CN108459161A - 接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜及细菌检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜及细菌检测的方法，属于生物检测技术领域。该制备方法为以纳米纤维膜为基材层在其表面通过原子转移自由基聚合接枝引入葡萄糖聚合物，然后再与功能化异硫氰酸荧光素复合反应，制备得到金黄色葡萄球菌检测膜，其中，功能化异硫氰酸荧光素为异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的反应物。本发明制备的检测膜对金黄色葡萄球菌具备特异性设别能力，能专一的检测金黄色葡萄球菌的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及细菌检测，属于生物检测技术领域，具体地涉及一种接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜及细菌检测的方法。
背景技术
感染性疾病是全球第二大引起人类死亡的主要原因，而金黄色葡萄球菌(SAU)是引起人类感染的主要病原体，可引起多中国类型的感染：如皮肤软组织感染、眼眶蜂窝组织炎、坏死性筋膜炎、坏死性肺炎、心内膜炎、骨髓炎和败血症等，自1961年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌出现以来，目前，在全球范围内已成为医院和社区获得性感染的重要起因。
由于金黄色葡萄球菌对营养要求不高，且具备高度的耐盐性，容易污染肉类、水产品、乳品等食品，包括中国在内的多个国家均将金黄色葡萄球菌作为食品卫生标准的常规检查项目之一。目前为止尚未有研究能明确的表明金黄色葡萄球菌产毒与其菌数的定量联系，故无法得知金黄色葡萄球菌菌数水平与产毒之间的关系。国外通常采用食物中菌数含量达到103CFU/g
作为金黄色葡萄球菌定量风险评估标准，我国食品中金黄色葡萄球菌检验按照GBT4789.10-20010执行，其中定量检验是第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数和第三法金黄色葡萄球菌MPN计数，试验研究表明，单纯的采用上述两种方法，会由于人员差异引起测量结果的准确度。
菌落总数测试片(PetrifilmTM)是在一定条件下(如培养基、培养温度和培养时间等)培养后，所得每g(mL)检样中形成的微生物菌落总数，该测试片能应用于所有的食品，但主要用于评估大多数食品的总的细菌含量水平。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种方便快速准确检测金黄色葡萄球菌的检测膜及细菌检测的方法。
为实现上述目的，本发明公开了一种接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜层：取纳米纤维膜浸渍于氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)得到的所述表面活化的纳米纤维膜与溴异丁酰溴反应得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取步骤b)得到的所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与葡萄糖单体发生接枝共聚反应，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备大肠杆菌检测膜：取步骤c)得到的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，制备得到大肠杆菌检测膜。
进一步优选的，所述步骤c)的具体反应过程如下：
所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与溴化亚铜混合后，在惰性气体环境中，与葡萄糖单体、二联吡啶的甲醇混合液，在80℃的恒温水浴下振荡反应10～20h，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜。
再进一步优选的，所述步骤c)中，所述溴化亚铜与葡萄糖单体、二联吡啶之间的物质的量之比为0.5～2:50～200:0.5～2。
更进一步优选的，所述步骤d)的异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液的制备过程如下：
取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合后置于水中，所述异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的质量比为4～8:100，控制温度为4℃，搅拌反应4～6h，去除未反应完全的异硫氰酸荧光素后调节溶液的pH为7～9，得到被异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白水溶液。
更进一步优选的，所述步骤e)的具体反应过程如下：取步骤c)得到的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制温度为4℃，反应10～20min，取出，采用清水洗涤至少2次，干燥后制备得到大肠杆菌检测膜。
更进一步地，所述纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm，所述纳米纤维膜的材质为聚乙烯-聚乙烯醇。
本发明还公开了采用上述制备方法制备得到的金黄色葡萄球菌检测膜。
作为本发明技术方案的优选，所述纳米纤维膜基材层表面的接枝率不低于20％。
作为本发明技术方案的优选，所述异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白的质量比为5～7:100。
作为本发明技术方案的优选，所述异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白的质量比为6:100。
作为本发明技术方案的优选，在异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白水溶液中，所述异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，所述牛血清蛋白的浓度为100mg/mL。
作为本发明技术方案的优选，取0.5～2mmol的溴化亚铜和表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，在氮气气体环境中，加入50～200mmol的葡萄糖单体、0.5～2mmol的二联吡啶的甲醇混合液，在恒温水浴下振荡反应，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜。
作为本发明技术方案的优选，所述溴化亚铜与葡萄糖单体、二联吡啶之间的物质的量之比为0.5:50:0.5。
