CN1756848B - 通过测量乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性检测的测支原体测定法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测测试样品中存在支原体的方法，包括：(i)提供测试样品；(ii)检测和/或测量该测试样品中乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性，所述活性指示了是否存在支原体污染。

Description

通过测量乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性检测的测支原体测定法
本发明涉及用于检测柔膜细菌家族成员的分析方法和材料，该柔膜细菌污染了测试样品比如来自细胞培养物的样品。
在分类学上，柔膜细菌与其它细菌的区别在于不含细胞壁，该纲细菌被称为柔膜纲细菌(Razin等1998)。该纲成员概述于下表1中。
表1：柔膜细菌纲的主要特征和分类
  分类   种数   基因组大小(kb)   基因组中G+C的Mol％   宿主
  I目：支原体目I科：支原体科I属：支原体属II属：脲原体属 1026 580-1,350760-1,170 23-4027-30 人，动物人，动物
  II目：昆虫原体目I科：昆虫原体科I属：虫原体属II属：中间原体属 512 790-1,140870-1,100 27-2927-30 昆虫，植物昆虫，植物
  II科：螺原体科I属：螺原体属 33 780-2,220 24-31 昆虫，植物
  III目：无胆甾原体目I科：无胆甾原体科I属：无胆甾原体属 13 1,500-1,650 26-36 动物，一些植物，昆虫
  IV目：厌氧支原体目科：厌氧支原体科I属：厌氧支原体属II属：无甾醇支原体属 41 1,500-1,6501,500 29-3440 牛/羊瘤胃牛/羊瘤胃
  未确定的(1999)phytoplasma 640-1,185 23-29 昆虫，植物
在本申请上下文中，术语“支原体”意在包括柔膜细菌纲所有成员，而非仅仅支原体目。实际上，“支原体”是本领域指代所有柔膜细菌的常用术语。
支原体作为人、哺乳动物、爬行动物、鱼类、节肢动物和植物的寄生虫广泛分布于自然界。它们是最小最简单的原核生物。它们没有坚硬的细胞壁且无法合成肽聚糖；因此它们对于抗生素比如青霉素及其类似物不敏感。支原体是从DNA的鸟嘌呤和胞嘧啶的分子百分含量较低的革兰氏阳性菌即乳酸杆菌、芽胞杆菌、链球菌和两种梭菌属经退化性进化而发展的。在进化过程中，柔膜细菌丢失了它们遗传信息的重要部分。正是这一有限的编码容量决定了需要寄生的生存方式。多数菌株是兼性厌氧生物，但还有一些是专性厌氧的，因此，它们的代谢与厌氧菌类似。
已鉴定了超过180种柔膜细菌种，其中从细胞培养物中分离出了20种来自人、牛和猪的不同支原体和无胆甾原体种。其中，六个种引起了全部支原体感染中的95％；它们是口腔支原体(M.orale)、精氨酸支原体(M.arginii)、发酵支原体(M.fermentans)、唾液支原体(M.salivarum)、猪鼻支原体(M.hyorhinis)和莱氏支原体(A.laidlawii)。感染的主要原因是来自引入实验室的其它细胞系的交叉污染。在组织培养试剂比如血清产品中可发现有害的外源支原体。与细菌不同，支原体污染很少导致浑浊生长或明显的细胞损害。在接种七天后还可以从作用表面获得活的支原体，支原体还可穿过细菌-截留过滤器。在它们的最大种群阶段，上清液中可含有高达108个支原体/ml，与宿主细胞的比例为5∶1。如果存在，支原体在培养基中“生长”至可检测的浓度，然后它们也可被吸附到细胞表面。目前尚未定论的是支原体是否进入并在培养物中的哺乳动物细胞内并存活。
支原体几乎可改变体外培养物的任一性质。它们耗尽培养物中的养分特别是精氨酸。受感染的真核细胞表现出异常的生长，在代谢和形态方面发生改变。某些生物学特性已经涉及毒性决定因素；这些包括向寄主细胞环境中分泌或引入支原体酶比如磷脂酶、ATP酶、溶血素、蛋白酶和核酸酶。
支原体的主要问题是它们的污染通常是隐蔽的，不同于细菌检测，不易于显现出来。它们对抗生素的耐药性和透过常规灭菌过滤器的能力意味着它们可以逃避一般的细胞培养物防菌工艺。由于具有这些未被检测污染的负面影响，很明显对于任何细胞培养实验室而言必需进行持续筛选。
大量研究已表明培养物中至少10％-15％的细胞已被支原体污染。(Rottem和Barile 1993，McGarrity和Kotani 1985)。大多数细胞生物生物学家认识到需要进行常规的支原体测试，但由于现有测试方法的成本和不准确性，这种想法迄今仍无法实现。
可用于检测活的支原体的唯一准确的方法是培养微-有机体。但是，与它们的体外培养有关的困难已证明是难以克服的，因为它们的培养需要复杂的培养基(Razin等1998)。培养也被认为是最灵敏的方法，因为据说可以检测单一的活有机体。但是，高度专业的人员使用非常特定要求的培养条件需要花费两或三周时间才能得到结果。需要花费如此长的时间是因为需要将细胞培养成足够的数目由此形成菌落，然后可使用Dienes染色辨别。支原体可在琼脂上以及在肉汤培养物中培养，尽管使用标准琼脂或肉汤培养基时，一些菌落可能不能完全包埋，大多数支原体生成包埋在琼脂糖中具有特征性的“煎鸡蛋”外观的微观菌落。有一些菌株不能容易地利用标准的琼脂糖或肉汤培养物生长。这些菌株需要用于它们分离和鉴定的细胞-辅助培养物。后一方法有助于鉴定并检测吸附于宿主细胞表面的支原体种(Rottem和Barile1993)。但是，由于培养方法的复杂性，这些测试通常由支原体测试服务实验室完成。
检测样品中支原体的一种较简单的方法是使用荧光染料测定DNA。最常使用的一种染料是4’6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)，而Hoecsht染色被认为是可选的方法。取出细胞培养样品、固定并使用Hoechst 33258染色(邻苯二酰胺)染色并在落射荧光检测(Battaglia等1994，Raab 1999)。如果存在与细胞相关联的支原体，那么在细胞质中细胞核将显示被荧光结构围绕。阴性细胞仅在核内的细胞DNA被染色。对DNA染色结果的准确解释需要专业的眼光，还需要专业的设备即荧光显微镜。
对外服务实验室通常采用PCR的方法检测支原体，其也是在具有适当设备的实验室中进行的。支原体PCR试剂盒中使用的引物退火至支原体基因组的保守区域，可以检测若干的支原体种(Raab 1999)。最易购得的PCR试剂盒需要通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增的产物，经所得的带型确定存在的污染种属。但是带型的观察是主观性的。
Roche(Raab 1999)的支原体PCR ELISA依赖不同的体系，而且无法鉴别不同的种属。该试剂盒包括地高辛-dUTP，并将PCR产物被俘获于包被有抗-地高辛-过氧化酶偶联物的微板中的孔表面。使用标准ELISA板计数器测量四甲(TMB)的有色产物。
基于腺苷磷酸化酶的活性，Life Technologies开发出了MYCOTECTTTM试剂盒，已发现腺苷磷酸化酶仅在哺乳动物细胞中小量(如果根本不存在)存在(Verhoef等1983)。该酶将6-甲基嘌呤脱氧核糖(6-methyl deoxiriboside，6-MPDR)转化为两种毒性产物(6-甲基嘌呤和6-甲基嘌呤核糖)。该测定需要将污染的细胞系加到生长于24孔组织培养板的指示细胞系中。加入6-MPDR底物且再生长3-4天后，加入结晶紫染料测试指示细胞的活力，其中支原体阳性导致这些毒性剂的生成。尽管报道了如果将培养基条件调整为利于支原体生长，能在每200,000个靶细胞中检测出1个支原体细胞(Whitaker等1987)，但这一体系的主要缺点在于工作强度大且费时。
