KR101162738B1 - 아세테이트 키나아제 또는 카르바마 키나아제 활성을측정함으로써 마이코플라스마의 검출 분석법 - Google Patents

아세테이트 키나아제 또는 카르바마 키나아제 활성을측정함으로써 마이코플라스마의 검출 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 단계를 포함하는 시험 시료에서 마이코플라스마의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다: (i) 시험 시료를 제공하는 단계; 및 (ii) 시험 시료에서 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제의 활성을 검출 및/또는 측정하는 단계로서, 상기 활성은 마이코플라스마에 의한 오염의 표시이다.

Description

아세테이트 키나아제 또는 카르바마 키나아제 활성을 측정함으로써 마이코플라스마의 검출 분석법{Assay for detecting mycoplasma by measuring acetate kinase or carbama kinase activity}
본 발명은 세포 배양물 유래의 시료와 같은 시험 시료를 오염시키는 몰리큐테스(Mollicutes) 과(family)의 멤버를 검출하는 분석법 및 물질에 관한 것이다.
분류학적으로, 세포벽의 결핍은 몰리큐테스라 명명된 강(class)에서 기타 박테리아로부터 몰리큐테스를 분리하기 위해 이용되어 왔다 (Razin et al 1998). 상기 강의 멤버는 하기 표 1에 요약된다.
몰레큐테스 강의 주요 특성 및 분류학
분류 종 숫자 게놈 크기
(kb)		 게놈의 G+C 몰% 서식 환경
목 I: 마이코플라스마탈레스(Mycoplamatales)
과 I: 마이코플라스마타세아에(Mycoplamataceae)
속 I: 마이코플라스마(Mycoplama)
속 II: 우레아플라스마(Ureaplasma)



102

6



580-1350

760-1170



23-40

27-30



인간, 동물

인간, 동물
목 II: 엔토플라스마탈레
스(Entoplasmatales)
과 I: 엔토플라스마타세
아에(Entoplasmataceae)
속 I: 엔토모플라스마
(Entomoplasma)
속 II: 메소플라스마
(Mesoplasma)



5

12



790-1140

870-1100



27-29

27-30



곤충, 식물

곤충, 식물
과 II: 스피로플라스마타세아에(Spiroplasmataceae)
속 I: 스피로플라스마
(Spiroplasma)


33


780-2220


24-31


곤충, 식물
목 III: 아콜레플라스마탈레스(Acholeplasmatales)
과 I: 아콜레플라스마타세아에(Acholeplasmataceae)
속: 아콜레플라스마
(Acholeplasma)




13




1500-1650




26-36




동물, 일부 식물, 곤충
목 IV: 아내로플라스마탈레스(Anaeroplasmatales)
과: 아내로플라스마타세
아에(Anaeroplasmataceae)
속 I: 아내로플라스마
(Anaeroplasma)
속 II: 아스테로플라스마(Asteroplasma)



