KR101789787B1 - 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법 - Google Patents

염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101789787B1
KR101789787B1 KR1020160104097A KR20160104097A KR101789787B1 KR 101789787 B1 KR101789787 B1 KR 101789787B1 KR 1020160104097 A KR1020160104097 A KR 1020160104097A KR 20160104097 A KR20160104097 A KR 20160104097A KR 101789787 B1 KR101789787 B1 KR 101789787B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
mycoplasma
buffer
hydrogen peroxide
detection
dye
Prior art date
Application number
KR1020160104097A
Other languages
English (en)
Inventor
권찬호
김재훈
Original Assignee
주식회사 바이오맥스
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 바이오맥스 filed Critical 주식회사 바이오맥스
Priority to KR1020160104097A priority Critical patent/KR101789787B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101789787B1 publication Critical patent/KR101789787B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01007—Peroxidase (1.11.1.7), i.e. horseradish-peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

마이코플라즈마가 생성하는 과산화수소를 퍼옥시다아제 및 염료를 이용하여 검출함으로써 고가의 분석기기나 특정시약을 사용하지 않고도 마이코플라즈마를 쉽고 빠르게 검출 가능한 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법이 개시된다. 본 발명은 (a) 분석시료에 제1버퍼(Buffer)를 혼합하여 마이코플라즈마의 대사산물로 과산화물을 발생시키는 단계; (b) 제1버퍼가 혼합된 시료에 제2버퍼와 혼합된 반응시약을 첨가하여 상기 과산화물에서 활성산소를 발생시키는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 활성산소와의 반응으로 발색 또는 형광이 나타나도록 하며, 이를 측정하여 마이코플라즈마를 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.

Description

염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법{Mycoplasma Detection Method Using Dye}
본 발명은 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 마이코플라즈마가 생성하는 과산화수소를 퍼옥시다아제 및 염료를 이용하여 검출함으로써 고가의 분석기기나 특정시약을 사용하지 않고도 마이코플라즈마를 쉽고 빠르게 검출 가능한 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법에 관한 것이다.
세포 배양 시장은 생물 약제학 제품에 대한 엄청난 수요의 증가로 세계적으로 급속한 성장을 하고 있다. 생명 과학 산업의 중요한 부분으로 도입된 후 현재 세포 배양 시장은 엄청난 성장을 보이고 있으며, 전 세계적으로 생명 공학 및 생명 약제학 산업의 급속한 두 자릿수 성장은 향후 세포 배양 시장의 성장의 주요 원동력이 될 것으로 보인다.
세포 배양을 통해 다양한 항체의약품과 줄기세포 등의 생명 의약품 생산품은 GMP 시설 하에서 엄격하고 체계적인 관리가 이루어져야 한다. 이러한 대량 세포 배양 시스템에서 오염원의 관리는 매우 중요하므로 이를 위해 세포 배양 시 주 오염원인 마이코플라즈마 검출 및 제거 그리고 오염 방지를 위한 노력과 비용은 계속 증가 추세에 있다.
마이코플라즈마(Mycoplasma)는 0.3~0.8㎛의 지름을 갖는 가장 작고 간단한 원핵생물의 한 종류이며 지속적인 배양을 하는 세포 또는 세포주의 오염원으로 잘 알려져 있으며, 20여종의 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속과 아콜레플라즈마(Acholeplasma) 속이 세포배양의 주요 오염원으로 알려져 있다. 마이코플라즈마에 오염된 세포의 경우 성장속도가 저하되고 유전자 발현을 포함한 세포 내 여러 반응들이 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 일반적인 세포배양에서 80~25%의 세포가 마이코플라즈마에 오염되어 있으며, 한 번 오염되면 실험실 전체가 오염된다. 그러나 눈으로 관찰 되지 않아 오염 사실을 확인하기 어려우며, 일반 항생제로 제거가 어렵다.
이런 마이코플라즈마는 세포를 이용한 생산 공정 중 제조에 사용되는 동물조직, 배양에 사용되는 혈청 및 트립신, 작업 환경 또는 작업자 등과 같은 다양한 경로를 통해 제조 공정에 유입될 수 있으며 작업소 내 세포주의 교차오염으로 인해 다른 세포주로 오염이 확산될 수 있다. 따라서 제품의 품질관리를 위해서는 마이코플라즈마 오염 여부를 정기적으로 확인하여, 감염이 된 경우에는 적절한 조치를 취하는 것이 필요하다.
마이코플라즈마를 검출하기 위한 시험법은 국내외의 각종 공정서에 제시되어 있다. 인증된 마이코플라즈마 부정시험법은 배양시험법(직접도말법, 증균배양법, 멤브레인 필터법)과 indicator cell culture 법이다. 그러나 그 결과를 최종적으로 확인하는 데 28일이 소요되고 여러 가지 번거로운 과정이 많아서 경제적이지 못하다. 이에 신속하고 경제적인 마이코플라즈마 검출법의 개발 및 적용이 절실히 필요하다.
또한 이러한 배양시험법이나 indicator cell culture 법 이외에 간접적인 검출법으로 PCR과 같은 분자생물학적 방법과 효소면역분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 같은 면역학적 방법 등의 기술개발을 통해 이러한 문제를 해결하고자 하고 있다. 이들 중 PCR을 이용한 방법은 비교적 짧은 검출시간과 높은 특이성 및 감도의 검출 방법이지만 생균이 아닌 사균 검출의 위험과 고가의 관련 장비와 지식이 요구되는 문제점이 있다. 이외에 세포생물학적 검출법과 면역학적 검출법은 낮은 검출 감도의 문제를 가지고 있다. 효소면역분석법은 다양한 마이코플라즈마에 적용이 어려우며, 복잡한 실험 과정과 낮은 선택도와 민감도 그리고 높은 가격 등의 문제점이 있다.
대한민국 등록특허 제4198176호에서는 마이코플라즈마 펄모니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 펄모니스의 검출 방법 및 키트에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 마이코플라즈마 펄모니스의 종특이적인 16s rRNA 시퀀스 영역을 표적할 수 잇는 프라이머를 이용하여 마이코플라즈마를 검출하고 있지만 PCR을 과 특정 프라이머를 사용하고 있으므로, 검출비용이 많이 소모된다는 단점을 가진다.
대한민국 등록특허 제1491904호에서는 마이코플라즈마 오염 유무 확인을 위한 프라이머 세트, ＴａｑＭａｎ 프로브 및 이를 이용한 Ｒｅａｌ――Ｔｉｍｅ ＰＣＲ 시험 방법에 관하여 개시하고 있다. 이 발명에서는 특정 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간으로 마이코플라즈마를 검출하고 있지만, PCR을 사용하고 있어 검출비용이 많이 소모되며, 사균에 의한 검출이 발생할 수 있어 선택성이 낮아질 수 있다는 단점을 가진다.
이들을 대체하기 위하여 개발된 검출법으로는 마이코플라즈마가 생산하는 특정 대사체를 목표로 하는 생화학적 기반의 검출법이 있다. 이 기술은 마이코플라즈마의 ATP 생성 기작을 이용하여 생성된 ATP를 루시퍼라아제(luciferase)를 이용하여 루시퍼린(luciferin)을 발광체인 옥시루시퍼린(oxiluciferin)을 생성하게 해서 이를 발광 감지기를 이용하여 마이코플라즈마를 검출하는 검출법이다. 다만 이 방법의 경우 루시퍼린 발광감지기의 가격이 고가여서 많은 분야에 적용하지 못한다는 단점을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 상기 문제점을 해결하고자 안출된 것으로, 마이코플라즈마가 생성하는 과산화수소를 퍼옥시다아제 및 염료를 이용하여 검출하는 것으로 PCR이나 전용의 발광감지기를 사용하지 않으며, 높은 감도와 낮은 비용으로 마이코플라즈마를 검출 가능한 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명의 제1양태는, (a) 분석시료에 제1버퍼(Buffer)를 혼합하여 세포를 분해하고 제2버퍼를 첨가하는 단계; (b) 상기 버퍼가 혼합된 시료에 반응시약을 첨가하여 상기 마이코플라즈마의 대사산물로 과산화물을 발생시키며, 상기 과산화물을 활성산소로 변환하는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 활성산소와의 반응으로 발색 또는 형광이 나타나도록 하며, 이를 측정하여 마이코플라즈마를 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 제1 버퍼는; (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES); (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc); (iii) 계면활성제; 및 (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출방법을 제공한다.