为了更好的实现本发明的技术方案，本发明还公开了一种细菌检测的方法，它包括如下步骤：
1)采用上述制备的细菌检测膜，裁剪成长×宽＝3cm×1cm；
2)将所述步骤1)的检测膜浸入3mL待测溶液中；
3)待5分钟后观察膜的颜色，通过肉眼观察膜颜色的变化来定性判断细菌的浓度：若膜颜色为无色，细菌的总数大于105CFU/mL；若膜颜色为浅黄绿色，细菌的总数为103～104CFU/mL；若膜颜色为深黄绿色，细菌的总数为10～103CFU/mL；若膜颜色在黄绿色基础上显橙色，细菌的总数为小于10CFU/mL。
进一步地，定量检测的方法包括如下步骤：
4)选用上述制备的检测膜，裁剪成长×宽＝3cm×1cm；
5)取待测溶液，测定其荧光强度值，然后将所述步骤4)的检测膜浸渍于待测溶液中，分别在相等的时间间隔之间测定待测溶液的荧光强度值，并计算荧光强度变化速率的数值；
6)将所述步骤5)的荧光强度变化速率的数值代入标准曲线中，得到待测样品中的细菌浓度值。
再进一步地，所述步骤6)中的标准曲线为金黄色葡萄球菌标准液的表面荧光强度变化速率与细菌浓度对数值之间的线性关系图，绘制过程如下：
取五份金黄色葡萄球菌悬浮液的浓度为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的标准溶液，分别测定其荧光强度值，然后取5个完全相同的所述步骤4)的检测膜分别浸渍于上述标准溶液中，分别在相等的时间间隔之间测定上述标准溶液表面的荧光强度值，由多个前后变化的荧光强度的差值计算荧光强度的变化速率，以荧光强度的变化速率为纵坐标，以对应的标准溶液浓度的对数值为横坐标，得到标准曲线。
本发明制备方法的原理：
本发明的制备方法为在纳米纤维膜表面接枝共聚葡萄糖的聚合物，葡萄糖聚合物的分子表面含有羟基和羧基，而异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白表面依然含有丰富的氨基、羧基等，利用基团之间的氢键相互作用使得葡萄糖聚合物与牛血清蛋白发生非特异性吸附，最终制备得到可检测出金黄色葡萄球菌的细菌检测膜。
本发明细菌检测方法的原理：
金黄色葡萄球菌表面含有可特异性识别葡萄糖的蛋白结构，因此溶液中如果有金黄色葡萄球菌，其能够诱发检测膜表面的牛血清蛋白在膜表面解吸附，带动异硫氰酸荧光素的解吸附，其中，异硫氰酸荧光素进入溶液中，而异硫氰酸荧光素具备荧光特性，使得检测膜表面的颜色由有颜色到逐渐褪去，实现金黄色葡萄球菌的浓度范围的检测，而从检测膜上解离下来的牛血清蛋白和异硫氰酸荧光素进入溶液中，其中，溶液中异硫氰酸荧光素的量与金黄色葡萄球菌的浓度成正比，因此，可以通过测定溶液中荧光强度的增加值，定量的检测金黄色葡萄球菌的浓度。
有益效果：
本发明的细菌检测膜可在5min内快速准确的检测金黄色葡萄球菌细菌的浓度，与传统的培养皿方法相比，检测效率和即时性有了较大的提高，同时该细菌检测膜结合标准曲线，还可测量溶液中金黄色葡萄球菌的精确浓度，此外，该细菌检测膜只能对金黄色葡萄球菌进行特异性设别，具备细菌专一性识别能力。
附图说明
图1为标准溶液的荧光强度变化速率与细菌浓度对数值之间的线性关系图；
图2为本发明实施例的检测膜对金黄色葡萄球菌的专一性识别测试图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为115μm，克重为12gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用自来水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为3％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为25℃，反应30～40min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入60mmol的葡萄糖单体和0.5mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应10～11h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备功能化异硫氰酸荧光素溶液：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合于水中，控制异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，牛血清蛋白的浓度为100mg/mL，于温度为4℃的条件下，搅拌反应4～5h，反应完全后，采用透析的方式去除未反应完的异硫氰酸荧光素，并调整溶液的pH为7.5左右，得到异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备金黄色葡萄球菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素功能化的牛血清蛋白中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为20％。
实施例2
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为135μm，克重为15gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用蒸馏水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为4％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为30℃，反应40～50min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入80mmol的葡萄糖单体和0.7mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应12h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备可显色的细菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于异硫氰酸荧光素的水溶液中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为21％。
实施例3