4

1



1500-1650

1500



29-34

40



소/양 혹위

소/양 혹위
규명되지 않음(1999)
피토플라스마
(Phytoplama)
640-1185
23-29
곤충, 식물
본 출원의 명세서에서, 용어 "마이코플라스마"는 단지 마이코플라스마탈레스가 아닌, 몰리큐테스 강의 모든 멤버를 포함할 의도이다. 실제로, "마이코플라스마"는 모든 몰리큐테스에 대한 당업계에 통상적인 용어이다.
마이코플라스마는 인간, 포유동물, 파충류, 어류, 절지류 및 식물의 기생동물로서 자연에 광범위하게 퍼져 있다. 이는 가장 작고 간단한 원핵생물이다. 이는 견고한 세포벽이 결여되고, 펩티도클리칸 합성을 할 수 없으며; 이는 그러므로 페니실린 및 이의 유사체와 같은 항생제에 민감하지 않다. 마이코플라스마는 DNA의 낮은 몰%의 구아닌 및 시토신 함량을 갖는 그람 양성 박테리아, 즉, 락토바실러스, 바실러스, 스트렙토코커스 및 2 종의 클로스트리디움 종으로부터 퇴화성 진화에 의해 발생하였다. 몰리큐테스는 진화의 과정 동안 이의 유전적인 정보의 실질적인 부분을 상실하였다. 기생 생활 방식에 대한 요구를 언급한 것은 상기 제한된 암호화 능력이다. 대부분의 종은 통성혐기성균 (facultative anaerobe)이나, 일부는 편성혐기성균(obligate anaerobe)이므로, 이의 대사에서 혐기성균과 유사하다.
180 종 이상의 몰리큐트(Mollicute)가 확인되었으며, 이 중에서 인간, 소 및 돼지 유래의 20종의 마이코플라스마 및 아콜레플라스마가 세포 배양물으로부터 분리되었다. 모든 마이코플라스마 감염의 95%를 설명하는 6 종이 존재하며; 이는 몰리큐트 오랄레(M. orale), 몰리큐트 아르기니아이(M. arginii), 몰리큐트 퍼멘탄스(M. fermentans), 몰리큐트 살리바룸(M. salivarum), 몰리큐트 히오리니스(M. hyorhinis) 및 아콜레플라스마 라이들라위아이(A. laidlawii)이다. 감염의 주 원인은 실험실에 도입된 기타 세포주 유래의 교차 오염이다. 또한, 외래 마이코플라스마의 원하지 않는 공급원이 조직 배양 시약, 예를 들면, 혈청 제품에서 발견될 수 있다. 박테리아와는 달리, 마이코플라스마 오염은 좀처럼 혼탁 성장 또는 명백한 세포 손상을 야기하지 않는다. 생존 마이코플라스마는 접종 후 7일에 작업 표면으로부터 회수될 수 있으며, 마이코플라스마는 또한 박테리아 보유 필터를 통과할 수 있다. 이의 최대 군집 상에서, 숙주 세포와 5:1의 비율로 상층액의 ml 당 108 마이코플라스마가 존재할 수 있다. 존재한다면, 마이코플라스마는 배양 배지에서 검출가능한 농도로 '성장'하며, 이는 이어서 세포 표면에 흡착된다. 마이코플라스마가 배양 중인 포유동물 세포내에 들어가서 생존하는가가 시끄러운 논점이다.
마이코플라스마는 시험관 내 배양의 거의 모든 특성을 변경할 수 있다. 이는 배양물 영양분, 특히 아르기닌을 고갈시킬 것이다. 감염된 진핵세포는 비정상적인 성장, 대사 및 형태의 변화를 나타낸다. 특정 생물학적 특성이 발병력 결정인자(virulence determinant)로서 관련되며; 상기는 마이코플라스마 효소, 예를 들면 포스포리파아제, ATPase, 헤모라이신, 프로테아제 및 뉴클레아제의 숙주 세포 환경내로의 분비 또는 도입을 포함한다.
마이코플라스마의 주요 문제는 이의 오염이 종종 숨겨지며, 박테리아 검출과는 달리, 용이하게 가시화될 수 없다는 것이다. 항생제에 대한 이의 내성 및 정상적인 박테리아 멸균 필터를 통과하는 능력은 이들이 세포 배양 기술의 전형적인 예방을 피할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 오염이 검출되지 않는 악영향의 결과, 연속적인 스크리닝이 임의의 세포 배양 실험실에서 필수적이라는 것은 명백해진다.
배양 중인 세포의 적어도 10%-15%가 마이코플라스마로 오염될 수 있다는 수 많은 연구가 존재한다 (Rottem 및 Barile 1993, McGarrity 및 Kotani 1985). 대부분의 세포 생물학자는 마이코플라스마에 대한 통상적인 시험을 수행할 필요를 인식하나, 현재 유용한 시험의 비용 및 부정확성 때문에, 이는 지금까지 현실화되지 않은 이상으로 남아 있다.
생존 마이코플라스마의 검출에 유용한 유일한 정확한 방법은 미생물의 배양이다. 그러나, 이의 시험관내 배양과 관련된 어려움은 이의 배양에 필요한 복잡한 배지로 인해 문제가 되고 있다 (Razin et al 1998). 배양은 또한 가장 민감한 방법으로 고려되고 있으며, 이는 하나의 생존 생물을 검출할 수 있다고 한다. 그러나, 상기 결과는 매우 특이적인 배양 조건으로 매우 능숙한 스태프에 의해 2 내지 3 주 소요된다. 소요되는 시간은 콜로니를 형성하는 충분한 수로 세포를 배양하는 요구의 결과이며, 상기 콜로니는 이어서 디엔스(Dienes) 염색을 이용하여 구별될 수 있다. 마이코플라스마는 대부분의 마이코플라스마가 특징적인 "프라이된 계란" 모양을 하고, 일부 콜로니가 완전히 포매될 수 없지만, 한천에서 포매되어 자라면서 현미경학적 콜로니를 생성하면서, 한천 및 브로쓰 배양에서 배양될 수 있다. 표준 한천 또는 브로쓰 배양 배지를 이용하여 용이하게 자랄 수 없는 일부 균주가 있다. 상기 균주는 이의 분리 및 확인(identify)을 위해 세포 보조 배양을 요한다. 후자의 접근은 숙주 세포 표면에 부착하는 마이코플라스마 종의 확인 및 검출을 돕는다 (Rottem 및 Barile 1993). 그러나, 배양 과정의 복잡한 특성으로 인해, 상기 시험은 마이코플라스마 시험 서비스 실험실에 의해 대개 통상적으로 수행된다.
시료에서 마이코플라스마를 검출하는 더욱 간단한 수단 중의 하나는 플루오로크롬(fluorochrome)을 이용한 DNA의 분석이다. 가장 통상적으로 이용되는 것 중의 하나는 4',6-디아민-2-페닐인돌 디히드로클로라이드(DAPI)이나, Hoecsht 염색이 선택 방법으로 고려된다. 세포 배양 시료를 취하고, 고정하고, Hoechst 33258 (비스벤즈아미드)로 염색하고, UV 형광하에 검사한다 (Battaglia et al 1994, Raab 1999). 세포와 연관된 마이코플라스마가 존재한다면, 이어서 세포 핵은 세포질에서 형광 구조에 의해 둘러싸여 나타날 것이다. 음성 세포는 단지 세포 DNA의 핵 염색으로 나타난다. DNA 염색 결과의 정확한 해석은 경험있는 눈을 요구하며, 또한 전문가 장치, 즉 형광현미경을 요한다.
