CN116429738A - 一种用于血液检测的组合物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种用于血液检测的组合物及其检测方法。以质量百分比计，该组合物由以下组成构成：氨基聚乙二醇甘露糖0.1～1.5％、壳聚糖改性荧光增白剂0.001～0.1％、溴甲酚绿0.001～0.01％、氢氧化钾10～15％、氯化钠2～5％、二甲基亚砜1～5％、蜗牛酶0.001～0.05％、抗荧光淬灭剂1～1.5％、甘油10～15％、余量为水。本发明选用特定改性荧光增白剂对真菌进行染色，配合氨基聚乙二醇甘露糖和蜗牛酶，能够快速、高灵敏度地检测出血液中的真菌，具有更高的阳性检测率，解决了现有技术的局限性，而且对血液真菌感染患者诊断具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种用于血液检测的组合物及其检测方法。
背景技术
近年来，由于造血干细胞移植、实体器官移植的广泛开展、高强度免疫抑制剂和大剂量化疗药物的应用以及各种导管的体内介入、留置等，临床上侵袭性真菌感染(invasivefungal infections，IFl)的患病率明显上升。IFI也日益成为导致骨髓及器官移植受者、接受化疗的恶性血液病和恶性肿瘤患者、AIDS以及其他危重病患者的严重并发症及重要死亡原因之一。由于缺少有效的早期诊断手段，深部真菌感染病死率居高不下。对深部真菌感染治疗成败的关键在于早期诊断，及早用药治疗。
常规病原学诊断“微生物培养”可为临床提供直接的诊断依据，但其培养方法耗时长(4-7天)，不适宜用作早期诊断。并且，随着光谱抗生素、抗菌药物的大量应用，使得培养的阳性率极低。常用的免疫学方法，也由于抗原抗体反应的特异性差，往往对某一疑似真菌感染患者要作多种真菌抗原或抗体检测，既费时又不经济，而且当所用药盒的抗原谱或抗体谱不全时也极易造成漏诊。对一些以往接触过相应真菌抗原的个体，作抗体检测时还会出现阳性反应，因而对抗体的检测往往要求作动态观察才能作出诊断，期末属性较差。
荧光染色法是一种快速有效检测真菌的新方法，不但为临床准确快速诊断真菌感染性疾病提供了依据，也为合理用药、快速治疗创造了条件。在基础医学、检验医学与临床医学之间开展抗感染研究建立了一条链接纽带。为浅部真菌和深部真菌导致的各种真菌感染性疾病提供了快速准确的早期诊断。荧光染色法通过使用特殊的荧光剂，与真菌细胞壁的多糖物质相结合，如纤维素、(1，3)-β-D-葡聚糖等，在荧光显微镜的紫外激发光下使其呈现荧光。使用荧光染色液进行真菌检测，是介于传统检验方法中直接镜检法和生化检测法两者之间的一种检测方法。利用直接镜检的基本操作方法，通过分析观察到的染色后的真菌，能够对真菌和寄生虫感染导致的各种疾病，做出快速、准确的实验室检测。
发明内容
本发明目的在于解决现有荧光染色在血液真菌感染检测中容易出现个别真菌局部着色不良、要求试剂纯度高、操作繁琐、条件要求高、灵敏度低、容易染色不佳等问题。
基于上述目的，本申请通过提供一种用于血液检测的组合物及其检测方法来解决该领域中的这种需要。
一方面，本发明涉及一种用于血液检测的组合物，其以质量百分比计，由以下组成构成：氨基聚乙二醇甘露糖0.1～1.5％、壳聚糖改性荧光增白剂0.001～0.1％、溴甲酚绿0.001～0.01％、氢氧化钾10～15％、氯化钠2～5％、二甲基亚砜1～5％、蜗牛酶0.001～0.05％、抗荧光淬灭剂1～1.5％、甘油10～15％、余量为水。
优选地，本发明提供的用于血液检测的组合物，其以质量百分比计，由以下组成构成：氨基聚乙二醇甘露糖0.5％、壳聚糖改性三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂0.001％、溴甲酚绿0.01％、氢氧化钾13％、氯化钠3.3％、二甲基亚砜3％、蜗牛酶0.001％、抗荧光淬灭剂1％、甘油12％、余量为水。
进一步地，本发明提供的用于血液检测的组合物中，所述壳聚糖改性荧光增白剂的制备方法包括：将壳聚糖的醋酸溶液和荧光增白剂的氢氧化钠溶液混合，升温110～120℃，反应5h，冷却得到的乳黄色粘稠液体，真空冻干得到所述壳聚糖改性荧光增白剂。
进一步地，本发明提供的用于血液检测的组合物中，所述荧光增白剂为三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂。
进一步地，本发明提供的用于血液检测的组合物中，以质量百分比计，所述壳聚糖的醋酸溶液浓度为30～50％；以质量百分比计，所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液浓度为20～40％；以质量比计，所述壳聚糖的醋酸溶液与所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液的配比为1:1～3。
进一步地，本发明提供的用于血液检测的组合物中，所述壳聚糖的醋酸溶液的pH为5～6，所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液的pH为9～10。
另一方面，本发明涉及一种血液中真菌感染检测试剂盒，其包含上述的用于血液检测的组合物。