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为150μm，克重为18gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用蒸馏水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为2％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为30℃，反应60min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入100mmol的葡萄糖单体和1.0mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应12h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备功能化异硫氰酸荧光素溶液：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合于水中，控制异硫氰酸荧光素的浓度为5mg/mL，牛血清蛋白的浓度为100mg/mL，于温度为4℃的条件下，搅拌反应6h，反应完全后，采用透析的方式去除未反应完的异硫氰酸荧光素，并调整溶液的pH为8.0左右，得到异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备可显色的细菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为18％。
实施例4
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为200μm，克重为25gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用蒸馏水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为4％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为30℃，反应60min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入150mmol的葡萄糖单体和1.5mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应12h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备功能化异硫氰酸荧光素溶液：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合于水中，控制异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，牛血清蛋白的浓度为100mg/mL，于温度为4℃的条件下，搅拌反应6h，反应完全后，采用透析的方式去除未反应完的异硫氰酸荧光素，并调整溶液的pH为8.3左右，得到异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备可显色的细菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为28％。
实施例5
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为250μm，克重为30gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用蒸馏水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为4％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为30℃，反应60min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入180mmol的葡萄糖单体和1.7mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应12h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备功能化异硫氰酸荧光素溶液：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合于水中，控制异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，牛血清蛋白的浓度为100mg/mL，于温度为4℃的条件下，搅拌反应6h，反应完全后，采用透析的方式去除未反应完的异硫氰酸荧光素，并调整溶液的pH为8.5左右，得到异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备可显色的细菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为30％。
实施例6
本实施例公开了一种接枝共聚制备细菌检测膜的方法，它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取聚乙烯-聚乙烯醇纳米纤维悬浮液均匀的喷淋在棉质织物基布层的表面，干燥后得到负载在基布层上的纳米纤维膜层，其厚度为300μm，克重为40gsm；取该纳米纤维膜层浸渍于恒温(温度设定为30℃)氢氧化钠溶液中，所述氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L，浸渍处理1h左右，取出，采用蒸馏水将表面残余的溶剂洗净，然后置于室温中自然晾干，得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)制备的所述表面活化的纳米纤维膜层浸渍在体积百分比含量为4％的溴异丁酰溴的甲苯溶液中，所述溴异丁酰溴作为自由基引发剂，控制反应温度为30℃，反应60min，得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取0.5mmol的溴化亚铜与所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜置于反应容器中，向容器中通入氮气，在氮气的保护气氛下，继续加入200mmol的葡萄糖单体和2.0mmol的二联吡啶的甲醇混合液，将反应容器置于恒温水浴中，控制水浴温度为80℃，搅拌反应12h，后处理为采用蒸馏水进行超声洗涤干燥，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备功能化异硫氰酸荧光素溶液：取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合于水中，控制异硫氰酸荧光素的浓度为6mg/mL，牛血清蛋白的浓度为100mg/mL，于温度为4℃的条件下，搅拌反应6h，反应完全后，采用透析的方式去除未反应完的异硫氰酸荧光素，并调整溶液的pH为9.0左右，得到异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备可显色的细菌检测膜：取步骤c)制备的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜层浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制反应温度为4℃，处理20min左右的时间，取出，采用清水洗净后制备得到可显色的细菌检测膜，该检测膜的接枝率为28％。
