JP5696144B2

JP5696144B2 - 多能性幹細胞コロニーの識別方法及び装置並びに多能性幹細胞の自動培養方法及び装置

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Publication number: JP5696144B2
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Description

本発明は、多能性幹細胞コロニーの識別方法及び装置並びに多能性幹細胞の自動培養方法及び装置に関し、より詳細には、未分化の多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーとそれ以外のコロニーとを識別する方法及び装置と、これらの方法及び装置を用いた多能性幹細胞の自動培養方法及び装置に関する。

近年、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞（本明細書においては、「ＥＳ細胞」と「ｉＰＳ細胞」とを総称して「多能性幹細胞」という。）が人工的に創り出されるに至り、再生医療などの分野で大きな寄与が期待されている。多能性幹細胞は生体を構成する種々の細胞に分化し得る分化万能性を有しているため、患者自身のｉＰＳ細胞を用いることにより、拒絶反応を起こすことなく皮膚、軟骨、骨、血管、神経、臓器等を再生することが可能となる。

多能性幹細胞は上述のように分化万能性を有しているため、培養の途中で一部の多能性幹細胞が分化を開始してしまう場合がある。このように分化を開始した細胞は再び未分化の状態に戻すことはできず、目的とする臓器や器官の作成には使用できないこととなる。従って、多能性幹細胞の継代に際しては、培養された幹細胞のコロニーが未分化であるか否かを見極め、最終的に未分化多能性幹細胞のみを分離することが重要である。

このような未分化多能性幹細胞の識別は、例えば「ＡＶＩＳＯ社」の「ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（登録商標）」を用い、細胞の染色や蛍光観察により行うことができる。しかしながら、一般に染色は細胞を固定化してから行うことが多く、また色素が細胞に対して毒性を示すことが多いため、細胞を生きたまま観察することは困難である。また、低毒性の色素を用いたとしても、細胞にとってはやはり毒であり、再生医療分野への応用は不適切である。

また、未分化多能性幹細胞の識別を行うに際して培養容器の撮像画像を取得し、これを画像処理した撮像画像を用いてコロニー毎に未分化コロニーであるか否かの判断をそのコロニーの輝度に基づいて行う試みが為されている（特願２００９−２３５３０６号）。しかし、コロニーの輝度のみに基づいて未分化コロニーを識別する場合、条件によっては正確な識別ができない場合がある。また、全てのコロニーについて一つ一つ判断しなければならないため、培養容器全体についての判断が終了するまでに長時間を要し、培養容器内で細胞の状態が変化してしまうという問題点がある。

本発明は、上記従来技術の問題点を解決するために為されたものであり、本発明の目的は、多能性幹細胞の培養に際して、培養容器上のコロニーが分化であるか未分化であるかを識別し得る方法及び装置を提供し、並びに未分化多能性幹細胞を迅速に培養し得る方法及び装置を提供することである。

本発明は、未分化の多能性幹細胞のみにより形成されるコロニーの形状が円形に近く、分化した多能性幹細胞を含むコロニーの形状は円形にはならないという知見に基づいて為されたものである。即ち、本発明のコロニーの識別方法は、多能性幹細胞の培養器内の撮像画像に基づいて未分化コロニーと未確定コロニーとの識別を行うコロニーの識別方法であって、コロニーの円形度の所定の第１の閾値をＣ１、第２の閾値をＣ２（Ｃ１＜Ｃ２）とした場合に、コロニーの円形度Ｃを演算により求め、Ｃ２≦Ｃとなるコロニーを未分化多能性幹細胞のみを含む前記未分化コロニーであると判断し、Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２となるコロニーを未分化コロニーである可能性のある未確定コロニーであると判断することを特徴とする。

ここで、本明細書においては、「多能性幹細胞」とは、「分化した多能性幹細胞」及び「未分化の多能性幹細胞」を含む細胞をいい、「分化した多能性幹細胞」及び「分化多能性幹細胞」とは、分化が始まった多能性幹細胞又は多能性幹細胞から分化した細胞のことをいう。また、円形度Ｃ＝（４πＳ）／（Ｌ×Ｌ）によって定義される値をいう。ここで、Ｓはコロニーの面積、Ｌはコロニーの周囲長である。従って、コロニーの形状が円形の場合は円形度Ｃ＝１となり、コロニーの形状が歪むに従って円形度Ｃは小さくなり、また、コロニーの外周がギザギザである場合も円形度Ｃは小さくなることが分かる。

上記コロニーの識別方法には、更に、Ｃ＜Ｃ１となるコロニーを多能性幹細胞を含む前記分化コロニーであると判断する構成を付加することができる。

また、上記の識別方法においては、前記円形度に加え、前記撮像画像におけるコロニーの輪郭内の輝度Ｂに基づいて、未分化コロニーと、前記未確定コロニーと、分化コロニーとを識別するように構成することができる。

コロニーの輝度による識別は、未分化の多能性幹細胞は撮像画像において暗く見え、分化した多能性幹細胞は撮像画像において明るく見え、更に多能性幹細胞が多層に重なった多層多能性幹細胞の場合は未分化の多能性幹細胞より更に暗く見えるという知見に基づいている。