또한 상기 제2버퍼는 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출방법을 제공한다.
또한 상기 염료는 발색 염료 또는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 염료는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline)인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 반응시약은; (A) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP); (B) 피루브산염(pyruvate); (C) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P); (D) 코엔자임 A(Coenzyme A); (E) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및 (F) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP)를 포함하는 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출방법을 제공한다.
또한 상기 시료는 세포 또는 세포주인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 의 제2양태는 (a) 제1 버퍼; (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES); (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc); (iii) 계면활성제; 및 (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA); (b) 제2버퍼; (i) 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES); (c) 반응시약; (i) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP); (ii) 피루브산염(pyruvate); (iii) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P); (iv) 코엔자임 A(Coenzyme A); (v) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및 (vi) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP); (c) 염료; 및 (i) 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine); (d) 양의 대조군, (i) 과산화수소를 포함하는 마이코플라즈마 검출키트를 제공한다.
이러한 본 발명에 따르면 마이코플라즈마의 대사산물인 과산화물을 퍼옥시다아제로 처리하여 발색 또는 형광을 나타나내므로, 고가의 PCR 기기나 전용의 발광감지기를 사용하지 않고 실험실 내에서 흔히 사용되는 분광계를 이용하여 마이코플라즈마를 측정 가능하고, 많은 비용을 소모하지 않고 마이코플라즈마의 측정이 가능하다.
도 1은 마이코플라즈마가 특정기질을 대사하는 과정에 있어서, 과산화수소의 생성을 보여주는 모식도,
도 2는 마이코플라즈마의 글리세롤 대사과정 및 이에 의하여 생성되는 과산화수소를 염료(Amplex red)로 검출하는 방법에 관한 모식도,
도 3은 글리세롤 대사를 이용한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성을 Amplex Red를 이용한 검출 결과로, (A) 3mM의 글리세롤 농도 첨가 시 (B) 30mM의 글리세롤 농도 첨가 시 과산솨수소의 생성량을 표현한 그래프,
도 4는 마이코플라즈마의 글리세롤 대사경로에 의한 Amplex red의 농도에 따른 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 5는 마이코플라즈마의 글리세롤 대사경로에 의한 MgCl2의 농도에 따른 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 6은 마이코플라즈마의 글리세롤 대사경로에 의한 ATP의 농도에 따른 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 7은 23종의 마이코플라즈마 글리세롤 대사경로에 의한 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 8은 23종의 마이코플라즈마 중 M. pneumoniae와 M. pirum 그리고 M.fermentans의 글리세롤 대사 경로를 이용한 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 9는 23종의 마이코플라즈마 글리세롤 대사경로에 의한 6시간 이후 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 10은 마이코플라즈마의 Glycerol-3-phosphate(G3P)의 농도에 따른 과산화수소의 생성량 결과 그래프,
도 11은 마이코플라즈마의 NAD의 농도에 따른 과산화수소의 생성량 결과 그래프
도 12는 최적량의 G3P에 의한 23종의 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 13은 인산칼륨 버퍼(potassium phosphate buffer)에 의한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 14는 PBS 버퍼에 의한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 15는 HEPES 버퍼에 의한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 16은 PIPES 버퍼에 의한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 17은 PIPES 버퍼 및 HEPES 버퍼에 의한 마이코플라즈마의 과산화수소 샐성량 비교 결과 그래프,
도 18은 PIPES 버퍼 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 19는 피루브산염의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 20은 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 NAD의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 21은 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 코엔자임A의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 22는 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 TPP의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 23은 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 온도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 24는 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 계면활성제(Triton X-100)의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 25는 마이코플라즈마의 피루브산염 대사경로에 의한 MgOAc의 농도에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 26은 최적 피루브산염 대사에 의한 23종의 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 27은 최적량의 피루브산염 및 G3P를 첨가한 경우 23종의 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 28은 최적량의 피루브산염, 글리세롤 및 G3P를 첨가한 경우 23종의 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 29는 마이코플라즈마 이외의 다른 미생물에 의한 과산화수소 생성량 결과 그래프,
도 30은 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포를 PCR을 통하여 확인한 전기영동 겔 이미지
도 31은 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포의 과산화수소 생성량 결과로 (a) CHO-k1, (b) MC3TC, (c) Hella세포의 결과 그래프,
도 32는 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포를 PCR 기반의 검출 방법을 이용하여 확인한 전기영동 겔 이미지
도 33은 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포를 세포배양 기반의 PlasmoTest™ kit를 이용한 검출 결과,
도 34는 본원 발명의 검출 키트를 이용하여 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포를 검출한 결과,
도 35는 본원 발명의 검출 키트를 이용하여 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 세포를 형광 분석한 결과,
도 36은 본원 발명의 검출 키트를 이용하여 인위적으로 마이코플라즈마에 오염시킨 12종의 세포를 검출한 결과.
이하에서는 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은 기존의 마이코플라즈마 검출 방법이 PCR이나 전용의 발광감지기를 사용하므로, 분석에 소요되는 시간이 많이 필요하며, 많은 비용이 소요된다는 문제에 주시하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과 마이코플라즈마의 대사산물인 과산화물을 퍼옥시다아제로 처리하는 경우 염료의 발색 또는 형광의 방생으로 인하여 적은 비용으로 빠른 시간 내에 검출 가능하다는 것을 확인하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명은, (a) 분석시료에 제1버퍼(Buffer)를 혼합하여 세포를 분해하고 제2버퍼를 첨가하는 단계; (b) 상기 버퍼가 혼합된 시료에 반응시약을 첨가하여 상기 마이코플라즈마의 대사산물로 과산화물을 발생시키며, 상기 과산화물을 활성산소로 변환하는 단계; 및 (c) 시료에 염료를 첨가하여 활성산소와의 반응으로 발색 또는 형광이 나타나도록 하며, 이를 측정하여 마이코플라즈마를 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라즈마 검출 방법에 관한 것이다.
기존의 마이코플라즈마 검출방법 중 PCR을 이용한 방법은 선택도가 매우 높아 정확한 측정이 가능하지만, 핵산을 증폭하는데 걸리는 시간이 많이 필요하며, 사용되는 장비 및 시약이 고가라는 단점을 가지고 있다. 이를 대체하기 위하여 마이코플라즈마가 생산하는 APT에 루시퍼라제를 혼합하여 루시퍼린이 옥시루시퍼린으로 전환될 때 발생하는 발광을 전용의 발광측정기를 이용하여 측정하는 방법이 개발되었지만, 이 방법 역시 전용의 발광측정기를 이용해야 하므로 다양한 방면에서 사용되지 못한다는 단점을 가지고 있다. 이에 본 발명은 마이코플라즈마의 대사산물은 과산화물을 퍼옥시다아제로 처리하여 활성산소를 발생시키며, 상기 활성산소와 염료를 반응시켜 반색 또는 형광을 나타나게 함으로써 낮은 비용으로 마이코플라즈마를 검출 가능하다.
본 발명에 있어서, 상기 제1 버퍼는; (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES); (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc); (iii) 계면활성제; 및 (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 제1버퍼는 마이코플라즈마가 부착되어 있는 세포를 분해하여 마이코플라즈마의 대사작용을 촉진하는 역할을 하는 것으로, 라이즈드 버퍼(lysed buffer)의 일종이다. 상기 제1버퍼 없이도 마이코플라즈마는 대사작용을 통하여 과산화물을 생성하지만, 이 경우 생성되는 과산화물의 양이 적어서 빠른 검출을 하기는 어렵다. 따라서 제1버퍼를 이용하여 세포를 분해하여 마이코플라즈마의 대사작용을 촉진하는 경우 더욱 빠른 검출이 가능할 수 있다.
