WO2017056945A1 - 細胞評価装置および方法 - Google Patents

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WO2017056945A1 PCT/JP2016/076812 JP2016076812W WO2017056945A1 WO 2017056945 A1 WO2017056945 A1 WO 2017056945A1 JP 2016076812 W JP2016076812 W JP 2016076812W WO 2017056945 A1 WO2017056945 A1 WO 2017056945A1
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松本　剛
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富士フイルム株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a cell evaluation apparatus and method for evaluating cells in the process of differentiation induction.
  • Pluripotent stem cells such as iPS (Induced Pluripotent Stem) cells and ES (Embryonic Stem) cells have the ability to differentiate into cells of various tissues. In regenerative medicine, drug development and disease elucidation It is attracting attention as a possible application.
  • Differentiation induction is performed to obtain target cells such as nerve cells and hepatocytes from pluripotent stem cells, but it was automatically confirmed whether or not the target cells were correctly differentiated during this differentiation induction. There is a need.
  • Patent Document 1 proposes to determine the differentiation stage of cells based on the rate of decrease in the amount of oxygen dissolved in the medium and the amount of alkaline phosphatase. Further, Patent Document 2 and Patent Document 3 propose a method of confirming an undifferentiated state or a differentiated state by analyzing the expression level of a gene involved in differentiation.
  • a single discriminator detects the image feature amount and evaluates whether or not the target cell is differentiated, the region where the target cell is not detected by the discriminator It is not possible to evaluate whether a region other than the target cell is present or a region where no cell is present.
  • differentiated cells can be detected by a discriminator
  • undifferentiated cells may remain in a region where differentiated cells are not detected.
  • undifferentiated cells there is a problem that the tissue becomes malignant after transplanted.
  • Patent Documents 1 to 3 propose methods for evaluating the differentiation state of cells, but even if the methods described in these documents are used, there is a possibility that the remaining undifferentiated cells may be missed. is there.
  • an object of the present invention is to provide a cell evaluation apparatus and method capable of suppressing oversight of remaining undifferentiated cells.
  • the cell evaluation apparatus of the present invention includes a first evaluation unit and a second evaluation unit that evaluate cells to be evaluated, and the first evaluation unit evaluates based on an image obtained by imaging the cells to be evaluated. It has at least two discriminating units for discriminating whether or not the target cell corresponds to at least two types of cells, and the second evaluation unit conflicts with the discrimination results by at least two discriminating units among the discriminating units.
  • the evaluation target cell is evaluated under an evaluation condition different from the evaluation condition of the first evaluation unit.
  • the second evaluation unit can evaluate the evaluation target cell based on an image obtained by imaging the evaluation target cell at a higher magnification than the first evaluation unit.
  • the second evaluation unit when the second evaluation unit performs evaluation based on an image obtained by dividing a group of cells to be evaluated into a plurality of regions, one of the images of the plurality of regions is used.
  • the evaluation result of the image can be used as the representative evaluation result.
  • the second evaluation unit when the second evaluation unit performs an evaluation based on an image obtained by dividing a group of cells to be evaluated into a plurality of regions, The most evaluation result can be used as the representative evaluation result.
  • the second evaluation unit when the second evaluation unit performs an evaluation based on an image obtained by dividing a group of cells to be evaluated into a plurality of regions, the evaluation results of the images of the plurality of regions are averaged. The result obtained can be used as the representative evaluation result.
  • the first evaluation unit evaluates the evaluation target cell based on an image obtained by imaging the evaluation target cell by a noninvasive imaging method
  • the second evaluation unit Can evaluate a cell to be evaluated based on an image obtained by imaging the cell to be evaluated by an invasive imaging method.
  • the second evaluation unit can evaluate the evaluation target cell based on the fluorescence image of the evaluation target cell.
  • the second evaluation unit is based on an image captured at a time point that is set in advance from a time point when the image used for determination in the first evaluation unit is captured.
  • the cells to be evaluated can be evaluated.
  • the second evaluation unit can evaluate the evaluation target cell based on an image obtained by imaging a larger number of evaluation target cells than the first evaluation unit.
  • the cell evaluation apparatus of the present invention when the first evaluation unit and the second evaluation unit evaluate the evaluation target cell a plurality of times over time, at least two discriminations of the past first evaluation unit are performed. When the discrimination results by the parts are contradictory, the evaluation by the second evaluation part can be performed without performing the evaluation by the first evaluation part of the cell to be evaluated.
  • the cell evaluation device of the present invention when the first evaluation unit and the second evaluation unit perform evaluation by dividing a group of cells to be evaluated into a plurality of regions, one of the plurality of regions is evaluated.
  • the past discrimination results of one region are contradictory, it is possible to prevent evaluation by the first evaluation unit of the current evaluation target cell in one region and the region around the one region.
  • the second evaluation unit has at least two determination units that are the same as the first evaluation unit, and when the determination results by the at least two determination units are contradictory, The cells to be evaluated can be further evaluated under different evaluation conditions.
  • the second evaluation unit sequentially evaluates by changing the evaluation condition a plurality of times when the determination results by the at least two determination units included in the second evaluation unit are contradictory. Therefore, the evaluation can be terminated when the determination results by at least two determination units are consistent.
  • the cell evaluation method of the present invention is a first method for determining whether or not an evaluation target cell corresponds to at least two types of cells based on an image obtained by imaging the evaluation target cell using at least two determination units. Evaluation is performed, and when the determination results of at least two determination units of the determination units are contradictory, a second evaluation is performed in which evaluation target cells are evaluated under evaluation conditions different from the first evaluation. .
  • the cell evaluation apparatus and method of the present invention based on an image obtained by imaging a cell to be evaluated, whether or not the cell to be evaluated corresponds to at least two types of cells is determined using at least two determination units.
  • the first evaluation is performed, and when the determination results of at least two of the determination units are contradictory, the evaluation target cell is subjected to the second evaluation under an evaluation condition different from the first evaluation. Therefore, for example, even when one discriminating unit discriminates that the cell to be evaluated corresponds to a differentiated cell, when another discriminating unit discriminates that the cell to be evaluated corresponds to an undifferentiated cell, Since the determination results are contradictory, the second evaluation is performed again under different evaluation conditions. By re-evaluating in this way, it is possible to suppress oversight of remaining undifferentiated cells.
  • the block diagram which shows schematic structure of the cell evaluation system using one Embodiment of the cell evaluation apparatus of this invention. Table showing discrimination results by first discrimination unit, discrimination results by second discrimination unit, and cell discrimination results based on these discrimination results.
  • the figure which shows the evaluation object range which divided the imaging region and the imaging region The flowchart for demonstrating the effect
  • FIG. 1 is a block diagram showing a schematic configuration of a cell evaluation system using the cell evaluation apparatus of the present embodiment.
  • the cell evaluation system of the present embodiment includes a first evaluation unit 1 and a second evaluation unit 2 as shown in FIG.
  • the first evaluation unit 1 includes a first imaging device 10
  • the second evaluation unit includes a second imaging device 20, and the first evaluation unit 1 and the second evaluation unit 2.
