WO2015025506A1 - 幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラム - Google Patents

幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラム Download PDF

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WO2015025506A1
WO2015025506A1 PCT/JP2014/004204 JP2014004204W WO2015025506A1 WO 2015025506 A1 WO2015025506 A1 WO 2015025506A1 JP 2014004204 W JP2014004204 W JP 2014004204W WO 2015025506 A1 WO2015025506 A1 WO 2015025506A1
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WO
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stem cell
feature amount
observation
information
change
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Application number
PCT/JP2014/004204
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Inventor
尭之 辻本
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富士フイルム株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/4833—Physical analysis of biological material of solid biological material, e.g. tissue samples, cell cultures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability

Definitions

  • the present invention relates to a stem cell differentiation determination apparatus, method, and program for determining differentiation of stem cells based on an observation image obtained by imaging an observation area including stem cells.
  • Stem cells such as ES cells and iPS cells have the ability to differentiate into cells of various tissues, and are attracting attention as potential applications in regenerative medicine, drug development, disease clarification, and the like.
  • Stem cells are seeded in a culture medium in a culture vessel set in a cell culture apparatus, proliferate on the culture medium, and adjacent stem cell colonies grow by repeating binding.
  • stem cells In the growth process of stem cells, in order to improve differentiation efficiency when differentiating stem cells into cells of a target tissue, it is required to proliferate while maintaining an undifferentiated state. And the stem cell which once started differentiation can not be made to grow in the objective tissue.
  • stem cell colonies are cut out and transplanted to another culture vessel and passage is carried out, but at this passage, only undifferentiated stem cells need to be extracted. is there. That is, when culturing stem cells, it is necessary to appropriately determine the undifferentiation and differentiation of stem cells.
  • Patent Document 1 it is proposed to image stem cells temporally and to judge undifferentiation / differentiation by capturing temporal changes in the observation image.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 it has been proposed to obtain various feature quantities of stem cell colonies being cultured, and to discriminate undifferentiated / differentiated in colony units based on the feature quantities.
  • Patent Document 5 it has been proposed to determine the undifferentiation / differentiation of stem cells using several tens of feature amounts such as the number of stem cells and the number of nucleoli.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 when undifferentiated / differentiated is determined in colony units, a culture person takes a huge amount of time to check all the colonies or randomly select colonies. Although confirmation will be made, the former is inefficient, and the latter is not an appropriate confirmation method because heterogeneity occurs in each colony even in culture under the same conditions.
  • Patent Document 5 discloses that determination of undifferentiation / differentiation is performed based on various feature amounts. However, when the culture person confirms the determination result of undifferentiation / differentiation, which feature amount is determined It can not be confirmed whether it is the determination result used, but there is a problem that the culture person's interpretation of the determination result largely depends on the skill of the culture person.
  • An object of the present invention is to provide a stem cell differentiation determination apparatus, method, and program that allow a culture person to confirm undifferentiation and differentiation efficiently and accurately in view of the above problems.
  • the stem cell differentiation determination apparatus of the present invention is characterized by acquiring at least one feature amount of stem cells for each observation image, and an observation image acquisition unit for acquiring at least two observation images of imaging observation regions including stem cells in time series. Information regarding changes in feature quantities between observation images captured in time series or between observation images, a determination unit that determines whether stem cells are undifferentiated or differentiated based on the amount acquisition unit, and the feature quantities
  • the information processing apparatus is characterized by including: a change information acquisition unit that acquires information on a change in the determination result from undifferentiated to differentiation in the unit;
  • the change information acquisition unit serves as the information on the change in the feature amount, such as time information when the feature amount changes, an observation image in which the feature amount changes, and an observation area in which the feature amount changes. Position information and information identifying a stem cell colony whose feature value has changed can be acquired.
  • the change information acquisition unit serves as information on the change in the determination result, such as time information when the determination result changes, an observation image in which the determination result changes, position information in the observation area where the determination result changes, and stem cells And at least one of the information identifying the colonies of
  • the feature for each of the regions is Based on the above, it is possible to provide a reliability acquisition unit for acquiring the reliability of the determination result for each area, and to preferentially output the output unit from the observation image of the area with low reliability.
  • the above region can be a region of stem cell colonies.
  • the above-mentioned area can be set as a preset divided area.
  • the output unit can output the feature amount.
  • a photographing unit for photographing an observation image may be provided, and the photographing unit may switch the optical magnification or resolution at the time of photographing the observation image according to the set feature amount to be focused.
  • the output unit can output an observation image of the entire colony of stem cells.
  • the output unit can output a partial observation image in the stem cell colony.
  • the output unit may output, as a moving image, a plurality of observation images captured before and after the time when the feature amount changes or the time when the determination result changes.
  • the stem cell differentiation determination method of the present invention acquires at least two observation images of imaging observation regions including stem cells in time series, acquires at least one feature amount of stem cells for each observation image, and is based on the feature amount.
  • the information regarding the change in the feature amount between the observation images captured in time series or the change in the determination result from undifferentiation to differentiation among the observation images It is characterized in that information is acquired, and information on a change in the feature amount or information on a change in the determination result is output.
  • the stem cell differentiation determination program of the present invention comprises a computer, an observation image acquisition unit for acquiring at least two observation images obtained by imaging observation regions including stem cells in time series, and at least one feature amount of stem cells for each observation image. Information about changes in feature amounts between observation images captured in time series, a determination unit that determines whether stem cells are undifferentiated or differentiated based on the feature amounts to be acquired and the feature amounts, or It is characterized in that it functions as a change information acquisition unit that acquires information on a change in determination result from undifferentiated to differentiation between observed images, and an output unit that outputs information on a change in feature amount or information on a change in determination result. Do.
  • the stem cell differentiation determination apparatus and method and program of the present invention at least two observation images obtained by photographing the observation area including the stem cells in time series are acquired, and at least one feature value of the stem cells is acquired for each observation image.
  • information about changes in feature value between observation images captured in time series or undifferentiation between observation images Information on the change in the determination result to differentiation is acquired, and information on the change in the feature amount or information on the change in the determination result is output, so that the information confirmed by the culture person can be limited.
  • the culture person can confirm undifferentiation and differentiation efficiently and accurately.
  • Block diagram showing a schematic configuration of a stem cell culture observation system using the first embodiment of the stem cell differentiation determination apparatus of the present invention A diagram showing an example of a table in which feature amounts of interest are associated with magnification and resolution
  • a diagram showing an example of divided areas obtained by dividing an observation area Diagram showing an example of the observation area Flow chart for explaining the operation of the stem cell culture observation system shown in FIG. 1
  • Block diagram showing a schematic configuration of a stem cell culture observation system using a second embodiment of the stem cell differentiation determination apparatus of the present invention A diagram showing an example in which images of stem cell colonies are displayed side by side in a preset sequence based on the degree of reliability
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a stem cell culture observation system.
  • the stem cell culture observation system includes, as shown in FIG. 1, a stem cell culture device 1, an imaging device 2, a stem cell differentiation determination device 3, a display 4, and an input device 5.
  • the stem cell culture apparatus 1 is an apparatus for culturing stem cells.
  • the stem cell culture apparatus 1 a plurality of culture vessels in which stem cells to be cultured are seeded in a medium are accommodated.
  • the stem cell culture apparatus 1 further includes a stage 10, a transport unit 11, and a control unit 12.
  • the stage 10 is provided with a culture vessel to be photographed by the photographing device 2.
  • the transport unit 11 selects a culture container to be imaged from among a plurality of culture containers accommodated at a predetermined position in the stem cell culture apparatus 1, and transports the selected culture container to the stage 10.
  • the control unit 12 controls the entire stem cell culture apparatus 1, and in addition to the operation of the stage 10 and the transport unit 11 described above, environmental conditions such as temperature, humidity and CO 2 concentration in the stem cell culture apparatus 1 are It is to control.
  • the temperature, the configuration for adjusting the humidity and CO 2 concentration can be a known configuration.
  • the imaging device 2 captures an observation image of an observation area including stem cells in a culture vessel set on the stage 10 in time series.
  • the imaging device 2 includes an optical system 20 for imaging and acquiring an observation image, an imaging element 21 which photoelectrically converts an observation image formed by the optical system 20 and outputs the image as an image signal, an optical system 20 and And a control unit 22 that controls the imaging device 21.