可以使用免疫测定法检测支原体抗原，应用抗支原体抗原的抗体。例如在临床样本(Daxboeck等2003)中检测肺炎支原体(M.Pneumoniae)，使用不同的抗体鉴定不同的种属。现有大量商售试剂盒，例如IDEXX实验室(US)，为检测对动物健康具有指征的大量支原体提供了酶联免疫吸附分析(ELISA)。
大多数已知的测验至少需要24小时才能完成，需要昂贵的设备和大量的工作。此外，它们是菌株-特异性测定。均非一般性的，即，都无法一般性地检测支原体种。
英国专利号2357336B描述了可用于检测细胞培养物中支原体的测定法。该测定法基于观察到支原体过度生成了大量的APT酶。支原体的ATP酶活性将大量细胞的或外部加入的ATP转化为ADP，使得ADP可被检测。因此，该测定法基于检测ADP，通过向样品中加入含酶试剂(包含丙酮酸激酶和烯醇丙酮酸磷酸、腺苷酸激酶、甘油激酶、肌激酶的组合；或肌酸激酶(creative kinase)和肌酸磷酸酯(creative phosphate)的组合)而进行检测，该试剂将ADP转化为ATP并使用生物发光反应检测ATP。
该英国专利号2,357,336的公开内容在此引入，包括为了可能的修改内容。
本发明在于提供用于检测样品(比如来自细胞培养物的样品)中支原体的其它方法。
本发明第一方面提供了一种检测测试样品中存在污染性支原体的方法，包括：
(i)提供测试样品；
(ii)检测和/或测量样品中乙酸激酶(acetate kinase)和/或氨基甲酸激酶(carbamate kinase)的活性(B)，所述活性指示了是否存在污染性支原体；以及包括
(iii)基于步骤(ii)中对所述活性的检测和/或测量确定被支原体污染的测试样品。
优选地，该方法在步骤(ii)之后步骤(iii)之前还包括如下步骤：
(iia)获得在相应的对照样品中检测和/或测量的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性信息(A)；以及
(iib)比较在测试样品中检测和/或测量的活性(B)与对照样品(A)中所检测和/或测量的活性。
其中，如果在步骤(ii)中测试样品中检测和/或测量的活性(B)高于步骤(iia)中的对照样品的活性(A)，即，B/A的比值大于1，那么在步骤(iii)中样品被确定为被支原体污染了。
本发明第二次方面提供了一种方法，其中在步骤(ii)中检测和/或测量测试样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性(B)和/或在(iia)中获得相应的对照样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性(A)包括检测和/或测量一种或多种底物和/或一种或多种下列反应产物的出现和/或消失：
优选地，该检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。更优选地，通过光-发射反应尤其是生物发光反应检测和/或测量该ATP。
已知并从许多发光有机体中发现并分离了光-发射体系，这些有机体包括某些细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼、千足虫、蝇、真菌、蠕虫、甲壳动物和甲虫，特别是Photinus、Photuris和Luciola属的萤火虫以及pyrophorus属的叩头虫。在许多这些有机体中，发生酶促催化的氧化还原反应，利用自由能变化将分子激发至高能态。然后，当激发的分子自发回复基态时，发出了可见光。该发射光称为“生物发光”。
甲虫萤光素酶，特别是那些来自萤火虫种(photinus pyralis)的萤光素酶，从最早的研究开始已经用作了解生物发光的范例。P.Pyralis萤光素酶似乎不含辅基或紧密结合的金属离子并具有550个氨基酸，分子量约为60,000道尔顿；该酶以结晶形式已在本领域应用了多年。对涉及萤火虫萤光素酶产生生物发光机理的分子成分研究表明该酶的底物是萤火虫萤光素，一种多杂环有机酸，D-(-)-2-(6′-羟基-2′-苯并噻唑)Δ2-噻唑啉-4-羧酸(除非另有说明，此后被称为“萤光素”)。
ATP可经下面的生物发光反应检测。
发射光的强度与ATP浓度线性相关并可使用发光计测量。
萤光素酶已被用作测定微小浓度的ATP的手段；使用该酶的高质量制剂可检测低至10-16摩尔的ATP。萤光素酶-萤光素反应对于ATP高度特异。例如脱氧-ATP生成的光不到ATP所产生的2％，其它核苷三磷酸酯生成低于0.1％。
结晶态萤光素酶可直接从甲虫的发光器官分离。可以获得编码若干甲虫种萤光素酶(其中包括P pyralis(萤火虫)萤光素酶，P plagiophthalamus(叩头虫)的四种萤光素同工酶、L.cruciata(萤火虫)萤光素酶和L.lateralis萤光素酶)的cDNA(de Wet等，1987，Masuda等，1989，Wood等，1989，欧洲专利申请号0 353 464)。此外，任何编码其它甲虫种(其可生成萤光素酶)的萤光素酶的cDNA可由本领域技术人员使用已知技术方便地得到(de Wet等，1986，Wood等，1989)。通过使用cDNA编码的萤光素酶，就可以直接地从已被转化以表达cDNA的培养的细菌(例如大肠杆菌)、酵母、培养的哺乳动物中分离制备大量高纯形式的萤光素酶。
此外，编码甲虫萤光素酶的cDNA的可用性以及快速筛选编码催化萤光素酶-荧光酶反应的酶的cDNA的能力(参见Wet等，1986，supra，和Wood等，supra)也使得本领域技术人员可以制备并获得大量纯的形式、突变体萤光素酶，这些酶保留了通过萤光素酶-萤光素反应催化生成生物发光的活性。这样的突变体萤光素酶将在一个或多个位点具有不同于天然存在的甲虫萤光素酶氨基酸序列(White等，1996，WO01/31028和WO 00/24878)。在本发明中，术语“萤光素酶”不仅包括甲虫中天然存在的萤光素酶还包括这些天然存在的萤光素酶的突变体，其保留了通过催化萤光素酶-萤光素反应而提供生物发光的活性。
最优选地在本发明的方法中，在步骤(i)之后步骤(ii)之前，处理样品以至裂解任何支原体并从而将它们的细胞内容物释放到样品中。本领域技术人员将理解裂解可通过多种方法实现，包括应用的化学物质比如洗涤剂和机械方法比如(超)声波降解法等。
有利地，通过洗涤剂处理样品或其它裂解法实现裂解，其可裂解支原体细胞膜却不影响可能存在的任何其它细菌的细胞壁。例示性的洗涤剂处理包括使用低浓度(例如0.25％v/v)的洗涤剂比如Triton X100。
优选的裂解法是足以裂解支原体膜但不影响细菌细胞的方法。在比较真核细胞裂解和细菌裂解的研究中，已观察到非离子型洗涤剂(主要是聚乙氧醚)可用于裂解体细胞但不影响微生物细胞(Schramm和Weyens-vanWitzenberg 1989，Stanley 1989)。由于存在刚性细胞壁，使得细菌对洗涤剂裂解较不敏感，需要更加严格的裂解过程裂解细菌细胞。为了有效的裂解并释放全部蛋白，细菌通常需要暴露于酶比如溶菌酶中以破裂细胞壁(Pellegrini等1992)。下文记载了最优选的洗涤剂裂解支原体的条件。
但是，细菌污染将导致浑浊生长，并且当在反向显微镜下观察细胞培养物时可以看到细菌。因此可非常轻易地检测出这些细菌培养物并直接丢弃。