또한 상기 버퍼의 첨가량은 시료의 양에 따라 제한 없이 사용 가능하지만, 시료 100㎕에 HEPRS 30~70mM, MgOAc 5~15mM, 0.1~1% 계면활성제, EDTA 0.1~5mM의 비율로 첨가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 HEPRS 40~60mM, MgOAc 8~12mM, 0.2~0.3% 계면활성제, EDTA 1~3mM일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 제2버퍼는 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES)을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 제2버퍼는 마이코플라즈마의 대사과정에서 발생할 수 있는 부반응을 억제하기 위하여 첨가하는 것으로, 시료 100㎕에 10~100mM의 비율로 첨가하는 것이 바람직하며 더욱 바람직하게는 40~60mM일 수 있다.
이후 생성된 마이코플라즈마에 의하여 생성된 과산화물은 반응시약 내의 퍼옥시다아제와 결합하여 활성산소를 발생하게 되며, 이 활성산소와 염료가 반응하여 발색되거나 형광을 나타내게 된다. 이때 사용되는 염료는 검출의 용이성을 위하여 발색염료 또는 형광염료인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 형광염료를 사용 가능하다.
또한 상기 염료는 활성산소의 농도에 따라 색상이 변화하는 것이라면 제한 없이 사용 가능하지만 바람직하게는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine, Amplex Red) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline, DAOS)일 수 있다.
또한 상기 마이코플라즈마에 의하여 생성되는 과산화물은 검출이 가능한 과산화물이라면 제한 없이 생성 가능하지만, 비교적 쉽게 검출 가능하며, 인체 독성이 적은 과산화수소가 생성되는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 반응시약은; (A) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP); (B) 피루브산염(pyruvate); (C) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P); (D) 코엔자임 A(Coenzyme A); (E) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및 (F) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP)를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 반응시약은 퍼옥시다아제인 겨자무과산화효소를 포함하고 있어 마이코플라즈마의 대사산물로 발생하는 과산화물에서 활성산소를 발생시킨다. 피루브산염 및 G3P는 마이코플라즈마가 대사작용을 수행하는 데 있어서 필수적인 기질이며, NAD 및 TPP는 마이코플라즈마가 과산화물을 대사하는데 필요한 효소들로 일정 농도를 첨가하는 경우 과산화물의 생산량을 늘릴 수 있다.
또한 상기 반응시약은 검출하는 마이코플라즈마의 종류 및 시료의 양에 따라 필요한 양을 자유롭게 선택하여 사용 가능하지만, 시료 100㎕에 하여 HRP 0.01~0.5U/ml, 피루브산염 1~10mM, G3P 1~10mM, 코엔자임 A 0.1~1mM, NAD 0.01~0.5mM 및 TPP 0.01~0.5mM의 비율로 첨가하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 HRP 0.1~0.3U/ml, 피루브산염 3~8mM, G3P 3~8mM, 코엔자임 A 0.3~0.8mM, NAD 0.08~0.15mM 및 TPP 0.08~0.15mM다.
또한 상기 시료는 세포 또는 세포주인 것이 바람직하다.
본 발명의 제2양태는 (a) 제1 버퍼; (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES); (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc); (iii) 계면활성제; 및 (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA); (b) 제2버퍼; (i) 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES); (c) 반응시약; (i) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP); (ii) 피루브산염(pyruvate); (iii) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P); (iv) 코엔자임 A(Coenzyme A); (v) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및 (vi) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP); (c) 염료; 및 (i) 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine); (d) 양의 대조군, (i) 과산화수소를 포함하는 마이코플라즈마 검출키트를 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시 예를 들어 설명한다.
실시예
(1) 마이코플라즈마 균주 라이브러리 구축
가. 마이코플라즈마 균주 분양 및 구입
마이코플라즈마를 영국의 는 Mycoplasma orale를 비롯해서 모두 23여종을 유상 또는 무상으로 분양 받아 아래 표 1과 같이 마이코플라즈마 균주 라이브러리를 구축하여 이를 마이코플라즈마 신속 검출 키트 개발에 활용하였다.
이 중에 M. bovis와 M. bovirhinis는 헬리코박터은행을 통해 M. synoviae, M. hyopneumoniae와 M. gallisepticum 은 한국수의유전자원은행을 통해 무상으로 분양받았고 M. orale 는 ATCC를 통해 M. penumoniae를 비롯한 12종은 일본의 NBRC를 통해 M. argini 를 비롯한 5종은 영국의 NCTC를 통해 분양기관으로부터 유상으로 분양 받았다.
No. Species Culture No. Origin/Source
1 Mycoplsma orale ATCC23714 Human
2 Mycoplsma bovirhinis HPKTCC B1819 Bovine
3 Mycoplasma bovis HPKTCC B1818 Bovine
4 Mycoplasma synoviae BA0702556 Avian
5 Mycoplasma hyopneumoniae BA0002798 Human
6 Mycoplasma gallisepticum BA0702557 Avian
7 Mycoplasma pneumoniae NBRC14401 Human
8 Mycoplasma fermentans NBRC14854 Human
9 Mycoplasma homins NBRC14850 Human
10 Acholeplasma laidlawii NBRC14400 Mammalian/Avian
11 Mycoplasma salivarium NBRC14478 Human
12 Mycoplasma arthritidis NBRC14860 Human
13 Mycoplasma argini NC10129 Bovine/Porcine
14 Mycoplasma opalescene NC10149 Canine
15 Mycoplasma pirum NC11702 Human
16 Ureaplasma urealyticum NC10177 Human
17 Acholeplasma modicum NC10134 Bovine
18 Acholeplasma granularum NBRC14847 Porcine
19 Mycoplasma maculosum NBRC14848 Mammalian
20 Mycoplasma hyorhinis NBRC14858 Porcine
21 Mycoplasma lipophilum NBRC14895 Human
22 Acholeplasma pleciae NBRC100476 Mammalian
23 Mesoplasma florum NBRC100688 Plant
나. 마이코플라즈마 균주 배양 및 균주 보관
분양 및 구입한 균주의 배양 및 균주 관리를 위해서 PPLO 배지에 말 혈청 등을 첨가한 액체 배지에서 배양하였다. 이때 균주의 활성 및 관리를 위해서는 PPLO 고체 배지를 이용해서 미호기성 배양을 위한 이산화탄소 가스팩이 든 혐기자 안에서 배양하였다. 배양된 균주는 추후 원활한 연구개발을 위해서 균주를 글리세롤 세균보관법을 이용하여 저온 냉장고에 보관하였다.
다. 마이코플라즈마 균주 검출을 위한 세포주의 라이브러리 구축
실험에 사용한 세포는 CHO-K1 (Chinese hamster ovary fibroblast), MC3TC (골아세포), Hella 유래의 배양세포를 이용하였다. 사용한 세포는 한국세포주은행 (KCLB)에서 유상 분양 받아서 사용하였다. 실험을 위해 각각 세포주는 10% Fetal Bovine Serum (Thermo, Lot No. E05160-500)을 포함한 MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE (Gibco, Lot No. 1365310)에서 배양하였고 배양 조건은 5% CO2 배양기에서 37℃에서 배양하여 3~4일마다 계대하였다. 실험을 위해서 각각 세포주는 10% dimethyl sulfoxide (DMSO)를 혼합한 배양액에 현탁시킨 세포를 냉동용 바이알에 넣어 -196℃ (액체질소)에 보관하였다.
실험예 1 : 기질에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 조사
(1) 외부 기질에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 조사
외부 기질로써 글리세롤(Glycerol)과 피루브산염(pyruvate), 2-옥스부티레이트(2-oxbutyrate), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), 아세트알데히드(acetaldehyde), 프룩토스(fructose) 등의 7가지 이상의 기질에 대한 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량을 발색 및 형광 염료를 이용하여 생성량을 조사하였다. 이때 마이코플라즈마를 lysed buffer를 이용하여 세포분해(cell lysis)를 한 상태와 하지 않은 상태에서의 과산화수소의 생성량을 조사하였다. 마이코플라즈마의 기질에 대한 대사는 마이코플라즈마의 관련 효소에 의한 기작에 의해서 작동하는 것이므로 어느 상태가 가장 검출 키트에 적용하기 좋은 조건인지 조사하려고 하였다. 이를 통해서 마이코플라즈마의 기질에 따른 과산화수소 대사 기작을 조사하여 각 조건에서 적절한 대사 기질 및 조건 등을 선정하고 검출 시에 lysed buffer 사용 여부를 조사하였다.