具体的には、円形度Ｃに基づいて識別した未分化コロニーを（Ａ）、未確定コロニーを（Ｂ）、分化コロニーを（Ｃ）、コロニーの輝度の所定の第１の閾値をＢ１、第２の閾値をＢ２、第３の閾値をＢ３、第４の閾値をＢ４（Ｂ１＜Ｂ２＜Ｂ３＜Ｂ４）とした場合に、コロニーの輪郭内全ての輝度がＢ２≦Ｂ≦Ｂ３となるコロニーを未分化コロニー（ａ）であると判断し、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ＜Ｂ１となるコロニーを多層コロニー（ｄ）であると判断し、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ４＜Ｂとなるコロニーを分化コロニー（ｃ）であると判断し、前記未分化コロニー（ａ）、前記多層コロニー（ｄ）、前記分化コロニー（ｃ）以外のコロニーを未確定コロニー（ｂ）であると判断した後、最終的に（（Ａ）かつ（ａ））となるコロニーを前記未分化コロニーであると判断し、（（Ａ）かつ（ｂ）又は（Ｂ）かつ（ａ）又は（Ｂ）かつ（ｂ））となるコロニーを前記未確定コロニーであると判断し、（ｄ）となるコロニーを多能性幹細胞が多層に重なった前記多層コロニーであると判断し、（（ｃ）又は（Ｃ）かつ（ａ）又は（Ｃ）かつ（ｂ））となるコロニーを前記分化コロニーであると判断するように構成することができる。

更に、本発明のコロニーの識別方法は、前記未確定コロニーについて更に精細画像を得、該精細画像における該未確定コロニー内の細胞全てが所定の大きさより小さい場合に、前記未確定コロニーが前記未分化コロニーであると識別するように構成することができる。

このような未確定コロニー内の細胞の大きさによる識別は、未分化の多能性幹細胞は小さく、分化した多能性幹細胞は未分化多能性幹細胞より大きいという知見に基づいている。

本発明のコロニーの識別方法においては、前記撮像画像は、画像処理により輪郭強調することが好ましい。

本発明の多能性幹細胞の自動培養方法は、上記のコロニーの識別方法により前記未分化コロニーと該未分化コロニー以外のコロニーとを識別する工程、前記未分化コロニーと該未分化コロニー以外のコロニーの位置情報を取得する工程、前記培養容器に細胞剥離剤を導入する工程、前記位置情報に基づいて前記未分化コロニーを剥離させる工程、及び該未分化コロニーの剥離により得られる未分化コロニーを回収する工程を包含することを特徴とする。

また、本発明の多能性幹細胞の自動培養方法は、上記のコロニーの識別方法により前記未分化コロニー以外のコロニーを識別する工程、前記未分化コロニー以外のコロニーの位置情報を取得する工程、前記培養容器に細胞剥離剤を導入する工程、前記位置情報に基づいて、前記未分化コロニー以外のコロニーを剥離させる工程、該未分化コロニー以外のコロニーの剥離により得られる多能性幹細胞を取り除く工程、及び前記未分化コロニーを剥離させて未分化コロニーを回収する工程を包含することを特徴とする。

更に、本発明の多能性幹細胞の自動培養方法は、上記のコロニーの識別方法により前記未分化コロニーを識別する工程、前記未分化コロニーの数及び該未分化コロニー以外のコロニーの数を取得する工程、及び（未分化コロニー数）／（コロニー総数）が所定の閾値より大きい場合に、前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収する工程を包含することを特徴とする。

また、上記において、更に、（未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未確定コロニーのそれぞれについて、更に精細画像を取得し、該精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断したものの数を前記未分化コロニー数に加えて新たな未分化コロニー数とし、（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に、前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するとともに、（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未分化コロニーと前記精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断した未確定コロニーとを選択的に剥離させて回収する工程を包含していてもよい。

本発明のコロニー識別装置は、多能性幹細胞の培養器内の撮像画像を得る画像取得手段と、前記撮像画像から求めたコロニーの円形度Ｃに基づいて分化コロニーと未分化コロニーとの識別を行う識別手段とを備え、該識別手段は、コロニーの円形度の所定の第１の閾値をＣ１、第２の閾値をＣ２（Ｃ１＜Ｃ２）とした場合に、Ｃ２≦Ｃとなるコロニーを未分化多能性幹細胞のみを含む前記未分化コロニーであると判断し、Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２となるコロニーを未分化コロニーである可能性のある未確定コロニーであると判断し、Ｃ＜Ｃ１となるコロニーを分化した多能性幹細胞を含む前記分化コロニーであると判断することを特徴とする。

また、上記において、前記識別手段は、前記円形度に加え、前記撮像画像におけるコロニーの輪郭内の輝度Ｂに基づいて、前記未分化コロニーと、前記未確定コロニーと、前記分化コロニーとを識別するように構成することができる。

更に、本発明のコロニー識別装置は、前記未確定コロニーについて精細画像を得る精細画像取得手段を更に備え、前記識別手段は、該精細画像における該未確定コロニー内全ての細胞が所定の大きさより小さい場合に、前記未確定コロニーが前記未分化コロニーであると識別するように構成することができる。