与细菌不同，支原体将穿过用于过滤灭菌的0.45μM过滤器(Baseman和Tully 1997)，并且可能通过增加过滤步骤区别细菌和支原体污染。
因此，在本发明优选的实施方案中，在步骤(i)中，测试样品穿过细菌过滤器。当然，本领域技术人员将认识到如果处理测试样品从而除去细菌，例如通过使其穿过细菌-截留过滤器，就不必进行选择性地裂解支原体，即不再会裂解细菌。
在优选实施方案中，在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。但是，该测定还可利用内源性的ADP。
在优选实施方案中，在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物试剂加入测试样品中，该支原体底物试剂包含：乙酰基磷酸(acetyl phosphate)或其前体和/或氨基甲酰基磷酸(carbamoyl phosphate)或其前体。
“其前体”包括可生成乙酰基磷酸和/或氨基甲酰基磷酸的一种或多种化合物。下面列出了例示性的反应：
Figure G2004800056923D00081
Figure G2004800056923D00083
因此，可以向支原体底物试剂中加入前体比如乙酰-CoA代替乙酰基磷酸。
相似地，可以向支原体底物试剂中加入前体比如瓜氨酸和氨代替氨基甲酰基磷酸。
最优选地在本发明的方法中，在步骤(ii)之前向样品中加入乙酰基磷酸和氨基甲酰基磷酸和/或其前体。这使得可以完成支原体污染的一般性测定，因为支原体利用它们的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶利用底物之一或两者。
可选择地，只使用一种上述底物或其前体可进行更特异的测定。这样的测定对仅应用乙酸激酶或氨基甲酸激酶的一种的支原体是特异的。下表2中列出了柔膜体纲家族(寄生哺乳动物宿主)的一些例子，它们优选利用乙酸激酶、优选氨基甲酸激酶或均优选。出了下面列出的以外，还有经生化研究确定利用同样路径的大量爬行动物、昆虫和植物感染的支原体(Kirchoff等1997，Forsyth等1996，Taylor等1996和Tully等1994)。
表2：支原体通过利用葡萄糖或精氨酸的ATP生成
  种属   优选ATP生成途径   所利用的酶
  猪鼻支原体(M.hyorhinis)   葡萄糖发酵和精氨酸裂解   乙酸激酶/氨基甲酸激酶
  口腔支原体(M.orale)   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  发酵支原体(M.fermentant)   精氨酸裂解和葡萄糖发酵   氨基甲酸激酶/乙酸激酶
  唾液支原体(M.salivarum)   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  种属   优选ATP生成途径   所利用的酶
  精氨酸支原体(M.argin)   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  A.laidlawii   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  U.urealyticum   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  肺炎支原体(M.pneumoniae)   精氨酸裂解和葡萄糖发酵   氨基甲酸激酶/乙酸激酶
  霉状支原体(M.mycoides)   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  关节炎支原体(M.arthritidis)   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  Anaeroplasma sp   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  人型支原体(M.hominis)   精氨酸裂解   氨基甲酸激酶
  A.vituli   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  M.lagogenitaliuin   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  霉状支原体(M.mycoides)   葡萄糖发酵   乙酸激酶
  穿透支原体(M.penetrans)   精氨酸裂解和葡萄糖发酵   氨基甲酸激酶/乙酸激酶
  梨支原体(M.pirum)   精氨酸裂解和葡萄糖发酵   氨基甲酸激酶/乙酸激酶
  M.incognitis   精氨酸裂解和葡萄糖发酵   氨基甲酸激酶/乙酸激酶
最优选地，在本发明所有方面的所有方法中，“相应的对照样品”是经支原体裂解处理和/或加入支原体底物和/或一定时间间隔(例如超过约30分钟)之前的测试样品。在优选实施方案中，针对同一样品、测试样品进行两种活性测试。第一种活性测试(A)在支原体裂解步骤之前或同时进行，然后加入支原体底物和/或一定时间间隔(例如超过约30分钟)后，进行第二次种活性测量(B)。如果B/A值高于1，则测试样品被确定为被支原体污染。
本领域技术人员将理解该“相应的对照样品”还可是预定的阴性对照样品，但这不是优选的。
在一个实施方案中，对照样品已表明未被支原体污染。适宜的操作方法包括如本文所述的PCR测试、DNA荧光染色或培养方法。由此，在一个实施方案中，我们使用“相应的对照样品”表示基本上包含与测试样品中同样物质的样品，但与测试样品不同的是已表明未被支原体污染。本领域技术人员将理解未被支原体污染的情形可经许多已知的方法证实。大量适宜的方法综述于Rottem和Barile 1993，而测试试剂盒和用法概述于Raab等1999。
测试样品和/或对照样品可以是细胞样品，比如细胞培养物样品，尤其是哺乳动物细胞培养物。下表3中列出了一些例子。
表3：已使用该测定法测试的常规培养的细胞系
细胞名称  细胞类型                      提供者/保藏号
K562      人慢性髓性白血病              ECACC 89121407
U937      人组细胞性淋巴瘤              ECACC 87070802
HL-60     人前髓细胞                    ECACC 88112501
Cem-7     人急性T-淋巴母细胞性白血病    ATCC CCL-119
Jurkat    人T-细胞白血病                ECACC 88042803
CHO       中国仓鼠卵巢                  ECACC 85050302
COS-7     猴肾细胞，SV40转化            ECACC 87021302
Vero      非洲绿猴肾细胞                ECACC 84113001
MRC5      人胎肺                        ECACC 84101801
HUVEC     人脐静脉内皮细胞              ECACC 89110702
BSMC      人支气管平滑肌细胞            Cambrex CC-2576
NHEK      正常人表皮角质细胞            Cambrex CC-2503
MCF-7     人乳腺癌                      ECACC 86012803