그 결과, 2-옥스부티레이트(2-oxbutyrate), N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), 아세트알데히드(acetaldehyde), 프룩토스(fructose) 등에 대해서는 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량에 유의적인 변화가 없었다. 특히, 마이코플라즈마를 lysed buffer로 처리하지 않고 살아있는 마이코플라즈마에 상기의 기질을 첨가하였을 때 첨가하지 않은 대조군에 비해 약간의 과산화수소 생성이 감지되었으나 매우 미비하였다. 이는 외부 기질을 일부 마이코플라즈마가 기질로 사용하지만 짧은 시간 이를 세포내부로 들여와 과산화수소를 생성하는 대사물로 이용하기에는 어렵기 때문인 것으로 판단된다. 이에 마이코플라즈마의 짧은 시간 효과적인 검출을 위해서는 lysed buffer로 세포를 파쇄하고 대사관련 효소의 일련의 반응을 짧은 시간에 이루어질 수 있는 조건에서 특이 대사에 대한 과산화수소 생성이 이루어지도록 하고 이를 발색 및 형광 염료인 Amplex Red를 이용하여 검출하였다.
(2) 특이 기질 및 기질의 농도 선정
상기 다양한 외부 기질 중에서 글리세롤(glycerol)과 피루브산염(pyruvate)에 대해서 마이코플라즈마에 특이적인 기질로써 과산화수소를 생성함에 따라서 이에 대한 마이코플라즈마의 대사 과정에 대해서 조사하였다. 이 과정에서 마이코플라즈마의 글리세롤 대사 경로가 주요하게 작용하는 것으로 보고 이에 관련된 대사 경로와 주요하게 관여되는 대사물질에 대해서 문헌 조사하여 특이기질에 대한 마이코플라즈마의 대사경로에 대해 조사하였다. 그 결과 글리세롤 대사 경로에 대해서는 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이 ATP를 소모하면서 글리세롤 키나아제(glycerol kinase)에 의해서 글리세롤이 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate, G3P)로 전환되고 생성되는 G3P는 글리세롤-3-포스페이트 산화효소(glycerol-3-phosphate oxidase)에 의해서 DHAP가 생성되는데 이 과정에서 과산화수소가 발생하게 된다. 이에 따라서 글리세롤 첨가에 따라 생성되는 과산화수소가 생성되는 지질 대사(Lipid metabolism) 과정 중의 글리세롤 대사 과정을 이용한 마이코플라즈마 검출에 특정 기질에 주요한 기질로 활용하였다.
가. 글리세롤 메타볼리즘(Glycerol metabolism)을 이용한 마이코플라즈마 검출
마이코플라즈마 배양액을 상기 방법과 같이 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100ml에 반응액으로 10mM KHPO4 (pH7.5) buffer에 3mM Glycerol, 3mM MgCl2, 3mM ATP, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
그 결과, 도 3(A)에 나타난 바와 같이, 특정 기질을 넣어 준 대조군에 비해 약간의 과산화수소 생성이 확인되었다.
그러나 매우 과산화수소 생성이 적으므로 글리세롤의 농도를 10배 높여서 특정기질로써 글리세롤의 첨가에 따른 과산화수소가 생성되는 지 여부를 조사하였다. 이를 위해서 같은 시료액에 대해 반응액으로 10mM KHPO4 (pH7.5) buffer에 30mM Glycerol, 3mM MgCl2, 3mM ATP, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
그 결과 도 3(B)에 나타난 바와 같이, 기질 농도를 높이는 경우, 과산화수소 생성이 높아지는 결과를 보였다. 이에 다른 요소들이 주는 영향을 조사하기 위하여 발색 및 형광 염료인 Amplex Red의 농도와 효소 반응에 영향을 줄 수 있는 2가 양이온인 MgCl2의 농도와 효소 반응에 주요한 기질 인 ATP 농도 그리고 조효소인 NAD의 농도에 대한 영향을 조사하였다.
(가-1) Amplex Red에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 3mM Glycerol, 3mM MgCl2, 3mM ATP, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP에 다양한 농도에 Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 4에 나타난 바와 같이 Amplex Red의 첨가량이 늘어 날수록 과산화수소의 생산량이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Amplex Red의 경우 검출에 필요한 최소량인 0.1mM을 첨가하는 것이 가장 적정한 것으로 결정되었다.
(가-2) MgCl2 에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 3mM Glycerol, 3mM ATP, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 MgCl2를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 5에 나타난 바와 같이 MgCl2의 농도는 과산화수소의 생산에 큰 영향을 주지는 않는 것으로 나타났지만, 부반응의 영향을 고려하여 3mM을 첨가하는 것이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(가-3) ATP 에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 3mM Glycerol, 3mM MgCl2, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 ATP를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 6에 나타난 바와 같이 ATP의 농도는 과산화수소의 생산에 큰 영향을 주지는 않는 것으로 나타났지만, 부반응의 영향을 고려하여 0.5mM을 첨가하는 것이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(가-4) NAD 에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 3mM Glycerol, 3mM ATP, 3mM MgCl2, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 NAD를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
NAD의 농도는 과산화수소의 생산에 큰 영향을 주지는 않는 것으로 나타났지만, 부반응의 영향을 고려하여 0.5mM을 첨가하는 것이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(가-5) 최적 글리세롤 대사 기질을 이용한 검출 실험
다양한 마이코플라즈마에 대해 상기 실험을 통해 최적화된 글리세롤 대사 기질을 이용한 마이코플라즈마의 글리세롤 대사 경로를 이용한 과산화수소 생성을 이용한 검출 실험을 수행하였다.
이때 23종의 마이코플라즈마를 배양하여 이를 상기의 방법과 같이 시료 현탁액을 만들어 이를 lysed buffer로 처리하여 세포를 파쇄한 100 ml의 시료에 대해 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 3mM Glycerol, 3mM ATP, 0.5mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 MgCl2를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도7에 나타난 바와 같이 23종의 마이코플라즈마에 대해 글리세롤 대사 경로를 이용하여 과산화수소 생성을 이용한 마이코플라즈마 검출 여부를 테스트한 결과, M. pneumoniae와 M. pirum 에 대해서만 상기의 조건에서 과산화수소 생성을 통한 마이코플라즈마 검출이 가능함을 확인할 수 있었다(도 8).
보다 확실한 반응 여부를 위해서 30분 이후 반응을 보다 6시간 진행시킨 후에 글리세롤 대사 경로를 이용하여 과산화수소 생성을 이용한 마이코플라즈마 검출 여부를 테스트하였다.
도9에 나타난 바와 같이, M. hyopneumoniae , M. pneumoniae와 M. pirum 의 3 종류 외에는 매우 미비한 정도의 과산화수소 생성을 나타내었다. 이는 기존 문헌 조사에서도 글리세롤 대사 경로에 의한 과산화수소 생성에 의한 세포에 독성을 나타낸다는 대다수의 논문들이 모두 M. pneumoniae를 대상으로 한 논문이었는데 글리세롤 대사 경로의 경우 다른 마이코플라즈마 균주와는 달리 M. pneumoniae의 관련 효소의 활성이 매우 높기 때문인 것으로 판단된다.