PCR에 의한 마이코플라스마 검출은 외래 서비스 실험실에 의해 통상적으로 이용되는 시험이며, 또한 적당한 장치를 갖는 실험실에서 수행된다. 마이코플라스마 PCR 키트에 이용되는 프라이머는 마이코플라스마 게놈의 보존된 영역에 어닐링하며, 수 종의 검출을 허용한다 (Raab 1999). 대부분의 시판되는 PCR 키트는 증폭된 산물이 생성된 밴드 패턴이 존재하는 오염된 종을 결정하는 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석될 것을 요한다. 그러나, 밴드 패턴의 관찰은 주관적이다.
Roche (Raab 1999)사의 마이코플라스마 PCR ELISA는 상이한 시스템에 의존하며, 종 사이에 구별할 수 없다. 상기 키트는 디곡시제닌-dUTP를 포함하며, PCR 산물이 항-디곡시제닌-퍼옥시다제 콘쥬게이트로 코팅된 미세역가 플레이트에서 웰의 표면 상에 포획된다. 테트라메틸벤지딘(TMB)을 이용한 유색 산물을 표준 ELISA 플레이트 판독기를 이용하여 볼 수 있다.
Life Technologies 사는 포유동물 세포에서 소량(적어도 존재한다면)으로 단지 발견되는 아데노신 포스포릴라아제의 활성에 기초하여 MYCOTECTTM 키트를 개발하였다(Verhoef etal 1983). 상기 효소는 6-메틸퓨린 데옥시리보시드(6-MPDR)를 2개의 독성 산물(6-메틸퓨린 및 6-메틸퓨린 리보시드)로 전환한다. 상기 분석법은 오염된 세포주의 24 웰 조직 배양 플레이트에서 자란 지시(indicator) 세포주에 첨가를 요한다. 6-MPDR 기질이 첨가되고, 초기 성장의 3-4일 후에, 크리스탈 바이올렛 염색액을 첨가하여 표시 세포의 생존에 대해 시험하는데, 여기에서 마이코플라스마 양성은 상기 독성 물질의 생산을 초래한다. 200,000개의 표적 세포당 1개의 마이코플라스마 세포를 검출하는 것이 보고되었지만, 배지 조건이 마이코플라스마의 성장을 지지하도록 조절된다면(Whitaker et al, 1987), 상기 시스템의 주요 단점은 노동 집약적이고, 시간이 많이 소요된다는 점이다.
마이코플라스마 항원에 대한 항체를 이용하는 면역분석법을 이용하여 마이코플라스마 항원을 검출하는 것이 가능하다. 예를 들면, 임상 시료에서 마이코플라스마 뉴모니애 (M. pneumoniae)의 검출이다 (Daxboeck et al 2003). 상이한 항체의 이용은 종 확인을 허용한다. 수 많은 시판되는 키트가 존재하며, 예를 들면 IDEXX laboratories (US)사는 동물 건강에 관련된 수 많은 마이코플라스마이 검출용 효소면역측정법(ELISA)를 공급한다.
대부분의 알려진 분석법은 완료하는데 최소 24시간이 소요되며, 비싼 장치 및 현저한 양의 전문지식을 요한다. 또한, 이는 균주 특이적인 분석법이다. 일반적인, 즉 일반적으로 마이코플라스마 종을 검출하는 능력을 갖는 것은 없다.
영국특허 제2,357,336 B호는 세포 배양물에서 마이코플라스마를 검출하기 위해 이용될 수 있는 분석법을 기재한다. 상기 분석법은 마이코플라스마가 대량으로 효소 ATPase를 과잉 생산하는 관찰에 기초한다. 마이코플라스마의 ATPase 활성은 충분한 세포성 또는 외부에서 첨가된 ATP를 ADP로 전환하여, ADP를 검출가능하게 한다. 그리하여, 상기 분석법은 ADP의 검출에 기초하며, 이는 시료에 효소를 포함하는 시약(피루베이트 키나아제 및 포스포에놀 피루베이트의 조합; 아데닐레이트 키나아제; 글리세롤 키나아제, 미오키나아제; 또는 크레아티브(creative) 키나아제 및 크레아티브 포스페이트의 조합을 포함)을 첨가함으로써 수행되며, 상기 시약은 ADP를 ATP로 전환하며, 생물발광 반응을 이용하여 ATP를 검출한다.
영국 특허 제2,357,336호의 개시는 가능한 수정의 목적을 포함하여 본원에 포함된다.
본 발명은 세포 배양물 유래의 시료와 같은 시료에서 마이코플라스마를 검출하는 수단을 제공하려고 한다.
제1양태에 따라, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 시험 시료에서 오염 마이코플라스마의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 시험 시료를 제공하는 단계;
(ii) 시험 시료에서 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제의 활성(B)을 검출 및/또는 측정하는 단계로서, 상기 활성은 오염 마이코플라스마의 존재의 표시이며; 및
(iii) 단계(ii)에서 상기 활성의 검출 및/또는 측정에 기초하여 마이코플라스마로 오염된 시험 시료를 확인하는 단계.
바람직하게는, 상기 방법은 추가로 단계(ii) 후에 단계(iii) 전에 수행된 하기 단계를 포함한다:
(iia) 상응하는(corresponding) 대조군 시료에서 검출 및/또는 측정된 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제 활성 정보 (A)를 수득하는 단계; 및
(iib) 시험 시료에서 검출 및/또는 측정된 활성(B)과 대조군 시료에서의 것(A)을 비교하는 단계로서, 단계(ii)에서의 시험 시료에서 검출 및/또는 측정된 활성 (B)가 단계 (iia)에서 대조군 시료의 것(A)보다 크다면, 즉 비율 B/A가 1보다 크다면 상기 시험 시료는 단계 (iii)에서 마이코플라스마로 오염된 것으로서 확인된다.
제2양태에서, 본 발명은 단계 (ii)의 시험 시료에서 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제의 활성 (B)의 검출 및/또는 측정 및/또는 단계 (iia)의 상응하는 대조군 시료에서 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제 활성 정보 (A)를 수득하는 것이 하기 반응의 하나 이상의 기질 및/또는 하나 이상의 산물의 출현 및/또는 소멸을 검출 및/또는 측정하는 것을 포함하는 방법을 제공한다:
Figure 112005038051107-pct00001
바람직하게는, 검출 및/또는 측정 단계는 ATP를 검출 및/또는 측정하는 것을 포함한다. 여전히 더욱 바람직하게는, ATP는 광 발광 반응, 특히 생물발광 반응에 의해 검출 및/또는 측정된다.
광 발광 시스템이 공지되어 있으며, 특정 박테리아, 원생동물, 강장동물, 연체동물, 어류, 노래기, 파리, 균류, 벌레, 갑각류동물, 및 딱정벌레, 특히 포티누스(Photinus), 포투리스(Photuris), 및 루시올라(Luciola) 속의 개똥벌레 및 피로포루스(pyrophorus) 속의 방아벌레를 포함하는 많은 발광 생물체로부터 분리되었다. 상기 많은 생물체에서, 자유 에너지 변화가 이용되어 분자를 고에너지 상태로 여기시키는 효소적으로 촉매된 산화환원이 일어난다. 이어서, 여기된 분자가 자발적으로 기저 상태로 되돌아갈 때, 가시광선이 방출된다. 상기 방출된 광선은 "생물발광"이라 불린다.
딱정벌레 루시퍼라아제, 특히 개똥벌레 종인 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)의 루시퍼라아제가 초기 연구 이후로 생물발광을 이해하는 본보기로서 이용되었다. 포티누스 피랄리스(P. pyralis)의 루시퍼라아제는 보결 원자단(prosthetic group) 또는 단단하게 결합된 금속 이온이 없는 효소이며, 550개의 아미노산을 가지며, 약 60,000 달톤의 분자량을 가지며; 상기 효소는 수 년 동안 결정 형태로 당업계에 유용하였다. 생물발광을 생성하는 개똥벌레 루시퍼라아제의 기작에서 분자 성분의 연구는 상기 효소의 기질이 개똥벌레 루시페린, 즉 폴리헤테로시클릭 유기산(D-(-)-2- (6'-히드록시-2'-벤조티아졸릴)△2-티아졸린-4-카르복실산 (이후부터, 다르게 지정되지 않는다면 "루시페린"으로서 언급함))이라는 것을 보여주었다.
ATP는 하기 생물발광 반응을 이용하여 검출될 수 있다.
Figure 112005038051107-pct00002
발광된 광 강도는 ATP 농도와 직선으로 관련되며, 발광 측정기를 이용하여 측정된다.
루시퍼라아제가 낮은 농도의 ATP를 분석하는 수단으로 이용되었으며; 10-16 몰만큼 적은 ATP가 상기 효소의 고품질 제제를 이용하여 검출될 수 있다. 루시퍼라아제-루시페린 반응은 ATP에 대해 매우 특이적이다. 예를 들면, 데옥시-ATP는 ATP에 의해 생성된 빛의 2% 미만을 생성하며, 기타 뉴클레오시드 트리포스페이트는 0.1% 미만을 생성한다.
결정성 루시퍼라아제는 딱정벌레의 광 기관으로부터 직접 분리될 수 있다. 수 종의 딱정벌레의 루시퍼라아제(이 중에, 포티누스 피랄리스(P. pyralis)(개똥벌레)의 루시퍼라아제, 포티누스 플라지오프탈라무스(P. plagiophthalamus)(방아벌레)의 4종의 루시퍼라아제 이성화효소, 루시올라 크루시아타(L. cruciata)(개똥벌레)의 루시퍼라아제 및 루시올라 라테랄리스(L. lateralis)의 루시퍼라아제를 포함)를 코딩하는 cDNA (de Wet et al., 1987, Masuda et al., 1989, Wood et al., 1989, European Patent Application Publication No. 0 353 464)가 유용하다. 또한, 루시퍼라아제를 제조하는 임의의 기타 딱정벌레 종의 루시퍼라아제를 코딩하는 cDNA가 공지된 기술을 이용하여 당업자에 의해 용이하게 수득가능하다 (de Wet et al., 1986, Wood et al., 1989). 딱정벌레 루시퍼라아제를 코딩하는 cDNA가 입수되면, cDNA를 발현하기 위해 형질전환되는 배양 중인 박테리아 (예를 들면, 대장균), 효모, 포유동물 세포 등으로부터 다량의 루시퍼라아제를 분리에 의해 매우 순수한 형태로 제조하는 것은 전적으로 곧장 가능하다.
또한, 딱정벌레 루시퍼라아제를 코딩하는 cDNA의 유용성 및 루시퍼라아제-루시페린 반응(de Wet et al., 1986, 이하 동일, 및 Wood et al., 이하 동일)을 촉매하는 효소를 코딩하는 cDNA를 신속하게 스크리닝하는 능력은 또한 당업자로 하여금 루시퍼라아제-루시페린 반응을 통해 생물발광의 생성을 촉매할 때 활성을 보유하는 돌연변이체 루시퍼라아제를 순수한 형태로 다량으로 제조 및 수득하게 한다. 상기 돌연변이체 루시퍼라아제는 하나 이상의 위치에서 천연적으로 발생하는 딱정벌레 루시퍼라아제의 서열과 상이한 아미노산 서열을 가질 것이다 (White et al., 1996, WO 01/31028 및 WO 00/24878). 본 개시에서, 용어 "루시퍼라아제"는 딱정벌레에서 천연적으로 발생하는 루시퍼라아제뿐만 아니라, 상기 천연적으로 발생하는 루시퍼라아제의 루시퍼라아제-루시페린 반응을 촉매함으로써 생물발광을 제공시 활성을 보유하는 돌연변이체를 포괄한다.
본 발명의 방법에서, 단계 (i) 후에 단계 (ii) 전에, 시료를 임의의 마이코플라스마를 용해하기 위해 처리하여, 시료내로 이의 세포 내용물을 방출하는 것이 가장 바람직하다. 당업자는 용해(lysis)가 세제(detergent)와 같은 화학물질 및 초음파처리와 같은 기계적 방법 등의 적용을 포함하는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
유리하게는, 용해는 시료를 세제, 또는 마이코플라스마 세포막의 용해를 허용하나 존재할 수 있는 임의의 박테리아의 세포벽에는 영향을 주지 않는 기타 용해 방법으로 처리함으로써 수행된다. 전형적인 세제 처리는 저농도(예를 들면, 0.25% v/v)의 세제, 예를 들면, Triton X100의 이용을 포함한다.
바람직한 용해 방법은 마이코플라스마 막을 용해하기에 충분하나, 박테리아 세포에 대해 효과적이지 않은 방법이다. 진핵세포 용해 및 박테리아 용해를 비교하는 연구에서, 비이온성 세제(주로 폴리에톡시에테르)가 미생물 세포에 영향을 주지 않고, 체세포를 용해하기 위해 이용될 수 있다는 것을 관찰하였다 (Schramm 및 Weyens-van Witzenberg 1989, Stanley 1989). 박테리아를 세제 용해에 덜 민감하게 하는 것은 견고한 세포벽의 존재이며, 더욱 가혹한 용해 절차가 박테리아 세포를 용해하기 위해 요구된다. 효율적인 용해 및 총 단백질 방출을 위해, 박테리아는 종종 세포벽을 파괴하기 위해 리소자임과 같은 효소에 대한 노출을 요구한다(Pellegrini et al 1992). 가장 바람직한 세제 마이코플라스마 용해 조건은 이후에 보여준다.