AoSMC     主动脉平滑肌细胞              Cambrex CC-2571
A549      人肺癌细胞                    ECACC 86012804
HepG2     人肝细胞癌                    ECACC 85011430
FM3A      小鼠乳房癌                    ECACC 87100804
PC12      大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤          ECACC 88022401
ARPE-19   人视网膜色素上皮细胞          ATCC CCL-2302
RT112     人膀胱癌                      ECACC 85061106
其中ECACC代表European Collection of Animal Cell Culture，ATCC代表AmericanTissue Culture Collection，Cambrex代表Cambrex Bio Science Wokingham，UK。
此外，还可测试哺乳动物原代细胞型，加上由组织库例如ATCC和ECACC所保藏的所有那些细胞。
显然，可利用本发明的测定法检测贴壁细胞(例如HepG2、A549、CHO和COS细胞)和培养于悬浮液中的细胞(例如Jurkates、U937、K562和HL-60细胞)培养物中的支原体污染。
优选地，测试样品来自细胞培养物上清液，其先经离心除去细胞物质。但是，也可在存在细胞或细胞碎片存在下进行。
还可用本发明的方法测试不含细胞的样品。例如，本发明的方法尤其适用于不含细胞试剂的测试样品，比如血清(例如胎牛血清)、胰蛋白酶以及其它培养补充物等。表4中列出了可使用此方法测试的常用培养基和补充物的例子。
表4：可使用该测定系统的组织培养基和补充物
 培养基   血清   生长因子   其它组织培养试剂
 RPMI   胎牛   表皮生长因子   胰蛋白酶
 DMEM   新生牛   转化生长因子   胰岛素
 Eagle’s MEM   马   粒细胞集落刺激因子   运铁蛋白
 Glasgow MEM   人   粒细胞-巨噬细胞CSF   胶原
 Ham’s F12   猪   神经生长因子   纤连蛋白
 IMDM   鸡   玻连蛋白
 Medium 199   兔   氨基酸补充物
 McCoy’s 5A   羊   明胶
 杂交瘤   白蛋白
 CHO培养基   胰酶制剂
 胚胎培养基   牛垂体提取物
 Williams Medium E
本发明的第三方面提供了检测测试样品中存在支原体的方法，包括如下步骤：
(i)提供测试样品；
(ii)不加入将ADP转化为ATP的外源性试剂(例如，激酶活性的底物)，使用生物发光反应检测或测量测试样品中ATP以获得ATP和/或光输出测量(A)；
(iii)从相应的对照样品中获得ATP和/或光输出测量(B)；
(iv)比较ATP和/或光输出测量比值B/A；以及
(v)当比值B/A大于1时，确定测试样品被支原体污染了。
如本发明先前的相关方面所提到的，最优选在步骤(ii)之前进行支原体裂解处理和/或加入支原体底物和/或经过一定时间的间隔。
如本发明先前的相关方面所提到的，最优选“相应的对照样品”是测试样品，但其未经支原体裂解处理和/或加入支原体底物和/或搁置了一定时间的间隔(例如长于大约30分钟)。
换言之，两种测量均来自测试样品。因此，在优选的实施方案中，向样品中加入包含洗涤剂和萤光素酶/萤光素加AMP的支原体检测试剂后进行对照ATP和/或光输出测量，加入激酶活性底物(或其前体)后进行测试ATP和/或光输出测量。
本发明的第四方面提供了处理细胞培养物以除去支原体污染的体外方法，包括：使用除去或破坏支原体的试剂处理支原体污染的细胞培养物；随后使用本发明的方法测试来自该培养物的样品的支原体污染；如果需要，重复该过程一次或多次直至在该样品中检测不到支原体污染。
用于细胞培养中的大多数常规抗生素对于支原体无效。另一些试剂显示出抑制活性，这包括硫酸庆大霉素、硫酸卡那霉素和洒石酸泰洛星(www.unc.edu/depts/tcf/mycoplasma.htm)。现有大量商售的处理产品，包括支原体清除剂(ICN-Flow)，喹诺酮抗生素家族的衍生物以及来自MinervaBiolabs(Berlin，Germany)的非-抗生素处理-美国公司Invivogen提供了PlasmocinTM，其含有两种杀菌成分，一种作用于蛋白质合成，另一种抑制DNA复制。已报道四环素和环丙沙星抗生素具有低于80-85％的成功率(www.unc.edu/depts/tcf/mycoplasma.htm)。因此，一旦发生污染，很难从培养物中完全根除支原体。
大多数有效的抗生素是喹诺酮衍生物，不同抗生素的有效性根据所测试支原体的种属而不同。Duffy等2000，考察了肺炎支原体、人型支原体、发酵支原体、生殖道支原体(M.Genitalium)和U.Urealyticum抵抗喹诺酮类吉米沙星的存活力，并与包括四环素、克林霉素和其它喹诺酮等大量抗生素进行了比较。结果表明，尽管各种属间的应答变化较大，但是吉米沙星的表现优于四环素。一些种属因为获得了tetM基因显示了对四环素的耐药性。这是经常发生的，并在取决于支原体源的物种应答中随着变异而复杂化。例如，真核细胞培养物中接触抗生素的支原体与从人或动物来源分离的相同种属具有不同的特性(Taylor-Robinson和Bebear 1997)。尽管报道成功的抗支原体处理显示了高度可变性，最近Uphoff等2002的研究报道96％的白血病-淋巴瘤细胞系经所试验的至少一种方法处理导致其不含支原体。
现将参考附图描述具体表现本发明各方面的例子，其中：
附图1：存在猪鼻支原体(M.Hyorhinis)污染时ATP生成的动力学。
附图2：购自Stratagene的PCR试剂盒与本发明优选实施方案的比值的比较。
附图3：使用根据本发明优选实施方案的支原体除去剂处理污染的细胞系。
附图4：细胞、上清液和通过0.45μm(F1)、0.22μm(F2)和0.1μm(F3)过滤器过滤的上清液的比值。
附图5：上清稀释液的结果。
附图6：7900CFUs/孔的发酵支原体，对于不同底物进行的测试。
附图7：以1450CFUs/孔储备的口腔支原体，对于不同底物进行的测试。
附图8：口腔支原体储备稀释液显示了对该测定的灵敏度。
附图9：猪鼻支原体与不同的底物试剂的比较。
附图10：在感染猪鼻支原体(MH)和口腔支原体(MO)的K562细胞中Triton-X100的浓度对检测支原体酶活性的作用。
附图11：表明了与增加细菌细胞(大肠杆菌)的数目(1-10,000个细胞/100μl样品)相比，Triton-X100的浓度增加对受猪鼻支原体(MH)污染的K562细胞的作用。
实施例1：本发明的测定方法
优选测定方法的原理是为支原体酶提供适当的底物。如果存在支原体污染，就可优选通过萤光素酶-萤光素反应测量ADP向ATP的转化。
加入支原体检测试剂(Mycoplasma Detection Reagent)，大约5分钟后，进行初始的光输出读数(A)，加入支原体底物(MS)并允许任何的酶促反应进行大约10分钟，此时进行第二次光读数(B)。
如果存在支原体污染，那么与第一次读数(A)相比第二次读数(B)将更高，比值B/A大于1。如果培养物是阴性的(未被支原体污染)，那么比值B/A将为1或更通常低于1，因为随着时间推移经常观察到发光光信号的衰退。附图1说明了反应的动力学。典型地，所观察到的支原体污染的比值B/A远高于1，例如附图1所示的比值为114。
