JP6161616B2 - 多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法 - Google Patents
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Description
MSHD(Δr)=<(z(x1,y1)−z(x2,y2))2> (I)
式中、z(x1,y1)はAにおける細胞表面の高さであり、z(x2,y2)はBにおける細胞表面の高さであり、<>はアンサンブル平均である。また、(x1,y1)及び(x2,y2)は、下記式(II)を満たす任意の組み合わせである。
Δr=((x1−x2)2+(y1−y2)2))1/2 (II)
MSHD(Δr)∝ΔrS (III)
式中、Sはバリオグラムを両対数表示したグラフにおける傾きである。なお、両対数グラフの性質より、横軸Δrあるいは縦軸MSHDを規格化することにより定数倍しても、グラフは平行移動するだけであり、傾きSは横軸及び縦軸の定数倍に対して不変であることに注意されたい。また、前述のGlenn, Nらの文献にも示されている通り、バリオグラムを両対数グラフで表示し、その傾きSによって表面形状の統計的性質を評価することは、既知の数学的手法である。
反射防止コーティングされた直径35mmのガラスボトムディッシュに、ヒト成体線維芽細胞由来の253G1 iPS細胞株を10〜20コロニー/ディッシュとなるよう播種し、最終濃度が4ng/mLのヒトbasic FGFを含有するPrimate ES Medium(ReproCell社製、商品名:RCHEMD001)培地を用いてオンフィーダ培養した。1つのコロニーの大きさは200μm程度であった。フィーダ細胞としてはマウス肺線維芽細胞を用いた。細胞は播種後3日目まで培養した。培地は1日1回交換した。
未分化のiPS細胞3コロニー、及びレチノイン酸を添加して培養したiPS細胞3コロニーについて、それぞれのコロニーの中央部付近で7〜15視野を解析した。各視野内を6つのROIに分割し、各ROI単位において実施例1と同じ条件で細胞の底面及び表面形状を抽出して細胞表面の高さを測定した。ROIの大きさは23μm×23μmであった。平坦度を、細胞表面の高さの平均値で規格化された細胞表面の高さの標準偏差として算出し、統計処理をしてスチューデントt検定を行った。結果を表2及び図4に示した。レチノイン酸を添加して培養したiPS細胞の平坦度は、未分化のiPS細胞の平坦度より高く、その差は有意であった。
実施例2と同じ条件で、未分化のiPS細胞及びレチノイン酸を添加して培養したiPS細胞について、水平方向に0.125μm間隔、及び垂直方向に0.32μm間隔の3次元データを取得し、得られたデータから断層像を作成した。作成した断層像から、細胞の底面及び表面形状を抽出し、バリオグラム解析を行った。具体的には、Δrが0.25μm〜15μmの範囲におけるMSHDの値を上述した式(I)で算出し、細胞表面の高さの平均値で規格化した。図5に示したように、レチノイン酸を添加して培養したiPS細胞の平坦度は、未分化のiPS細胞の平坦度より高かった。
実施例3と同様に、細胞表面の高さの平均値で規格化したMSHDの値を用いてバリオグラム解析を行い、Δrが5μm〜15μmの範囲におけるバリオグラムの傾きを、上述した式(III)を用いて算出し、平坦度とした。次に、統計解析をしてスチューデントt検定を行った。その結果を表4及び図8に示した。レチノイン酸を添加して培養したiPS細胞の平坦度は、未分化のiPS細胞の平坦度に比べて顕著に高かった。
iPS細胞の分化用のサンプルを、播種後4日目に培地を10%FBS含有DMEM培地に交換し、播種後7日目まで培地交換を行わずに培養したこと以外、実施例1と同様に細胞のサンプルを準備して、播種後7日目に測定を行った。
実施例2における各サンプルを用いて、未分化のiPS細胞について1コロニー(15視野)、レチノイン酸を添加して培養したiPS細胞について2コロニー(それぞれ11及び13視野)の被撮像を用いて、視野単位における細胞表面の高さを実施例2と同じ条件で反射型定量位相顕微鏡を用いて測定した。Δrが5μmにおけるMSHDの値を算出して細胞表面の高さの平均値で規格化した後、常用対数を取り、平坦度を算出した。統計解析をしてスチューデントt検定を行った。結果を表6及び図10に示した。レチノイン酸を添加して培養したiPS細胞の平坦度は、未分化iPS細胞の平坦度に比べて顕著に高かった。
Claims (9)
- 多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法であって、
培養された多能性幹細胞の平坦度を決定するステップを含み、
前記平坦度は、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度であり、
前記平坦度が分化の度合いの指標となる、
方法。 - 前記平坦度が、顕微鏡の視野単位における平坦度である、請求項1に記載の方法。
- 前記平坦度が、顕微鏡の視野内の関心領域単位における平坦度である、請求項1に記載の方法。
- 前記平坦度が、1つの細胞における平坦度である、請求項1に記載の方法。
- 前記平坦度が、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの標準偏差であり、
細胞表面の高さは、培養容器に接着している細胞底面から培養容器に接着していない細胞表面までの距離であり、
細胞集団の表面の高さは、培養容器に接着している細胞集団の底面から培養容器に接着していない細胞集団の表面までの距離である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記平坦度が、所定の水平方向距離における平均二乗高低差の値である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記平坦度が、所定の2点の水平方向距離におけるバリオグラムの傾きである、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記平坦度が、細胞表面又は細胞集団の表面の高さの平均値で規格化されている、請求項5〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記平坦度が、反射型定量位相顕微鏡を用いて決定される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
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