  • the discrimination result evaluation device 30 is shared. Further, the display device 3 and the input device 4 are connected to the discrimination result evaluation device 30.
  • the first imaging device 10 captures an image of a cell in the differentiation induction process.
  • a phase contrast microscope apparatus is used as the first imaging apparatus 10.
  • the first imaging device 10 includes an image sensor such as a charge-coupled device (CCD) image sensor or a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) image sensor.
  • CCD charge-coupled device
  • CMOS complementary metal-oxide semiconductor
  • the captured image captured by the image sensor is a first image sensor.
  • the image is output from the imaging device 10 to the discrimination result evaluation device 30.
  • Examples of cells to be imaged include cells in the process of inducing differentiation from pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells to mesoderm, cells in the process of inducing differentiation from neural stem cells to neurons, and differentiation induction from hepatic stem cells to hepatocytes.
  • Other cells in may also be used.
  • the second imaging device 20 captures an image of a cell in the differentiation induction process.
  • the second imaging device 20 images cells under evaluation conditions different from those of the first imaging device 10.
  • the evaluation conditions include imaging conditions.
  • the second imaging device 20 of the present embodiment captures a phase difference image at a higher magnification than the first imaging device 10 and is configured to be capable of capturing a fluorescent image. It is a thing. Note that imaging of a phase difference image is a non-invasive imaging method, whereas imaging of a fluorescence image is invasive imaging because there is cell damage due to irradiation with excitation light. Further, the second imaging device 20 may image fluorescence emitted from the stained cells, or may image autofluorescence of the cells. The captured image captured by the second imaging device 20 is output from the second imaging device 20 to the discrimination result evaluation device 30.
  • the discrimination result evaluation device 30 is composed of a computer having a CPU (Central Processing Unit), a semiconductor memory, a hard disk, and the like. Whether the cell included in the captured image is an undifferentiated cell or a differentiated cell based on the captured image captured by the first imaging device 10 and the second imaging device 20. Is determined.
  • CPU Central Processing Unit
  • the discrimination result evaluation apparatus 30 includes a first discrimination unit 31, a second discrimination unit 32, and a discrimination result determination unit 33.
  • the first discriminating unit 31 discriminates whether or not the cells included in the captured image are undifferentiated cells based on the input captured image. As a method for determining whether or not the cell is an undifferentiated cell, for example, it may be determined using the morphological characteristics of the cell.
  • the cell is an undifferentiated cell using, for example, the size, circularity or luminance of the cell. Further, it may be determined whether it is an undifferentiated cell colony in cell colony unit instead of cell unit, for example, the number or density of cells contained in the cell colony, the roundness of the cell colony, luminance or Whether or not the cell is an undifferentiated cell can be determined using the area or density of the white stripe.
  • white stripes represent cell boundaries and are so-called halo images. Since halo increases as differentiation progresses, it can be determined that the cell is an undifferentiated cell when the area or density of white stripes is not more than a threshold value. In addition, as a method for determining whether or not the cell is an undifferentiated cell, other known techniques can be used.
  • the second discrimination unit 32 discriminates whether or not the cells included in the cell image are differentiated cells based on the input captured image.
  • a method for determining whether a cell is a differentiated cell may be determined using, for example, morphological characteristics of the differentiated cell.
  • the cell size, circularity or brightness, axon length or number, dendrite size or number, cell nucleus size or The number or the area or density of white stripes can be used.
  • cell size, circularity or brightness, cell nucleus size or number, white stripe area or density, and the like can be used.
  • differentiation induction from pluripotent stem cells to cardiomyocytes is performed, the presence or absence of pulsation of cells, the area or density of white stripes, or the like can be used.
  • the presence or absence of the pulsation of a cell can be acquired by calculating the change amount of two images taken in time series.
  • the color of the cells can be used.
  • the cell is a differentiated cell.
  • a determination method in the first determination unit 31 and the second determination unit 32 a determination method based on cell size, circularity, luminance, white stripe area or density is common, but the first method Discrimination criteria such as threshold values in the discriminating unit 31 and the second discriminating unit 32 are different from each other.
  • the discrimination result determination unit 33 acquires the discrimination result by the first discrimination unit 31 and the discrimination result by the second discrimination unit 32, and determines whether or not these discrimination results conflict. Specifically, as shown in FIG. 2, the determination result by the first determination unit 31 is a determination result that undifferentiated cells exist in the captured image, and the determination result by the second determination unit 32 is If it is a discrimination result that there are no differentiated cells in the captured image, these results are not contradictory, so it is determined that the cells in the captured image are undifferentiated cells. To do.
  • the determination result by the first determination unit 31 is a determination result that undifferentiated cells are not present in the captured image
  • the determination result by the second determination unit 32 is that the differentiated cells are present in the captured image.
  • the determination result it is determined that the cell in the captured image is a differentiated cell, since these results are not contradictory and are appropriate.
  • the determination result by the first determination unit 31 is a determination result that undifferentiated cells exist in the captured image
  • the determination result by the second determination unit 32 indicates that differentiated cells exist in the captured image. Since these results are contradictory, it is unclear whether the cells in the captured image are differentiated cells or undifferentiated cells.
  • the determination result by the first determination unit 31 is a determination result that undifferentiated cells are not present in the captured image
  • the determination result by the second determination unit 32 is that the differentiated cells are not present in the captured image.
  • the overall control unit 34 controls the entire cell evaluation system including the first imaging device 10 and the second imaging device 20. In particular, when the determination result in the determination result determination unit 33 is unknown, the overall control unit 34 performs imaging of cells under evaluation conditions different from those of the first imaging device 10 by the second imaging device 20, and again The first determination unit 31 and the second determination unit 32 are controlled to perform determination.
  • Imaging by the second imaging device 20 may be automatically performed by the overall control unit 34 according to the determination result, or the user is notified by displaying on the display device 3 that the determination result is unknown. Then, the user may input an instruction to perform imaging by the second imaging device 20 using the input device 4.
  • the second imaging device 20 images cells under evaluation conditions different from the first imaging device 10 as described above based on the control signal output from the overall control unit 34.
  • a phase difference image of a cell is captured at a higher magnification than the first imaging device 10.
  • the image captured at a high magnification by the second imaging device 20 is output to the discrimination result evaluation device 30, and the discrimination result evaluation device 30 is again operated by the first discrimination unit 31 based on the input high magnification image.
  • the determination and the determination by the second determination unit 32 are performed. Based on these determination results, the determination result determination unit 33 determines whether the cell included in the captured image is an undifferentiated cell, a differentiated cell, or an unknown, and determines the determination result.
  • the overall control unit 34 performs imaging of cells under further different evaluation conditions using the second imaging device 20, and again the first determination unit 31 and the second determination unit 32 are controlled to perform the determination.
  • the second imaging device 20 captures a fluorescence image of a cell.