本発明のコロニーの識別装置においては、前記撮像画像は、画像処理により輪郭強調することが好ましい。

本発明の多能性幹細胞の自動培養装置は、上記のコロニー識別装置と、前記培養容器に細胞剥離剤を導入する剥離剤導入手段と、前記各コロニーの位置情報に基づいて前記未分化コロニーを剥離させるとともに、該未分化コロニーの剥離により得られる未分化コロニーを回収するピペッティング装置とを備えたことを特徴とする。

また、本発明の多能性幹細胞の自動培養装置は、上記のコロニー識別装置と、前記未分化コロニー以外のコロニーの位置情報を取得する位置情報取得手段と、前記培養容器に細胞剥離剤を導入する剥離剤導入手段と、
前記位置情報取得手段において取得した位置情報に基づいて前記未分化コロニー以外のコロニーを剥離させ、該未分化コロニー以外のコロニーの剥離により得られる多能性幹細胞を取り除き、更に前記未分化コロニーを剥離させて未分化コロニーを回収するピペッティング装置とを備えたことを特徴とする。

更に、本発明の多能性幹細胞の自動培養装置は、上記のコロニー識別装置と、前記未分化コロニー及び該未分化コロニー以外のコロニーの数を取得するコロニー数取得手段と、（未分化コロニー数）／（コロニー総数）が所定の閾値より大きい場合に前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するピペッティング装置とを備えたことを特徴とする。

上記多能性幹細胞の自動培養装置においては、（未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未確定コロニーのそれぞれについて、更に精細画像を取得する精細画像取得手段を更に備え、
前記コロニー数取得手段は、該精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断したものの数を前記未分化コロニー数に加えて新たな未分化コロニー数とし、
前記ピペッティング装置は、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に、前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するとともに、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未分化コロニーと前記精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断した未確定コロニーとを選択的に剥離させて回収する構成を付加することもできる。

多能性幹細胞コロニーの識別方法及び装置並びに多能性幹細胞の自動培養方法及び装置は、多能性幹細胞の培養容器内のコロニーの撮像画像を得、これを画像処理し、各コロニーの円形度に基づいて分化コロニーと未分化コロニーとを識別しているため、コロニーが未分化であるか分化であるかについて識別を行うことを可能としている。従って、多能性幹細胞の培養に際してその一部のコロニーが分化を開始した場合にも、未分化コロニーのみを識別することが可能となる。

（ａ）は多能性幹細胞が存在しないディッシュにおける照明光の散乱状態を示す模式図、（ｂ）は未分化の多能性幹細胞が存在するディッシュにおける照明光の散乱状態を示す模式図、（ｃ）は分化した多能性幹細胞が存在するディッシュにおける照明光の散乱状態を示す模式図、（ｄ）は多層化した多能性幹細胞が存在するディッシュにおける照明光の散乱状態を示す模式図である。ディッシュ内のコロニーについて、その撮像画像の輝度に基づき識別を行う場合の閾値を示す概念図である。本発明の一実施形態におけるコロニーの識別手順を示すフローチャートである。コロニーの識別が行われた後の処理を示すフローチャートである。ディッシュ内の撮像画像を取得する撮像装置（カメラ）を示す斜視図である。ピペッティングにより培養液を吐出して未分化コロニーの剥離を行うピペッティング装置を示す斜視図である。ピペッティングにより剥離した未分化コロニーの回収を行うピペッティング装置を示す斜視図である。分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーと、未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーとが混在する培養容器内の模式図である。１回のピペッティングにより剥離される範囲を表す模式図である。未分化コロニーの大きさが１回のピペッティングにより剥離される範囲より小さい場合のピペッティング操作を示す模式図である。未分化コロニーの大きさが１回のピペッティングにより剥離される範囲より大きい場合のピペッティングの範囲を示す模式図である。未分化コロニーの大きさが１回のピペッティングにより剥離される範囲より大きい場合のピペッティング操作の手順を示す模式図である。未分化コロニーの近傍に分化コロニーが存在する場合のピペッティング操作を示す模式図である。

本発明の実施形態について、図面を参照しながら以下に説明するが、本発明は以下の記載に限定されるものではない。

本発明は、上述のように、未分化の多能性幹細胞のみにより形成されるコロニーの形状が円形に近く、分化した多能性幹細胞を含むコロニーの形状は円形にはならないという知見に基づいて為されたものである。本発明のコロニーの識別方法においては、分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーであるか、未分化の多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーであるかの識別に加えて、未分化コロニーである可能性のある未確定コロニーであるかについての識別がコンピュータなどを用いて自動的に行われる。ここで、未確定コロニーとは、分化コロニー及び未分化コロニーの何れであるかを特定することができないが、未分化コロニーである可能性のあるコロニーをいう。また、これらの識別に加えて、多層に重なった多能性幹細胞を含む多層コロニーの識別も行うことができる。未確定コロニーであると判断されたコロニーについては、後述するように更に精細画像を用いることにより、分化コロニーであるか未分化コロニーであるかの識別が行われる。

このような識別は、コロニーを形成している培養後の多能性幹細胞の培養容器の広範囲に亘る広視野画像を得、これを画像処理した後の画像に基づいて各コロニーの円形度及び輝度を求めることにより行われる。なお、ここでの画像処理には、コロニーの輪郭を強調する処理と、各画素の輝度を例えばモノクロの０〜２５５階調（８ビット）の範囲の輝度にノーマライズする処理とが含まれる。また、本実施形態では輝度を８ビット２５６階調で表しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、これより階調数を大きく又は小さくすることが可能である。