나. 글리세롤-3-포스페이트 메타볼리즘(Glycerol-3-phosphate metabolism)을 이용한 마이코플라즈마 검출
상기의 글리세롤 대사 경로는 글리세롤 키나아제(glycerol kinase)에 의해서 glycerol-3-phosphate(G3P)를 생성하고 이 G3P가 다시 glycerol-3-phosphate oxidase에 의해서 분해되면서 과산화수소가 발생하는 대사 경로를 거치게 된다. 글리세롤을 기질로 하였을 때 글리세롤 키나아제에 의한 활성의 결과로 상기의 3가지 마이코플라즈마의 과산화수소 대사가 이루어졌는지 아니면 다른 20종의 마이코플라즈마의 글리세롤 키나아제의 활성이 있음에도 불구하고 G3P oxidase의 활성에 종간의 차이가 있어서 단지 3종의 마이코플라즈마만이 과산화수소 생성이 이루어진 것인지에 대한 조사를 위해서 glycerol-3-phosphate를 특정기질로 하여 glycerol 대사 경로를 이용한 마이코플라즈마 검출을 위한 실험을 수행하였다.
(나-1) Glycerol-3-phosphate(G3P) 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 1mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red 에 다양한 농도에 G3P를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 10에 나타난 바와 같이, M. pneumoniae와 M. pirum의 경우, G3P의 농도 증가에 따라서 과산화수소의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 M. pneumoniae의 경우 G3P의 대사가 활발하게 이루어져서 높은 과산화수소 생성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 M. orale와 M. fermentans 의 경우에는 매우 미비한 과산화수소 생성을 나타내었다. 이는 앞선 글리세롤 대사를 이용한 과산화수소 생성 실험과 같이 M. pneumoniae의 경우 매우 높은 G3P oxidase의 효소 활성을 갖기 때문인 것으로 보인다.
(나-2) NAD 농도에 의한 영향
반응 시 코펙터(cofactor)로 첨가하는 NAD의 농도에 의한 영향을 조사하기 위해서 아래와 같은 조건에서 실험을 수행하였다. 마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 1mM G3P, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red 에 다양한 농도에 NAD를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 11에 나타난 바와 같이 NAD의 농도에 의한 영향은 1mM 이상에서 효소 활성에 영향을 주지 않는 것으로 판단된다. 오히려 높은 농도에서는 부반응이 많아지므로 과산화수소 생성을 통한 마이코플라즈마 검출에 좋지 않으므로 NAD의 농도는 1mM 로 하는 것이 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(나-3) 최적 G3P 대사 기질을 이용한 검출 실험
23종의 마이코플라즈마 배양액을 각각 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 1mM G3P, 1mM NAD, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 12에 나타난 바와 같이, M. pneumoniae와 M. pirum의 경우, G3P의 농도 증가에 따라서 과산화수소의 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 최적 조건에서 M. Pirum도 매우 높은 과산화수소 농도를 생성하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 다른 20여종의 마이코플라즈마에 대해서는 매우 낮은 과산화수소가 생성됨을 확인할 수 있었다.
(다) 피루브산염 메타볼리즘(Pyruvate metabolism)을 이용한 마이코플라즈마 검출
피루브산염 대사 경로를 이용하여 마이코플라즈마 검출 테스트를 수행하였다. 마이코플라즈마의 피루브산염 대사과정에서 NADH를 소비하고 이때 생성되는 과산화수소를 Amplex Red를 이용하여 검출하는 방법이다.
(다-1) buffer의 종류에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 다양한 종류의 buffer에 대해 2mM Pyruvate, 2mM Coenzyme A, 3mM NAD, 2mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
그 결과, 3종의 마이코플라즈마에 대해서 기질의 첨가에 따라 대사 반응이 이루어지고 과산화수소가 시간에 따라 생성됨을 확인할 수 있었다. 그러나 상대적으로 buffer 종류에 따라서는 높은 부반응이 일어남을 확인할 수 있었다.
이에 따라서 보다 안정적인 대사 반응을 위해서 potassium phosphate buffer, PBS buffer, HEPES buffer와 PIPE buffer에 대해 background 반응과 과산화수소 생성반응의 검출 정도를 비교하였다.
도13 내지 도 16에 나타난 바와 같이 PIPE buffer가 가장 안정적으로 부반응을 억제하고 대사과정을 통해 형성되는 과산화수소 생성에 대한 Amplex Red 반응을 나타내는데 가장 적합한 것으로 확인되었다.
상기 실험에서 HEPES buffer와 PIPE buffer 가 유사한 결과를 나타내었으므로 이에 대해서 보다 정밀하게 부반응과 과산화수소 생성 반응의 검출 정도를 비교한 결과 도 17에 나타난 바와 같이 PIPES buffer가 HEPES buffer에 비해 약 2배정도 더 안정적인 검출 반응을 나타내는 것을 알 수 있었다.
(다-2) PIPE buffer의 농도에 의한 영향
PIPE buffer의 다양한 농도에 따른 부반응과 피루브산염의 대사에 따른 과산화수소 생성 검출을 위한 Amplex Red 반응을 조사하였다. 이는 보다 안정적인 부반응 억제를 위한 PIPE buffer의 농도를 테스트하기 위한 것이다.
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 다양한 농도의 PIPES (pH7.4) buffer에 대해 2mM Pyruvate, 2mM Coenzyme A, 3mM NAD, 2mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 18에 나타난 바와 같이 안정적인 과산화수소 검출 반응과 적절한 부반응을 위해서는 50mM PIPES (pH7.4) buffer를 반응 buffer 농도로 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.
(다-3) 특정 기질인 피루브산염의 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES(pH7.4) buffer에 대해 2mM Coenzyme A, 3mM NAD, 2mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 pyruvate 를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도19에 나타난 바와 같이, 피루브산염의 첨가에 따라 3 종의 마이코플라즈마 모두 과산화수소 생성을 나타내었으나 농도 증가에 따라 일정하지 않은 과산화수소 생성을 보여주었다. 그러나 5mM와 10mM에서 피루브산염이 안전적인 반응을 나타내고 있으므로, 5mM의 피루브산염을 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.
(다-4) NAD의 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 2mM Coenzyme A, 2mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 NAD 를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도 20에 나타난 바와 같이, NAD 농도가 증가함에 따라 과산화수소 생성이 증가하였는데 0.2 ~ 0.5 mM의 NAD에서 가장 높은 과산화수소 생성을 나타내었다. 그러나 0.5mM 이상의 농도에서 오히려 과산화수소 생성이 감소하였다. 가장 높은 과산화수소생성을 나타내면서도 가장 안정적인 반응을 나타낸 0.5mM 의 NAD의 농도가 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(다-5) 코엔자임 A(Coenzyme A)의 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 5mM NAD, 2mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 Coenzyme A를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도21에 나타난 바와 같이, 코엔자임A 농도가 증가함에 따라 과산화수소 생성이 증가하였는데 0.5 mM의 코엔자임A에서 가장 높은 과산화수소 생성을 나타내었다. 가장 높은 과산화수소생성을 나타내면서도 가장 안정적인 반응을 나타낸 0.5mM 의 coenzyme A의 농도를 가장 적절한 농도인 것으로 나타났다.
(다-6) TPP 의 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red에 다양한 농도에 TPP를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 1분 간격으로 535nm/590nm (Ex/Em)으로 형광 검출하였다.
도22에 나타난 바와 같이, TPP 농도가 증가함에 따라 과산화수소 생성은 0.1 mM에서부터 감소하였다. 이에 따라 0.1mM 의 TPP의 농도가 가장 바람직한 것으로 나타났다.
(다-7) 반응 온도의 농도에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.1mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 535nm/590nm (Ex/Em)에서 형광 검출하였다. 이때 반응 온도를 설정하여 25, 35, 35℃에서 1분 간격으로 30분 동안 검출하였다.
도 23에 나타난 바와 같이, 35℃에서 가장 안정적인 검출 반응을 나타내었다. 이는 피루브산염등의 특정 기질의 제공에 대해 마이코플라즈마의 피루브산염 대사과정에 관여하는 효소가 35℃에서 가장 높은 활성을 갖기 때문인 것으로 보인다.
(다-8) 라이즈드 버퍼(lysed buffer)의 조성에 의한 영향
마이코플라즈마 배양액을 원심 분리한 후 이를 PBS buffer로 세척한 후 이를 다시 원심 분리하여 세포를 모으고 모은 세포에 lysed buffer를 넣고 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.1mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 535nm/590nm (Ex/Em)에서 1분간 35℃에서 30분 동안 검출 반응을 측정하였다.