  • the fluorescent image capturing by the second imaging device 20 may also be performed automatically by the overall control unit 34 according to the determination result, or the display device 3 may display that the determination result is unknown. May be notified to the user, and the user may input an instruction to perform imaging by the second imaging device 20 using the input device 4.
  • the fluorescence image captured by the second imaging device 20 is output to the discrimination result evaluation device 30, and the discrimination result evaluation device 30 again performs the discrimination and the first discrimination by the first discrimination unit 31 based on the input fluorescence image.
  • the determination by the second determination unit 32 is performed. Based on these determination results, the determination result determination unit 33 determines whether the cell included in the captured image is an undifferentiated cell, a differentiated cell, or an unknown, and determines the determination result.
  • the first imaging device 10 and the second imaging device 20 scan within the imaging region R where a plurality of cells exist as shown in FIG. An image for each evaluation target range r is taken.
  • the unit of the imaging region R may be, for example, a well plate having a plurality of wells, and each well in the well plate may be the evaluation target range r, or one well may be the imaging region R and divided in the one well. It is good also considering each performed area
  • the determination in the determination result evaluation apparatus 30 is performed based on the image for each evaluation target range r, and the determination result for each evaluation target range r is stored in the determination result determination unit 33.
  • the display device 3 is configured by a display device such as a liquid crystal display.
  • the display device 3 displays images picked up by the first image pickup device 10 and the second image pickup device 20 under the control of the overall control unit 34, and the determination results by the first and second determination units 31 and 32. In addition, the determination result by the determination result determination unit 33 is displayed.
  • the input device 4 is configured by an input device such as a keyboard and a mouse.
  • the input device 4 accepts an imaging instruction input by the second imaging device 20 as described above, for example.
  • the display device 3 and the input device 4 may be configured by using a touch panel.
  • a culture container containing cells to be evaluated in the differentiation induction process is set in the first imaging device 10 and set so that an image of the first evaluation target range is captured (S10).
  • the overall control unit 34 confirms whether or not the first evaluation has been performed in the past for the set evaluation target range (S12).
  • the first evaluation is processing from imaging by the first imaging device 10 to storage of a determination result by the determination result determination unit 33.
  • the first imaging device 10 captures a phase difference image of the first evaluation target range (S14), and the imaging is performed. An image is input to the first determination unit 31 and the second determination unit 32.
  • the first imaging device 10 performs imaging at a lower magnification than the second imaging device 20, and specifically performs imaging at a magnification of 1 to 4 times.
  • the determination result determination unit 33 is based on the determination results by the first and second determination units 31 and 32, and the cells in the captured image are undifferentiated cells, differentiated cells, or unknown. Is determined, and the determination result is stored.
  • the overall control unit 34 determines whether or not to perform the second evaluation based on the determination result by the determination result determination unit 33 (S20). Specifically, when the determination result by the determination result determination unit 33 is unknown, it is determined to perform the second evaluation, and in other cases, the second evaluation is not performed and the first evaluation target range is determined. Is finished (S20, NO). Note that the second evaluation is processing from imaging by the second imaging device 20 to storage of a determination result by the determination result determination unit 33.
  • a culture container is installed in the 2nd imaging device 20, and the 2nd imaging device 20 is the first evaluation object.
  • a phase difference image of the range is captured (S22), and the captured image is input to the first determination unit 31 and the second determination unit 32.
  • the second imaging device 20 performs imaging at a higher magnification than the first imaging device 10, and specifically performs imaging at a magnification of 10 to 20 times.
  • what is necessary is just to perform the movement of the culture container from the 1st imaging device 10 to the 2nd imaging device 20 using a turntable etc., for example.
  • the first determination unit 31 determines again whether undifferentiated cells are present in the captured image (S24), and the second determination unit 32 determines whether differentiated cells are present in the captured image. Are discriminated (S26), and the respective discrimination results are input to the discrimination result judgment unit 33.
  • the determination result determination unit 33 is based on the determination results by the first and second determination units 31 and 32, and the cells in the captured image are undifferentiated cells, differentiated cells, or unknown. Is determined, and the determination result is stored.
  • the overall control unit 34 determines whether or not to perform the evaluation based on the fluorescence image based on the determination result by the determination result determination unit 33 (S28). Specifically, when the determination result by the determination result determination unit 33 is unknown, it is determined to perform the evaluation using the fluorescent image. In other cases, the evaluation using the fluorescent image is not performed, and the first evaluation target range is determined. Is finished (S28, NO).
  • the second imaging device 20 captures the fluorescence image of the first evaluation target range (S22), and the fluorescence. An image is input to the first determination unit 31 and the second determination unit 32.
  • the first discriminating unit 31 discriminates again whether or not undifferentiated cells exist in the fluorescent image (S24), and the second discriminating unit 32 determines whether or not differentiated cells exist in the fluorescent image. Are discriminated (S26), and the respective discrimination results are input to the discrimination result judgment unit 33.
  • the discrimination result determination unit 33 determines whether the cells in the fluorescence image are undifferentiated cells, differentiated cells, or unknown based on the discrimination results of the first and second discrimination units 31 and 32. Is determined, the determination result is stored, and the evaluation of the first evaluation target range is terminated (S28, NO).
  • the first evaluation target range is evaluated up to three times, and the determination result is stored.
  • next evaluation target range exists (S30, NO)
  • the culture vessel is again installed in the first imaging device 10 so that an image of the next evaluation target range is captured (S10).
  • the next evaluation target range is also evaluated three times at the maximum in the same manner as the first evaluation target range, and the determination result is stored.
  • the evaluation target range is sequentially changed and the processes of S12 to S30 are repeated, and when the evaluation of all the evaluation target ranges is completed, the evaluation of the current imaging region R is finished (S30, YES).
  • the process returns to S10 and the first evaluation in the imaging region R is performed again.
  • the second round of evaluation is performed sequentially from the target range.
  • the first evaluation has already been performed in the past, and the determination result by the determination result determination unit 33 is determined to be either an undifferentiated cell or a differentiated cell, and is unknown. If it is not the determination result, no evaluation is performed (S12, YES, S20, NO). On the other hand, if the first evaluation has already been performed in the past and the determination result by the determination result determination unit 33 is unknown, the first evaluation is not performed and the second evaluation is performed. (S12, YES, S20, YES).
  • the evaluation of the imaging region R in the second round is completed when the evaluation of all the evaluation target ranges whose determination results are unknown is completed (S30, YES).
  • the determination unit 31 and 32 determines whether the evaluation target cell corresponds to an undifferentiated cell or a differentiated cell.
  • the determination results of the first and second determination units 31 and 32 are contradictory, the cells to be evaluated are re-evaluated under different evaluation conditions. Therefore, by re-evaluating in this way, it is possible to suppress oversight of remaining undifferentiated cells.
  • the second evaluation unit 2 may perform the evaluation when a preset time has elapsed. That is, the second image pickup device 20 may pick up an image when a preset time has elapsed since the first image pickup device 10 picked up the image. In this case, it is considered that the differentiation of the cells progresses with the passage of time, and the state of the cells is changed. Therefore, it is not always necessary to change the magnification as in the above-described embodiment, and in the second imaging device 20 Alternatively, the image may be taken at a low magnification.