由上述实施例可知，将纳米纤维膜表层的厚度控制在合适范围内，其表层可进一步地接枝共聚葡萄糖聚合物。
将上述实施例1制备的细菌检测膜进行细菌检测，具体过程如下：
1)首先，取五份金黄色葡萄球菌悬浮液的浓度为10CFU/mL、102CFU/mL、103CFU/mL、104CFU/mL、105CFU/mL的标准溶液，分别测定其荧光强度，然后取5个完全相同的长×宽＝3cm×1cm的检测膜分别浸渍于上述标准溶液中，分别在1min，2min，3min，4min和5min的时间点上，采用荧光分光光度计测定上述标准溶液的荧光强度值，由前后变化的荧光强度的差值计算荧光强度的变化速率，以荧光强度的变化速率的数值为纵坐标，以对应的标准溶液浓度的对数值lg值为横坐标，得到标准曲线，如图1所示，图1所示的线性关系图如下数学关系式所示：
lgCbacteria＝10.3k+0.82
上述数学关系式中，Cbacteria为细菌浓度，且10CFU/mL＜Cbacteria＜105CFU/mL，k为标准溶液荧光强度的变化速率的数值；
2)然后选用如上述相同的长×宽＝3cm×1cm的检测膜，选择3mL金黄色葡萄球菌悬浮液并测定其荧光强度值，然后将检测膜浸渍于金黄色葡萄球菌悬浮液中；
3)采用荧光分光光度计测定上述金黄色葡萄球菌悬浮液的荧光强度值，由前后变化的荧光强度差值计算计算荧光强度的变化速率k＝0.107；
4)根据所述步骤3)荧光强度的变化速率，结合图1的标准曲线得到细菌浓度为84CFU/mL。
为了进一步的证明本发明的检测膜只对金黄色葡萄球菌具备专一性识别，取三块上述检测膜分别置于金黄色葡萄球菌悬浮液、大肠杆菌悬浮液、铜绿假单胞菌悬浮液中，分别同时在1min、2min、3min、4min及5min测定各检测膜表面的荧光强度值对作荧光归一化处理，得到了图2，图2中，横坐标为时间，纵坐标为归一化荧光值，由图2中可看出，本发明检测膜只对金黄色葡萄球菌具备专一性识别能力，对大肠杆菌和铜绿假单胞菌不具备响应能力。
Claims (10)
1.一种接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
a)制备表面活化的纳米纤维膜：取纳米纤维膜浸渍于氢氧化钠溶液中活化处理得到表面活化的纳米纤维膜；
b)制备表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜：取步骤a)得到的所述表面活化的纳米纤维膜与溴异丁酰溴反应得到表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜；
c)制备表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜：取步骤b)得到的所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与葡萄糖单体发生接枝共聚反应，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜；
d)制备异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液；
e)制备金黄色葡萄球菌检测膜：取步骤c)得到的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，制备得到金黄色葡萄球菌检测膜。
2.根据权利要求1所述接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤c)的具体反应过程如下：
所述表面具有引发原子转移自由基的纳米纤维膜与溴化亚铜混合后，在惰性气体环境中，与葡萄糖单体、二联吡啶的甲醇混合液，在80℃的恒温水浴下振荡反应10～20h，制备得到表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜。
3.根据权利要求2所述接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤c)中，所述溴化亚铜与葡萄糖单体、二联吡啶之间的物质的量之比为0.5～2:50～200:0.5～2。
4.根据权利要求1所述接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤d)的异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液的制备过程如下：
取异硫氰酸荧光素和牛血清蛋白混合后置于水中，所述异硫氰酸荧光素与牛血清蛋白的质量比为4～8:100，控制温度为4℃，搅拌反应4～6h，去除未反应完全的异硫氰酸荧光素后调节溶液的pH为7～9，得到被异硫氰酸荧光素标记的牛血清蛋白水溶液。
5.根据权利要求1所述接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤e)的具体反应过程如下：
取步骤c)得到的所述表面接枝葡萄糖聚合物的纳米纤维膜浸渍于步骤d)的所述异硫氰酸荧光素的牛血清蛋白溶液中，控制温度为4℃，反应10～20min，取出，采用清水洗涤至少2次，干燥后制备得到金黄色葡萄球菌检测膜。
6.根据权利要求1所述接枝共聚制备金黄色葡萄球菌检测膜的方法，其特征在于：所述步骤a)中，所述纳米纤维膜的厚度为100～300μm，克重为12～40gsm，所述纳米纤维膜的材质为聚乙烯-聚乙烯醇。
7.一种接枝共聚制备的金黄色葡萄球菌检测膜，其特征在于：它为权利要求1～6中任意一项所述的制备方法制备得到。
8.一种检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)选用所述权利要求7的金黄色葡萄球菌检测膜；
2)将所述步骤1)的检测膜浸入待测溶液中；
3)待5分钟后观察膜的颜色，通过肉眼观察膜颜色的变化来定性判断细菌的浓度：若膜颜色为无色，细菌的总数大于105CFU/mL；若膜颜色为浅黄绿色，细菌的总数为103～104CFU/mL；若膜颜色为深黄绿色，细菌的总数为10～103CFU/mL；若膜颜色在黄绿色基础上显橙色，细菌的总数为小于10CFU/mL。
9.根据权利要求8所述检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：定量检测的方法包括如下步骤：
4)选用权利要求7制备的检测膜；
5)取待测溶液，测定其荧光强度值，然后将所述步骤4)的检测膜浸渍于待测溶液中，在5分钟以内的每相等的时间间隔之间测定待测溶液的荧光强度值，由前后变化的数值计算荧光强度变化速率；
6)将所述步骤5)的荧光强度变化速率的数值代入标准曲线中，得到待测样品的细菌浓度值。
10.根据权利要求9所述检测金黄色葡萄球菌的方法，其特征在于：所述步骤6)中的标准曲线为金黄色葡萄球菌标准液的荧光强度变化速率与细菌浓度对数值之间的线性关系图。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20180828 |
|
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