① Tritox X-100(계면활성제)에 의한 영향
lysed buffer의 조성 시 세포 파쇄에 주요한 역할을 하는 계면활성제인 Triton X-100의 %농도에 따른 영향을 조사하였다.
도 24에 나타난 바와 같이, 첨가하지 않았을 때에 비해 Trion X-100을 0.13% 이상 첨가하였을 때 과산화수소의 발생량이 증가하였다. 그러나 0.5% 이상의 농도에서 부반응이 증가하므로 0.25%의 농도로 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.
② MgOAc에 의한 영향
lysed buffer에 의해서 세포 파쇄 될 때 효소 및 단백질의 주요한 안정제 역할을 하는 MgOAc 농도에 따른 영향을 조사하였다.
도25에 나타난 바와 같이, 첨가하지 때에 비해 5mM 이상에서 과산화수소 발생량이 증가하였다. 이에 따라 10mM의 농도로 사용하는 것이 바람직한 것으로 나타났다.
(다-9) 최적 피루브산염 대사 기질을 이용한 검출 실험
다양한 마이코플라즈마에 대해 상기 실험을 통해 최적화된 피루브산염 대사 기질을 이용한 마이코플라즈마의 피루브산염 대사 경로를 이용한 과산화수소 생성을 이용한 검출 실험을 수행하였다.
이때 23종의 마이코플르즈마를 배양하여 이를 lysed buffer (50mM HEPES (7.4), 10mM MgOAc, 0.25% Triton X-100 2mM EDTA (pH8.5))로 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES (pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.1mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 535nm/590nm (Ex/Em)에서 1분간 35℃에서 30분 동안 검출 반응을 측정하였다.
도 26에 나타난 바와 같이, 그 결과 M. orale를 비롯해서 11개의 종류의 마이코플라즈마가 피루브산염 대사 반응 경로를 통해 과산화수소의 발생 되는 것을 확인할 수 있었다. 특정 기질을 넣어 주었을 때에 종에 특이적으로 효소 활성 반응이 나타나는 것을 확인하였으나 마이코플라즈마는 대부분 과산화수소 생성에 있어서 글리세롤 대사 경로보다는 피루브산염 대사 경로에서 더 많은 과산화수소가 생성되는 것을 확인할 수 있었다.
(라) 글리세롤 및 피루브산염 메타볼리즘을 결합한 마이코플라즈마 검출
23종의 마이코플라즈마 가운데 글리세롤 대사 경로를 이용하는 것이 M. pneumoniae와 M. pirum 의 2종류이고 피루브산염 대사 경로를 이용하는 것이 M. orale 등의 11종이었다. 이 두 대사 경로를 이용하여 글리세롤 및 피루브산염을 특정 기질로 마이코플라즈마 검출을 위한 키트를 구성한다면 12종에 대해서는 검출이 가능할 것으로 판단된다. 이에 두 개의 대사경로를 결합하여 마이코플라즈마 검출이 가능한 지를 조사하였다.
(라-1) 피루브산염과 G3P를 특정 기질로 하였을 때 과산화수소 생성 검출
다양한 마이코플라즈마에 대해 상기 실험을 통해 최적화된 피루브산염과 G3P를 대사 기질로 이용하여 마이코플라즈마의 과산화수소 생성을 이용한 검출 실험을 수행하였다.
이때 23종의 마이코플라즈마를 배양하여 이를 lysed buffer (50mM HEPES (7.4), 10mM MgOAc, 0.25% Triton X-100 2mM EDTA (pH8.5))로 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES(pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 1mM G3P, 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.1mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 535nm/590nm (Ex/Em)에서 1분간 35℃에서 30분 동안 검출 반응을 측정하였다.
도27에 나타난 바와 같이, 다양한 마이코플라즈마에서 과산화수소의 생성이 관찰되고 있으며, 이에 따라 피루브산염과 G3P를 기질로 동시에 사용하여도 과산화수소의 생성이 가능한 것을 확인할 수 있었다.
(나) 피루브산염, G3P와 글리세롤을 특정 기질로 하였을 때 과산화수소 생성 검출
다양한 마이코플라즈마에 대해 상기 실험을 통해 최적화된 피루브산염, G3P 및 글리세롤을 대사 기질로 이용하여 마이코플라즈마의 과산화수소 생성을 이용한 검출 실험을 수행하였다.
이때 23종의 마이코플르즈마를 배양하여 이를 lysed buffer (50mM HEPES (7.4), 10mM MgOAc, 0.25% Triton X-100 2mM EDTA(pH8.5))로 1분간 세포를 완전히 현탁시킨 후 이 용액을 검출을 위한 시료로 사용하였다. 이 시료 100 ml에 반응액으로 50mM PIPES(pH7.4) buffer에 대해 5mM pyruvate, 1mM G3P, 3mM glycerol , 5mM NAD, 0.5mM Coenzyme, 0.1mM TPP, 0.2U/ml HRP, 0.1mM Amplex Red를 넣은 반응액 100 ml를 섞은 후 이를 SPECTRAMAX Gemini XP, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 535nm/590nm (Ex/Em)에서 1분간 35℃에서 30분 동안 검출 반응을 측정하였다.
도28에 나타난 바와 같이, 다양한 마이코플라즈마에서 과산화수소의 생성이 관찰되고 있으며, 이에 따라 피루브산염, G3P 및 글리세롤을 기질로 동시에 사용하여도 과산화수소의 생성이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 다만, 피루브산염 및 G3P만을 사용한 경우에 비하여 일부 마이코플라즈마의 과산화수소의 생산량이 감소하고 있으므로, 피루브산염 및 G3P만을 기질로 사용하는 것이 더욱 바람직할 것으로 측정되었다.
실험예 2 : 마이코플라즈마의 종에 따른 과산화수소 생성량 조사
가. 마이코플라즈마의 종에 따른 과산화수소 생성 조사
23여종 이상의 라이브러리를 활용하여 마이코플라즈마의 종에 따른 과산화수소 생성량을 조사하여 개발한 특정 기질의 첨가에 따른 과산화수소 생성을 통한 마이코플라즈마 검출을 조사하였다.
이 중에서 M. orale와 A. laidlawii등과 같이 주요하게 검출되는 마이코플라즈마가 포함되어 있으므로 마이코플라즈마 검출 키트로 가능할 것으로 판단되어 이 최적화된 대사 경로를 최적화하여 이에 따른 마이코플라즈마 검출을 조사하였다. 그러나, 마이코플라즈마는 난배양성 미호기성균으로 일부 균주는 배양이 매우 어려워서 분양 시 배양이 되지 않거나 초기에는 배양되다가도 나중에는 배양되지 않는 균종이 몇몇이 있었다. 대표적인 예가 M. fermentans와 M. hominis 등으로 검출되지 않은 종에 대해서 생육여부를 확인하여서 다시 표시하였다(표 2).
No. Species Addition of specific substrates
Glycerol Glycerol-3-phosphate pyruvate
1 Mycoplsma orale - - positive
2 Mycoplsma bovirhinis - - positive
3 Mycoplasma bovis - - positive
4 Mycoplasma synoviae - - positive
5 Mycoplasma hyopneumoniae - - positive
6 Mycoplasma gallisepticum - - positive
7 Mycoplasma pneumoniae positive positive positive
8 Mycoplasma fermentans no growth
9 Mycoplasma homins no growth
10 Acholeplasma laidlawii - - positive
11 Mycoplasma salivarium - - -
12 Mycoplasma arthritidis - - -
13 Mycoplasma argini - - -
14 Mycoplasma opalescene - - -
15 Mycoplasma pirum positive positive -
16 Ureaplasma urealyticum no growth
17 Acholeplasma modicum no growth
18 Acholeplasma granularum - - positive
19 Mycoplasma maculosum - - positive
20 Mycoplasma hyorhinis - - positive
21 Mycoplasma lipophilum no growth
22 Acholeplasma pleciae no growth
23 Mesoplasma florum no growth
나. 타 미생물의 과산화수소 생성량 조사
세포 배양 시 마이코플라즈마 이외에 미생물 오염은 검출 키트를 사용하지 않아도 육안으로도 쉽게 검출할 수 있으나 검출 키트의 성능 특성상 타 오염원에 대한 선택도 테스트를 위해 타 미생물에 대한 과산화수소 생성 여부를 조사하였다.