本発明においては、まず、コロニーの形状に基づいて識別が行われる。具体的には、コロニーの円形度Ｃ＝（４πＳ）／（Ｌ×Ｌ）（Ｓはコロニーの面積、Ｌはコロニーの周囲長）を求め、コロニーの円形度が１に近いほどそのコロニーに含まれる多能性幹細胞が未分化のみである蓋然性が高いことになる。なお、本実施形態ではコロニーの円形度を（４πＳ）／（Ｌ×Ｌ）の式により求めたが、本発明はこれに限定されるものではなく、円形度を求めることができる式であれば、他の式を用いて求めてもよい。

本発明においては、コロニーの円形度Ｃについて、分化未分化を確定することができない未確定コロニーの円形度と分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーの円形度との境界の閾値を第１の閾値Ｃ１とし、未分化の多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーの円形度と未確定コロニーの円形度との境界の閾値が第２の閾値Ｃ２（Ｃ１＜Ｃ２）として設定される。これらの閾値に基づき、Ｃ２≦Ｃとなるコロニーが未分化コロニーであると判断され、Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２となるコロニーが未確定コロニーであると判断され、Ｃ＜Ｃ１となるコロニーが分化コロニーであると判断される。

上述のコロニーの識別に用いる撮像画像を得るに際しては、例えば、ガウシアンフィルタや中間値フィルタが使用される。これらのフィルタを使用することにより、ノイズやフィーダ細胞の画像を除去することができる。しかし、これらのフィルタによっては大きなフィーダ細胞による画像は除去することができない等の理由により、円形度のみによっては分化コロニーと未分化コロニーの識別を正確に行うことができない場合がある。本実施形態においては、以下の輝度によるコロニーの識別を並行して行うことにより、更に正確なコロニーの識別を行うことが可能となっている。

輝度によるコロニーの識別は、以下のような知見に基づいている。即ち、図１（ａ）に示すように、ディッシュの底面１０に細胞などが付着していない場合、照明光１２はディッシュの底面１０を透過した後、殆ど散乱せずに撮像光１３としてカメラなどからなる撮像装置１１に到達するため、得られる画像は明るいものになる。これに対して、図１（ｂ）に示すように、ディッシュの底面１０に多能性幹細胞等が付着している場合、照明光１２は未分化の多能性幹細胞２１ａによって散乱されることになる。ここで、未分化の多能性幹細胞２１ａは後述する分化した多能性幹細胞に比較して小さく、また、細胞の核２２の大きさは分化未分化によって大きな変化はないため、未分化の多能性幹細胞２１ａでは分化した多能性幹細胞に比較して核２２以外の部分の占める割合が相対的に小さく、図１（ｂ）に示すように、照明光１２は比較的大きく散乱されることになる。そのため、撮像装置１１に到達する撮像光１４は少なくなり、得られる未分化の多能性幹細胞２１ａの部分の画像は暗くなる。一方、分化した多能性幹細胞では、図１（ｃ）に示すように、核２２に対して核２２以外の部分が相対的に大きく、そのため、図１（ｂ）の未分化多能性幹細胞の場合より照明光１２が受ける散乱は小さくなり、撮像装置１１に到達する撮像光１５は多くなる。従って、得られる分化多能性幹細胞２１ｂの部分の画像は、図１（ｂ）の未分化多能性幹細胞の場合より明るくなる。更に、多能性幹細胞の培養が過剰に行われるなどにより、図１（ｄ）に示すように、多能性幹細胞２１ｃが多層に重なった多層コロニーの場合は、照明光１２は図１（ｂ）の場合より大きく散乱されるため、撮像装置１１に到達する撮像光１６は非常に少なくなり、得られる多能性幹細胞２１ｃの部分の画像は非常に暗くなる。

なお、上記のように散乱光の強弱によりコロニーの識別を行う場合、照明方法によって細胞の見え方は異なるので、分化した多能性幹細胞は明るく、未分化の多能性幹細胞は中程度の明るさに、多層化した多能性幹細胞は暗く見えるようにするために、照明光として、観察位置に対して透過照明光を一方向から照射することが好ましい。

本発明においては、図２に示すように、撮像画像の輝度について閾値が定められる。具体的には、多層化した多能性幹細胞の輝度と未確定の多能性幹細胞の輝度との境界の閾値として第１の閾値Ｂ１が、未確定の多能性幹細胞の輝度と未分化の多能性幹細胞の輝度との境界の閾値として第２の閾値Ｂ２及び第３の閾値Ｂ３が、未確定の多能性幹細胞の輝度と分化した多能性幹細胞の輝度との境界の閾値が第４の閾値Ｂ４（Ｂ１＜Ｂ２＜Ｂ３＜Ｂ４）としてそれぞれ設定される。多能性幹細胞の輝度Ｂに基づくコロニーの識別においては、コロニーの輪郭内全ての輝度がＢ２≦Ｂ≦Ｂ３となるコロニーが未分化コロニーであると判断され、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ＜Ｂ１となるコロニーが多層コロニーであると判断され、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ４＜Ｂとなるコロニーが分化コロニーであると判断され、未分化コロニー、多層コロニー、分化コロニー以外のコロニーが未確定コロニーであると判断される。