그러나, 박테리아로의 오염은 혼탁한 성장을 야기할 것이며, 박테리아는 또한 위상차 현미경관찰하에 세포 배양물을 볼 때 관찰된다. 상기 박테리아 배양물은 꽤 용이하게 검출될 수 있으며, 바로 폐기된다.
박테리아와 달리, 마이코플라스마는 필터 멸균에 이용되는 0.45㎛ 필터를 통과할 것이며(Baseman 및 Tully 1997), 여과 단계의 첨가를 통해 박테리아 및 마이코플라스마 오염을 구별하는 것이 가능하다.
그리하여, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 시험 시료를 단계(i)에서 박테리아 필터를 통과시킨다. 당연히, 당업자는 시험 시료가 예를 들면, 시료를 박테리아 보유 필터를 통과시킴으로써 박테리아를 제거하기 위해 처리된다면, 박테리아를 용해하지 않고, 마이코플라스마를 선택적으로 용해하는 것이 중요하지 않다는 것을 인식할 것이다.
바람직한 구현예에서, ADP는 검출 및/또는 측정 단계 (ii) 전에 시험 시료에 첨가된다. 그러나, 분석은 또한 내재하는 ADP를 이용할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 마이코플라스마 기질 시약이 검출 및/또는 측정 단계 (ii) 전에 시험 시료에 첨가되며, 마이코플라스마 기질 시약은 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체 및/또는 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체를 포함한다.
"이의 전구체'는 이로부터 아세틸 포스페이트 및/또는 카바모일 포스페이트가 생성될 수 있는 하나 이상의 화합물을 포함한다. 전형적인 반응은 하기에 요약된다:
Figure 112005038051107-pct00003
그리하여, 아세틸 포스페이트를 마이코플라스마 기질 시약에 첨가하는 대신에, 아세틸-CoA와 같은 전구체를 포함할 수 있었다.
유사하게, 카바모일 포스페이트 대신에 시트룰린 및 암모니아와 같은 전구체를 마이코플라스마 기질 시약에 첨가할 수 있었다.
아세틸 포스페이트 및 카바모일 포스페이트 및/또는 이의 전구체 양자를 본 발명의 방법에서 단계 (ii) 전에 시료에 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 이는 마이코플라스마가 이의 아세테이트 키나아제 및/또는 카바메이트 키나아제 효소를 통해 하나의 기질 또는 양자의 기질을 이용하기 때문에 마이코플라스마 오염에 대한 일반적인 분석을 수행 가능하게 한다.
대안적으로, 더욱 구체적인 분석은 상기 기질 또는 이의 전구체 중의 하나를 단지 이용함으로써 수행될 수 있다. 상기 분석은 효소 아세테이트 키나아제 또는 카바메이트 키나아제 중의 단지 하나를 이용하는 마이코플라스마에 대해 특이적일 것이다. 하기 표 2는 아세테이트 키나아제를 우선적으로, 카바메이트 키나아제를 우선적으로, 또는 양자를 우선적으로 이용하는 몰리큐테스 과 (포유동물 숙주에 기생하는)의 멤버의 일부 예를 인용한다. 하기에 열거된 것외에, 생화학적 조사가 상기 동일한 경로의 이용을 확인한 마이코플라스마를 감염시키는 수 많은 파충류, 곤충 및 식물이 있다 (Kirchoff et al 1997, Forsyth et al 1996, Taylor et al 1996 및 Tully et al 1994).
글루코오스 또는 아르기닌 이용을 통한 마이코플라스마에 의한 ATP 생성.
종 우선적인 ATP 생성 경로 이용된 효소
엠.히오리니스(M.hyorhinis) 글루코오스 발효 및 아르기닌 용해 아세테이트 키나아제/카바메이트 키나아제
엠.오랄레(M. orale) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
엠.퍼멘탄스(M. fermentans) 아르기닌 용해 및 글루코오스 발효 카바메이트 키나아제/아세테이트 키나아제
엠.살리바룸(M. salivarum) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
엠.아르기니아이(M.arginii) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
에이.라이들라위아이(A. laidlawii) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
유.우레아리티큠(U. urealyticum) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
엠.뉴모니애(M. pneumoniae) 아르기닌 용해 및 글루코오스 발효 카바메이트 키나아제/아세테이트 키나아제
엠.미코이데스(M. mycoides) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
엠.아르트리티디스(M. arthritidis) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
아내로플라스마 종(Anaeroplasma sp) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
엠.호미니스(M. hominis) 아르기닌 용해 카바메이트 키나아제
에이.비툴리(A. vituli) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
엠.라고게니탈리움(M. lagogenitalium) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
엠.미코이데스(M. mycoides) 글루코오스 발효 아세테이트 키나아제
엠.페네트란스(M. penetrans) 아르기닌 용해 및 글루코오스 발효 카바메이트 키나아제/아세테이트 키나아제
엠.피룸(M. pirum) 아르기닌 용해 및 글루코오스 발효 카바메이트 키나아제/아세테이트 키나아제
엠.인코그니티스(M. incognitis) 아르기닌 용해 및 글루코오스 발효 카바메이트 키나아제/아세테이트 키나아제