이때 미생물은 미호기성균으로 Lactobacillus casei, 통성혐기성균으로 Eshcerichia coli와 Saccharomayces cerevisiae 의 3 가지 미생물에 대한 상기의 조성된 마이코플라즈마 검출용 조성물에 의한 과산화수소 생성량을 조사하였다.
도29에 나타난 바와 같이, 미호기성균으로 L. casei와 통성혐기성균으로 E. coli는 외부 특정 기질의 첨가에도 과산화수소 생성량이 급격히 증가하지 않았으나 진균인 Saccharomayces cerevisiae의 경우에는 약간의 과산화수소 생성량이 증가함을 확인할 수 있었다. Saccharomayces cerevisiae 오염인 경우 탁도 등으로 쉽게 검출이 되므로 거짓양성이 될 정도로 교차오염의 가능성은 낮을 것으로 판단되지만 향후 마이코플라즈마 검출 키트의 거짓양성(positive false)의 원인이 될 수도 있다로 이에 대해 주의할 필요가 있다.
실험예 3 : 세포주에 따른 마이코플라즈마의 과산화수소 생성량 조사
가. 숙주 세포 라이브러리 구축
생화학적 기반의 검출법이 실험하는 세포주에 따라서 검출의 차이를 나타낼 수 있으므로 되도록 3종의 세포주로 CHO-K1, MC3TC, Hela cell을 확보하여 이를 이용하여 마이코플라즈마 검출의 숙주 세포로 활용하였다.
나. 세포주에 따른 과산화수소 생성량 조사
이에 M. orale , M. bovis , M. bovihirhins와 M. pneumoniae를 각각 108 cfu/ml로 배양한 후 이를 멸균된 원심 분리 용기로 원심분리한 후 이를 멸균된 PBS 1ml로 현탁하여 배양한 세포주에 첨가하여 인위적으로 오염시켰다. 각각 오염된 세포주는 계대 배양한 후에 이를 PCR 방법으로 오염 여부를 도30과 같이 확인하였다.
오염된 세포주에 따라 각각의 마이코플라즈마에 대해 상기의 특정 기질과 조성물을 첨가하여 조사하였다.
오염된 세포주에서 상기의 방법으로 처리하여 분리 추출한 각각의 마이코플라즈마 현탁액에 대해서 상기의 특정 기질과 조성물을 첨가하여 조사한 결과 모두 안정적으로 특정 기질에 대한 대사를 통해 과산화수소를 생성하고 이를 안정적으로 검출 할 수 있었다(도31).
실험예 3 : 마이코플라즈마 검출 키트의 비교 테스트
기존의 마이코플라즈마 제품 중에서 PCR 기반의 제품(e-Myco™ plus Mycoplasma PCR Detection Kit)과 세포배양 기반의 제품(PlasmoTest™) 등의 타 제품과의 특이도, 민감도, 검출시간, 검출방법 등에 대해서 비교하여 개발된 마이코플라즈마 검출 키트의 성능을 비교 조사하였다.
비교예 1 : PCR 기반 제품
PCR 기반의 제품으로 Intron의 mycoplasma validation PCR detection kit를 이용하여 세포주에 오염시킨 마이코플라즈마를 검출하였다.
검출에 걸린 시간은 세포주의 전처리 및 PCR 과정과 이후 gel electrophoresis 시간까지 총 6시간이 걸렸으며 도32에 나타난 바와 같이 모두 검출 되었다.
4개의 균주외에도 23 개의 마이코플라즈마에 대해서 검출 실험을 실시하였으나 마이코플라즈마의 생육 여부가 확인되지 않은 균주를 제외하고 대부분이 검출되었으나 Achloeplasma를 비롯해서 몇몇 균주는 PCR 기반 균주에 검출되지 않았고 또한 PCR 수행 여부를 확인하는 밴드가 확인되지 않는 듯 PCR 기반의 마이코플라즈마 검출법은 과제 계획서에서 지적했듯이 특이도와 검출 시간에 문제를 가지고 있었다.
다만 10 cfu/ml 의 오염에 대해서 검출할 수 있는 높은 민감도를 가지고 있는 것으로 분석되었다.
비교예 2 : 세포 배양 기반의 제품
세포배양 기반의 제품으로 Invivogen의 PlasmoTest™ kit를 이용하여 세포주에 오염시킨 마이코플라즈마를 검출하였다.
HEK-Blue 2 cell을 배양(22시간)하여 세포수가 5x104가 되도록 배양한 후에 이 세포 배양액 200ul 에 시료 50ul를 넣고 18시간동안 배양하여 마이코플라즈마 오염여부를 검출 하였다. 검출에 걸린 시간은 세포주의 배양과 검출 과정까지 총 40시간이 걸렸으며 도33에 나타난 바와 같이 모두 검출 되었다.
Invivogen의 PlasmoTest™ kit를 이용한 세포주에 오염시킨 마이코플라즈마 검출은 오랜 시간이 걸리지만 상당히 특이도 민감도가 떨어지는 결과를 얻었다. 4개의 오염된 세포주의 마이코플라즈마에 대해서도 M. pneumoniae에 대해서만 쉽게 검출 할 수 있었고 다른 균주에 대해서는 검출이 되지 않는 등의 상당한 문제가 있는 것으로 보여진다.
실시예 1: 본원 발명의 마이코플라즈마 검출키트
본원발명에 의한 제품의 테스트를 수행하였다.
이때 사용된 키트는
(a) 제1 버퍼;
(i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES);
(ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc);
(iii) 계면활성제; 및
(iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA);
(b) 제2버퍼;
(i) 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES);
(c) 반응시약;
(i) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP);
(ii) 피루브산염(pyruvate);
(iii) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P);
(iv) 코엔자임 A(Coenzyme A);
(v) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD);
(vi) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP);
(c) 염료;
(i) 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine);
로 구성되어 있는 제품을 사용하였으며, 상기 실험예에서 보인 최적의 농도를 이용하여 실험을 수행하였다.
(1) 발색 검출 반응
발색 검출의 경우 spectrophotometer로 595nm에서 측정하는 경우 세포 전처리를 포함해서 30분 이내에서 측정이 가능하였다. 도34에 나타난 바와 같이, 4개의 균주 모두 검출이 가능하였으며 spectrophotometer가 구비 되지 않는 경우에도 빛이 차단된 곳에서 6시간 이상 반응 시키면 도 34와 같이 육안으로도 쉽게 반응 여부를 확인할 수 있었다. 이로써 개발하고자 하는 키트의 경제적이고 신속 간편 마이코플라즈마 검출 키트에 맞는 제품으로 개발되었음을 확인할 수 있었다.
(2) 형광 검출 반응
형광 검출의 경우 또한, 전처리를 포함해서 30분 이내에서 측정이 가능하였고 도35에 나타난 바와 같이, 오염되지 않은 세포주에 비해 매우 안정적으로 4개의 균주 모두 검출이 가능하였다. 이로써 기존 PCR 기반의 제품과 세포 배양 기반의 제품에 비해 신속 간편한 마이코플라즈마 검출 키트 제품으로 개발되었음을 확인할 수 있었다.
(3) 다양한 마이코플라즈마에 대한 발색 검출 반응
4종의 마이코플라즈마 이외에 다른 종류의 마이코플라즈마에 대한 발색 검출 반응을 테스트하였다. 도 36에 나타난 바와 같이, 형광 검출된 12 종류 중에서 M. hyorhinis 를 제외한 11 종에 대해서 발색 검출 되었으며 spectrophotometer로 30분 이내로 검출이 가능하였으며 2시간 이후에 육안으로 분석이 가능할 정도로 발색 반응이 일어남을 확인하였다.