  • CMOS complementary metal-oxide semiconductor
  • CCD charge-coupled device
  • the control unit 22 controls the entire imaging device 2, and in particular, in the present embodiment, controls the magnification of the optical system 20 and the resolution of the imaging device 21.
  • the magnification and the resolution are changed according to the feature amount to be used in determination of undifferentiation and differentiation of stem cells in the stem cell differentiation determination apparatus 3.
  • a table in which the feature amount of interest is associated with the magnification and the resolution as shown in FIG. 2 is set. Then, before capturing the observation image of the stem cells, the user inputs a feature amount to be focused using the input device 5.
  • the feature amount input by the user is set in the determination unit 32 of the stem cell differentiation determination device 3 and is also input into the control unit 22 of the imaging device 2 through the control unit 35 of the stem cell differentiation determination device 3.
  • the magnification of the optical system 20 and the resolution of the image sensor 21 are set with reference to the table based on the input feature amount.
  • the feature amount to be noted is the circularity of the colony
  • a relatively low magnification (4 ⁇ ) and a low resolution 340 pixels ⁇ 256 pixels
  • the feature amount to be noticed is In the case of stem cell density, relatively high magnification (20 ⁇ ) and high resolution (1360 pixels ⁇ 1024 pixels) are set. This is preferable when acquiring the circularity of the colony as a feature value, since it is necessary to recognize the whole colony, and a lower magnification is preferable. Also, since it is only necessary to recognize the outline of the colony, so high resolution is necessary. It is because there is not.
  • the density of stem cells is to be obtained as a feature amount, it is necessary to recognize each stem cell in a colony, and thus higher magnification and resolution are preferable.
  • a plurality of imaging elements 21 having different resolutions may be switched, or when an image signal is read out from one imaging element 21, downsampling is performed by performing, for example, binning. You may do so.
  • the magnification and resolution may be switched to pick up an observation image, respectively, as shown in FIG.
  • the other magnification and resolution may be included in the table, and the magnification and resolution may be set.
  • the feature amount used in determining the undifferentiation and differentiation of the stem cells in the stem cell differentiation determination device 3 may be switched according to the degree of maturity of the stem cells, and based on the feature amount according to the degree of maturity.
  • the magnification and resolution of the photographing device 2 may be set. Specifically, for example, while stem cells are not matured until they form colonies, accuracy may be reduced if undifferentiated differentiation is determined from the outer shape of stem cell colonies.
  • the uniformity of stem cells may be set, and the magnification and resolution of the imaging device 2 may be set to the magnification and resolution corresponding to the uniformity of stem cells. Specifically, for example, as shown in FIG. 2, a relatively higher magnification and resolution are set than in the case of evaluating the circularity of colonies.
  • the feature amount to be focused on in the stem cell differentiation determination apparatus 3 is set to the circularity of colonies and the density of stem cells.
  • the resolution may be set to the magnification and resolution corresponding to the degree of circularity of colonies and the density of stem cells, respectively, and the observation image may be taken at each magnification and resolution.
  • the observation image is photographed with relatively low magnification and resolution to evaluate the density of stem cells.
  • the observation image may be photographed with setting to a relatively high magnification and resolution.
  • the density of stem cells may be set as the feature amount to be noted, and the magnification and resolution in the imaging device 2 may be set to the magnification and resolution corresponding to the density of stem cells. Specifically, for example, as described above, the magnification and resolution are set relatively higher than in the case of evaluating the circularity of the colony.
  • a timer may be provided, and the elapsed time by the timer may be acquired as the maturity, or the number of stem cells in the observation image is counted and the count number is acquired as the maturation You may do it.
  • the stem cell differentiation determination apparatus 3 is one in which one embodiment of a stem cell differentiation determination program of the present invention is installed in a computer.
  • the stem cell differentiation determination device 3 includes a central processing unit, a semiconductor memory, a hard disk, and the like, and an embodiment of a stem cell differentiation determination program is installed on the hard disk. Then, the program is executed by the control unit 35 having the central processing unit, whereby the observation image acquisition unit 30, the feature amount acquisition unit 31, the determination unit 32, the change information acquisition unit 33, and the display control as shown in FIG.
  • the unit 34 operates.
  • the display control unit corresponds to the output unit.
  • the output unit is not limited to one for display control, and may be one for recording in, for example, another device.
  • the observation image acquisition unit 30 acquires and stores a plurality of observation images captured in time series in the imaging device 2. Further, the observation image acquisition unit 30 outputs the acquired observation image to the feature amount acquisition unit 31 and the display control unit 34.
  • the feature amount acquisition unit 31 acquires at least one feature amount of stem cells for each of the time-series observation images acquired by the observation image acquisition unit 30.
  • the characteristic quantities of stem cells include the above-described circularity of stem cell colonies, stem cell density, stem cell homogeneity, and the like.
  • the feature amount is not limited to these, and other feature amounts may be acquired.
  • a morphological feature of a colony whether or not a defect such as a hole exists inside the colony may be acquired. If there is a defect inside the colony, differentiation is considered to be progressing.
  • the circularity of the colony and the defect inside the colony can be obtained from the binarized and labeled observation image.
  • the density of stem cells and the uniformity of stem cells can be obtained by detecting an edge from an observation image using a Sobel filter or the like and calculating the density and uniformity of the edge.
  • both the uniformity of stem cells and the circularity of colonies may be obtained as feature amounts, and the weightings for these feature amounts may be changed according to the degree of maturity of stem cells to obtain an evaluation value. Specifically, for example, in the stage where the degree of maturation is not advanced, the weight on stem cell uniformity is made larger than the weight on the roundness of colonies, and in the stage where the degree of maturity is advanced, the weight on the roundness of colonies is set. It may be made larger than the weighting for stem cell uniformity.
  • the feature amount may be acquired according to the culture condition, or the above-described weighting may be changed according to the culture condition. Specifically, for example, when a colony is seeded and cultured in a medium, the roundness of the colony is obtained as a feature amount, and when the stem cell alone is seeded and cultured in the medium, the density and uniformity of stem cells are uniform. You may make it acquire sex etc. as a feature-value.
  • the weight for roundness of colonies is set larger than the weight for stem cell density
  • the weight for stem cell density is circled. It may be made larger than the weight for the degree.
  • the culture conditions are input by the user using the input device 5.
  • the feature quantity acquisition unit 31 of the present embodiment acquires the above-mentioned feature quantity and evaluation value for each stem cell colony present in the observation image.
  • Each stem cell colony can be detected, for example, by detecting an edge from an observation image and performing pattern matching on the detected edge.
  • a plurality of observation regions are set in advance as shown in FIG. The divided areas may be divided, and the feature amount may be acquired for each divided area.
  • the determination unit 32 determines whether the stem cells in the observation image are undifferentiated or differentiated based on the feature amount and evaluation value for each stem cell colony or each divided area acquired in the feature amount acquisition unit 31. It is a thing. Specifically, when acquiring the circularity of a colony as the feature amount, the determination unit 32 compares the circularity with a preset threshold value, and if the circularity is equal to or more than the threshold value, the undifferentiated state is obtained. If the degree of circularity is less than the threshold value, it is determined that the cells are differentiated.
  • the determination unit 32 compares the density of stem cells with a threshold set in advance, and undifferentiated when the density is equal to or higher than the threshold. If it is determined that there is a certainty, and the degree of density is less than the threshold value, it is determined that the cells are differentiated.
  • the determination unit 32 compares the uniformity of the stem cells with a preset threshold value, and when the uniformity is equal to or more than the threshold value, it is undifferentiated. It is determined to be present, and when uniformity is less than a threshold value, it is determined to be differentiated.
  • the determination unit 32 determines that the colony is undifferentiated when a defect does not exist inside the colony, and a defect exists inside the colony. In this case, it is determined that differentiation has occurred.
  • the determination method for each feature amount has been described, but in the case of acquiring a plurality of feature amounts, for example, the determination result based on at least one feature amount among the plurality of feature amounts
  • the final determination result of being differentiated may be acquired, or it is determined that the determination result based on a part of plural feature quantities is differentiated.
  • a final determination result that differentiation is performed may be acquired, or in the case of a determination result that determination results based on all feature quantities are differentiated, it is said that differentiation is performed.