进一步地，本发明提供的血液中真菌感染检测试剂盒中，制备方法包括：
将氨基聚乙二醇甘露糖、氢氧化钾、氯化钠、二甲基亚砜和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第一溶液；
壳聚糖改性荧光增白剂、蜗牛酶、抗荧光淬灭剂、甘油和适量水混合均匀，超声至分散均匀得到第二溶液；
将溴甲酚绿和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第三溶液；
检测前将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液混合定容至对应质量百分比，过滤，即得检测染液。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果或者优点：
本发明选用特定改性荧光增白剂对真菌进行染色，配合氨基聚乙二醇甘露糖和特定浓度范围的蜗牛酶，能够快速、高灵敏度地检测出血液中的真菌，具有更高的阳性检测率，其对1×103CFU/mL的模拟感染血液样本阳性检出率为75～86％，解决了现有技术的局限性，而且对血液真菌感染患者诊断具有重要的临床价值。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试验用品和原料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
实施例1
本实施例提供了一种用于血液检测的组合物及其制备。
壳聚糖改性荧光增白剂的制备：将壳聚糖的醋酸溶液和荧光增白剂的氢氧化钠溶液混合，升温110～120℃，反应5h，冷却得到的乳黄色粘稠液体，真空冻干洗脱得到壳聚糖改性荧光增白剂。真空冻干条件为-54℃、3800Pa、真空。洗脱为用G-50柱层析提纯，洗脱剂为V(丁醇):V(吡啶):V(25％NH3)＝1:1:1。
荧光增白剂为三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂，荧光增白剂220，即4,4’-(4-二乙醇胺基-对磺酸苯胺基-1,3,5-三嗪-2-氨基)-二苯乙烯-2,2’-二磺酸钠盐，购自武汉克米克生物医药技术有限公司。以质量百分比计，壳聚糖的醋酸溶液浓度为30％；以质量百分比计，荧光增白剂的氢氧化钠溶液浓度为20％；以质量比计，壳聚糖的醋酸溶液与荧光增白剂的氢氧化钠溶液的配比为1:2。壳聚糖的醋酸溶液的pH为6，荧光增白剂的氢氧化钠溶液的pH为9。
以质量百分比计，原料组成：氨基聚乙二醇甘露糖0.1％、壳聚糖改性荧光增白剂0.001％、溴甲酚绿0.001％、氢氧化钾10％、氯化钠2％、二甲基亚砜1％、蜗牛酶0.001％、抗荧光淬灭剂1％、甘油10％、余量为水。
氨基聚乙二醇甘露糖购自广州碳水科技有限公司，溴甲酚绿购自山东博亿生物科技有限公司，蜗牛酶(酶活5.0万U/g)购自南京都莱生物技术有限公司，抗荧光淬灭剂购自福州奥研实验器材有限责任公司。
制备过程：将氨基聚乙二醇甘露糖、氢氧化钾、氯化钠、二甲基亚砜和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第一溶液；壳聚糖改性荧光增白剂、蜗牛酶、抗荧光淬灭剂、甘油和适量水混合均匀，超声至分散均匀得到第二溶液；将溴甲酚绿和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第三溶液；检测前将第一溶液、第二溶液和第三溶液混合定容至对应质量百分比，过滤，即得检测染液。
实施例2
本实施例提供了一种用于血液检测的组合物及其制备。
本实施例原料来源与制备方法同实施例1，区别在于，以质量百分比计，原料组成为：氨基聚乙二醇甘露糖0.5％、壳聚糖改性三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂0.001％、溴甲酚绿0.01％、氢氧化钾13％、氯化钠3.3％、二甲基亚砜3％、蜗牛酶0.001％、抗荧光淬灭剂1％、甘油12％、余量为水。
实施例3
本实施例提供了一种用于血液检测的组合物及其制备。
本实施例原料来源与制备方法同实施例1，区别在于，以质量百分比计，原料组成为：氨基聚乙二醇甘露糖1.5％、壳聚糖改性荧光增白剂0.1％、溴甲酚绿0.01％、氢氧化钾15％、氯化钠5％、二甲基亚砜5％、蜗牛酶0.05％、抗荧光淬灭剂1.5％、甘油15％、余量为水
对比实施例1
本实施例提供了一种用于血液检测的染液。
本实施例原料来源与制备方法同实施例2，区别在于原料组成中，将壳聚糖改性荧光增白剂替换为三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂，且原料中不含氨基聚乙二醇甘露糖。
对比实施例2
本实施例提供了一种用于血液检测的染液。
本实施例原料来源与制备方法同实施例2，区别在于原料组成中不含氨基聚乙二醇甘露糖。
对比实施例3
本实施例提供了一种用于血液检测的染液。
本实施例原料来源与制备方法同实施例2，区别在于，以质量百分比计，原料组成中，蜗牛酶浓度为0.1％。
对比实施例4
