急に検出され始める．8 時間後以降のコロニー数はほぼ
一定であることから，8 時間でほぼ全てのコロニーが検
出されたことを表している．コロニー数の変化を詳細に
みると，8 時間15分にコロニー数がいったん減少し，そ
の後また増大する現象が確認される．コロニー数の減少
はロニーが重なったことに起因し，増大は新たなコロニ
ーが検出されたことによる．
【００３７】図８に，１２時間経過時に取得した画像を
2 値化した画像を示す．培養１２時間後に取得されたコ
ロニー像を目視することで確実にコロニーと判定される
像は全て図８で正しく判定されており，検出アルゴリズ
ムの精度の高さを示している．しかし，図７に示したA
，B ，C のコロニーはそれぞれひとつのコロニーとし
て計数されているが，実際には２値化前の画像から複数
のコロニーが重なったものであることが判別できる．ま
た，図８の矢印で示した陰影は，培養初期から確認され
ているノイズであるが，図８で１個のコロニーと計数さ
れている．
2 値化した画像を示す．培養１２時間後に取得されたコ
ロニー像を目視することで確実にコロニーと判定される
像は全て図８で正しく判定されており，検出アルゴリズ
ムの精度の高さを示している．しかし，図７に示したA
，B ，C のコロニーはそれぞれひとつのコロニーとし
て計数されているが，実際には２値化前の画像から複数
のコロニーが重なったものであることが判別できる．ま
た，図８の矢印で示した陰影は，培養初期から確認され
ているノイズであるが，図８で１個のコロニーと計数さ
れている．
【００３８】次に，重なったコロニーを分離識別するア
ルゴリズムとノイズを除去するアルゴリズムを用いた結
果について説明する．各コロニーを内部に含むN 個の微
小領域S i として，各コロニーに外接するＮ個の長方形
を用いた．培養開始12時間後のコロニー識別画像を図９
に示す．図９では，図８で重なっていたコロニーがA と
B では明確に分離されている．また，図８でコロニーと
識別されたノイズが除去されている．図１０にコロニー
数の時間変化を示す．コロニー数は減少することなく，
一定値に収束していることが確認でき，アルゴリズムの
有効性を示している．
ルゴリズムとノイズを除去するアルゴリズムを用いた結
果について説明する．各コロニーを内部に含むN 個の微
小領域S i として，各コロニーに外接するＮ個の長方形
を用いた．培養開始12時間後のコロニー識別画像を図９
に示す．図９では，図８で重なっていたコロニーがA と
B では明確に分離されている．また，図８でコロニーと
識別されたノイズが除去されている．図１０にコロニー
数の時間変化を示す．コロニー数は減少することなく，
一定値に収束していることが確認でき，アルゴリズムの
有効性を示している．
【００３９】コロニーC は図９では1 個と計数されてい
るが，2 個か3 個のコロニーが重なったものである可能
性が高いため，計数誤差は4 ％程度と評価される．画像
取得の時間間隔を短くすればコロニーC についても分離
識別できる可能性がある．以上のとおり，混釈法に基づ
く一般生菌数の計数で，顕微鏡でみたコロニー画像を培
養の初期から逐次コンピュータに取り込み，画像処理に
よりコロニー数を実時間で計数していく方法を説明し
た．各コロニーに焦点を合わせる必要がないCCD 投影型
顕微鏡，および，培地容器の結露を防ぐ構造により，計
測の自動化を実現した．取得画像の2 値化を含め，計数
処理の完全自動化を実現した．特にコロニーが重なった
場合の計数方法が，コロニーが重なる前の画像情報を利
用するアルゴリズムにより達成される．
るが，2 個か3 個のコロニーが重なったものである可能
性が高いため，計数誤差は4 ％程度と評価される．画像
取得の時間間隔を短くすればコロニーC についても分離
識別できる可能性がある．以上のとおり，混釈法に基づ
く一般生菌数の計数で，顕微鏡でみたコロニー画像を培
養の初期から逐次コンピュータに取り込み，画像処理に
よりコロニー数を実時間で計数していく方法を説明し
た．各コロニーに焦点を合わせる必要がないCCD 投影型
顕微鏡，および，培地容器の結露を防ぐ構造により，計
測の自動化を実現した．取得画像の2 値化を含め，計数
処理の完全自動化を実現した．特にコロニーが重なった
場合の計数方法が，コロニーが重なる前の画像情報を利
用するアルゴリズムにより達成される．
【００４０】本実施の形態の生菌数の計数方法は，食品
衛生法に基づく公定法で定められた混釈法を採用してい
る．本方法は，公定法に準じ，かつ迅速に計数できると
いう利点を持つ．
衛生法に基づく公定法で定められた混釈法を採用してい
る．本方法は，公定法に準じ，かつ迅速に計数できると
いう利点を持つ．
【００４１】前述の実施例では，大腸菌を用いた実験
で，8 〜9 時間の培養でコロニー数が4％の誤差範囲で
計数され，提案方法が有効であることが確認された．本
実施の形態で用いた画像取得システムに関しては，焦点
型光学顕微鏡も培地が厚くない場合は有効である可能性
がある．
で，8 〜9 時間の培養でコロニー数が4％の誤差範囲で
計数され，提案方法が有効であることが確認された．本
実施の形態で用いた画像取得システムに関しては，焦点
型光学顕微鏡も培地が厚くない場合は有効である可能性
がある．
【００４２】本実施の形態の計数方法は培地の一部を観