本発明においては、分化未分化を確定することができない未確定コロニーに対しては、更に精細画像（拡大画像）を取得することにより、最終的に未分化コロニーであるか分化コロニーであるかの判断が行われる。ここで、精細画像とは、広視野画像の中の一部を広視野画像と同じ大きさで表したものをいう。上述のように分化した多能性幹細胞２１ｂ（図１（ｃ））に比較して未分化の多能性幹細胞２１ａ（図１（ｂ））は小さいため、精細画像を用いて細胞の大きさを判断することにより、未分化コロニーであるか分化コロニーであるかを識別することができる。

図３は、本発明の一実施形態においてコロニーの識別が行われる手順を示すフローチャートである。本実施形態では、まず、図５に示すように、多能性幹細胞を培養したディッシュ４１内を蓋４２を介してカメラ４３により撮影して広視野の画像が取得される（ステップ５０）。この画像を画像処理により輪郭強調し、更に８ビットの輝度にノーマライズした撮像画像（ステップ５２）を得、この撮像画像用いて、上記のコロニーの識別と、各コロニーの位置情報の取得とが行われる。なお、ディッシュ４１内の撮影は、蓋４２を外した状態で行ってもよい。本実施形態では、コロニーの円形度Ｃによる識別（図３のステップ５４）とコロニーの輪郭内の輝度Ｂによる識別（図３のステップ５６）とが並行して行われる。なお、本実施形態では、円形度Ｃによる識別と輝度Ｂによる識別とを並行して行ったが、これらの何れか一方の識別を先に行った後、他方の識別を行うように構成してもよい。

コロニーの円形度Ｃによる識別においては、前述の図３に示すように、Ｃ２≦Ｃとなるコロニーが未分化コロニー（Ａ）であると判断され、Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２となるコロニーが未確定コロニー（Ｂ）であると判断され、Ｃ＜Ｃ１となるコロニーが分化コロニー（Ｃ）であると判断される。同様に、多能性幹細胞の輝度Ｂに基づく識別においては、前述の図２及び図３に示すように、コロニーの輪郭内全ての輝度がＢ２≦Ｂ≦Ｂ３となるコロニーが未分化コロニー（ａ）であると判断され、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ＜Ｂ１となるコロニーが多層コロニー（ｄ）であると判断され、コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ４＜Ｂとなるコロニーが分化コロニー（ｃ）であると判断され、未分化コロニー（ａ）、多層コロニー（ｄ）、分化コロニー（ｃ）以外のコロニーが未確定コロニー（ｂ）であると判断される。

本実施形態では、上記コロニーの円形度Ｃによる識別結果と、上記コロニーの輪郭内の輝度Ｂによる識別結果とに基づいて、最終的なコロニーの識別が行われる。本実施形態では、
（Ａ）かつ（ａ）
となるコロニーが未分化コロニーであると判断され、
（Ａ）かつ（ｂ）又は（Ｂ）かつ（ａ）又は（Ｂ）かつ（ｂ）
となるコロニーが未確定コロニーであると判断され、
（ｄ）
となるコロニーが多層コロニーであると判断され、
（ｃ）又は（Ｃ）かつ（a）又は（Ｃ）かつ（ｂ）
となるコロニーが分化コロニーであると判断される。

図４は、コロニーの識別が行われた後の処理を示すフローチャートである。本実施形態においては、まず、（Ａ）かつ（ａ）で判断された未分化コロニー数と、培養容器全体におけるコロニーの総数との比率、即ち（未分化コロニー数）／（コロニー総数）が求められる（ステップ６０）。この比率が所定の閾値と比較され、閾値より大きいか等しい場合には、培養容器内の全てのコロニーの剥離が行われ、未分化及び分化した多能性幹細胞の両方を含む細胞が一括して次の継代に供される（ステップ６７）。培養容器内の全てのコロニーの剥離は、培養容器に細胞剥離剤を導入した後、ピペッティング装置から培養液を培養容器の全面に吐出することにより行われる。

このように未分化及び分化した両方の細胞を用いて一括継代を行うことにより、未分化及び分化した多能性幹細胞の選別に要する時間を省略することが可能となり、培養時間全体の短縮を図ることができる。また、このような継代は分化を開始した多能性幹細胞の継代を伴うことになるが、このような分化した多能性幹細胞は未分化の多能性幹細胞とは性質が異なるため、細胞培養の最終段階における継代で未分化の多能性幹細胞を分離すれば、分化した多能性幹細胞を容易に排除することができる。

一方、上記の（未分化コロニー数）／（コロニー総数）の比率が閾値より小さい場合（ステップ６１）には、未確定コロニーのそれぞれについて更に精細画像（拡大画像）が取得される（ステップ６２）。本実施形態では、この精細画像についても、前述の広視野画像と同様の画像処理が行われる。コロニーの精細画像においては、前述のように未分化の多能性幹細胞は小さく、分化した多能性幹細胞は大きく見えるので、精細画像における全ての細胞が所定の大きさより小さい場合に当該未確定コロニーは未分化コロニーであると識別され、精細画像において所定の大きさより大きい細胞が含まれている場合には当該未確定コロニーは分化を開始した細胞を含む分化コロニーであると識別される（ステップ６３）。