  • the second imaging device 20 captures a high-magnification phase difference image and a fluorescence image.
  • the present invention is not limited to this.
  • a plurality of phase difference images with different exposure times are captured.
  • the discrimination by the first and second discriminating units 31 and 32 may be performed using an image obtained by adding the plurality of phase difference images.
  • the second imaging apparatus 20 may capture a multiple exposure image or a confocal image.
  • the second imaging device 20 may capture two images with different imaging conditions, and perform the determination by the first and second determination units 31 and 32 using the difference image.
  • the evaluation when performing the evaluation after the 2nd round of the imaging region R, about the evaluation object range r for which the first evaluation has already been performed in the past and the determination result is unknown, The evaluation is not performed and the second evaluation is performed.
  • the first evaluation is performed not only on the evaluation target range r for which the determination result is unknown but also on the surrounding evaluation target range r adjacent to the evaluation target range r. You may make it perform from 2nd evaluation, without performing. This is because there is a high possibility that the determination result of the surrounding evaluation target range r adjacent to the evaluation target r whose determination result is unknown is high, and by performing the second evaluation in this way, The time required for evaluation of the imaging region R can be shortened.
  • the imaging field of view becomes narrow, so that the evaluation target range r is divided into a plurality of areas as shown in FIG. An image is taken.
  • the determination result is different for each image of the divided areas sr, the determination result of the image of any one of the divided areas sr is used as the representative determination result of the evaluation target range r.
  • the largest determination result among the determination results of the images of the plurality of divided regions sr included in the evaluation target range r may be stored as a representative determination result of the evaluation target range r.
  • the average determination result of the determination results of the images of the plurality of divided regions sr included in the evaluation target range r may be stored as a representative determination result of the evaluation target range r.
  • the first discrimination unit 31 calculates the undifferentiated cell-likeness of the cells in the image of each divided region sr as the first score, and calculates the average value of the first scores of all the divided regions sr. calculate.
  • the second discriminating unit 32 calculates the differentiated cell likeness of the cells in the image of each divided region sr as the second score, and calculates the average value of the second scores of all the divided regions sr. .
  • the first score has a higher value as the possibility of being an undifferentiated cell is higher (the probability that the undifferentiated cell is larger), and the second score is more likely to be a differentiated cell (differentiated cell). It is assumed that the larger the value, the larger the value.
  • the determination result is the determination result of the representative of the evaluation object range r
  • a preset threshold value it is assumed that these average values are not contradictory, and the average value
  • the determination result with the larger value is set as the determination result of the evaluation target range r.
  • the difference between the average value of the first score and the average value of the second score is smaller than a preset threshold value, it is determined that these average values are contradictory, and the evaluation target range r is determined. The result is unknown.
  • low-dimensional information such as cell size, brightness, and color may be scored for undifferentiated cell-likeness score and differentiated cell-likeness score, cell roundness, cell Cytologic high-dimensional information such as the shape of the nucleus and the cell density may be scored.
  • the determination result of the evaluation target range r is stored as unknown. It may be.
  • the second evaluation unit 2 performs the evaluation based on the high-magnification phase difference image and the evaluation based on the fluorescence image.
  • the evaluation based on the fluorescence image the first and second
  • the evaluation may be performed on the basis of images captured under different evaluation conditions, and by the first and second discriminating units 31 and 32. The evaluation may be terminated when the determination results are consistent.
  • whether the cell to be evaluated is an undifferentiated cell or a differentiated cell is evaluated.
  • the present invention is not limited to this, and it is determined whether the cell is a living cell or a dead cell. You may make it evaluate.
  • the first discrimination unit 31 discriminates whether or not the evaluation target cell is a living cell
  • the second discrimination unit 32 discriminates whether or not the evaluation target cell is a dead cell.
  • the determination result determination unit 33 may determine whether the cell to be evaluated is a live cell, a dead cell, or an unknown cell. Whether or not it is a living cell may be determined based on, for example, circularity or luminance, and whether or not it is a dead cell may be determined based on, for example, luminance or the presence or absence of a nucleus. Note that the phase difference image of dead cells generally becomes white and has a high luminance. Thus, dead cells can be appropriately removed by evaluating whether they are live cells or dead cells.
  • the first determination unit 31 determines whether the cell to be evaluated is a pluripotent stem cell
  • the second determination unit 32 determines whether the cell to be evaluated is a feeder cell.
  • the determination result determination unit 33 may determine whether the cell to be evaluated is a pluripotent stem cell, a feeder cell, or unknown. Whether or not it is a pluripotent stem cell is determined based on, for example, circularity or brightness, and whether or not it is a feeder cell is determined based on a shape unique to the feeder cell, for example. Good. Thus, by evaluating whether it is a pluripotent stem cell or a feeder cell, a feeder cell can be appropriately removed at the end of differentiation induction.
  • a third determination unit may be provided for the above embodiment, and the third determination unit may determine whether the cell is a feeder cell.
  • the discrimination results of two or more discrimination units among the first to third discrimination units are contradictory to each other, and when all the discrimination units are discrimination results that the corresponding type of cell does not exist, the second Re-evaluation by the evaluation unit 2 may be performed. The re-evaluation conditions are the same when four or more discriminators are provided.