  • a final determination result may be acquired.
  • a plurality of feature quantities are weighted to calculate an evaluation value, whether it is undifferentiated or differentiated is determined by comparing the evaluation value with a preset threshold value. May be
  • the change information acquisition unit 33 acquires information on the change in the feature amount between the observation images captured in time series or information on the change in the determination result from undifferentiated to differentiated between the observation images.
  • the change information acquisition unit 33 uses, for example, time information at which the feature has changed, an observation image at which the feature has changed, position information in the observation area at which the feature has changed, and a feature. At least one of the information identifying the stem cell colonies whose amount has changed is acquired.
  • the time information at which the feature value has changed means, for example, the imaging time at which the circularity of at least one stem cell colony present in the observation image is equal to or greater than the threshold or the density of stem cells of at least one stem cell colony is equal to or greater than the threshold It is shooting time etc.
  • the photographing time is not limited to the photographing time when the feature amount straddles the threshold in this way, and for example, the photographing time when the change amount of the feature amount is equal to or more than the predetermined change amount may be acquired.
  • imaging when the feature quantities and evaluation values change from a value to be an undifferentiated determination to a value to be a differentiation determination The time may be acquired as time information when the feature amount has changed, or the photographing time when the feature amount or the evaluation value is equal to or greater than a preset change amount may be acquired.
  • the imaging time at the time when at least one of the values changes may be acquired, or a preset one
  • the latest shooting time may be acquired as the time information when the feature value has changed among the shooting times when the plurality of values of the section has changed respectively, or the latest shooting time among the shooting times when all the values have changed respectively May be acquired as time information when the feature amount has changed.
  • the observation image in which the feature amount has changed is an observation image captured at the time information in which the feature amount has changed.
  • the observation image in which the feature amount has changed only the observation image of the photographing time in which the feature amount has changed may be acquired, or the observation image of the photographing time in which the feature amount has changed and the image taken one time ago The acquired observation image may be acquired.
  • the position information in the observation area in which the feature quantity has changed is, for example, position information in the observation area in which there exist stem cell colonies and divided areas in which the feature quantity and the evaluation value have changed as described above.
  • position information coordinate values in the observation area are acquired.
  • a 10 cm ⁇ 10 cm rectangular area near the center in the culture vessel is used as the observation area, and the upper left corner point of this observation area is used as the coordinate value (0, 0). Is assigned.
  • coordinate values at which stem cell colonies exist for example, coordinate values of the center or center of gravity of stem cell colonies are obtained.
  • coordinate values of the divided area coordinate values of the center or the center of gravity of the divided area are acquired.
  • the information specifying the stem cell colony is, for example, the number of the stem cell colony whose feature value or evaluation value has changed as described above when the stem cell colony present in the observation area is respectively numbered. It is.
  • the change information acquisition unit 33 acquires information on the change in the feature amount, but acquires information on the change in the determination result in which the determination in the determination unit 32 has changed from undifferentiated to differentiated. You may do so.
  • the change information acquisition unit 33 as information related to the change in the determination result, time information when the determination result changes, an observation image in which the determination result changes, position information in the observation area where the determination result changes, and the determination result Alternatively, at least one of the information for identifying the stem cell colony that has changed may be acquired.
  • the time information at which the determination result has changed is, for example, the imaging time at which the determination result of at least one stem cell colony or divided area present in the observation image has changed from undifferentiated to differentiated.
  • the observation image in which the determination result has changed is an observation image captured at the time information in which the above-described determination result has changed. Note that as the observation image in which the determination result has changed, only the observation image of the photographing time in which the determination result has changed may be acquired, or the observation image of the photographing time in which the determination result has changed is photographed at the time before it An observation image may be acquired.
  • the position information in the observation area in which the determination result has changed is, for example, position information in the observation area in which there exist stem cell colonies and divided areas in which the determination result has changed from undifferentiated to differentiated.
  • the information specifying the stem cell colony is, for example, the number of the stem cell colony whose determination result has changed from undifferentiated to differentiated in the case where the stem cell colony present in the observation area is respectively numbered. .
  • the display control unit 34 causes the display 4 to display information on the change in the feature amount when the change information obtaining unit 33 obtains information on the change in the feature amount. That is, the display control unit 34 identifies the time information when the feature quantity has changed, the observation image in which the feature quantity has changed, the position information in the observation area where the feature quantity has changed, and the information for identifying the stem cell colony where the feature quantity has changed. Is displayed on the display 4.
  • the display control unit 34 causes the display 4 to display information on the change in the determination result. That is, the display control unit 34 among the information specifying the time information when the determination result changes, the observation image when the determination result changes, the position information in the observation area where the determination result changes, and the stem cell colony where the determination result changes. Is displayed on the display 4.
  • the display control unit 34 causes the display 4 to display position information in the observation area in which the feature amount or the determination result has changed, a mark or the like is added so that stem cell colonies or divided areas of the position information can be immediately determined. It is also possible to display a color map in which different colors are assigned to stem cell colonies and divided regions of the position information and other stem cell colonies and divided regions. Even when displaying information for identifying stem cell colonies whose feature amounts or discrimination results have changed, the stem cell colonies are marked with a mark or the like so that the stem cell colonies can be immediately distinguished, or the stem cell colonies are highlighted. It is also possible to display a color map in which different colors are assigned to the stem cell colony and the other stem cell colonies.
  • the input device 5 includes a mouse, a keyboard, and the like, and receives an operation input by the user.
  • the input device 5 can receive the setting input of the feature amount to be noticed when determining the optical magnification of the optical system 20 and the resolution of the imaging device 21.
  • the setting input of the range of the divided area can be received.
  • the culture of the imaging target is selected from the plurality of culture vessels contained by the transport unit 11, and the selected culture vessel is installed on the stage 10 (S10).
  • the imaging device 2 captures an observation image of the observation area including the stem cells in the culture vessel (S12).
  • a rectangular observation area of 10 cm ⁇ 10 cm as shown in FIG. 4 is photographed with a phase contrast microscope at 40 shots ⁇ 40 shots to acquire one observation image.
  • the observation image of the time series of a 24-hour interval is taken after 1 day, 2 days, 3 days, ... and so on.
  • the interval for capturing the observation image is not limited to this.
  • the observation image may be captured at three-hour intervals, and after three hours, five hours, eight hours, etc. It is also possible to shoot while lengthening, or conversely to shoot while gradually shortening the shooting interval, such as after eight hours, five hours, or three hours.
  • the photographing interval is preset by the user using the input device 5, and photographing is automatically performed based on the setting.
  • each observation image is acquired with the imaging
  • the optical magnification of the photographing device 2 is 20 times and the resolution is 1360 ⁇ 1024.
  • the present invention is not limited to this, and the optical magnification and the resolution may be adjusted according to the noted feature amounts. It may be changed.
  • photographed by the imaging device 2 is output to the stem cell differentiation determination apparatus 3, and it is acquired by the observation image acquisition part 30 of the stem cell differentiation determination apparatus 3 (S14).
  • the time-series observation images acquired by the observation image acquisition unit 30 are output to the feature amount acquisition unit 31, and the feature amount acquisition unit 31 acquires at least one feature amount of stem cells for each observation image (S16).
  • the feature amount acquisition unit 31 acquires, as a feature amount, the degree of roundness of the stem cell colony and the density of stem cells for each existing stem cell colony in the observation image.
  • the feature amount acquired for each stem cell colony of each observation image by the feature amount acquisition unit 31 is output to the determination unit 32, and the determination unit 32 determines the feature amount of each stem cell colony of each observation image input. It is determined whether each stem cell colony is undifferentiated or differentiated (S18). Specifically, when the roundness of a stem cell colony is equal to or greater than a preset threshold and the density of stem cells is equal to or greater than a preset threshold, it is determined that the stem cell colony is undifferentiated and stem cells are undifferentiated. The stem cell colony is determined to be differentiated if the degree of circularity of the colony is less than the threshold or the density of stem cells is less than the threshold.
  • the feature amounts acquired for each stem cell colony of each observed image by the feature amount acquisition unit 31 are output to the change information acquisition unit 33, and the change information acquisition unit 33 determines that the feature amounts of at least one stem cell colony cross the threshold.