가장 바람직하게는, 본 발명의 모든 양태의 모든 방법에서, "상응하는 대조군 시료"는 마이코플라스마 용해 처리 및/또는 마이코플라스마 기질의 첨가 및/또는 시간 간격(예를 들면, 약 30분 이상) 전의 시험 시료이다. 바람직한 구현예에서, 활성 측정의 양자는 동일한 시료에서 수행된다. 제1 활성 측정 (A)는 마이코플라스마 용해 단계 전에 또는 함께 수행되며, 마이코플라스마 기질의 첨가 및/또는 시간 간격(예를 들면, 약 30분 이상) 후에, 제2 활성 측정 (B)이 수행된다. B/A의 값이 1보다 크면, 시험 시료는 마이코플라스마로 오염된 것으로 확인된다.
당업자는 "상응하는 대조군 시료"는 또한 예정된 음성 대조군 시료일 수 있으나, 이는 덜 바람직한 것이라는 것을 인식할 것이다.
하나의 구현예에서, 대조군 시료는 마이코플라스마 오염이 없는 것으로 나타났다. 이를 수행하는 적당한 방법은 본원에 기재된 PCR 시험, DNA 형광 염색 또는 배양 방법을 포함한다.
그리하여, 하나의 구현예에서, "상응하는 대조군 시료"는 시험 시료에 포함된 것과 실질적으로 동일한 물질을 포함하나, 시험 시료와 달리, 마이코플라스마 오염이 없는 시료를 의미한다. 당업자는 마이코플라스마 비오염 조건은 다양한 공지된 방법에 의해 보여질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 수 많은 적당한 방법이 [Rottem 및 Barile 1993]에 의해 검토된 반면, 시험 키트 및 서비스의 요약이 [Raab et al 1999]에 제공된다.
시험 시료 및/또는 대조군 시료는 세포 시료, 예를 들면 세포 배양물 시료, 특히 포유동물 세포 배양물일 수 있다. 일부 예가 하기 표 3에 열거된다.
상기 분석법을 이용하여 시험된 통상적으로 배양된 세포주.
세포명 세포 유형 공급자/기탁번호
K562 인간 만성 골수백혈병 ECACC 89121407
U937 인간 조직구림프종 ECACC 87010802
HL-60 인간 전골수구성 백혈병 ECACC 88112501
Cem-7 인간 급성 T-림프모구백혈병 ATCC CCL-119
Jurkat 인간 T-세포 백혈병 ECACC 88042803
CHO 중국비단털쥐난소 ECACC 85050302
COS-7 SV40 형질전환된 원숭이 신장 세포 ECACC 87021302
Vero 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 ECACC 84113001
MRC5 인간 태아 폐 ECACC 84101801
HUVEC 인간 배꼽정맥 내피세포 ECACC 89110702
BSMC 인간 기관지 평활근세포 Cambrex CC-2576
NHEK 정상 인간 표피 각질세포 Cambrex CC-2503
MCF-7 인간 유방 샘암종 ECACC 86012803
AoSMC 대동맥 평활근세포 Cambrex CC-2571
A549 인간 폐 암종세포 ECACC 86012804
HepG2 인간 간세포 암종 ECACC 85011430
FM3A 마우스 유선 암종 ECACC 87100804
PC12 래트 부신 갈색세포종 ECACC 88022401
ARPE-19 인간 망막색소 상피세포 ATCC CRL-2302
RT112 인간 방광 암종 ECACC 85061106
여기에서, ECACC는 유럽 동물 세포 배양물 집합을 나타내며, ATCC는 미국 조직 배양물 집합을 나타내며, Cambrex는 Cambrex Bio Science Workingham, UK를 나타낸다.
또한, 포유동물 일차 세포 유형외에 조직 은행, 예를 들면 ATCC 및 ECACC에 의해 보유된 모든 세포를 시험하는 것이 가능할 수 있다.
본 발명의 분석이 부착성 세포(예를 들면, HepG2, A549, CHO 및 COS 세포) 및 현탁 상태로 배양하는 세포(예를 들면, Jurkats, U937, K562 및 HL-60 세포) 양자의 배양물에서 마이코플라스마 오염을 검출하기 위해 이용될 수 있다는 것은 주목할만하다.
바람직하게는, 시험될 시료는 세포성 물질을 제거하기 위해 이전에 원심분리된 세포 배양물 상층액 유래이다. 그러나, 또한 세포 또는 세포성 찌꺼기의 존재하에 상기 분석을 수행하는 것이 가능하다.
세포가 없는 시료는 또한 본 발명의 방법을 이용하여 시험될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 세포-불포함(cell-free) 시약, 예를 들면 조직배양 배지, 전형적으로 동물 유래 물질, 예를 들면 혈청(예를 들면, 소태아 혈청), 트립신, 및 기타 배양 보조제 등을 포함하는 것의 시료를 시험하는데 특히 유용하다. 상기 방식으로 시험될 수 있는 일부 통상적으로 이용되는 배지 및 보조제의 예는 하기 표 4에 보여준다.
상기 분석 시스템을 이용하여 시험될 수 있는 조직배양 배지 및 보조제.
배양 배지 혈청 성장 인자 기타 조직 배양 시약
RPMI 소 태아 표피성장인자 트립신
DMEM 신생 암소 형질전환성장인자 인슐린
Eagle's MEM 말 과립구집락자극인자 트랜스페린
Glasgow MEM 인간 과립구-대식구 CSF 콜라겐
Ham's F12 돼지 신경성장인자 피브로넥틴
IMDM 닭 비트로넥틴
배지 199 토끼 아미노산 보조제
McCoy's 5A 양 젤라틴
Hybridoma 알부민
CHO 배지 판크레아틴
배아 배양 배지 소 뇌하수체 추출액
Williams 배지 E
본 발명의 제3양태는 하기 단계를 포함하는, 시험 시료에서 마이코플라스마의 존재를 검출하는 방법을 제공한다:
(i) 시험 시료를 제공하는 단계;
(ii) ADP를 ATP로 전환하는 외래 시약(예를 들면, 키나아제 활성에 대한 기질)을 첨가하지 않고, ATP 및/또는 광 생성(output) 측정값(A)을 수득하기 위해 생물발광 반응을 이용하여 시험 시료에서 ATP를 검출 또는 측정하는 단계;
(iii) 상응하는 대조군 시료로부터 ATP 및/또는 광 생성 측정값(B)을 수득하는 단계;
(iv) ATP 및/또는 광 생성 측정 비 A/B를 비교하는 단계; 및
(v) A/B의 비가 1보다 큰 경우에 마이코플라스마로 오염된 시험 시료를 확인하는 단계.