本发明优选的测试试剂盒包含支原体检测试剂(MDR)；用于重构MDR的支原体测定缓冲液(MAB)和支原体底物(MS)。MDR和MS优选以冻干制剂提供。
所有支原体或者通过乙酸激酶途径或者通过氨基甲酸激酶途径产生ATP。本发明的支原体底物包括用于这两种酶促反应中的一种或两种的底物。两种酶均需要ADP，并优选在本发明的支原体检测试剂中过量提供以促使ATP的形成。
尽管可以在细胞存在下进行测定，将MDR加至已经经离心除去细胞物质的培养物上清液样品中。或者或其它地，该测试样品可经细菌过滤器过滤。
MDR包括萤光素酶底物、萤光素和其它辅因子以及AMP和ADP。支原体底物(MS)包括为检测氨基甲酸和/或乙酸激酶活性所必需的氨基甲酰基磷酸和/或乙酰基磷酸或其前体。
优选样品体积是100μl，向其中加入100μl的重构MDR。大约5分钟后进行第一次发光读数(A)，这给出了基础读数，基于其上进一步确定比例计算值B/A。
本发明的测试方法已用于研究莱氏无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)、猪鼻支原体、发酵支原体、口腔支原体和生殖道支原体(M.genitalium)污染并检测了大量未知的支原体感染。
本发明人已将他们的数据与PCR检测支原体进行了比较，并表明大于1的比值与支原体DNA检测之间相关。这一相关关系示于表2中，其中凝胶上阳性PCR带与大于1的比值相关。
实施例2：将本发明的方法用于从细胞培养物中除去支原体污染的过程
本发明人还表明了当细胞经示例性支原体除去剂(ICN-Flow)(其是喹诺酮家族抗生素的衍生物)处理时可检测比值B/A的降低。
制造商(ICN-Flow)推荐处理检疫细胞7天以确保完全除去污染的支原体。但是，使用本发明测定方法所得比值显示7天并不足够。根据该比值仍高于1这一事实可明显地得出这一结论。停止处理之后继续培养，该比值增加，经PCR测试(Stratagene试剂盒)后该培养物再次为阳性。这些数据示于附图3中，其中发现了三种不同细胞系被猪鼻支原体污染。
虽然K562和U937细胞是悬浮细胞系，但A549细胞是贴壁细胞型；因此这些数据证明了该测定可用于贴壁细胞型也可用于悬浮细胞型。这也在附图2中得到证明，其中CHO和COS-7细胞是通常用于细胞培养实验室中的贴壁细胞型。
附图3还表明使用MRA处理COS-7和CHO细胞培养物10天足以除去污染的支原体。
实施例3：细菌过滤器无法除去支原体
本发明人还表明了培养上清液通过大量的细菌截留过滤器后仍表现阳性比值，后者预示了活性支原体的存在。结果示于附图4中。
支原体可形成直径为600μm大小的菌落，也可作为0.15μm大小的单细胞存在于它们的细胞周期中。由于它们较小，支原体可穿过通常用于“灭菌”组织培养试剂的0.45μm和0.22μm的过滤器。附图4还证明了该测定可在细胞存在下进行，但测试灵敏度降低。因此，优选本发明的测定方法针对基本上不含细胞的样品进行。可通过离心细胞培养物并抽取上清液样品方便地获得该样品，任选地，可经细菌过滤器过滤。
实施例4：优选测定的灵敏度
如附图5和8所示，上清稀释液显示了该测定的灵敏度，受污染的培养物上清液的1∶1000稀释液仍给出了高于1的比值。取决于不同支原体(柔膜体纲)种属中乙酸激酶和氨基甲酸酶的特定活性，可进一步稀释样品。稀释的范围还可根据测试样品中菌落形成单位的数目变化。
实施例5：本发明测定方法的变化
本发明的测定方法无需加入外来异源性的氨基甲酸和乙酸激酶的底物，这些底物为ADP、氨基甲酰基磷酸和乙酰基磷酸或其前体。在污染的培养样品中，乙酰基磷酸和氨基甲酰基磷酸或其前体将与足够的来源于细胞培养物的细胞ADP一起内源性地存在，促使形成ATP的反应。或者，可通过其它外来加入的或细胞内的酶即腺苷酸激酶利用ATP和AMP产生ADP。
可能避免直接加入这些底物，而使体系自身产生它们。利用乙酸盐和氨以及ATP将促使乙酸激酶和氨基甲酸激酶产生乙酰基磷酸和氨基甲酰基磷酸，其然后又可被相同的酶用于由ADP产生ATP。
还可利用稍早部分的葡萄糖发酵和精氨酸水解(argentine lysis)途径从“前体”产生这两种底物，例如加入可被支原体酶利用的乙酰-CoA和瓜氨酸分别合成乙酰基磷酸和氨基甲酰基磷酸。
Figure G2004800056923D00173
Figure G2004800056923D00174
后面的附图表明了发酵支原体生化活性之间的差异，其优选通过氨基甲酸激酶途径产生ATP，但也将利用乙酸激酶途径。附图6表明了针对不同酶途径加入各自底物以及随后应用组合试剂的作用。
发酵支原体利用两种途径，但口腔支原体仅利用氨基甲酸激酶途径，如附图7所示，仅在单一的氨基甲酸试剂或组合试剂中观察到阳性比值。附图8表明口腔支原体的检测限低至14CFU/孔。
本发明人还考察了优选利用乙酸激酶途径的支原体，该支原体被称为猪鼻支原体。数据示于附图9中。
本发明人还测试了超过15种不同的细胞系(参见表3)，并表明这些细胞均不具有足够的背景酶促活性以影响比值并给出假阳性结果。本发明人，不希望受限于理论，认为其原因在于该途径是厌氧的，所有哺乳动物细胞培养物将通过氧化性作用的磷酸化产生ATP。因此，仅通过使用氨基甲酰基磷酸或其前体或者仅乙酰基磷酸或其前体，可采用本发明的测定方法以允许确定待测支原体污染是来自利用乙酸激酶途径的组、氨基甲酸激酶途径的组或利用两者的组。这可具有有利的诊断应用。
只具有乙酸激酶活性的细菌不是通常被视为细胞培养污染的那些细菌，可能的例外是实验室中处理的某些大肠杆菌种，主要是为了生物学的目的。但是，这些有机体的活性仅在接种体浓度非常高时才可观察到，其中出现浑浊生长并可轻易地通过肉眼观察到样品的出现的浑浊。因此，如果需要，可改变本发明的方法以包括起始筛选细菌污染的步骤。这可通过许多方法实现，但优选通过标准细菌过滤器过滤样品而实现(Baseman和Tully，1997)。
实施例6：用于本发明的支原体测定方法和试剂盒的优选试剂组成
1.支原体检测剂(MDR)每100ml
·乙酸镁              214.5mg(10mM)
·无机焦磷酸盐        178.4μg(4μM)
·牛血清白蛋白        160mg(0.16％)
·D-萤光素            10mg(360μM)
·L-萤光素            250μg(8.9μM)
·萤光素酶(RY)        85μg
·ADP                 250.5μg(5μM)
·ATP                 69.44mg(2mM)
*RY是由Lucigen提供的重组萤光素酶的名称。已发现D和L-萤光素的混合物较单独D-萤光素给出了更稳定的光输出。
2.支原体底物(MS)每100ml
·乙酰基磷酸          55.23(3mM)
·氨基甲酰基磷酸      45.87(3mM)
支原体底物(Ms)前体
产生乙酰基磷酸或氨基甲酰基磷酸的反应例子：
优选的浓度范围：
乙酰-CoA              0.1mM至100mM
无机磷酸盐            0.1mM至100mM
(例如磷酸钾)
优选的浓度范围：
瓜氨酸                1mM至100mM
碳酸氢铵              1mM至200mM
优选的浓度范围：
乙酸盐(例如钠或钾)    1mM至500mM
ATP                   0.1mM至100mM
优选的浓度范围：
碳酸氢铵              1mM至200mM
ATP                   0.1mM至100mM
供应商
Sigma-Aldrich Company Ltd.