本实施例提供了一种用于血液检测的染液。
本实施例原料来源与制备方法同实施例2，区别在于，不含蜗牛酶。
实施例4
本实施例提供了不同浓度白色念珠菌的血液样本中的荧光染色效果。
以白色念珠菌(ATCC10231)的标准株检测为例，取对数生长期的白色念珠菌用生理盐水进行稀释成1×107、1×105、1×103CFU/mL，共3个梯度，分别等量加入相同健康人血液样本中，作为模拟感染血液样本。
使用移液器取5μL模拟感染血液样本至载玻片上，另使用移液器分别将2μL实施例1～3、对比实施例1～4制得的检测染液加入其中，吹打混匀后覆盖好盖玻片，制成样本涂片，分别置于荧光显微镜下观察，若发现蓝绿色荧光的菌体，则证明该模拟感染血液样本阳性，若1min后未发现蓝绿色荧光的菌体，则证明该模拟感染血液样本为阴性，每组试验重复100次，统计检出率，试验结果如表1所示。
表1，不同浓度白色念珠菌的血液样本中的阳性检出率
| 1×107CFU/mL | 1×105CFU/mL | 1×103CFU/mL | |
| 实施例1 | 100％ | 100％ | 80％ |
| 实施例2 | 100％ | 100％ | 86％ |
| 实施例3 | 100％ | 100％ | 75％ |
| 对比实施例1 | 100％ | 64％ | 43％ |
| 对比实施例2 | 100％ | 83％ | 62％ |
| 对比实施例3 | 100％ | 45％ | 5％ |
| 对比实施例4 | 100％ | 87％ | 65％ |
由表1可知，本发明选用特定改性荧光增白剂对真菌进行染色，配合氨基聚乙二醇甘露糖和特定浓度范围的蜗牛酶，能够快速、高灵敏度地检测出血液中的真菌，具有更高的阳性检测率，其对1×103CFU/mL的模拟感染血液样本阳性检出率为75～86％，相较将壳聚糖改性荧光增白剂替换为三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂，且原料中不含氨基聚乙二醇甘露糖的对比实施例1或不含氨基聚乙二醇甘露糖的对比实施例2取得了更高的检出率。同时，本发明通过验证发现，当蜗牛酶在一定范围时，能更好得辅助染色，得到更高的灵敏度；但当蜗牛酶过高时，会完全破坏真菌细胞壁，而破坏染色结果。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种用于血液检测的组合物，其特征在于，以质量百分比计，由以下组成构成：氨基聚乙二醇甘露糖0.1～1.5％、壳聚糖改性荧光增白剂0.001～0.1％、溴甲酚绿0.001～0.01％、氢氧化钾10～15％、氯化钠2～5％、二甲基亚砜1～5％、蜗牛酶0.001～0.05％、抗荧光淬灭剂1～1.5％、甘油10～15％、余量为水。
2.根据权利要求1所述的用于血液检测的组合物，其特征在于，以质量百分比计，由以下组成构成：氨基聚乙二醇甘露糖0.5％、壳聚糖改性三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂0.001％、溴甲酚绿0.01％、氢氧化钾13％、氯化钠3.3％、二甲基亚砜3％、蜗牛酶0.001％、抗荧光淬灭剂1％、甘油12％、余量为水。
3.根据权利要求1所述的用于血液检测的组合物，其特征在于，所述壳聚糖改性荧光增白剂的制备方法包括：将壳聚糖的醋酸溶液和荧光增白剂的氢氧化钠溶液混合，升温110～120℃，反应5h，冷却得到的乳黄色粘稠液体，真空冻干得到所述壳聚糖改性荧光增白剂。
4.根据权利要求3所述的用于血液检测的组合物，其特征在于，所述荧光增白剂为三嗪基氨基二苯乙烯型荧光增白剂。
5.根据权利要求3所述的用于血液检测的组合物，其特征在于，以质量百分比计，所述壳聚糖的醋酸溶液浓度为30～50％；
以质量百分比计，所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液浓度为20～40％；
以质量比计，所述壳聚糖的醋酸溶液与所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液的配比为1:1～3。
6.根据权利要求3所述的用于血液检测的组合物，其特征在于，所述壳聚糖的醋酸溶液的pH为5～6，所述荧光增白剂的氢氧化钠溶液的pH为9～10。
7.一种血液中真菌感染检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～6任一项所述的用于血液检测的组合物。
8.根据权利要求7所述的血液中真菌感染检测试剂盒，其特征在于，制备方法包括：
将氨基聚乙二醇甘露糖、氢氧化钾、氯化钠、二甲基亚砜和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第一溶液；
壳聚糖改性荧光增白剂、蜗牛酶、抗荧光淬灭剂、甘油和适量水混合均匀，超声至分散均匀得到第二溶液；
将溴甲酚绿和适量水混合均匀，超声至完全溶解得到第三溶液；
检测前将所述第一溶液、所述第二溶液和所述第三溶液混合定容至对应质量百分比，过滤，即得检测染液。
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