このようにして全ての未確定コロニーについて未分化コロニーであるか分化コロニーであるかの識別が終了した後、再度（未分化コロニー数）／（コロニー総数）の比率が求められる。そして、上述と同様にこの比率が所定の閾値と比較され（ステップ６４）、閾値より大きいか等しい場合には、上述と同様に培養容器内の全てのコロニーの剥離が行われ、未分化及び分化した多能性幹細胞の両方を含む細胞が次の継代に供される。このように未分化及び分化した両方の多能性幹細胞を用いて次の継代を行うことにより、未分化及び分化した多能性幹細胞の選別に要する時間を省略することが可能となり、培養時間全体の短縮を図ることができる。

一方、上記の（未分化コロニー数）／（コロニー総数）の比率が閾値より小さい場合には、未分化コロニーのみの選択的剥離が行われる（ステップ６６）。図８は未分化コロニーと分化コロニーとが混在している培養容器の撮像画像を模式的に示しており、未分化の領域は濃く、分化した部分は白抜きで示されている。図８において、未分化の多能性幹細胞のみからなる孤立した未分化コロニー３１及び３５が剥離により回収すべきコロニーである。周辺が分化を開始した分化コロニー３２、全体が分化してしまった分化コロニー３３、及び内部が部分的に分化している分化コロニー３４も分離すべきコロニーから除外される。一方、コロニー３６は未分化の多能性幹細胞のみからなるが、後述するようにピペッティング装置からの液の吐出により剥離を行うと、ピペッティングの液流の作用が及び得る近傍に存在する分化コロニー３７から分化した多能性幹細胞が剥離してしまうため、未分化コロニー３６は選択されない。このような未分化コロニーの選択に際しては、ピペッティング装置に装着するチップの種類や吐出液の吐出速度等によって物理的な力の作用する範囲が変化することを考慮する必要がある。剥離方法としてピペッティングよりも位置精度の高いクローニングリング、ガラスキャピラリ等を用いる場合は、未分化コロニーと分化コロニーとの間の距離が小さい場合にも、未分化コロニーのみの剥離を行うことができる。

次に、回収すべき未分化コロニーが選択された後、ピペッティング装置による未分化コロニーの回収が行われる。まず、培養容器全体に細胞剥離剤が導入される。この剥離剤の種類、濃度、量等は、剥離を行う所定時間の間、ディッシュの底面に付着した細胞をピペッティング装置の吐出による培養液の液流により剥離させることができ、かつ、液流がない状態では細胞がディッシュ底面から剥離しないように決められる。細胞剥離剤を含む剥離液を導入した後、図６に示すように、選択された未分化コロニーに対してピペッティング装置４４から培地が吐出され、その液流により未分化コロニーのみが剥離することになる。ピペッティング装置からの培地の吐出は１回に限らず、同じ位置で又は移動しながら複数回行うことも可能であり、吐出速度、液量なども変更可能である。剥離すべき未分化コロニーの剥離が完了すると、図７に示すように、必要に応じてディッシュ４１を傾斜させて、未分化コロニーを含む液がピペッティング装置４４により回収され、更に継代が必要な場合は、新たな培地を入れたディッシュ４１に分注されることとなる。

ここで、未分化コロニーの剥離を行う場合のピペッティング操作について説明する。図９に示すように、ピペッティングにより細胞が剥離される範囲の半径をｒとする。近傍に分化コロニーなどの剥離対象となっていないコロニーが存在せず、完全に孤立しているコロニーの場合で、図１０に示すように、ピペッティングにより剥離される半径ｒが剥離されるべき未分化コロニーの半径Ｒより大きい場合には、１回のピペッティングによりコロニー全体を剥離させることができる。また、ピペッティングにより細胞が剥離される範囲の半径ｒが剥離されるべき未分化コロニーの半径Ｒより小さい場合には、図１１に示すように、複数回（図１１では４回）のピペッティングにより未分化コロニー全体の剥離が行われる。その場合の手順は、図１２に示すように、まず、２回のピペッティングにより、未分化コロニー４５の上側半分が剥離され、その状態を確認した後、更に２回のピペッティングにより、未分化コロニー４５の下側半分が剥離されて未分化コロニー全体の剥離が完了する。一方、図１３に示すように、未分化コロニー４５の近傍に分化コロニー４６などが存在する場合は、分化コロニー４６を含む領域４７の部分についてはピペッティングによる剥離を行うことなく、領域４８ａ、領域４８ｂ及び領域４８ｃの３つの領域のみについてピペッティングによる剥離が行われる。

本実施形態においては、多能性幹細胞の培養容器内のコロニーの撮像画像を得、これを画像処理し、各コロニーの円形度及び輝度に基づいて分化コロニーと未分化コロニーとを識別しているため、コロニーが未分化であるか分化であるかについて正確な識別を行うことを可能としている。従って、多能性幹細胞の培養に際してその一部のコロニーが分化を開始した場合にも、未分化コロニーのみを識別することが可能となる。また、このようにコロニーを識別し、未分化コロニーが多い場合には培養容器内の全てのコロニーについて継代を行うことにより、最終的に未分化の多能性幹細胞を迅速に培養することが可能となる。