Fancy Road
Poole
Dorset
BH12 4QH
United Kingdom
3.支原体测定缓冲液(MAB)每100ml
·HEPES           1.1915g(50mM)
·EDTA            74.44mg(2mM)
·Triton X-100    250μl(0.25％)
·pH7.50
用于本发明的支原体测定方法和试剂盒的组分的优选浓度范围
优选浓度范围包括
·ADP 1μM至100mM，优选1至100μM，更优选5μM。
·AMP 1μM至100mM，优选0.1mM至100mM，更优选2mM。
·乙酰基磷酸1μM至100mM，优选0.1mM至20mM，更优选3mM。
浓度高于10减少了光输出，但仍可进行测定。
·氨基甲酰基磷酸1μM至100mM，优选0.1mM至20mM，更优选3mM。
实施例7：洗涤剂对支原体测定的作用
破裂活的支原体的细胞膜以允许酶释放入样品是本发明测定方法的优选实施方案。这使得与底物结合并生成ATP。但是，阳性比值预示了可不进行任何裂解处理而显示出支原体污染。这暗示了这些酶可由活的支原体释放。其它的可能性是一些非活性有机体通过天然裂解释放它们的内容物。
加入即使低浓度的非离子型洗涤剂Triton-X100，保证了氨基甲酸和乙酸激酶向样品内的最大释放，从而很大地提高了测试的灵敏度。
下述试验的目的在于测定Hepes-EDTA缓冲液中Triton-X100的浓度对于所观察到的支原体污染的K562细胞培养物的比值的影响。考察了两种有机体-猪鼻支原体和口腔支原体。
附图10表明可在不含洗涤剂裂解步骤的情况下检测支原体酶。还表明了浓度高于4-5％时光输出下降，这是因为洗涤剂对萤光素酶/反应的副作用。但是在浓度高达20％(v/v)时仍可检测阳性活性。
本发明人还表明了上述试验中使用的Triton-X100浓度不引起来自大肠杆菌株JM109细胞的任何可检测的氨基甲酸或乙酸激酶活性。
上述结果证实没有与所用的细菌细胞数目有关的阳性比率。将Triton-X100浓度提高到已报道的裂解细菌细胞(1-2％)的水平，仍没有导致高于1的阳性比率。
一般地，生物洗涤剂通常用于破裂脂质双极性膜从而释放并随后溶解膜结合蛋白。非-离子型洗涤剂为非-变性的并可增溶膜而不干扰生物活性。原则上，它们主要用于研究蛋白构象和分离亲水蛋白与跨膜疏水蛋白。阴离子和阳离子洗涤剂导致蛋白结构的较大改变并可有效地破坏蛋白质聚集。两性离子洗涤剂也是低-变性的，但可有效地破坏蛋白质聚集。
这些不同组的洗涤剂已与大量不同的细胞类型进行了研究，以有效地裂解并释放和保存真核和原核有机体的蛋白内容物。
对于本发明的优选测定，所需的裂解剂是导致支原体膜破裂并允许与底物反应所需的代谢酶释放的裂解剂。由于没有除去洗涤剂或中和的步骤，因此所选择的体系不妨碍氨基甲酸和/或乙酸激酶的活性或萤光素酶/萤光素/ATP反应是很重要的。还优选使用选择性引起支原体裂解的体系，对于可能是细胞培养物/样品的潜在污染的细菌具有很少或没有作用。
但是，通过0.45μm过滤器的过滤步骤将除去任何较大的污染性微生物。
支原体与细菌的关键差别在于不含细胞壁，正是由于细菌细胞壁使得细菌更难于裂解。有许多导致完全裂解的相当剧烈的方法，包括压力(FrenchPress)和声裂法。其它酶消化方法包括加入溶菌酶后加入洗涤剂。但是，支原体可被浓度约1-2％的Triton-X100裂解。
低浓度的其它非离子型洗涤剂比如35(0.4％)(Sigma-AldrichCompany Ltd)和B-PER(1％)(Perbio Science UK Ltd)，对于萤光素酶没有副作用，并可破裂支原体膜，对于萤光素酶反应没有不利影响。这些洗涤剂浓度可高达10％而不丧失支原体检测的敏感度。
污染性支原体可在不存在破裂支原体膜的裂解步骤时被检测。但是，增加轻微的裂解步骤(0.25％Triton X-100的Hepes-EDTA缓冲液)提高了该测定的灵敏度，因为将有关的支原体酶释放到反应混合物中了。
该裂解步骤将优选导致支原体的选择性裂解，而对细菌细胞影响较小或没有影响。低浓度的大多数非-离子型洗涤剂应具有此作用。但是，过滤步骤将物理除去任何污染性细菌，并允许应用任何洗涤剂但优选使用不抑制萤光素酶反应或氨基甲酸激酶和乙酸激酶活性的那些洗涤剂。
实施例8：优选试剂盒目录
LT07-118(足够10次测试用)
1.LT27-217支原体检测试剂，冻干的。2×600μl小瓶。
2.LT27-218支原体测试缓冲液。1×10ml瓶。
3.LT27-221支原体底物。冻干的。2×600μl小瓶。
LT07-218(足够25次测试用)
1.LT27-217支原体检测试剂，冻干的。5×600μl小瓶。
2.LT27-218支原体测试缓冲液。1×10ml瓶。
3.LT27-221支原体底物。冻干的。5×600μl小瓶。
LT07-318(足够100次测试用)
1.LT27-216支原体检测试剂，冻干的。1×10ml小瓶。
2.LT27-220支原体测试缓冲液。1×20ml瓶。
3.LT27-224支原体底物。冻干的。1×10ml小瓶。
用于本发明试剂盒和方法的优选试剂组成
1.支原体检测试剂(MDR)每100ml
·乙酸镁1              214.5mg(10mM)
·无机焦磷酸盐1        178.4g(4μM)
·牛血清白蛋白1        160mg(0.16％)
·D-萤光素2            10mg(360μM)
·L-萤光素2            250μg(8.9μM)
·萤光素酶(RY)3        85μg
·ADP1                 250.5μg(5μM)
·AMP1                   69.44mg(2mM)
2.支原体底物(MS)每100ml
·乙酰基磷酸1            55.23mg(3mM)
·氨基甲酰基磷酸1        45.87mg(3mM)
3.支原体测试缓冲液(MAB)每100ml
·HERPES1                1.1915g(50mM)
·EDTA1                  74.44mg(2mM)
·Triton X-1001          250μl(0.25％)
·pH 7.50
优选的浓度范围：
·ADP1μM至100mM
·AMP1μM至100mM
·乙酰基磷酸1μM至100mM，优选地，mM至10mM
·氨基甲酰基磷酸1μM至100mM。
提供商
1.
Sigma-Aldrich Company Ltd.
Fancy Road
Poole
Dorset
BH 12 4QH
United Kingdom
2.
Resem BV
Goudenregenstraat 84
NL-4131BE Vanen
Netherlands
3.
Lucigen Ltd
Porton Down Science Park
Porton，Salisbury
Wiltshire SP4 0JQ
U.K.