(4) 타 제품과의 비교테스트 요약
다른 마이코플라즈마 검출 키트와의 본원 발명에 의한 키트의 성능을 아래와 같이 특이도, 민감도, 검출시간, 검출 방법에 대해 비교 분석한 결과를 아래의 표3과 같이 요약하였다.
Detection method 비교예1
(PCR based detection)		 비교예 2
(Specific cell culture based detection)		 실시예 1
(hydrogen peroxide based detection)
Manufacture Intron (Korea) Invivogen (USA) Biomax (Korea)
Brand mycoplasma validation PCR detection kit PlasmoTest™ Myco-plex
Specificity good
(56%) 		not good
(18%) 		very good
(75%)
Sensitivity very good
(10 cfu / ml ) 		not good
(10 9 cfu / ml ) 		good
(10 6 cfu / ml )
Detection time good
(8 h) 		not good
(40 h) 		very good
0.5 h
Detection method gel electrophoresis colorimetric detection colorimetric & fluorometric detection
이상으로 본 발명의 바람직한 실시 예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 다음의 단계를 포함하는 염료를 이용한 미생물 검출방법으로서,
    (a) 분석시료에 제1버퍼(Buffer)를 혼합하여 세포를 분해하고 제2버퍼를 첨가하는 단계;
    (b) 상기 버퍼가 혼합된 시료에 반응시약을 첨가하여 상기 미생물의 대사산물로 과산화물을 발생시키며, 상기 과산화물을 활성산소로 변환하는 단계; 및
    (c) 시료에 염료를 첨가하여 활성산소와의 반응으로 발색 또는 형광이 나타나도록 하며, 이를 측정하여 미생물을 검출하는 단계;
    상기 미생물은 마이코플라즈마 오랄레(Mycoplsma orale), 마이코플라즈마 보버리니스(Mycoplsma bovirhinis), 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis), 마이코플라즈마 시노비아에(Mycoplasma synoviae), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 피룸(Mycoplasma pirum), 마이코플라즈마 마쿨로숨(Mycoplasma maculosum), 마이코플라즈마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 아콜레플라즈마 라이들라위(Acholeplasma laidlawii) 및 아콜레플라즈마 그라눌라룸(Acholeplasma granularum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이며,
    상기 반응시약은 (A) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP); (B) 피루브산염(pyruvate); (C) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P); (D) 코엔자임 A(Coenzyme A); (E) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및 (F) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP)를 포함하는 미생물 검출방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 버퍼는;
    (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES);
    (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc);
    (iii) 계면활성제; 및
    (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA);
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제2버퍼는 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES)을 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물 검출방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 염료는 발색 염료 또는 형광 염료인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 염료는 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine) 또는 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-설포프로필)-3,5-디메톡시아닐린(N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline)인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 과산화물은 과산화수소인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 시료는 세포 또는 세포주인 것을 특징으로 하는 미생물 검출 방법.
  9. 다음의 구성을 포함하는 미생물 검출 키트로서,
    (a) 제1 버퍼;
    (i) 4-(2-하이드록시에틸)-1- 피페라진에탄설포닉 에시드(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES);
    (ii) 마그네슘 아세테이트(MgOAc);
    (iii) 계면활성제; 및
    (iv) 에틸렌디아민테트라아세테이트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA);
    (b) 제2버퍼;
    (i) 피페라진-N,N'비스(2-에탄술폰산)(PIPES);
    (c) 반응시약;
    (i) 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase, HRP);
    (ii) 피루브산염(pyruvate);
    (iii) 글리세롤-3-포스페이트(Glycerol-3-phosphate, G3P);
    (iv) 코엔자임 A(Coenzyme A);
    (v) 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD); 및
    (vi) 티아민 디포스페이트(thiamine diphosphate, TPP);
    (c) 염료; 및
    (i) 10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진(10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine);
    (d) 양의 대조군.
    (i) 과산화수소;
    상기 미생물은 마이코플라즈마 오랄레(Mycoplsma orale), 마이코플라즈마 보버리니스(Mycoplsma bovirhinis), 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis), 마이코플라즈마 시노비아에(Mycoplasma synoviae), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라즈마 피룸(Mycoplasma pirum), 마이코플라즈마 마쿨로숨(Mycoplasma maculosum), 마이코플라즈마 하이오리니스(Mycoplasma hyorhinis), 아콜레플라즈마 라이들라위(Acholeplasma laidlawii) 및 아콜레플라즈마 그라눌라룸(Acholeplasma granularum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 미생물 검출 키트.
KR1020160104097A 2016-08-17 2016-08-17 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법 KR101789787B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160104097A KR101789787B1 (ko) 2016-08-17 2016-08-17 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160104097A KR101789787B1 (ko) 2016-08-17 2016-08-17 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101789787B1 true KR101789787B1 (ko) 2017-10-25

Family

ID=60299872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160104097A KR101789787B1 (ko) 2016-08-17 2016-08-17 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101789787B1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982870A (zh) * 2019-12-26 2020-04-10 江苏美克医学技术有限公司 一种微生物多重荧光染色液及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2796150B2 (ja) * 1989-12-20 1998-09-10 株式会社ヤトロン フルクトサミンの測定方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2796150B2 (ja) * 1989-12-20 1998-09-10 株式会社ヤトロン フルクトサミンの測定方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110982870A (zh) * 2019-12-26 2020-04-10 江苏美克医学技术有限公司 一种微生物多重荧光染色液及其应用
CN110982870B (zh) * 2019-12-26 2022-03-22 江苏美克医学技术有限公司 一种微生物多重荧光染色液及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marx et al. A microplate fluorimetric assay for the study of enzyme diversity in soils
CA2169168C (en) Method and test kits for detection of bacteriophage
Bonadonna et al. Innovative analytical methods for monitoring microbiological and virological water quality
Ogunseitan Direct extraction of catalytic proteins from natural microbial communities
Horiuchi et al. Simplified method for estimation of microbial activity in compost by ATP analysis
Ahmad et al. Identification of Acinetobacter baumannii and Determination of MDR and XDR Strains
KR101789787B1 (ko) 염료를 이용한 마이코플라즈마 검출방법
Dippenaar et al. Optimizing liquefaction and decontamination of sputum for DNA extraction from Mycobacterium tuberculosis
Madkour et al. Detection of carbapenemase-producers: Evaluating the performance of the carbapenem inactivation method and Carba NP test versus multiplex PCR
NO333474B1 (no) Fremgangsmate for detektering av mykoplasmaforurensning.
CN1756848B (zh) 通过测量乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性检测的测支原体测定法
Gallardo-Rodríguez et al. Rapid method for the assessment of cell lysis in microalgae cultures
Sugiyama et al. Development of a new chromogenic method for putrescine quantification using coupling reactions involving putrescine oxidase
NL2019074B1 (en) Pathogen detection method
CN110684822A (zh) 一种基于丙酮酸激酶检测样品中微生物的方法及试剂盒
Chiu et al. Measuring β‐Galactosidase Activity in Gram‐Positive Bacteria Using a Whole‐Cell Assay with MUG as a Fluorescent Reporter
Xuan et al. Quantification of ethanol using a luminescence system derived from Photobacterium leiognathi
JP4987469B2 (ja) 酢酸キナーゼまたはカルバメートキナーゼ活性を測定することによる、マイコプラズマを検出するためのアッセイ
Pavlova et al. Evaluation of the viability of the Bulgarian BCG vaccine by the adenosine triphosphate assay
Brown et al. Assessing microbial growth monitoring methods for challenging strains and cultures
OA18738A (en) Pathogen detection method
Miller Rapid Methods in Cosmetic Microbiology
RU2525934C1 (ru) Способ видовой дифференциации жизнеспособных родококков, иммобилизованных в гелевом носителе
JPS60234596A (ja) リジン脱炭酸試験用培地
BIOLUMINESCENCE M DRISCOLL, C RAMSAY, JWATKIN Biotrace Limited. The Science Park, Bridgend, CF31 3MA, UK E-mail: markd@ biotrace. co. uk

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190827

Year of fee payment: 8