  • the photographing time of the observation image is acquired as information on the change of the feature amount (S20). That is, the imaging time at which the observation image in which the degree of circularity of at least one stem cell colony or the density of stem cells became less than the threshold is taken is acquired.
  • the change information acquisition unit 33 outputs the photographing time acquired as described above and the observation image photographed at the photographing time to the display control unit 34, and the display control unit 34 receives the inputted photographing time and observation The image is displayed on the display 4 (S22).
  • the information on the change in the feature amount between the observation images captured in time series or the information on the change in the determination result from the undifferentiated to the differentiation between the observation images is acquired Since the information about the change of the feature amount or the information about the change of the judgment result is output, the information confirmed by the culture person can be limited, whereby the culture person can efficiently and accurately undifferentiated Differentiation can be confirmed.
  • the display control unit 34 causes the display 4 to display the observation image, it causes the display 4 to display feature amounts such as circularity and density of each stem cell colony present in the observation image, and undifferentiation of each stem cell colony
  • the determination result of the differentiation may be displayed on the display 4.
  • the display control unit 34 not only the observation image of the photographing time acquired by the change information acquiring unit 33 but also the circularity or density of the stem cell colony existing in the observation image of the other photographing time and the observation image
  • the determination result of undifferentiation / differentiation may be displayed on the display 4 or the like.
  • a reliability acquisition unit 36 is further provided to the stem cell culture observation system of the first embodiment.
  • the other configuration is the same as that of the stem cell culture observation system of the first embodiment.
  • the reliability acquisition unit 36 acquires the reliability of the determination result for each stem cell colony or each divided area based on the feature amount acquired for each stem cell colony or each divided area.
  • the judgment result by the circularity matches the judgment result by the stem cell density, so the judgment based on the above evaluation result
  • the reliability of the result is high, and the reliability “1” is acquired.
  • the evaluation value is used.
  • the reliability “0” is acquired on the assumption that the reliability of the determination result is low.
  • two levels of reliability are obtained, but not limited to two levels, three or more levels of reliability may be obtained.
  • the difference between the circularity of colonies and the threshold value of the density of stem cells may be obtained, and the larger the difference, the lower the reliability, and the smaller the difference, the higher the reliability.
  • the method of acquiring the reliability in the case of determining undifferentiation / differentiation based on the evaluation value calculated from the roundness of colonies and the density of stem cells has been described, but it is not limited thereto.
  • the reliability of the determination result may be acquired based on the difference between the feature amount and the threshold value.
  • the reliability of each stem cell colony or each divided area acquired by the reliability acquisition unit 36 is output to the display control unit 34. Then, when displaying the observation image in which the feature amount or the determination result has been changed as described above, the display control unit 34 gives priority to images of stem cell colonies or divided areas with low reliability based on the input reliability. Display on.
  • images of stem cell colonies having low reliability or images of divided areas may be sequentially switched and displayed, or as shown in FIG. Images of stem cell colonies or divided regions may be displayed side by side according to the above sequence. In the example shown in FIG. 7, it is assumed that the reliability increases from the upper left to the lower right.
  • the image with low reliability is displayed preferentially. Therefore, if the culture person confirms the judgment result preferentially from the image with low reliability. Thus, it is possible to efficiently check the determination result.
  • the images of stem cell colonies or divided areas with low reliability may be preferentially displayed as described above.
  • the content of the feature amount used to acquire the reliability may be displayed together.