本发明优选的实施方案提供了一种选择性生化测试，该测试利用了某些支原体酶的活性。这些酶的存在提供了快速筛选方法，使得可灵敏地检测测试样品中的污染性支原体。活的支原体被裂解且酶与支原体底物反应催化ADP向ATP的转化。
在加入支原体底物之前(A)和之后(B)测量样品中ATP的水平，可得到B/A比值，其是支原体存在或不存在的指征。如果这些酶不存在，第二次读数较第一次(A)不显示增加，而支原体的酶与支原体底物中的特异性底物相反应导致ATP水平升高。可使用如下的生物发光反应检测ATP的增加。
Figure G2004800056923D00241
该发射光的强度与ATP的浓度线性相关并可使用发光计测量。该测定优选在环境室温(18-22℃)下进行，该温度最适于萤光素酶的活性。
如果B/A高于1＝支原体污染的样品。
如果B/A为1或更低＝不含支原体的样品。
方法概述
优选对培养物上清液离心以除去细胞且，任选地，在进行该测定前通过细菌过滤器。
试剂盒包含进行该测定所需的所有试剂。
取100μl的培养物上清液作为样品。
加入支原体检测试剂(MDR)
等待5分钟
读数发光(A)
加入支原体底物(MS)
等待10分钟
读数发光(B)。
试剂重构和储存
确保使用了可用于相关试剂盒(10、25或100个测定点)的正确的重构试剂。
该过程通常需要至少15分钟的平衡时间。
支原体检测试剂(MDR)和支原体底物(MS)优选以冻干小球提供。将其在支原体测定缓冲液(MAB)中重构以产生用于测定的工作液。
对于10次测试(KIT LT07-118)：
1.支原体检测试剂的制备
将600μl支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体检测试剂的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
2.支原体底物的制备
将600μl支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体底物的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
3.支原体测定缓冲液
优先地以备用状态提供。不用时于2-8℃储存。
对于25次测试(KIT LT07-218)
1.支原体检测试剂的制备
将600μl支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体检测试剂的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
2.支原体底物的制备
将600μl支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体底物的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
3.支原体测定缓冲液
优先地以备用状态提供。不用时于2-8℃储存。
对于100次测试(KIT LT07-318)
1.支原体检测试剂的制备
将10ml支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体检测试剂的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
2.支原体底物的制备
将600μl支原体测定缓冲液加入包含冻干的支原体底物的小瓶中。
重新盖上盖子并轻微混合。
允许该试剂在室温下平衡15分钟。
3.支原体测定缓冲液
优先地以备用状态提供。不用时于2-8℃储存。
设备
1.仪器
该试剂盒需要使用发光计。应评价发光计的参数和所应用的条件从而形成该机器的正确程序。
本发明的优选测定已被设计使用样品池/试管发光计。关于平板发光计的应用请参见下文。
样品池/试管发光计：
读数时间1秒(积分)
2.其它设备和耗材
a.10ml无菌吸液管
b.发光计样品池
c.微量移液管-50-20μl；200-1000μl
d.台式离心机
优选流程
请注意应在任何进一步的处理步骤(例如胰蛋白酶化)之前取出培养基样品。
1.在应用前使所有试剂达到室温。
2.重构含支原体检测试剂和支原体底物的支原体测定缓冲液。室温静置15分钟以确保完全再水合。
3.将2ml细胞培养物或培养物上清液转移至离心管中并于1500rpm(200×g)离心以沉淀任何细胞。
4.将100μl澄清上清液转移至发光计样品池/试管中。
5.对发光计编程进行1秒钟的积分读数(这通常是大多数样品池发光计的默认设置)。
6.将100μl支原体检测剂加入各样品中并等待5分钟。
7.将样品池置于发光计中并开启程序(读数A)。
8.将100μl支原体底物加入各样品中并等待10分钟。
9.将样品池置于发光计中并开启程序(读数B)。
10.计算比值＝读数B/读数A
结果的解释
读数B与读数A的比值用于确定细胞培养物是否被支原体污染。
根据本发明的试剂盒所提供的迅速和方便意味着其提供了筛选培养物中存在的支原体的独特方法。由此其理想地适于常规测试培养细胞。经常使用本发明的测试方法将显示当细胞系被感染时可进行快速的补救行动。本发明的测试方法还可扩展用于引入的细胞系和完全培养基的常用成分。
在各试验情形之内，所获得的不同比值的解释可根据细胞的类型和所应用的条件而不同。但是，该测试对于未感染的培养物给予的比值B/A不大于1。被支原体感染的细胞将照例产生高于1的比值。
表a.测定结果解释：说明健康和受感染的细胞系的例子
  细胞系   支原体比值   结论
  受感染的细胞
  K562   123.26   阳性
  K549   4.10   阳性
  细胞系   支原体比值   结论
  U937   8.26   阳性
  HepG2   1.27*   边线，在24小时内隔离并重复测试
  健康细胞
  HL60   0.72   阴性
  COS-7   0.46   阴性
平板发光计流程
1.在应用前使所有试剂达到室温。
2.重建含支原体检测试剂和支原体底物的支原体测定缓冲液。室温静置15分钟以确保完全再水合。
3.将2ml细胞培养物或培养物上清液转移至离心管中并于1500rpm(200×g)离心沉淀任何细胞。
4.将100μl澄清上清液转移至与发光计兼容的平板中。
5.对发光计编程进行1秒钟的积分读数。
6.将100μl支原体检测剂加入各样品中并等待5分钟。
7.将平板置于发光计中并开启程序(读数A)。
8.将100μl支原体底物加入各样品中并等待10分钟。
9.将平板置于发光计中并开启程序(读数B)。
10.计算比值＝读数B/读数A
处理任何试剂时应高度小心。皮肤表面具有高水平的ATP，其可污染试剂导致错误的高读数。乳胶手套可避免此问题。
各试剂的最佳工作温度为22℃。如果已被冷冻，在使用前应留有使它们达到室温的时间。
该测定的灵敏度也允许检测隐蔽的污染，如果比值稍高于1(例如高达1.3)，建议重新测试该样品。任何检疫中的培养物可在进一步培养24-48小时后进行测试，以观察比值是否提高了。
总结
本发明的测定可在存在细胞或不存在细胞时进行。与已知的支原体检测体系不同，该测定允许使用廉价手持发光计体系快速筛选样品，并可在15分钟内给出结果从而允许对于受污染样品的适当处理。
PCR和DAPE/Hoechst染色，将与所有DNA结合，这些DNA来自活的或死亡的支原体。因此，如果想要处理和除去支原体，当使用PCR/DNA染色时即使支原体已被杀死，仍将获得假阳性结果。
本测定可检测活的支原体，而已知方法比如PCR无法区别活的和死亡的支原体。
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Claims (118)

1.一种检测测试样品中存在污染性支原体的方法，包括：
(i)提供测试样品；
(ii)检测和/或测量该测试样品中乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性B，所述活性指示存在污染性支原体；以及
(iii)基于步骤(ii)中对所述活性的检测和/或测量确定测试样品被支原体污染。
2.根据权利要求1的方法，在步骤(ii)之后步骤(iii)之前还包括进行如下步骤：
(iia)获得在相应的对照样品中检测和/或测量的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性信息A；以及
(iib)比较在测试样品中检测和/或测量的活性B与对照样品中所检测和/或测量的活性A；
其中，如果在步骤(ii)中所检测和/或测量的测试样品的活性B高于步骤(iia)中的对照样品的活性A，即，B/A的比值大于1，那么在步骤(iii)中该测试样品被确定为被支原体污染。
3.根据权利要求1的方法，其中在步骤(ii)中检测和/或测量的测试样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性B和/或在步骤(iia)中获得相应的对照样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性A包括检测和/或测量下列反应的一种或多种底物和/或一种或多种产物的出现和消失：
Figure F2004800056923C00012
4.根据权利要求2的方法，其中在步骤(ii)中检测和/或测量的测试样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性B和/或在步骤(iia)中获得相应的对照样品的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性A包括检测和/或测量下列反应的一种或多种底物和/或一种或多种产物的出现和消失：
Figure F2004800056923C00022
5.根据权利要求1的方法，还包括在步骤(i)之后步骤(ii)之前进行的使用支原体裂解试剂处理测试样品从而将支原体细胞内容物释放到样品中的步骤。
6.根据权利要求2的方法，还包括在步骤(i)之后步骤(ii)之前进行的使用支原体裂解试剂处理测试样品从而将支原体细胞内容物释放到样品中的步骤。
7.根据权利要求3的方法，还包括在步骤(i)之后步骤(ii)之前进行的使用支原体裂解试剂处理测试样品从而将支原体细胞内容物释放到样品中的步骤。
8.根据权利要求5的方法，其中裂解试剂为洗涤剂。
9.根据权利要求8的方法，其中洗涤剂裂解处理不能裂解细菌细胞。
10.根据权利要求5的方法，其中相应的对照样品与支原体裂解处理之前的测试样品相同。
11.根据权利要求8的方法，其中相应的对照样品与支原体裂解处理之前的测试样品相同。
12.根据权利要求9的方法，其中相应的对照样品与支原体裂解处理之前的测试样品相同。
13.根据权利要求2的方法，其中相应的对照样品与测试样品相同，但在获得对照样品的检测/测量信息一段时间间隔之后进行样品活性信息的检测/测量。
14.根据权利要求3的方法，其中相应的对照样品与测试样品相同，但在获得对照样品的检测/测量信息一段时间间隔之后进行样品活性信息的检测/测量。
15.根据权利要求5的方法，其中相应的对照样品与测试样品相同，但在获得对照样品的检测/测量信息一段时间间隔之后进行样品活性信息的检测/测量。
16.根据权利要求15的方法，其中时间间隔至少为30分钟。
17.根据权利要求1的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
18.根据权利要求2的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
19.根据权利要求3的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
20.根据权利要求5的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
21.根据权利要求8的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
22.根据权利要求9的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
23.根据权利要求10的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
24.根据权利要求13的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
25.根据权利要求16的方法，其中检测和/或测量步骤包括检测和/或测量ATP。
26.根据权利要求17的方法，其中通过光-发射反应检测和/或测量ATP。
27.根据权利要求26的方法，其中光发射反应是生物发光反应。
28.根据权利要求1的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