본 발명의 초기 양태와 관련하여 언급된 바와 같이, 마이코플라스마 용해 처리 및/또는 마이코플라스마 기질의 첨가 및/또는 시간 간격이 단계 (ii) 전에 일어나는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 초기 양태와 관련하여 언급된 바와 같이, "상응하는 대조군 시료"가 마이코플라스마 용해 처리 및/또는 마이코플라스마 기질의 첨가 및/또는 시간 간격 동안(예를 들면, 약 30분 이상) 방치하지 않은 것을 제외한 시험 시료인 것이 가장 바람직하다.
즉, 양자의 측정을 시험 시료로부터 하였다. 그리하여, 바람직한 구현예에서, 대조군 ATP 및/또는 광 생성 측정은 시료에 세제 및 루시퍼라아제/루시페린외에 AMP를 포함하는 마이코플라스마 검출 시약의 첨가에 이어 측정하고, 시험 ATP 및/또는 광 생성 측정은 키나아제 활성(또는 이의 전구체)에 대한 기질의 첨가에 이어 측정하였다.
본 발명의 제4양태는 하기 단계를 포함하는, 마이코플라스마 오염을 제거하기 위해 세포 배양물을 처리하는 시험관내 방법을 제공한다: - 마이코플라스마 오염된 세포 배양물을 마이코플라스마를 제거 또는 파괴하는 물질로 처리하는 단계; 및 이어서 본 발명의 방법을 이용하여 마이코플라스마 오염에 대해 배양물로부터의 시료를 시험하는 단계; 필요하다면, 마이코플라스마 오염이 시료에서 검출되지 않을 때까지 상기 방법을 1회 이상 반복하는 단계.
세포 배양에 이용되는 가장 통상적인 항생제는 마이코플라스마에 대해 비효과적이다. 저해 활성을 보여주는 일부 물질이 있으며, 이는 겐타마이신 설페이트, 카나마이신 설페이트 및 타일로신 타르트레이트를 포함한다(www. unc.edu/depts/tcf/mycoplasma.htm). 마이코플라스마 제거 물질(ICN-Flow), 항생제의 퀴놀론 패밀리의 유도체, 또한 Minerva Biolabs (Berlin, Germany)사의 비항생제 처리인 Mynox
Figure 112005038051107-pct00004
를 포함하는 수 많은 시판되는 처리 제품이 있다.
미국 회사인 Invivogen 사는 PlasmocinTM을 공급하는데, 이는 2가지 살균 성분을 가지며, 하나는 단백질 합성에 작용하며, 다른 하나는 DNA 복제를 저해한다. 항생제 테트라사이클린 및 시프로플록사신은 80-85% 미만의 성공율을 갖는 것으로 보고된다(www.unc.edu/depts/tcf/mycoplasma.htm). 일단 오염되면, 배양물로부터 마이코플라스마를 완전히 박멸하는 것은 극도로 어렵다.
대부분의 효과적인 항생제는 퀴놀론 유도체이며, 상이한 항생제의 유효성은 시험하는 마이코플라스마에 따라 변한다. [Duffy et al 2000]은 퀴놀론 게미플록사신에 대한 엠. 뉴모니애(M. pneumoniae), 엠. 호미니스(M. hominis), 엠. 퍼멘탄스(M. fermentans), 엠. 게니탈리움(M. genitalium) 및 유. 우레아리티쿰(U. urealyticum) 생존을 조사하였으며, 테트라사이클린, 클린다마이신 및 기타 퀴놀론을 포함하는 수 많은 항생제와 비교하였다. 결과는 종 사이에 다양한 반응을 보여주었으나, 게미플록사신은 테트라사이클린보다 더 잘 수행하였다. tetM 유전자의 습득으로 인해, 테트라사이클린에 대해 내성을 보여주는 일부 종이 있다. 이는 자주 발생하며, 마이코플라스마의 유래에 의존하여 종의 반응에서 변화에 의해 복잡해진다. 예를 들면, 진핵세포 배양에서 항생제에 노출된 마이코플라스마는 인간 또는 동물 유래로부터 분리된 동일한 종과 상이한 프로필을 갖는다(Taylor-Robinson 및 Bebear 1997). 항-마이코플라스마 처리의 보고된 성공이 매우 가변적인 반면, [Uphoff et al 2002]에 의한 최근의 연구는 백혈병-림프종 세포주의 96%가 시험한 하나 이상의 처리로 마이코플라스마가 없다는 것을 보고한다.
도 1: 엠. 히오리니스(M. hyorhinis) 오염의 존재하의 ATP 생성의 역학(kinetics).
도 2: Stratagene 사의 PCR 키트와 본 발명의 비율의 바람직한 구현예 사이의 비교.
도 3: 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 마이코플라스마 제거 물질로 오염된 세포주의 처리.
도 4: 세포, 상층액 및 0.45㎛ (F1), 0.22㎛ (F2) 및 0.l㎛ (F3) 필터를 통해 여과된 상층액을 이용한 비율 데이타.
도 5: 상층액 희석의 효과.
도 6: 상이한 기질에 대해 시험한 7900 CFU/웰에서의 엠. 퍼멘탄스(M. fermentans).
도 7: 상이한 기질에 대해 시험한 1450 CFU/웰에서의 엠. 오랄레(M. orale) 스톡.
도 8: 분석의 민감도를 보여주는 엠. 오랄레(M. orale) 스톡의 희석.
도 9: 엠. 히오리니스 (M. hyorhinis), 상이한 기질 시약의 비교.
도 10: 엠. 히오리니스 (M. hyorhinis)(MH) 및 엠. 오랄레(M. orale)(MO)로 감염된 K562 세포에서 마이코플라스마 효소 활성의 검출에 대한 Triton-X100 농도의 효과.
도 11: 박테리아 세포(대장균)의 증가하는 수(1-10,000 세포/lOO㎕ 시료)와 비교하여 엠. 히오리니스 (M. hyorhinis)(MH)로 오염된 K562 세포에 대한 증가하는 Triton-Xl00 농도의 효과.
실시예 1: 본 발명의 분석 방법
바람직한 분석 방법의 원리는 마이코플라스마 효소에 대한 적당한 기질을 공급하는 것이다. 마이코플라스마 오염이 존재한다면, 바람직하게는 루시퍼라아제-루시페린 반응에 의해 측정될 수 있는 ADP의 ATP로의 전환이 있다.
마이코플라스마 검출 시약이 첨가되고, 약 5분 후에, 초기 광 생성 측정값(A)을 판독(해독)하고, 마이코플라스마 기질 (MS)을 첨가하고, 임의의 효소 활성을 약 10분 동안 진행시키며, 그 지점에서 두번째 광 생성 측정값(B)을 판독한다.
마이코플라스마 오염이 존재한다면, 두번째 판독값(B)은 첫번째 판독값(A)과 비교하여 높을 것이며, 이는 1 보다 큰 비율 B/A를 제공한다. 배양물이 음성이라면(마이코플라스마에 의해 오염되지 않는다면), 비율 B/A는 시간에 따라 통상 관찰되는 발광 신호 붕괴로 인해 1 또는 가장 종종 1 이하일 것이다. 도 1은 상기 반응의 역학을 입증한다. 전형적으로, 마이코플라스마 오염으로 관찰된 비율 B/A는 1 보다 크고, 예를 들면 도 1은 114의 비율을 보여준다.