察している．菌濃度が低い場合は，CCD サイズの増大化
あるいは複数箇所の撮影による，より広い領域の計測を
行ってもよい．
察している．菌濃度が低い場合は，CCD サイズの増大化
あるいは複数箇所の撮影による，より広い領域の計測を
行ってもよい．
【００４３】本実施例では，大腸菌E . coli (ATCC2592
2)を用いたが，種々の菌の成長過程についての計数も可
能である．また，本発明に係る個数計数方法，そのため
のプログラム，記録媒体および個数計数装置は，コロニ
ー以外のもの，特に，次第に増殖または成長するものの
測定に適用することができる．
2)を用いたが，種々の菌の成長過程についての計数も可
能である．また，本発明に係る個数計数方法，そのため
のプログラム，記録媒体および個数計数装置は，コロニ
ー以外のもの，特に，次第に増殖または成長するものの
測定に適用することができる．
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば，信頼性が高く，なおか
つ，生菌数を迅速で正確に計数することができる個数計
数方法，そのためのプログラム，記録媒体および個数計
数装置を提供することができる．
つ，生菌数を迅速で正確に計数することができる個数計
数方法，そのためのプログラム，記録媒体および個数計
数装置を提供することができる．
【図１】本発明の実施の形態の個数計数装置で用いるＣ
ＣＤ投影型顕微鏡の原理を示す模式図である．
ＣＤ投影型顕微鏡の原理を示す模式図である．
【図２】本発明の実施の形態の個数計数装置の構成を示
す概略図である．
す概略図である．
【図３】本発明の実施の形態の個数計数装置で用いる培
養容器の構造を示す概略図である．
養容器の構造を示す概略図である．
【図４】図２に示す個数計数装置で用いるコロニー識別
アルゴリズムを示す説明図である．
アルゴリズムを示す説明図である．
【図５】図２に示す個数計数装置による個数計数方法を
示すフローチャトである．
示すフローチャトである．
【図６】図２に示す個数計数装置の概略ブロック図であ
る．
る．
【図７】図２に示す個数計数装置の基本アルゴリズムで
計測されたコロニー数と時間との関係を示すグラフであ
る．
計測されたコロニー数と時間との関係を示すグラフであ
る．
【図８】図２に示す個数計数装置で培養12時間後に取得
されたコロニー像を２値化した画像を示す図である．
されたコロニー像を２値化した画像を示す図である．
【図９】図２に示す個数計数装置で培養12時間後のコロ
ニー識別画像を示す図である．
ニー識別画像を示す図である．
【図１０】図２に示す個数計数装置により，重なったコ
ロニーを分離識別するアルゴリズムとノイズを除去する
アルゴリズムで計測されたコロニー数と時間との関係を
示すグラフである．
ロニーを分離識別するアルゴリズムとノイズを除去する
アルゴリズムで計測されたコロニー数と時間との関係を
示すグラフである．
１ CCD エリアセンサ
２ 光源
３ パーソナルコンピュータ（パソコン）
４ インターフェース
５ 培養容器
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０６Ｔ 7/00 ２００ Ｇ０６Ｔ 7/00 ２００Ａ
Ｆターム(参考） 4B029 AA07 FA10
4B063 QA01 QQ05 QR74 QS39 QX01
5B057 AA10 BA24 BA29 CA08 CA12
CA16 CB06 CB12 CB16 CE12
CH01 CH11 DA13 DA16
5L096 AA06 BA20 CA14 CA24 EA43
FA76 LA05 LA08
Claims (5)
- 【請求項１】測定対象を通過した光をエリアセンサで受
け、前記エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を
２値化して順次に２値化画像を得る２値化ステップと、 基準となる前記２値化画像を画像記憶手段に記憶する画
像記憶ステップと、 基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画
像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定
領域を設定する領域設定ステップと、 基準となる前記２値化画像で前記判定領域に対応する比
較領域の中に存在する前記画素連結領域の個数を計数す
る領域内計数ステップと、 前記領域内計数ステップで計数された個数が０または１
のとき、前記比較領域を前記判定領域で置き換え、前記
領域内計数ステップで計数された個数が２以上のとき、
前記比較領域を維持して、前記画像記憶手段に記憶され
た前記２値化画像を更新する更新ステップと、 前記画像記憶手段に記憶された前記２値化画像の中の前
記画素連結領域の個数を計数する個数計数ステップと
を、 有することを特徴とする個数計数方法。 - 【請求項２】測定対象を通過した光を受けたエリアセン
サが所定時間ごとに取得した画像を２値化して順次に２
値化画像を得る２値化手段と、 基準となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段と、 基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画