29.根据权利要求2的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
30.根据权利要求3的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
31.根据权利要求5的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
32.根据权利要求8的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
33.根据权利要求9的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
34.根据权利要求10的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
35.根据权利要求13的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
36.根据权利要求16的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
37.根据权利要求17的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
38.根据权利要求26的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
39.根据权利要求27的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将ADP加入测试样品中。
40.根据权利要求1的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
41.根据权利要求2的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
42.根据权利要求3的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
43.根据权利要求5的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
44.根据权利要求8的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
45.根据权利要求9的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
46.根据权利要求10的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
47.根据权利要求13的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
48.根据权利要求16的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
49.根据权利要求17的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
50.根据权利要求26的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
51.根据权利要求27的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
52.根据权利要求28的方法，其中在检测和/或测量步骤(ii)之前将支原体底物(MS)试剂加入测试样品中，该MS试剂包括：乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体。
53.根据权利要求40的方法，其中乙酰基磷酸前体是乙酰-CoA。
54.根据权利要求40的方法，其中氨基甲酰基磷酸前体是瓜氨酸和/或氨。
55.根据权利要求28的方法，其中对照样品是没有加入支原体试剂的测试样品的全部或部分。
56.根据权利要求40的方法，其中对照样品是没有加入支原体试剂的测试样品的全部或部分。
57.根据权利要求53的方法，其中对照样品是没有加入支原体试剂的测试样品的全部或部分。
58.根据权利要求54的方法，其中对照样品是没有加入支原体试剂的测试样品的全部或部分。
59.根据权利要求2至12或16至58任一项的方法，其中通过单独的方法表明对照样品不含支原体。
60.根据权利要求59的方法，其中通过一种或多种PCR测试、DNA荧光染色或支原体培养方法表明对照样品不含支原体。
61.根据权利要求1～58中任一项的方法，其中测试样品和/或对照样品是细胞-培养样品。
62.根据权利要求59的方法，其中测试样品和/或对照样品是细胞-培养样品。
63.根据权利要求60的方法，其中测试样品和/或对照样品是细胞-培养样品。
64.根据权利要求61的方法，其中细胞-培养样品中的细胞是哺乳动物细胞。
65.根据权利要求64的方法，其中哺乳动物细胞为贴壁细胞。
66.根据权利要求65的方法，其中贴壁细胞为Vero、MRC5、HUVEC、BSMC、NHEK、MCF-7、AoSMC、A549、HepG2、FM3A、PC12、ARPE-19、CHO和COS细胞，和/或从动物源分离的贴壁原生代细胞。
67.根据权利要求61的方法，其中细胞-培养样品中的哺乳动物细胞以悬浮方式生长。
68.根据权利要求67的方法，其中所述的哺乳动物细胞为K562、U937、HL-60、Cem-7以及Jurkats以及原生代细胞类型。
69.根据权利要求68的方法，其中所述的原生代细胞类型为白血病母细胞。
70.根据权利要求61的方法，其中细胞培养物是植物细胞的培养物。
71.根据权利要求61的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
72.根据权利要求64的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
73.根据权利要求65的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
74.根据权利要求66的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
75.根据权利要求67的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
76.根据权利要求68的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
77.根据权利要求69的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
78.根据权利要求70的方法，其中细胞培养样品来自细胞培养物的样品但其自身不含细胞物质。
79.根据权利要求1至58任一项的方法，其中测试样品和/或对照样品由不含细胞的试剂组成。
80.根据权利要求59的方法，其中测试样品和/或对照样品由不含细胞的试剂组成。
81.根据权利要求60的方法，其中测试样品和/或对照样品由不含细胞的试剂组成。
82.根据权利要求79的方法，其中不含细胞的试剂是胰蛋白酶。
83.一种处理细胞培养物以除去支原体污染的方法，包括：使用除去或破坏支原体的试剂处理支原体污染的细胞培养物；随后利用权利要求1～82中任一项的方法检测来自支原体污染的培养物的样品；如果需要，重复该过程一次或多次直至在该样品中检测不到支原体污染。
84.一种检测测试样品中存在支原体的方法，包括如下步骤：
(i)提供测试样品；
(ii)在不加入将ADP转化为ATP的外源性试剂条件下，通过利用生物发光反应检测或测量测试样品中的ATP来检测和/或测量测试样品中的乙酸激酶和/或氨基甲酸激酶的活性，以获得ATP和/或光输出测量A；
(iii)从相应的对照样品中获得ATP和/或光输出测量B；
(iv)比较ATP和/或光输出测量比值A/B；以及
(v)当比值A/B大于1时，确定测试样品被支原体污染。
85.根据权利要求1～58中任一项的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
86.根据权利要求60的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
87.根据权利要求61的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
88.根据权利要求64的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
89.根据权利要求65的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
90.根据权利要求66的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
91.根据权利要求67的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
92.根据权利要求68的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
93.根据权利要求69的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
94.根据权利要求70的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
95.根据权利要求71的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
96.根据权利要求79的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
97.根据权利要求82的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
98.根据权利要求83的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
99.根据权利要求84的方法，其中该方法包括使测试样品通过截留细菌细胞的过滤器的步骤。
100.乙酰基磷酸或其前体；和/或氨基甲酰基磷酸或其前体在如权利要求40至99所述的检测样品被支原体污染的方法中的应用。
101.用于根据权利要求1的方法检测支原体污染的试剂盒，其包括：
(i)乙酰基磷酸或其前体和/或氨基甲酰基磷酸或其前体；
(ii)驱动酶促反应向ATP形成方向进行的过量的ADP；
(iii)一种或多种用于裂解支原体的试剂。
102.根据权利要求101的试剂盒，其中用于裂解支原体的试剂包括洗涤剂。
103.根据权利要求101的试剂盒，还包含通过光发射反应检测和/或测量ATP的试剂。
104.根据权利要求102的试剂盒，还包含通过光发射反应检测和/或测量ATP的试剂。
105.根据权利要求103的试剂盒，其中所述试剂包括支原体检测试剂MDR，其包括乙酸镁、无机焦磷酸盐、牛血清白蛋白、萤光素、萤光素酶、ADP和AMP。
106.根据权利要求101至105任一项的试剂盒，其中试剂以冻干态提供。
107.根据权利要求101至105任一项的试剂盒，其进一步包括支原体测定缓冲液MAB，可将冻干试剂重构于其中。
108.根据权利要求106的试剂盒，其进一步包括支原体测定缓冲液MAB，可将冻干试剂重构于其中。
109.根据权利要求107的试剂盒，其中缓冲液维持在pH7.5。
110.根据权利要求103的试剂盒，进一步包含发光计。
111.根据权利要求105的试剂盒，进一步包含发光计。
112.根据权利要求110的试剂盒，所述的发光计是手持式发光计。
113.根据权利要求101至105任一项的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
114.根据权利要求106的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
115.根据权利要求107的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
116.根据权利要求109的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
117.根据权利要求110的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
118.根据权利要求112的试剂盒，进一步包含细菌过滤器。
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