なお、上記では、未分化コロニーのみを剥離させて回収する場合について説明したが、未分化コロニー以外の全てのコロニーを剥離させてピペッティング装置４４を用いてディッシュから除去した後、ディッシュに残った全ての未分化コロニーを一挙に剥離させて回収するように構成することも可能である。また、未分化コロニーの回収と未分化コロニー以外のコロニーの除去とを別々のピペッティング装置を用いて行ってもよい。

本発明の多能性幹細胞コロニーの識別方法及び装置並びに多能性幹細胞の自動培養方法及び装置によれば、未分化の多能性幹細胞を選択的にかつ迅速に継代することができるので、再生医療の分野で利用可能である。

１０ディッシュ底面
１１撮像装置
１２照明光
１３，１４，１５，１６撮像光
２１ａ未分化の多能性幹細胞
２１ｂ分化した多能性幹細胞
２１ｃ多層に重なった多能性幹細胞
２２核
４１ディッシュ
４２蓋
４３カメラ
３１未分化コロニー
３２，３３，３４分化コロニー
３５，３６未分化コロニー
３７分化コロニー
４４ピペッティング装置
４５未分化コロニー
４６分化コロニー
４７剥離領域
４８ａ，４８ｂ，４８ｃ剥離領域

Claims

多能性幹細胞の培養器内の明視野法による撮像画像に基づいて未分化コロニーと未確定コロニーと分化コロニーと多層コロニーとの識別を行うコロニーの識別方法であって、
コロニーの円形度の所定の第１の閾値をＣ１、第２の閾値をＣ２（Ｃ１＜Ｃ２）とした場合に、コロニーの円形度Ｃを演算により求め、
Ｃ２≦Ｃ
となるコロニーを未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーであると判断し、
Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２
となるコロニーを未分化コロニーである可能性のある未確定コロニーであると判断し、
Ｃ＜Ｃ１
となるコロニーを多能性幹細胞を含む分化コロニーであると判断し、
円形度Ｃに基づいて識別した未分化コロニーを（Ａ）、未確定コロニーを（Ｂ）、分化コロニーを（Ｃ）、前記撮影画像におけるコロニーの輝度の所定の第１の閾値をＢ１、第２の閾値をＢ２、第３の閾値をＢ３、第４の閾値をＢ４（Ｂ１＜Ｂ２＜Ｂ３＜Ｂ４）とした場合に、
コロニーの輪郭内全ての輝度がＢ２≦Ｂ≦Ｂ３となるコロニーを未分化コロニー（ａ）であると判断し、
コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ＜Ｂ１となるコロニーを多層コロニー（ｄ）であると判断し、
コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ４＜Ｂとなるコロニーを分化コロニー（ｃ）であると判断し、
未分化コロニー（ａ）、多層コロニー（ｄ）、分化コロニー（ｃ）以外のコロニーを未確定コロニー（ｂ）であると判断した後、
（Ａ）かつ（ａ）
となるコロニーを未分化コロニーであると判断し、
（Ａ）かつ（ｂ）又は（Ｂ）かつ（ａ）又は（Ｂ）かつ（ｂ）
となるコロニーを未確定コロニーであると判断し、
（ｄ）
となるコロニーを多能性幹細胞が多層に重なった多層コロニーであると判断し、
（ｃ）又は（Ｃ）かつ（a）又は（Ｃ）かつ（ｂ）
となるコロニーを分化コロニーであると判断することを特徴とするコロニーの識別方法。
前記未確定コロニーについて更に精細画像を得、該精細画像における該未確定コロニー内の細胞が所定の大きさより小さい場合に、前記未確定コロニーが前記未分化コロニーであると識別することを特徴とする請求項１に記載のコロニーの識別方法。
前記撮像画像は、画像処理により輪郭強調することを特徴とする請求項１又は２に記載のコロニーの識別方法。
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコロニーの識別方法により前記未分化コロニーと該未分化コロニー以外を識別する工程、
前記未分化コロニーと該未分化コロニー以外の位置情報を取得する工程、
前記培養容器に細胞剥離剤を導入する工程、
前記位置情報に基づいて前記未分化コロニーを剥離させる工程、及び
該未分化コロニーの剥離により得られる未分化コロニーを回収する工程
を包含することを特徴とする多能性幹細胞の自動培養方法。
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコロニーの識別方法により前記未分化コロニー以外のコロニーを識別する工程、
前記未分化コロニー以外のコロニーの位置情報を取得する工程、
前記培養容器に細胞剥離剤を導入する工程、
前記位置情報に基づいて、前記未分化コロニー以外のコロニーを剥離させる工程、
該未分化コロニー以外のコロニーの剥離により得られる多能性幹細胞を取り除く工程、及び
前記未分化コロニーを剥離させて未分化コロニー多能性幹細胞を回収する工程
を包含することを特徴とする多能性幹細胞の自動培養方法。
請求項１乃至３の何れか一項に記載のコロニーの識別方法により前記未分化コロニーを識別する工程、
前記未分化コロニーの数及び該未分化コロニー以外のコロニーの数を取得する工程、及び
（未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に、前記培養容
器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収する工程
を包含することを特徴とする多能性幹細胞の自動培養方法。