像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定
領域を設定する領域設定手段と、 基準となる前記２値化画像で前記判定領域に対応する比
較領域の中に存在する前記画素連結領域の個数を計数す
る領域内計数手段と、 前記領域内計数手段で計数された個数が０または１のと
き、前記比較領域を前記判定領域で置き換え、前記領域
内計数手段で計数された個数が２以上のとき、前記比較
領域を維持して、前記画像記憶手段に記憶された前記２
値化画像を更新する更新手段と、 前記画像記憶手段に記憶された前記２値化画像の中の前
記画素連結領域の個数を計数する個数計数手段として、 コンピュータを機能させるためのプログラム。 - 【請求項３】測定対象を通過した光を受けたエリアセン
サが所定時間ごとに取得した画像を２値化して順次に２
値化画像を得る２値化手段と、 基準となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段と、 基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画
像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定
領域を設定する領域設定手段と、 基準となる前記２値化画像で前記判定領域に対応する比
較領域の中に存在する前記画素連結領域の個数を計数す
る領域内計数手段と、 前記領域内計数手段で計数された個数が０または１のと
き、前記比較領域を前記判定領域で置き換え、前記領域
内計数手段で計数された個数が２以上のとき、前記比較
領域を維持して、前記画像記憶手段に記憶された前記２
値化画像を更新する更新手段と、 前記画像記憶手段に記憶された前記２値化画像の中の前
記画素連結領域の個数を計数する個数計数手段として、 コンピュータを機能させるためのプログラムを記録した
コンピュータ読み取り可能な記録媒体。 - 【請求項４】光源と、 測定対象を通過した前記光源の光を受けるエリアセンサ
と、 前記エリアセンサが所定時間ごとに取得した画像を２値
化して順次に２値化画像を得る２値化手段と、 基準となる前記２値化画像を記憶する画像記憶手段と、 基準となる前記２値化画像を得た後に得た前記２値化画
像の中に所定の画素連結領域をそれぞれ内部に含む判定
領域を設定する領域設定手段と、 基準となる前記２値化画像で前記判定領域に対応する比
較領域の中に存在する前記画素連結領域の個数を計数す
る領域内計数手段と、 前記領域内計数手段で計数された個数が０または１のと
き、前記比較領域を前記判定領域で置き換え、前記領域
内計数手段で計数された個数が２以上のとき、前記比較
領域を維持して、前記画像記憶手段に記憶された前記２
値化画像を更新する更新手段と、 前記画像記憶手段に記憶された前記２値化画像の中の前
記画素連結領域の個数を計数する個数計数手段とを、 有することを特徴とする個数計数装置。 - 【請求項５】前記光源はレーザー装置またはＬＥＤから
成り、前記測定対象は細菌培地から成り、前記エリアセ
ンサはＣＣＤから成ることを特徴とする請求項４記載の
個数計数装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001272798A JP4722343B2 (ja) | 2001-09-07 | 2001-09-07 | 個数計数方法、そのためのプログラム、記録媒体および個数計数装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001272798A JP4722343B2 (ja) | 2001-09-07 | 2001-09-07 | 個数計数方法、そのためのプログラム、記録媒体および個数計数装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003085533A true JP2003085533A (ja) | 2003-03-20 |
| JP4722343B2 JP4722343B2 (ja) | 2011-07-13 |
Family
ID=19098106
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001272798A Expired - Lifetime JP4722343B2 (ja) | 2001-09-07 | 2001-09-07 | 個数計数方法、そのためのプログラム、記録媒体および個数計数装置 |
Country Status (1)
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|---|---|
| JP (1) | JP4722343B2 (ja) |
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2001
- 2001-09-07 JP JP2001272798A patent/JP4722343B2/ja not_active Expired - Lifetime
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