  • the display control unit 34 when the display control unit 34 displays the observation image, the entire stem cell colony may be displayed, or a part of the image in the stem cell colony is displayed. It may be displayed.
  • the display control unit 34 displays an observation image in which the feature amount or the determination result changes, about 10 observation images captured before and after the imaging time at which the feature amount or the determination result changes It may be displayed. By displaying the moving image in this manner, it is possible to confirm the locus of change from undifferentiated to differentiated.

Abstract

【課題】幹細胞を含む観察領域を撮影した観察画像に基づいて幹細胞の分化を判定する幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムにおいて、培養者が効率的かつ正確に未分化・分化を確認できるようにする。 【解決手段】幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得する観察画像取得部（３０）と、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する特徴量取得部（３１）と、特徴量に基づいて、幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する判定部（３２）と、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得する変化情報取得部（３３）と、特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力する表示制御部（３４）とを備える。

Description

幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラム
　本発明は、幹細胞を含む観察領域を撮影した観察画像に基づいて、幹細胞の分化を判定する幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムに関するものである。
　ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発、病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。
　幹細胞は、細胞培養装置内に設置された培養容器内の培地に播種され、培地上において増殖し、隣接する幹細胞コロニー同士が結合を繰り返すことによって成長する。
　この幹細胞の成長過程においては、幹細胞から目的の組織の細胞に分化させる際の分化効率を向上させるため、未分化状態を保持させたまま増殖させることが求められる。そして、一旦分化を開始した幹細胞は、目的の組織に成長させることができない。
　また、幹細胞コロニーの未分化性の高い領域のみを切り出して別の培養容器に移植し、継代を行うことがあるが、この継代の際には、未分化の幹細胞のみを抽出する必要がある。すなわち、幹細胞の培養に際しては、幹細胞の未分化・分化を適切に判定する必要がある。
　そこで、たとえば特許文献１および特許文献２では、幹細胞を経時的に撮像し、その観察画像の経時的な変化を捉えることで未分化・分化の判定を行うことが提案されている。
　また、特許文献３および特許文献４では、培養している幹細胞コロニーについて種々の特徴量を取得し、その特徴量に基づいてコロニー単位で未分化・分化の判別を行うことが提案されている。
　また、特許文献５では、幹細胞の数や核小体の数など数十種の特徴量を用いて幹細胞の未分化・分化の判定を行うことが提案されている。
特開２０１２－９５６２７号公報 特開２０１１－２２９４１０号公報 国際公開２０１２／１４７４０３号 特開２００９－４４９７４号公報 特許第４８５２８９０号公報
　しかしながら、特許文献１および特許文献２のように、培養者が培養の途中経過の観察画像を観察することによって未分化・分化の判定を行う場合、どの時点で撮影された観察画像を見れば幹細胞の状態が未分化から分化へと変化しているかを判断することはできないため、培養者は全ての時点における観察画像を確認し、幹細胞の状態が変化する箇所を特定する必要があり、非効率的である。
　また、特許文献３および特許文献４のように、コロニー単位で未分化・分化の判定を行う場合、培養者が膨大な時間を要して全てのコロニーを確認するか、ランダムにコロニーを選んで確認することになるが、前者は非効率的であり、後者は同条件での培養においてもコロニー毎に不均一性が生じているため、適切な確認方法ではない。
　また、特許文献５には、種々の特徴量に基づいて未分化・分化の判定を行うことが開示されているが、培養者が未分化・分化の判定結果を確認する際、どの特徴量を用いた判定結果であるかを確認することができず、判定結果に対する培養者の解釈は、培養者の熟練度に大きく依存してしまう問題がある。
　本発明は、上記の問題に鑑み、培養者が効率的かつ正確に未分化・分化を確認することができる幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムを提供することを目的とする。
　本発明の幹細胞分化判定装置は、幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得する観察画像取得部と、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する特徴量取得部と、特徴量に基づいて、幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する判定部と、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得する変化情報取得部と、特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力する出力部とを備えたことを特徴とする。
　また、本発明の幹細胞分化判定装置においては、変化情報取得部を、特徴量の変化に関する情報として、特徴量が変化した時刻情報、特徴量が変化した観察画像、特徴量が変化した観察領域内の位置情報および特徴量が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものとできる。
　また、変化情報取得部を、判定結果の変化に関する情報として、判定結果が変化した時刻情報、判定結果が変化した観察画像、判定結果が変化した観察領域内の位置情報および判定結果が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものとできる。
　また、特徴量取得部を、観察領域内における複数の領域のそれぞれついて特徴量を取得するものとし、判定部を、上記領域毎について判定を行うものとする場合において、上記領域毎の特徴量に基づいて、上記領域毎の判定結果の信頼度を取得する信頼度取得部を設け、出力部を、信頼度の低い上記領域の観察画像から優先的に出力するものとできる。
　また、上記領域を、幹細胞のコロニーの領域とできる。
　また、上記領域を、予め設定された分割領域とできる。
　また、出力部を、特徴量を出力するものとできる。
　また、観察画像を撮影する撮影部を設け、撮影部を、設定された注目する特徴量に応じて観察画像を撮影する際の光学倍率または解像度を切り替えるものとできる。
　また、出力部を、幹細胞のコロニー全体の観察画像を出力するものとできる。
　また、出力部を、幹細胞のコロニー内の一部の観察画像を出力するものとできる。
　また、出力部を、特徴量が変化した時点または判定結果が変化した時点を中心として前後に撮影された複数の観察画像を動画として出力するものとできる。
　本発明の幹細胞分化判定方法は、幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得し、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得し、特徴量に基づいて、幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する際、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得し、特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力することを特徴とする。
　本発明の幹細胞分化判定プログラムは、コンピュータを、幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得する観察画像取得部と、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する特徴量取得部と、特徴量に基づいて、幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する判定部と、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得する変化情報取得部と、特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力する出力部として機能させることを特徴とする。
　本発明の幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムによれば、幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得し、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得し、その特徴量に基づいて、幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する場合において、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得し、その特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力するようにしたので、培養者が確認する情報を限定することができ、これにより培養者は効率的かつ正確に未分化・分化を確認することができる。
本発明の幹細胞分化判定装置の第１の実施形態を用いた幹細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 注目する特徴量と、倍率および解像度とを対応づけたテーブルの一例を示す図 観察領域を分割した分割領域の一例を示す図 観察領域の一例を示す図 図１に示す幹細胞培養観察システムの作用を説明するためのフローチャート 本発明の幹細胞分化判定装置の第２の実施形態を用いた幹細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図 信頼度の高低に基づく予め設定された配列で幹細胞コロニーの画像を並べて表示した一例を示す図