Abstract

未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる細胞評価装置および方法を提供する。評価対象の細胞を評価する第１の評価部１と第２の評価部２とを備え、第１の評価部１が、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が２種類の細胞に該当するか否かをそれぞれ判別する第１および第２の判別部３１，３２を有し、第２の評価部２が、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価部１の評価条件とは異なる評価条件で評価する。

Description

細胞評価装置および方法
　本発明は、分化誘導の過程の細胞を評価する細胞評価装置および方法に関するものである。
　ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞やＥＳ（Embryonic Stem）細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。
　多能性幹細胞から神経細胞や肝細胞などの目的の細胞を得るために分化誘導が行われるが、この分化誘導の際、目的の細胞に正しく分化しているか否かを自動的に確認したというニーズがある。
　そこで、従来、目的の細胞らしさを画像特徴量として定義し、その画像特徴量を判別器によって検出して評価することによって、目的の細胞に分化しているか否かを自動的にチェックする方法が提案されている。
　また、特許文献１には、培地内に溶存する酸素量の低下速度とアルカリフォスファターゼの量とに基づいて、細胞の分化段階を判断することが提案されている。また、特許文献２および特許文献３においては、分化に関与する遺伝子の発現量を解析することによって未分化状態であることまたは分化状態であることを確認する方法が提案されている。
特開２００５－１６８３６０号公報 特開２００６－０４２６６３号公報 国際公開第２０１０／１３７７２２号
　しかしながら、たとえば単一の判別器によって画像特徴量を検出して目的の細胞に分化しているか否かを評価するようにしたのでは、その判別器によって目的の細胞が検出されなかった領域が、目的の細胞以外の細胞が存在する領域なのか、もしくは細胞が存在していない領域なのかを評価することができない。
　したがって、たとえば判別器によって分化した細胞を検出することはできても、分化細胞が検出されなかった領域に未分化細胞が残っている可能性がある。このように未分化細胞の残存があると組織を移植した後に悪性腫瘍化するという問題がある。
　また、特許文献１～特許文献３には、細胞の分化状態を評価する方法が提案されているが、これらの文献に記載の方法を用いたとしても、未分化細胞の残存を見逃す可能性がある。
　本発明は、上記の問題に鑑み、未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる細胞評価装置および方法を提供することを目的とする。
　本発明の細胞評価装置は、評価対象の細胞を評価する第１の評価部と第２の評価部とを備え、第１の評価部が、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かをそれぞれ判別する判別部を少なくとも２つ有し、第２の評価部が、判別部のうち少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価部の評価条件とは異なる評価条件で評価することを特徴とする。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部よりも高倍率で評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像のうちの１つの画像の評価結果を代表の評価結果とすることができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像の評価結果のうち最も多い評価結果を代表の評価結果とすることができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像の評価結果を平均した結果を代表の評価結果とすることができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部は、評価対象の細胞を非侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価し、第２の評価部は、評価対象の細胞を侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の蛍光画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部において判別に用いた画像の撮像時点から予め設定された時間だけ経過した時点において撮像された画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部よりも多い枚数の評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部および第２の評価部は、評価対象の細胞を経時的に複数回評価する場合、過去の第１の評価部の少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、現在の評価対象の細胞の第１の評価部による評価を行うことなく第２の評価部による評価を行うことができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部および第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割して評価を行う場合、複数の領域のうちの１つの領域の過去の判別結果が相反する場合には、１つの領域とその１つの領域の周囲の領域の現在の評価対象の細胞の第１の評価部による評価を行わないようにできる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部と同じ少なくとも２つの判別部を有し、その少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、評価対象の細胞をさらに異なる評価条件で評価することができる。
　また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第２の評価部が有する少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合、評価条件を複数回変更して順次評価を行うものであり、少なくとの２つの判別部による判別結果が矛盾しない結果となった時点で評価を終了することができる。
　本発明の細胞評価方法は、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かを少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、判別部のうち少なくとも２つの判別部の判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価とは異なる評価条件で評価する第２の評価を行うことを特徴とする。
　本発明の細胞評価装置および方法によれば、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かを少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、判別部のうち少なくとも２つの判別部の判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価とは異なる評価条件で第２の評価を行う。したがって、たとえば１つの判別部によって評価対象の細胞が分化細胞に該当すると判別された場合でも、もう１つの判別部によって評価対象の細胞が未分化細胞に該当すると判別された場合には、これの判別結果は相反するものであるので、再度、異なる評価条件で第２の評価を行うようにする。このように再評価を行うことによって未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる。
本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた細胞評価システムの概略構成を示すブロック図 第１の判別部による判別結果と第２の判別部による判別結果とこれらの判別結果に基づく細胞の判定結果とを示す表 撮像領域および撮像領域を分割した評価対象範囲を示す図 本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた細胞評価システムの作用を説明するためのフローチャート 撮像領域、撮像領域を分割した評価対象範囲および評価対象範囲を分割した分割領域を示す図
　以下、本発明の細胞評価装置および方法の一実施形態を用いた細胞評価システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の細胞評価装置を用いた細胞評価システムの概略構成を示すブロック図である。
　本実施形態の細胞評価システムは、図１に示すように、第１の評価部１と第２の評価部２とを備えている。第１の評価部１は、第１の撮像装置１０を備えており、第２の評価部は、第２の撮像装置２０を備えており、第１の評価部１と第２の評価部２とで、判別結果評価装置３０が共有されている。また、判別結果評価装置３０には、表示装置３と入力装置４とが接続されている。
　第１の撮像装置１０は、分化誘導の過程における細胞の画像を撮像するものである。本実施形態においては、第１の撮像装置１０として位相差顕微鏡装置を用いる。第１の撮像装置１０は、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を備えており、撮像素子によって撮像された撮像画像は、第１の撮像装置１０から判別結果評価装置３０に出力される。
　撮像対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞から中胚葉まで分化誘導する過程における細胞、神経幹細胞からニューロンまで分化誘導する過程における細胞、肝幹細胞から肝細胞まで分化誘導する過程における細胞、多能性幹細胞から心筋細胞まで分化誘導する過程における細胞、および造血幹細胞から赤血球、リンパ球または血小板まで分化誘導する過程における細胞などがあるが、これらに限らず、分化誘導の過程におけるその他の細胞でもよい。