更に、（未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未確定コロニーのそれぞれについて、更に精細画像を取得し、該精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断したものの数を前記未分化コロニー数に加えて新たな未分化コロニー数とし、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に、前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するとともに、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未分化コロニーと前記精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断した未確定コロニーとを選択的に剥離させて回収する工程
を包含することを特徴とする請求項６に記載の多能性幹細胞の自動培養方法。
多能性幹細胞の培養器内の明視野法による撮像画像を得る画像取得手段と、
前記撮像画像から求めたコロニーの円形度Ｃ及び輝度に基づいて未分化コロニーと未確定コロニーと分化コロニーと多層コロニーとの識別を行う識別手段と
を備え、
該識別手段は、コロニーの円形度の所定の第１の閾値をＣ１、第２の閾値をＣ２（Ｃ１＜Ｃ２）とした場合に、
Ｃ２≦Ｃ
となるコロニーを未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーであると判断し、
Ｃ１≦Ｃ＜Ｃ２
となるコロニーを未分化コロニーである可能性のある未確定コロニーであると判断し、
Ｃ＜Ｃ１
となるコロニーを多能性幹細胞を含む分化コロニーであると判断し、
前記識別手段は、
前記円形度Ｃに基づいて識別した未分化コロニーを（Ａ）、未確定コロニーを（Ｂ）、分化コロニーを（Ｃ）、前記撮像画像におけるコロニーの輝度の所定の第１の閾値をＢ１、第２の閾値をＢ２、第３の閾値をＢ３、第４の閾値をＢ４（Ｂ１＜Ｂ２＜Ｂ３＜Ｂ４）とした場合に、
コロニーの輪郭内全ての輝度がＢ２≦Ｂ≦Ｂ３となるコロニーを未分化コロニー（ａ）であると判断し、
コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ＜Ｂ１となるコロニーを多層コロニー（ｄ）であると判断し、
コロニーの輪郭内の一部の輝度がＢ４＜Ｂとなるコロニーを分化コロニー（ｃ）であると判断し、
未分化コロニー（ａ）、多層コロニー（ｄ）、分化コロニー（ｃ）以外のコロニーを未確定コロニー（ｂ）であると判断した後、
（Ａ）かつ（ａ）
となるコロニーを未分化コロニーであると判断し、
（Ａ）かつ（ｂ）又は（Ｂ）かつ（ａ）又は（Ｂ）かつ（ｂ）
となるコロニーを未確定コロニーであると判断し、
（ｄ）
となるコロニーを多能性幹細胞が多層に重なった多層コロニーであると判断し、
（ｃ）又は（Ｃ）かつ（ａ）又は（Ｃ）かつ（ｂ）
となるコロニーを分化コロニーであると判断することを特徴とするコロニー識別装置。
前記未確定コロニーについて精細画像を得る精細画像取得手段を更に備え、前記識別手段は、該精細画像における該未確定コロニー内の細胞が所定の大きさより小さい場合に、前記未確定コロニーが前記未分化コロニーであると識別する請求項８に記載のコロニーの識別装置。
前記撮像画像は、画像処理により輪郭強調することを特徴とする請求項８又は９に記載のコロニーの識別装置。
請求項８乃至１０の何れか一項に記載のコロニー識別装置と、
前記培養容器に細胞剥離剤を導入する剥離剤導入手段と、
前記各コロニーの位置情報に基づいて前記未分化コロニーを剥離させるとともに、該未分化コロニーの剥離により得られる未分化コロニーを回収するピペッティング装置と
を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の自動培養装置。
請求項８乃至１０の何れか一項に記載のコロニー識別装置と、
前記未分化コロニー以外のコロニーの位置情報を取得する位置情報取得手段と、
前記培養容器に細胞剥離剤を導入する剥離剤導入手段と、
前記位置情報取得手段において取得した位置情報に基づいて前記未分化コロニー以外のコロニーを剥離させ、該未分化コロニー以外のコロニーの剥離により得られる多能性幹細胞を取り除き、更に前記未分化コロニーを剥離させて未分化コロニーを回収するピペッティング装置と
を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の自動培養装置。
請求項８乃至１０の何れか一項に記載のコロニー識別装置と、
前記未分化コロニー及び該未分化コロニー以外のコロニーの数を取得するコロニー数取得手段と、
（未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するピペッティング装置と
を備えたことを特徴とする多能性幹細胞の自動培養装置。
（未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未確定コロニーのそれぞれについて、更に精細画像を取得する精細画像取得手段を更に備え、
前記コロニー数取得手段は、該精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断したものの数を前記未分化コロニー数に加えて新たな未分化コロニー数とし、
前記ピペッティング装置は、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）≧（所定の閾値）の場合に、前記培養容器に細胞剥離剤を導入して全てのコロニーを剥離させて回収するとともに、
（新たな未分化コロニー数）／（コロニー総数）＜（所定の閾値）の場合に、前記未分化コロニーと前記精細画像に基づいて未分化コロニーであると判断した未確定コロニーとを選択的に剥離させて回収する
ことを特徴とする請求項１３に記載の多能性幹細胞の自動培養装置。