　以下、本発明の幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムの第１の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。本発明は、幹細胞を時系列に撮影した観察画像の変化情報の出力などに特徴を有するものであるが、まず、その幹細胞分化判定装置を備えた幹細胞培養観察システムの全体構成について説明する。図１は、幹細胞培養観察システムの概略構成を示すブロック図である。
　幹細胞培養観察システムは、図１に示すように、幹細胞培養装置１、撮影装置２と、幹細胞分化判定装置３と、ディスプレイ４と、入力装置５とを備えている。
　幹細胞培養装置１は、幹細胞の培養を行うための装置である。幹細胞培養装置１内には、培養対象の幹細胞を培地に播種した培養容器が複数収容されている。そして、幹細胞培養装置１は、ステージ１０と搬送部１１と制御部１２とを備えている。
　ステージ１０は、撮影装置２による撮影対象の培養容器が設置されるものである。また、搬送部１１は、幹細胞培養装置１内の所定位置に収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養容器を選択し、その選択した培養容器をステージ１０まで搬送するものでる。また、制御部１２は、幹細胞培養装置１全体を制御するものであり、上述したステージ１０や搬送部１１の動作以外に、幹細胞培養装置１内の温度、湿度およびＣＯ２濃度などの環境条件を制御するものである。なお、温度、湿度およびＣＯ２濃度を調整するための構成については、公知な構成を用いることができる。
　撮影装置２は、ステージ１０に設置された培養容器内における幹細胞を含む観察領域の観察画像を時系列に撮影するものである。撮影装置２は、観察画像を結像して取得するための光学系２０と、光学系２０によって結像された観察画像を光電変換して画像信号として出力する撮像素子２１と、光学系２０および撮像素子２１を制御する制御部２２とを備えている。
　光学系２０としては、たとえば位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡を用いることができる。また、撮像素子２１としては、ＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）センサやＣＣＤ（charge-coupled device）センサなどを用いることができる。
　制御部２２は、撮影装置２全体を制御するものであるが、特に、本実施形態においては、光学系２０の倍率や、撮像素子２１の解像度を制御するものである。
　具体的には、本実施形態においては、幹細胞分化判定装置３における幹細胞の未分化・分化の判定の際に用いられる注目する特徴量に応じて倍率や解像度を変更するものである。
　たとえば、制御部２２には、図２に示すような注目する特徴量と、倍率および解像度とを対応づけたテーブルが設定されている。そして、幹細胞の観察画像の撮影前に、ユーザによって入力装置５を用いて注目する特徴量が入力される。ユーザによって入力された特徴量は、幹細胞分化判定装置３の判定部３２に設定されるとともに、幹細胞分化判定装置３の制御部３５を介して撮影装置２の制御部２２に入力され、制御部２２は、入力された特徴量に基づいて上記テーブルを参照し、光学系２０の倍率と撮像素子２１の解像度とを設定する。
　図２に示すテーブルでは、注目する特徴量がコロニーの円形度である場合には、相対的に低い倍率（４倍）と低い解像度（３４０画素×２５６画素）を設定し、注目する特徴量が幹細胞の密集度である場合には、相対的に高い倍率（２０倍）と高い解像度（１３６０画素×１０２４画素）を設定するようにしている。これは、コロニーの円形度を特徴量として取得する場合には、コロニー全体を認識する必要があるため低い倍率の方が好ましく、また、コロニーの外形を認識するだけで良いのでそれ程高い解像度は必要ないからである。一方、幹細胞の密集度を特徴量として取得する場合には、コロニー内の幹細胞の一つ一つを認識する必要があるため高い倍率と解像度の方が好ましいからである。
　なお、解像度の変更については、たとえば互いに解像度の異なる複数の撮像素子２１を切り替えるようにしてもよいし、１つの撮像素子２１から画像信号を読み出す際に、たとえばビニングなどを行うことによってダウンサンプリングするようにしてもよい。
　また、特徴量としてコロニーの円形度と幹細胞の密集度との両方を取得する場合には、倍率および解像度を切り替えてそれぞれ観察画像を撮像するようにしてもよいし、図２の倍率および解像度とは別の倍率および解像度をテーブルに含めておき、その倍率および解像度を設定するようにしてもよい。
　また、幹細胞分化判定装置３における幹細胞の未分化・分化の判定の際に用いられる特徴量は、幹細胞の成熟度に応じて切り替えるようにしてもよく、その成熟度に応じた特徴量に基づいて撮影装置２の倍率および解像度を設定するようにしてもよい。具体的には、たとえば幹細胞がまだコロニーを形成するまで成熟していない間は、幹細胞コロニーの外形で未分化・分化を判定すると精度が低下する可能性がある。そこで、このような段階では、幹細胞が未分化である場合にはその分布は均一にとなり、幹細胞の一部が分化している場合にはその分布は不均一となるので、注目する特徴量として幹細胞の均一性を設定し、撮影装置２における倍率および解像度を、幹細胞の均一性に対応する倍率および解像度に設定するようにすればよい。具体的には、たとえば、図２に示したようにコロニーの円形度を評価する場合よりも相対的に高い倍率および解像度を設定する。
　そして、幹細胞の成熟度が進み、コロニーを形成する程度になった段階では、幹細胞分化判定装置３において注目する特徴量をコロニーの円形度および幹細胞の密集度に設定し、撮影装置２における倍率および解像度を、コロニーの円形度および幹細胞の密集度のそれぞれに対応する倍率および解像度に設定し、それぞれの倍率および解像度で観察画像を撮影すればよい。具体的には、たとえば、コロニーの円形度を評価するための観察画像を撮影する場合には、相対的に低い倍率および解像度に設定して観察画像を撮影し、幹細胞の密集度を評価するための観察画像を撮影する場合には、相対的に高い倍率および解像度に設定して観察画像を撮影すればよい。
　次いで、さらに幹細胞の成熟度が進み、コロニー同士が結合し始めた段階では、コロニーの円形度に基づく未分化・分化の判定は誤判定を招くおそれがある。したがって、この段階では、注目する特徴量として幹細胞の密集度を設定し、撮影装置２における倍率および解像度を、幹細胞の密集度に対応する倍率および解像度に設定するようにすればよい。具体的には、たとえば、上述したようにコロニーの円形度を評価する場合よりも相対的に高い倍率および解像度に設定する。
　幹細胞の成熟度については、たとえばタイマを設け、タイマによる経過時間を成熟度として取得するようにしてもよいし、または、観察画像内における幹細胞の数をカウントし、そのカウント数を成熟度として取得するようにしてもよい。
　幹細胞分化判定装置３は、コンピュータに対して本発明の幹細胞分化判定プログラムの一実施形態がインストールされたものである。 
　幹細胞分化判定装置３は、中央処理装置、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えており、ハードディスクに幹細胞分化判定プログラムの一実施形態がインストールされている。そして、このプログラムが中央処理装置を有する制御部３５によって実行されることによって、図１に示すような観察画像取得部３０、特徴量取得部３１、判定部３２、変化情報取得部３３および表示制御部３４が動作する。なお、本実施形態においては、表示制御部が、出力部に相当するものである。ただし、出力部は、表示制御するものに限らず、たとえば他の装置に記録するために出力するものでもよい。
　観察画像取得部３０は、撮影装置２において時系列に撮影された複数の観察画像を取得して記憶するものである。また、観察画像取得部３０は、取得した観察画像を特徴量取得部３１と表示制御部３４に出力するものである。
　特徴量取得部３１は、観察画像取得部３０によって取得された時系列の観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得するものである。幹細胞の特徴量としては、上述した幹細胞のコロニーの円形度や、幹細胞の密集度、幹細胞の均一性などがある。
　また、特徴量としては、これらに限らず、その他の特徴量を取得するようしてもよい。たとえば、コロニーの形態的な特徴量としては、コロニーの内部に穴などの欠陥が存在するか否かを取得するようにしてもよい。コロニーの内部に欠陥がある場合、分化が進んでいると考えられる。
　コロニーの円形度やコロニーの内部の欠陥については、観察画像を二値化してラベリングしたものから取得することができる。また、幹細胞の密集度や幹細胞の均一性については、Sobelフィルタなどを用いて観察画像からエッジを検出し、そのエッジの密集度や均一性を算出することで取得することができる。
　また、幹細胞の均一性とコロニーの円形度との両方を特徴量として取得し、幹細胞の成熟度に応じてこれらの特徴量に対する重み付けを変化させて評価値を取得するようにしてもよい。具体的には、たとえば、成熟度が進んでいない段階では、幹細胞の均一性に対する重み付けをコロニーの円形度に対する重み付けよりも大きくし、成熟度がある程度進んだ段階では、コロニーの円形度に対する重み付けを幹細胞の均一性に対する重み付けよりも大きくするようにしてもよい。
　また、培養条件に応じた特徴量を取得したり、培養条件に応じて上述した重み付けを変化させたりしてもよい。具体的には、たとえば培地にコロニーを播種して培養する場合には、コロニーの円形度を特徴量として取得し、培地に幹細胞単体を播種して培養する場合には、幹細胞の密集度や均一性などを特徴量として取得するようにしてもよい。
　また、たとえば、上述したコロニー播種の場合には、コロニーの円形度に対する重み付けを幹細胞の密集度に対する重み付けよりも大きくし、幹細胞単体の播種の場合には、幹細胞の密集度に対する重み付けをコロニーの円形度に対する重み付けよりも大きくするようにしてもよい。なお、培養条件は、ユーザによって入力装置５を用いて入力される。
　そして、本実施形態の特徴量取得部３１は、観察画像内に存在する幹細胞コロニー毎に上述した特徴量や評価値を取得するものである。各幹細胞コロニーは、たとえば観察画像からエッジを検出し、その検出したエッジに対してパターンマッチングを行うことによって検出することができる。なお、上述した幹細胞単位の播種であって、まだ成熟度が進んでおらず幹細胞コロニーが明確に形成されていない段階の場合には、たとえば図３に示すように観察領域を予め設定された複数の分割領域に分割し、その分割領域毎に特徴量を取得するようにすればよい。
　判定部３２は、特徴量取得部３１において取得された幹細胞コロニー毎または分割領域毎の特徴量や評価値に基づいて、観察画像内の幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定するものである。具体的には、判定部３２は、特徴量としてコロニーの円形度を取得する場合には、その円形度と予め設定された閾値とを比較し、円形度が閾値以上である場合に、未分化であると判定し、円形度が閾値未満である場合に、分化していると判定するものである。