　第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０と同様に、分化誘導の過程における細胞の画像を撮像するものである。ただし、第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞を撮像するものである。なお、評価条件とは撮像条件を含むものである。具体的には、本実施形態の第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０よりも高倍率な位相差画像を撮像するものであり、かつ蛍光画像の撮像も可能なように構成されたものである。なお、位相差画像の撮像が非侵襲的な撮像方法であるのに対し、蛍光画像の撮像は、励起光の照射による細胞のダメージがあるので侵襲的な撮像である。また、第２の撮像装置２０は、染色された細胞から発せられた蛍光を撮像してもよいし、細胞の自家蛍光を撮像してもよい。第２の撮像装置２０によって撮像された撮像画像は、第２の撮像装置２０から判別結果評価装置３０に出力される。
　判別結果評価装置３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成されるものである。判別結果評価装置３０は、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０によって撮像された撮像画像に基づいて、撮像画像内に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるかを判定するものである。
　判別結果評価装置３０は、具体的には、第１の判別部３１と、第２の判別部３２と、判別結果判定部３３とを備えている。
　第１の判別部３１は、入力された撮像画像に基づいて、撮像画像内に含まれる細胞が未分化細胞であるか否かを判別するものである。未分化細胞であるか否かの判別方法としては、たとえば細胞の形態的な特徴を用いて判別するようにすればよい。
　具体的には、たとえば細胞の大きさ、円形度または輝度を用いて未分化細胞であるか否かを判別することができる。また、細胞単位ではなく、細胞コロニー単位で未分化細胞のコロニーであるか否かを判別するようにしてもよく、たとえば細胞コロニーに含まれる細胞の数または密度、細胞コロニーの円形度、輝度もしくは白すじの面積または密度などを用いて未分化細胞であるか否かを判別することができる。
　なお、白すじとは細胞の境界を表すものであり、いわゆるハロの画像である。分化が進むとハロが多くなるので、白すじの面積または密度が閾値以下である場合に未分化細胞であると判別することができる。また、未分化細胞であるか否かの判別方法については、その他の公知な技術を用いることができる。
　第２の判別部３２は、入力された撮像画像に基づいて、細胞画像内に含まれる細胞が分化細胞であるか否かを判別するものである。分化細胞であるか否かの判別方法は、たとえば分化後の細胞の形態的な特徴を用いて判別するようにすればよい。
　具体的には、たとえば神経幹細胞からニューロンまで分化誘導する場合には、細胞の大きさ、円形度または輝度、軸索の長さまたは数、樹状突起の大きさまたは数、細胞核の大きさまたは数、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。また、肝幹細胞から肝細胞まで分化誘導する場合には、細胞の大きさ、円形度または輝度、細胞核の大きさまたは数、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。また、多能性幹細胞から心筋細胞まで分化誘導する場合には、細胞の拍動の有無、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。なお、細胞の拍動の有無は、時系列に撮像された２枚の画像の変化量を算出することによって取得することができる。また、造血幹細胞から赤血球まで分化誘導する場合には、細胞の色を用いることができる。
　なお、分化細胞であるか否かの判別方法については、その他の公知な技術を用いることができる。また、第１の判別部３１および第２の判別部３２における判別方法として、細胞の大きさ、円形度、輝度もしくは白すじの面積または密度に基づく判別方法が共通しているが、第１の判別部３１および第２の判別部３２における閾値などの判別基準はそれぞれ異なるものである。
　判別結果判定部３３は、第１の判別部３１による判別結果と第２の判別部３２による判別結果とを取得し、これらの判別結果が相反するか否かを判定するものである。具体的には、図２に示すように、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在するという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内には分化細胞が存在しないという判別結果である場合には、これらの結果は相反するものではないので適切な結果であるとして、撮像画像内の細胞は未分化細胞であると判定する。
　また、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在しないという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在するという判別結果である場合には、これらの結果も相反するものではないので適切な結果であるとして、撮像画像内の細胞は分化細胞であると判定する。
　一方、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在するという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在するという判別結果である場合には、これらの結果は相反するものであるので、撮像画像内の細胞が分化細胞であるか未分化細胞であるかの判定は不明とする。
　また、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在しないという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在しないという判別結果である場合にも、これらの結果は相反するものであるので、撮像画像内の細胞が分化細胞であるか未分化細胞であるかの判定は不明とする。判別結果判定部３３は、上述した判定結果を記憶するものである。
　全体制御部３４は、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０を含む細胞評価システム全体を制御するものである。特に、全体制御部３４は、判別結果判定部３３における判定結果が不明である場合には、第２の撮像装置２０によって第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞の撮像を行い、再度、第１の判別部３１および第２の判別部３２による判別を行うように制御するものである。
　第２の撮像装置２０による撮像は、全体制御部３４が判定結果に応じて自動的に行うようにしてもよいし、判定結果が不明であることを表示装置３に表示させることによってユーザに報知し、ユーザが、入力装置４を用いて第２の撮像装置２０による撮像を行うように指示入力してもよい。
　第２の撮像装置２０は、全体制御部３４から出力された制御信号に基づいて、上述したように第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞を撮像するものであるが、ここでは、第１の撮像装置１０よりも高倍率で細胞の位相差画像を撮像する。
　第２の撮像装置２０によって高倍率で撮像された画像は、判別結果評価装置３０に出力され、判別結果評価装置３０は、入力された高倍率画像に基づいて、再び第１の判別部３１による判別と第２の判別部３２による判別を行う。そして、判別結果判定部３３は、これらの判別結果に基づいて、撮像画像に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかの判定を行い、判定結果を記憶する。
　そして、全体制御部３４は、判別結果判定部３３における判定結果が再び不明である場合には、第２の撮像装置２０によってさらに異なる評価条件で細胞の撮像を行い、再度、第１の判別部３１および第２の判別部３２による判別を行うように制御するものである。具体的には、第２の撮像装置２０は、細胞の蛍光画像の撮像を行う。第２の撮像装置２０による蛍光画像の撮像についても、全体制御部３４が判定結果に応じて自動的に行うようにしてもよいし、判定結果が不明であることを表示装置３に表示させることによってユーザに報知し、ユーザが、入力装置４を用いて第２の撮像装置２０による撮像を行うように指示入力するようにしてもよい。
　第２の撮像装置２０によって撮像された蛍光画像は、判別結果評価装置３０に出力され、判別結果評価装置３０は、入力された蛍光画像に基づいて、再び第１の判別部３１による判別と第２の判別部３２による判別を行う。そして、判別結果判定部３３は、これらの判別結果に基づいて、撮像画像に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかの判定を行い、判定結果を記憶する。
　第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０は、全体制御部３４による制御によって、図３に示すような複数の細胞が存在する撮像領域Ｒ内を走査し、撮像領域Ｒ内の分割された評価対象範囲ｒ毎の画像を撮像するものである。撮像領域Ｒの単位は、たとえば複数のウェルを有するウェルプレートとし、そのウェルプレート内の各ウェルを評価対象範囲ｒとしてもよいし、１つウェルを撮像領域Ｒとし、その１つのウェル内の分割された各領域を評価対象範囲としてもよい。
　判別結果評価装置３０における判定は、評価対象範囲ｒ毎の画像に基づいてそれぞれ行われ、評価対象範囲ｒ毎の判定結果が判別結果判定部３３に記憶される。
　表示装置３は、液晶ディスプレイなどの表示デバイスによって構成されるものである。表示装置３は、全体制御部３４による制御によって、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０によって撮像された画像を表示したり、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果および判別結果判定部３３による判定結果を表示したりするものである。
　入力装置４は、キーボードやマウスなどの入力デバイスによって構成されるものである。入力装置４は、たとえば上述したように第２の撮像装置２０による撮像の指示入力を受け付けるものである。なお、表示装置３および入力装置４をタッチパネルによって構成することによってこれらを兼用するようにしてもよい。
　次に、本実施形態の細胞評価システムの作用について、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。
　まず、分化誘導の過程の評価対象の細胞が収容された培養容器が第１の撮像装置１０に設置され、最初の評価対象範囲の画像が撮像されるよう設定される（Ｓ１０）。
　そして、全体制御部３４によって、設定された評価対象範囲について、過去に第１の評価が行われたか否かが確認される（Ｓ１２）。なお、第１の評価とは、第１の撮像装置１０による撮像から判別結果判定部３３による判定結果の記憶までの処理である。
　そして、過去に第１の評価が行われていないことが確認されると（Ｓ１２，ＮＯ）、第１の撮像装置１０によって最初の評価対象範囲の位相差画像が撮像され（Ｓ１４）、その撮像画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。第１の撮像装置１０は、第２の撮像装置２０よりも低倍率で撮像を行い、具体的には１倍～４倍の倍率で撮像を行う。
　次いで、第１の判別部３１によって撮像画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ１６）、かつ第２の判別部３２によって撮像画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ１８）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。
　そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、撮像画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶する。
　全体制御部３４は、判別結果判定部３３による判定結果に基づいて、第２の評価を行うか否かを決定する（Ｓ２０）。具体的には、判別結果判定部３３による判定結果が不明である場合に第２の評価を行うことを決定し、それ以外の場合には、第２の評価は行わず、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２０，ＮＯ）。なお、第２の評価とは、第２の撮像装置２０による撮像から判別結果判定部３３による判定結果の記憶までの処理である。
　そして、全体制御部３４によって第２の評価を行うと決定された場合には（Ｓ２０，ＹＥＳ）、第２の撮像装置２０に培養容器が設置され、第２の撮像装置２０によって最初の評価対象範囲の位相差画像が撮像され（Ｓ２２）、その撮像画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０よりも高倍率で撮像を行い、具体的には１０倍～２０倍の倍率で撮像を行う。なお、第１の撮像装置１０から第２の撮像装置２０への培養容器の移動は、たとえばターンテーブルなどを用いて行うようにすればよい。
　次いで、再び第１の判別部３１によって撮像画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２４）、かつ第２の判別部３２によって撮像画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２６）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。
　そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、撮像画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶する。
　全体制御部３４は、判別結果判定部３３による判定結果に基づいて、蛍光画像による評価を行うか否かを決定する（Ｓ２８）。具体的には、判別結果判定部３３による判定結果が不明である場合に蛍光画像による評価を行うことを決定し、それ以外の場合には、蛍光画像による評価は行わず、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２８，ＮＯ）。
　そして、全体制御部３４によって蛍光画像による評価を行うと決定された場合には（Ｓ２８，ＹＥＳ）、第２の撮像装置２０によって最初の評価対象範囲の蛍光画像が撮像され（Ｓ２２）、その蛍光画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。
　次いで、再び第１の判別部３１によって蛍光画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２４）、かつ第２の判別部３２によって蛍光画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２６）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。
　そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、蛍光画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶し、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２８，ＮＯ）。
　上述したようにして最初の評価対象範囲について、最大で３回の評価が行われてその判定結果が記憶される。
　そして、次の評価対象範囲が存在する場合には（Ｓ３０，ＮＯ）、再び第１の撮像装置１０に培養容器が設置され、次の評価対象範囲の画像が撮像されるよう設定される（Ｓ１０）。次の評価対象範囲についても、最初の評価対象範囲と同様にして、最大で３回の評価が行われてその判定結果が記憶される。
　次いで、評価対象範囲が順次変更されてＳ１２～Ｓ３０の処理が繰り返して行われ、全ての評価対象範囲の評価が終わった時点において、今回の撮像領域Ｒの評価を終了する（Ｓ３０，ＹＥＳ）。
　そして、さらに一定期間経過させ、細胞の分化誘導を進行させた後に再び撮像領域Ｒの評価を継続して行う場合には（Ｓ３２，ＹＥＳ）、Ｓ１０に戻り、再び撮像領域Ｒ内の最初の評価対象範囲から順次、２巡目の評価が行われる。ただし、この際、過去に第１の評価を既に行っており、判別結果判定部３３による判定結果が未分化細胞であるか、分化細胞であるかのいずれかに確定しており、不明であるとの判定結果でない場合には、いずれの評価も行わない（Ｓ１２，ＹＥＳ、Ｓ２０，ＮＯ）。一方、過去に第１の評価を既に行っており、判別結果判定部３３による判定結果が不明であるとの判定結果である場合には、第１の評価は行わず、第２の評価から行う（Ｓ１２，ＹＥＳ、Ｓ２０，ＹＥＳ）。
　そして、判定結果が不明であった全ての評価対象範囲の評価が終了した時点で、２巡目の撮像領域Ｒの評価を終了する（Ｓ３０，ＹＥＳ）。
　次いで、さらに一定期間経過させ、細胞の分化誘導を進行させた後に３巡目の撮像領域Ｒの評価を行う場合には（Ｓ３２，ＹＥＳ）、再びＳ１０に戻り、２巡目の撮像領域Ｒの評価の場合と同様の処理が繰り返される。
　一方、継続して撮像領域Ｒの３巡目の評価を行わないことがユーザによって指示入力された場合や撮像領域Ｒ内の全ての評価対象範囲ｒの判定結果が確定し、判定結果が不明である評価対象範囲ｒが存在しなくなった時点において処理を終了する（Ｓ３２，ＮＯ）。
　上記実施形態の細胞評価システムによれば、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が未分化細胞に該当するか、分化細胞に該当するかをそれぞれ第１および第２の判別部３１，３２を用いて判別し、第１および第２の判別部３１，３２の判別結果が相反する場合には、評価対象の細胞を異なる評価条件で再評価する。したがって、このように再評価を行うことによって未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる。
　なお、上記実施形態においては、第１の評価部１による評価によって判定結果が不明である場合には、直ちに第２の評価部２による評価を行うようにしたが、第１の評価部１によって評価した後、予め設定された時間が経過した時点において第２の評価部２によって評価を行うようにしてもよい。すなわち、第１の撮像装置１０による画像の撮像から予め設定された時間経過した時点において第２の撮像装置２０による画像の撮像を行うようにしてもよい。この場合、時間の経過によって細胞の分化が進行し、細胞の状態が変化していると考えられるので、上記実施形態のように、必ずしも倍率を変更する必要はなく、第２の撮像装置２０においても低倍率で撮像するようにしてもよい。
　また、上記実施形態においては、第２の撮像装置２０によって高倍率の位相差画像および蛍光画像を撮像するようにしたが、これに限らず、たとえば露光時間の異なる複数枚の位相差画像の撮影を行い、その複数枚の位相差画像を加算した画像を用いて第１および第２の判別部３１，３２による判別を行うようにしてもよい。また、第２の撮像装置２０において、多重露光画像を撮像したり、共焦点画像を撮像したりしてもよい。また、第２の撮像装置２０において、撮像条件の異なる２枚の画像を撮像し、その差分画像を用いて第１および第２の判別部３１，３２による判別を行うようにしてもよい。
　また、上記実施形態においては、撮像領域Ｒの２巡目以降の評価を行う場合、過去に第１の評価を既に行っており、判定結果が不明である評価対象範囲ｒについては、第１の評価は行わず、第２の評価から行うようにしたが、判定結果が不明である評価対象範囲ｒだけでなく、その評価対象範囲ｒに隣接する周囲の評価対象範囲ｒについても第１の評価を行わず、第２の評価から行うようにしてもよい。これは、判定結果が不明である評価対象ｒに隣接する周囲の評価対象範囲ｒも判定結果が不明となっている可能性が高いためであり、このように第２の評価から行うことで、撮像領域Ｒの評価にかかる時間を短縮することができる。
　また、上記実施形態において、第２の撮像装置２０において高倍率撮像を行う場合、撮像視野が狭くなるので、図５に示すように評価対象範囲ｒを複数の領域に分割した分割領域ｓｒ毎の画像を撮像することになる。この場合、分割領域ｓｒ毎の画像について判定結果が異なる場合には、複数の分割領域ｓｒのうちのいずれか１つの分割領域ｓｒの画像の判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにすればよい。
　または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果のうち、最も多い判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにしてもよい。
　または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果の平均の判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにしてもよい。