　また、判定部３２は、特徴量として幹細胞の密集度を取得する場合には、その幹細胞の密集度と予め設定された閾値とを比較し、密集度が閾値以上である場合に、未分化であると判定し、密集度が閾値未満である場合に、分化していると判定するものである。
　また、判定部３２は、特徴量として幹細胞の均一性を取得する場合には、その幹細胞の均一性と予め設定された閾値とを比較し、均一性が閾値以上である場合に、未分化であると判定し、均一性が閾値未満である場合に、分化していると判定するものである。
　また、判定部３２は、特徴量としてコロニーの内部の欠陥を取得する場合には、コロニーの内部に欠陥が存在しない場合には、未分化であると判定し、コロニーの内部に欠陥が存在する場合には、分化していると判定するものである。
　なお、上記説明では、１つ１つの特徴量についての判定方法を説明したが、たとえば複数の特徴量を取得する場合には、その複数の特徴量の中で少なくとも１つの特徴量に基づく判定結果が分化しているという判定結果の場合に、分化しているという最終的な判定結果を取得するようにしてもよいし、一部の複数の特徴量に基づく判定結果が分化しているという判定結果の場合に、分化しているという最終的な判定結果を取得するようにしてもよいし、全ての特徴量に基づく判定結果が分化しているという判定結果の場合に、分化しているという最終的な判定結果を取得するようにしてもよい。また、複数の特徴量に重み付けをして評価値を算出する場合には、その評価値と予め設定された閾値とを比較することによって未分化であるかまたは分化しているかを判定するようにしてもよい。
　変化情報取得部３３は、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得するものである。
　具体的には、変化情報取得部３３は、特徴量の変化に関する情報として、たとえば特徴量が変化した時刻情報、特徴量が変化した観察画像、特徴量が変化した観察領域内の位置情報および特徴量が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものである。
　特徴量が変化した時刻情報とは、たとえば観察画像内に存在する少なくとも１つの幹細胞コロニーの円形度が閾値以上となった撮影時刻や少なくとも１つの幹細胞コロニーの幹細胞の密集度が閾値以上となった撮影時刻などである。また、このように特徴量が閾値を跨いだ撮影時刻に限らず、たとえば特徴量の変化量が、予め設定された変化量以上となる場合の撮影時刻を取得するようにしてもよい。
　なお、各幹細胞コロニーや各分割領域についてその他の特徴量や評価値を取得する場合には、その特徴量や評価値が、未分化判定となる値から分化判定となる値に変化したときの撮影時刻を特徴量が変化した時刻情報として取得してもよいし、その特徴量や評価値が、予め設定された変化量以上となる場合の撮影時刻を取得するようにしてもよい。
　また、１つの幹細胞コロニーや分割領域について複数の特徴量や評価値を取得する場合には、そのうちの少なくとも１つの値が変化した時点における撮影時刻を取得してもよいし、予め設定された一部の複数の値がそれぞれ変化した撮影時刻のうち最も遅い撮影時刻を特徴量が変化した時刻情報として取得するようにしてもよいし、全ての値がそれぞれ変化した撮影時刻のうち最も遅い撮影時刻を特徴量が変化した時刻情報として取得するようにしてもよい。
　また、特徴量が変化した観察画像とは、上述した特徴量が変化した時刻情報において撮影された観察画像である。なお、特徴量が変化した観察画像としては、特徴量が変化した撮影時刻の観察画像のみを取得してもよいし、特徴量が変化した撮影時刻の観察画像とその１つ前の時刻に撮影された観察画像とを取得するようにしてもよい。
　また、特徴量が変化した観察領域内の位置情報とは、たとえば、上述したように特徴量や評価値が変化した幹細胞コロニーや分割領域が存在する観察領域内の位置情報である。位置情報としては観察領域内の座標値が取得される。本実施形態においては、図４に示すように、培養容器内の中央付近の１０ｃｍ×１０ｃｍの矩形領域を観察領域とし、この観察領域の左上の角の点を座標値（０，０）として座標が割り当てられているものとする。幹細胞コロニーが存在する座標値としては、たとえば幹細胞コロニーの中心または重心の座標値が取得される。また、分割領域の座標値としては、分割領域の中心または重心の座標値が取得される。
　幹細胞のコロニーを特定する情報とは、たとえば観察領域内に存在する幹細胞コロニーに対して番号をそれぞれ付けるようにした場合において、上述したように特徴量や評価値が変化した幹細胞コロニーの番号のことである。
　また、上記説明では、変化情報取得部３３において、特徴量の変化に関する情報を取得する場合について説明したが、判定部３２における判定が未分化から分化に変化した判定結果の変化に関する情報を取得するようにしてもよい。
　具体的には、変化情報取得部３３が、判定結果の変化に関する情報として、判定結果が変化した時刻情報、判定結果が変化した観察画像、判定結果が変化した観察領域内の位置情報および判定結果が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものとしてもよい。
　判定結果が変化した時刻情報とは、たとえば観察画像内に存在する少なくとも１つの幹細胞コロニーや分割領域の判定結果が未分化から分化に変化した撮影時刻である。
　また、判定結果が変化した観察画像とは、上述した判定結果が変化した時刻情報において撮影された観察画像である。なお、判定結果が変化した観察画像としては、判定結果が変化した撮影時刻の観察画像のみを取得してもよいし、判定結果が変化した撮影時刻の観察画像とその前の時刻に撮影された観察画像とを取得するようにしてもよい。
　また、判定結果が変化した観察領域内の位置情報とは、たとえば、判定結果が未分化から分化に変化した幹細胞コロニーや分割領域が存在する観察領域内の位置情報である。
　幹細胞のコロニーを特定する情報とは、たとえば観察領域内に存在する幹細胞コロニーに対して番号をそれぞれ付けるようにした場合において、判定結果が未分化から分化に変化した幹細胞コロニーの番号のことである。
　表示制御部３４は、変化情報取得部３３において特徴量の変化に関する情報を取得する場合には、その特徴量の変化に関する情報をディスプレイ４に表示させるものである。すなわち、表示制御部３４は、上述した特徴量が変化した時刻情報、特徴量が変化した観察画像、特徴量が変化した観察領域内の位置情報および特徴量が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つをディスプレイ４に表示させるものである。
　また、表示制御部３４は、変化情報取得部３３において判定結果の変化に関する情報を取得する場合には、その判定結果の変化に関する情報をディスプレイ４に表示させるものである。すなわち、表示制御部３４は、判定結果が変化した時刻情報、判定結果が変化した観察画像、判定結果が変化した観察領域内の位置情報および判定結果が変化した幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つをディスプレイ４に表示させるものである。
　表示制御部３４が、特徴量または判別結果が変化した観察領域内の位置情報をディスプレイ４に表示させる場合には、その位置情報の幹細胞コロニーや分割領域が即座に判別できるようにマークなどを付して強調表示したり、その位置情報の幹細胞コロニーや分割領域とそれ以外の幹細胞コロニーや分割領域とに異なる色を割り当てたカラーマップを表示させるようにしてもよい。特徴量または判別結果が変化した幹細胞コロニーを特定する情報を表示する場合にも、その幹細胞コロニーが即座に判別できるように幹細胞コロニーに対してマークなどを付して強調表示したり、その幹細胞コロニーとそれ以外の幹細胞コロニーとに異なる色を割り当てたカラーマップを表示させるようにしてもよい。
　入力装置５は、マウスやキーボードなどを備えたものであり、ユーザによる操作入力を受け付けるものである。たとえば、入力装置５は、光学系２０の光学倍率や撮像素子２１の解像度を決定する際における注目する特徴量の設定入力を受け付け可能なものである。また、観察画像を複数の分割領域に分割して分割領域毎の特徴量や判定結果を取得する場合には、その分割領域の範囲の設定入力を受け付け可能なものである。
　次に、上述した幹細胞培養観察システムの作用について、図５に示すフローチャートを参照しながら説明する。
　まず、幹細胞培養装置１において、搬送部１１によって、収容されている複数の培養容器の中から撮影対象の培養が選択され、その選択された培養容器がステージ１０に設置される（Ｓ１０）。
　そして、撮影装置２によって、培養容器内の幹細胞を含む観察領域の観察画像の撮影が行われる（Ｓ１２）。
　具体的には、図４に示すような１０ｃｍ×１０ｃｍの矩形の観察領域を位相差顕微鏡によって４０ショット×４０ショットで撮影して１枚の観察画像を取得する。そして、本実施形態においては、幹細胞の播種時、１日後、２日後、３日後・・・と２４時間間隔の時系列の観察画像を撮影するものとする。ただし、観察画像を撮影する間隔についてはこれに限らず、たとえば３時間間隔で観察画像を撮影するようにしてもよいし、３時間後、５時間後、８時間後というように撮影間隔を次第に長くしながら撮影するようにしてもよいし、逆に８時間後、５時間後、３時間後というように撮影間隔を次第に短くしながら撮影するようにしてもよい。なお、撮影間隔についてはユーザによって入力装置５を用いて予め設定され、その設定に基づいて自動的に撮影が行われる。そして、各観察画像は、その撮影時刻とともに取得され、その撮影時刻は観察画像に付随するものとする。
　また、ここでは、撮影装置２の光学倍率を２０倍、解像度を１３６０×１０２４として撮影を行うものとするが、これに限らず、上述したように注目する特徴量に応じて光学倍率および解像度を変更するようにしてもよい。
　そして、撮影装置２によって撮影された時系列の観察画像は幹細胞分化判定装置３に出力され、幹細胞分化判定装置３の観察画像取得部３０によって取得される（Ｓ１４）。
　観察画像取得部３０によって取得された時系列の観察画像は特徴量取得部３１に出力され、特徴量取得部３１は、観察画像毎について、幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する（Ｓ１６）。ここでは、特徴量取得部３１は、観察画像内の存在する幹細胞コロニー毎について、それぞれ幹細胞コロニーの円形度と幹細胞の密集度とを特徴量として取得する。
　次いで、特徴量取得部３１によって各観察画像の各幹細胞コロニーについて取得された特徴量は判定部３２に出力され、判定部３２は、入力された各観察画像の各幹細胞コロニーの特徴量に基づいて、各幹細胞コロニーが未分化であるかまたは分化しているかを判定する（Ｓ１８）。具体的には、幹細胞コロニーの円形度が予め設定された閾値以上であり、かつ幹細胞の密集度が予め設定された閾値以上である場合に、その幹細胞コロニーは未分化であると判定し、幹細胞コロニーの円形度が閾値未満であるか、または幹細胞の密集度が閾値未満である場合に、その幹細胞コロニーは分化していると判定する。
　一方、特徴量取得部３１によって各観察画像の各幹細胞コロニーについて取得された特徴量は変化情報取得部３３に出力され、変化情報取得部３３は、少なくとも１つの幹細胞コロニーの特徴量が閾値を跨いだ観察画像の撮影時刻を特徴量の変化に関する情報として取得する（Ｓ２０）。すなわち、少なくとも１つの幹細胞コロニーの円形度または幹細胞の密集度が閾値未満となった観察画像が撮影された撮影時刻を取得する。
　変化情報取得部３３は、上述したようにして取得された撮影時刻とその撮影時刻に撮影された観察画像とを表示制御部３４に出力し、表示制御部３４は、入力された撮影時刻と観察画像とをディスプレイ４に表示させる（Ｓ２２）。
　上記第１の実施形態の幹細胞培養観察システムによれば、時系列に撮影された観察画像間における特徴量の変化に関する情報または観察画像間における未分化から分化への判定結果の変化に関する情報を取得し、その特徴量の変化に関する情報または判定結果の変化に関する情報を出力するようにしたので、培養者が確認する情報を限定することができ、これにより培養者は効率的かつ正確に未分化・分化を確認することができる。
　また、表示制御部３４が観察画像をディスプレイ４に表示させる際、観察画像内に存在する各幹細胞コロニーの円形度や密集度などの特徴量をディスプレイ４に表示させたり、各幹細胞コロニーの未分化・分化の判定結果をディスプレイ４に表示させたりしてもよい。このように特徴量を表示させることによって、未分化・分化の判定結果の根拠を培養者が知ることができ、培養者の熟練度に依らずに判定確認を行うことができる。
　また、表示制御部３４が、変化情報取得部３３において取得された撮影時刻の観察画像だけでなく、その他の撮影時刻の観察画像やその観察画像内に存在する幹細胞コロニーの円形度や密集度や未分化・分化の判定結果をディスプレイ４に表示させたりしてもよい。
　次に、本発明の幹細胞分化判定装置および方法並びにプログラムの第２の実施形態を用いた幹細胞培養観察システムについて説明する。
　第２の実施形態の幹細胞培養観察システムは、図６に示すように、第１の実施形態の幹細胞培養観察システムに対してさらに信頼度取得部３６を設けるようにしたものである。その他の構成については、第１の実施形態の幹細胞培養観察システムと同様である。
　信頼度取得部３６は、幹細胞コロニー毎または分割領域毎に取得された特徴量に基づいて、幹細胞コロニー毎または分割領域毎の判定結果の信頼度を取得するものである。
　具体的には、たとえば各幹細胞コロニーについて円形度と幹細胞の密集度とを特徴量として取得し、これらに重み付けをして算出した評価値に基づいて未分化・分化の判定を行う場合には、コロニーの円形度が予め設定された閾値以上であり、かつ幹細胞の密集度が予め設定された閾値以上である場合、すなわち円形度による判定結果と幹細胞の密集度による判定結果とが合致する場合には、上記評価値に基づく判定結果の信頼度は高いものとして信頼度「１」を取得する。
　また、コロニーの円形度が閾値未満であり、かつ幹細胞の密集度が閾値未満である場合も、円形度による判定結果と幹細胞の密集度による判定結果とが合致するので、上記評価結果に基づく判定結果の信頼度は高いものとして信頼度「１」を取得する。
　そして、コロニーの円形度と幹細胞の密集度が上述したような値以外の場合には、すなわち円形度による判定結果と幹細胞の密集度による判定結果とが相反する場合には、上記評価値に基づく判定結果の信頼度は低いものとして信頼度「０」を取得する。
　なお、上記説明では、２段階の信頼度を取得するようにしたが、２段階に限らず、３段階以上の信頼度を取得するようにしてもよい。具体的には、コロニーの円形度や幹細胞の密集度の閾値との差を取得し、その差が大きいほど信頼度を低くし、差が小さいほど信頼度を高くするようにしてもよい。
　また、上記説明では、コロニーの円形度および幹細胞の密集度から算出された評価値に基づいて未分化・分化の判定を行う場合における信頼度の取得方法について説明したが、これに限らず、たとえば１つの特徴量に基づいて未分化・分化の判定を行う場合には、その特徴量と閾値との差に基づいて判定結果の信頼度を取得するようにすればよい。
　信頼度取得部３６によって取得された幹細胞コロニー毎または分割領域毎の信頼度は、表示制御部３４に出力される。そして、表示制御部３４は、上述したように特徴量または判定結果が変化した観察画像を表示する際、入力された信頼度に基づいて、信頼度の低い幹細胞コロニーまたは分割領域の画像から優先的に表示させる。
　優先的に表示させる方法としては、たとえば信頼度の低い幹細胞コロニーまたは分割領域の画像から順番に切り替えて表示させるようにしてもよいし、図７に示すように、信頼度の高低に基づく予め設定された配列で幹細胞コロニーまたは分割領域の画像を並べて表示するようにしてもよい。なお、図７に示す例では、左上から右下に向けて信頼度が高くなるものとする。
　上記第２の実施形態の幹細胞培養観察システムによれば、信頼度の低い画像を優先的に表示させるようにしたので、培養者は、信頼度の低い画像から優先的に判定結果を確認すれば良く、これにより効率的に判定結果の確認作業を行うことができる。
　また、特徴量または判定結果が変化した観察画像以外の観察画像を表示する際にも、上述したように信頼度の低い幹細胞コロニーまたは分割領域の画像から優先的に表示させるようにしてもよい。
　また、上述したように信頼度の低い幹細胞コロニーまたは分割領域の画像を優先的に表示する際、信頼度を取得するために用いた特徴量の内容も一緒に表示するようにしてもよい。
　また、上記第１および第２の実施形態の幹細胞培養観察システムにおいて、表示制御部３４が観察画像を表示する際、幹細胞コロニー全体を表示してもよいし、幹細胞コロニー内の一部の画像を表示するようにしてもよい。
　また、表示制御部３４が、特徴量または判別結果が変化した観察画像を表示する際、特徴量または判別結果が変化した撮影時刻を中心として前後に撮影された１０枚程度の観察画像を動画として表示するようにしてもよい。このように動画表示することによって未分化から分化への変化の軌跡を確認することができる。

Claims (13)

  1. 　幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得する観察画像取得部と、
    　前記観察画像毎について、前記幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する特徴量取得部と、
    　前記特徴量に基づいて、前記幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する判定部と、
    　時系列に撮影された前記観察画像間における前記特徴量の変化に関する情報または前記観察画像間における前記未分化から前記分化への判定結果の変化に関する情報を取得する変化情報取得部と、
    　前記特徴量の変化に関する情報または前記判定結果の変化に関する情報を出力する出力部とを備えたことを特徴とする幹細胞分化判定装置。
  2. 　前記変化情報取得部が、前記特徴量の変化に関する情報として、前記特徴量が変化した時刻情報、前記特徴量が変化した前記観察画像、前記特徴量が変化した前記観察領域内の位置情報および前記特徴量が変化した前記幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものである請求項１記載の幹細胞分化判定装置。
  3. 　前記変化情報取得部が、前記判定結果の変化に関する情報として、前記判定結果が変化した時刻情報、前記判定結果が変化した前記観察画像、前記判定結果が変化した前記観察領域内の位置情報および前記判定結果が変化した前記幹細胞のコロニーを特定する情報のうちの少なくとも１つを取得するものである請求項１または２記載の幹細胞分化判定装置。
  4. 　前記特徴量取得部が、前記観察領域内における複数の領域のそれぞれついて前記特徴量を取得するものであり、前記判定部が、前記領域毎について前記判定を行うものである場合において、
    　前記領域毎の前記特徴量に基づいて、前記領域毎の前記判定結果の信頼度を取得する信頼度取得部を備え、
    　前記出力部が、前記信頼度の低い前記領域の前記観察画像から優先的に出力するものである請求項１から３いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  5. 　前記領域が、前記幹細胞のコロニーの領域である請求項４記載の幹細胞分化判定装置。
  6. 　前記領域が、予め設定された分割領域である請求項４記載の幹細胞分化判定装置。
  7. 　前記出力部が、前記特徴量を出力するものである請求項１から６いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  8. 　前記観察画像を撮影する撮影部を備え、
    　該撮影部が、設定された注目する前記特徴量に応じて前記観察画像を撮影する際の光学倍率または解像度を切り替えるものである請求項１から７いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  9. 　前記出力部が、前記幹細胞のコロニー全体の前記観察画像を出力するものである請求項１から８いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  10. 　前記出力部が、前記幹細胞のコロニー内の一部の前記観察画像を出力するものである請求項１から８いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  11. 　前記出力部が、前記特徴量が変化した時点または前記判定結果が変化した時点を中心として前後に撮影された複数の前記観察画像を動画として出力するものである請求項１から１０いずれか１項記載の幹細胞分化判定装置。
  12. 　幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得し、
    　前記観察画像毎について、前記幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得し、
    　前記特徴量に基づいて、前記幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する際、
    　時系列に撮影された前記観察画像間における前記特徴量の変化に関する情報または前記観察画像間における前記未分化から前記分化への判定結果の変化に関する情報を取得し、　前記特徴量の変化に関する情報または前記判定結果の変化に関する情報を出力することを特徴とする幹細胞分化判定方法。
  13. 　コンピュータを、
    　幹細胞を含む観察領域を時系列に撮影した少なくとも２つの観察画像を取得する観察画像取得部と、
    　前記観察画像毎について、前記幹細胞の少なくとも１つの特徴量を取得する特徴量取得部と、
    　前記特徴量に基づいて、前記幹細胞が未分化であるかまたは分化しているかを判定する判定部と、
    　時系列に撮影された前記観察画像間における前記特徴量の変化に関する情報または前記観察画像間における前記未分化から前記分化への判定結果の変化に関する情報を取得する変化情報取得部と、
    　前記特徴量の変化に関する情報または前記判定結果の変化に関する情報を出力する出力部として機能させることを特徴とする幹細胞分化判定プログラム。
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