　具体的には、たとえば第１の判別部３１によって各分割領域ｓｒの画像内の細胞の未分化細胞らしさを第１のスコアとして算出し、全ての分割領域ｓｒの第１のスコアの平均値を算出する。また、同様に、第２の判別部３２によって各分割領域ｓｒの画像内の細胞の分化細胞らしさを第２のスコアとして算出し、全ての分割領域ｓｒの第２のスコアの平均値を算出する。なお、第１のスコアは、未分化細胞である可能性が高い（未分化細胞らしさが大きい）ほど値が大きくなるものとし、第２のスコアは、分化細胞である可能性が高い（分化細胞らしさが大きい）ほど値が大きくなるものとする。
　そして、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均値とを比較し、これらの平均値が相反するものであるかを判定し、その判定結果を評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶する。具体的には、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均値との差が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、これらの平均値は相反していないとし、平均値が大きい方の判定結果を評価対象範囲ｒの判定結果とする。一方、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均との差が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、これらの平均値は相反しているとし、評価対象範囲ｒの判定結果を不明とする。
　なお、未分化細胞らしさのスコアおよび分化細胞らしさのスコアについては、上述したように、たとえば細胞の大きさ、輝度および色などの低次元情報をスコア化してもよいし、細胞の円形度、細胞の核の形状および細胞の密度などの細胞学的な高次元情報をスコア化するようにしてもよい。
　または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果の中に、１つでも不明の判定結果が含まれる場合には、評価対象範囲ｒの判定結果を不明として記憶するようにしてもよい。
　また、上記実施形態においては、第２の評価部２において、高倍率の位相差画像に基づく評価と蛍光画像に基づく評価とを行うようにしたが、蛍光画像に基づく評価において、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果が相反する場合には、さらに異なる評価条件で撮像された画像に基づいて評価を行うようにしてもよく、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果が矛盾しない結果となった時点で評価を終了するようにしてもよい。
　また、上記実施形態においては、評価対象の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるかを評価するようにしたが、これに限らず、生細胞であるか、死細胞であるかを評価するようにしてもよい。
　具体的には、第１の判別部３１によって評価対象の細胞が生細胞であるか否かを判別し、第２の判別部３２によって評価対象の細胞が死細胞であるか否かを判別し、判別結果判定部３３によって評価対象の細胞が、生細胞であるか、死細胞であるか、または不明であるかを判定するようにしてもよい。生細胞であるか否かについては、たとえば円形度や輝度などに基づいて判別し、死細胞であるか否かについては、たとえば輝度や核の有無に基づいて判別するようにすればよい。なお、死細胞の位相差画像は、一般的には白くなり、輝度が高い画像となる。このように生細胞であるか、死細胞であるかを評価することによって、死細胞を適切に取り除くことができる。
　また、多能性幹細胞であるかフィーダー細胞であるかを評価するようにしてもよい。具体的には、第１の判別部３１によって評価対象の細胞が多能性幹細胞であるか否かを判別し、第２の判別部３２によって評価対象の細胞がフィーダー細胞であるか否かを判別し、判別結果判定部３３によって評価対象の細胞が、多能性幹細胞であるか、フィーダー細胞であるか、または不明であるかを判定するようにしてもよい。多能性幹細胞であるか否かについては、たとえば円形度や輝度などに基づいて判別し、フィーダー細胞であるか否かについては、たとえばフィーダー細胞に固有の形状に基づいて判別するようにすればよい。このように多能性幹細胞であるか、フィーダー細胞であるかを評価することによって、分化誘導終了時点においてフィーダー細胞を適切に取り除くことができる。
　また、上記実施形態においては、第１の判別部３１と第２の判別部の２つの判別部の判別結果を用いて評価対象の細胞を評価するようにしたが、３つ以上の判別部の判別結果を用いて評価対象の細胞を評価するようにしてもよい。具体的には、たとえば上記実施形態に対して第３の判別部を設け、その第３の判別部によってフィーダー細胞であるか否かを判別するようにしてもよい。そして、第１～第３の判別部のうち２つ以上の判別部の判別結果が相反する場合と、全て判別部が該当する種類の細胞が存在しないとの判別結果である場合に第２の評価部２による再評価を行うようにすればよい。なお、４つ以上の判別器を設けた場合にも再評価の条件は同様である。
１　　 第１の評価部
２　　 第２の評価部
３　　 表示装置
４　　 入力装置
１０　 第１の撮像装置
２０　 第２の撮像装置
３０　 判別結果評価装置
３１　 第１の判別部
３２　 第２の判別部
３３　 判別結果判定部
３４　 全体制御部

Claims (14)

  1. 　評価対象の細胞を評価する第１の評価部と第２の評価部とを備え、
    　前記第１の評価部が、前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かをそれぞれ判別する判別部を少なくとも２つ有し、
    　前記第２の評価部が、前記判別部のうち少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合に、前記評価対象の細胞を前記第１の評価部の評価条件とは異なる評価条件で評価することを特徴とする細胞評価装置。
  2. 　前記第２の評価部が、前記第１の評価部よりも高倍率で前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１記載の細胞評価装置。
  3. 　前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像のうちの１つの画像の評価結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
  4. 　前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像の評価結果のうち最も多い評価結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
  5. 　前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像の評価結果を平均した結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
  6. 　前記第１の評価部が、前記評価対象の細胞を非侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価し、
    　前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞を侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から５いずれか１項記載の細胞評価装置。
  7. 　前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞の蛍光画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項６記載の細胞評価装置。
  8. 　前記第２の評価部が、前記第１の評価部において前記判別に用いた画像の撮像時点から予め設定された時間だけ経過した時点において撮像された画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
  9. 　前記第２の評価部が、前記第１の評価部よりも多い枚数の前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から８いずれか１項記載の細胞評価装置。
  10. 　前記第１の評価部および前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞を経時的に複数回評価する場合、
    　過去の前記第１の評価部の前記少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、現在の前記評価対象の細胞の前記第１の評価部による評価を行うことなく前記第２の評価部による評価を行う請求項１から９いずれか１項記載の細胞評価装置。
  11. 　前記第１の評価部および前記第２の評価部が、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割して評価を行う場合、
    　前記複数の領域のうちの１つの領域の過去の判別結果が相反する場合には、前記１つの領域と該１つの領域の周囲の領域の現在の前記評価対象の細胞の前記第１の評価部による評価を行わない請求項１０記載の細胞評価装置。
  12. 　前記第２の評価部が、前記第１の評価部と同じ少なくとも２つの判別部を有し、該少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、前記評価対象の細胞をさらに異なる評価条件で評価する請求項１から１１いずれか１項記載の細胞評価装置。
  13. 　前記第２の評価部が、該第２の評価部が有する前記少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合、評価条件を複数回変更して順次評価を行うものであり、前記少なくとの２つの判別部による判別結果が矛盾しない結果となった時点で評価を終了する請求項１２記載の細胞評価装置。
  14. 　評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かを少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、
    　前記判別部のうち少なくとも２つの判別部の判別結果が相反する場合に、前記評価対象の細胞を第１の評価とは異なる評価条件で評価する第２の評価を行うことを特徴とする細胞評価方法。
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