본 발명의 바람직한 분석 키트는 마이코플라스마 검출 시약 (MDR); MDR의 재구성을 위한 마이코플라스마 분석 완충액 (MAB) 및 마이코플라스마 기질 (MS)을 포함한다. MDR 및 MS는 바람직하게는 동결건조된 제제로서 제공된다.
모든 마이코플라스마는 아세테이트 키나아제 경로 또는 카바메이트 키나아제 경로를 통해 ATP를 생성한다. 본 발명의 마이코플라스마 기질은 상기 효소 반응의 하나 또는 양자에 대한 기질을 포함한다. ADP는 양자의 효소에 대한 요구조건이며, 바람직하게는 ATP 형성의 생성을 이끌기 위해 본 발명의 마이코플라스마 검출 시약에서 과량으로 제공된다.
세포의 존재하에 분석을 수행하는 것이 가능하지만, 세포성 물질을 제거하기 위해 이전에 원심분리된 배양물 상층액의 시료에 MDR을 첨가한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 시험 시료는 박테리아 필터를 통과할 수 있다.
MDR은 루시퍼라아제에 대한 기질인 루시페린 및 기타 보조인자외에 AMP 및 ADP를 포함한다. 마이코플라스마 기질 (MS)은 카바메이트 및/또는 아세테이트 키나아제 활성의 검출에 필요한 카바모일 포스페이트 및/또는 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체를 포함한다.
바람직한 시료 부피는 100㎕이며, 여기에 재구성된 MDR의 100㎕가 첨가된다. 약 5분 후에, 첫번째 발광측정값(A)을 판독하고, 이는 추가의 비율 B/A 계산을 결정하는 근거가 되는 기초 판독값(base reading)을 제공한다.
본 발명의 분석 방법은 아콜레플라스마 라이들라위아이(Acholeplasma laidlawii), 엠. 히오리니스(M. hyorhinis), 엠. 퍼멘탄스(M. fermentans), 엠. 오랄레(M. orale), 및 엠. 게니탈리움(M. genitalium)에 의한 오염을 조사하고, 수 많은 미공지 마이코플라스마 오염을 검출하기 위해 이용되었다.
본 발명가는 PCR에 의한 마이코플라스마의 검출에 대한 이의 데이타를 비교하였으며, 1 보다 큰 비율 및 마이코플라스마 DNA의 검출 사이에 관계가 있다는 것을 보여주었다. 이는 겔 상의 양성 PCR 밴드가 1 이상의 비율과 관계된 도 2에 보여준다.
실시예 2: 세포 배양물로부터 마이코플라스마 오염을 제거하는 과정에서 본 발명의 방법의 이용.
본 발명가는 또한 세포가 항생제의 퀴놀론 패밀리의 유도체인 전형적인 마이코플라스마 제거 시약(ICN- Flow)으로 처리될 때 비율 B/A의 감소를 검출할 수 있다는 것을 보여주었다.
제조자(ICN-Flow)는 오염 마이코플라스마의 완전한 제거를 확신하기 위해 격리 상태에서 7일 동안 세포를 처리하기를 추천한다.
그러나, 본 발명의 분석 방법을 이용하여 수득된 비율 데이타는 7일이 충분하지 않다는 것을 보여주었다. 이는 비율이 1 보다 크다는 사실로부터 명백하였다. 또한 처리의 제거 및 계속된 배양 후에, 비율은 증가하였으며, 배양물은 다시 PCR 시험(Stratagene 사 키트)후에 양성이었다. 상기 데이타를 도 3에 보여주며, 여기에서 3개의 상이한 세포주는 엠. 히오리니스(M. hyorhinis)로 오염된 것으로 나타났다.
K562 및 U937 세포가 상응하는 세포주인 반면, A549 세포는 부착성 세포 유형이며; 상기 데이타는 그러므로 분석이 부착성 및 상응하는 세포 유형 양자에 이용될 수 있다는 것을 확인한다. 이는 또한 도 2에 보여주며, 여기에서 CHO 및 COS-7 세포는 세포 배양 실험실에서 통상 이용되는 부착성 세포 유형이다.
도 3은 또한 COS-7 및 CHO 세포 배양물을 이용하여 10일 동안 MRA로의 처리가 오염 마이코플라스마를 제거하는데 충분하다는 것을 보여준다.
실시예 3: 마이코플라스마를 배제하기 위한 박테리아 필터의 실패
본 발명가는 또한 수 많은 박테리아 지연 필터를 통과한 배양물 상층액은 생존 마이코플라스마의 존재의 표시인 양성 비율을 보여주기를 계속한다는 것을 보여주었다. 이는 도 4에 보여준다.
마이코플라스마는 직경이 600㎛ 만큼 큰 콜로니를 형성할 수 있으나, 또한 이의 생활 주기에서 0.15㎛ 만큼 작은 단세포로서 존재할 수 있다. 이의 작은 크기로 인해, 마이코플라스마는 조직 배양 시약을 "멸균"하기 위해 통상적으로 이용되는 0.45㎛ 및 0.22㎛ 필터를 통과할 수 있다. 도 4는 또한 분석이 세포의 존재하에 수행될 수 있으나, 검출의 감소된 감도가 있다는 것을 확인한다. 그리하여, 본 발명의 분석 방법이 실질적으로 세포가 없는 시료에서 수행되는 것이 바람직하다. 이는 세포 배양물의 원심분리 및 상층액의 샘플링, 및 임의로 박테리아 필터를 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
실시예 4: 바람직한 분석의 감도
도 5 및 8에 보여준 바와 같이, 상층액의 희석은 오염된 배양물 상층액의 1:1000 희석이 여전히 1 보다 큰 비율을 제공할 수 있는 분석의 감도를 보여준다. 상이한 마이코플라스마 (몰리큐테스) 종에서 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 효소의 특이적인 활성에 의존하여, 시료를 추가로 희석하는 것이 가능하다. 희석 범위는 또한 시험 시료에서 콜로니 형성 단위의 수에 따라 변할 것이다.
실시예 5: 본 발명의 분석 방법의 변이
본 발명의 분석 방법은 ADP, 카바모일 포스페이트 및 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체의 형태로 카바메이트 및 아세테이트 키나아제 기질의 외래 첨가 없이 작동할 것이다.
오염된 배양물 시료에서, 아세틸 및 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체는 ATP의 형성으로 반응을 준비하기 위해 세포 배양물로부터 유래된 충분한 세포성 ADP와 함께 내재적으로 존재할 것이다. 대안적으로, ADP는 기타 외부적으로 첨가된 또는 세포성 효소, 즉 ATP 및 AMP를 이용하는 아데닐레이트 키나아제에 의해 생성될 수 있다.
상기 기질의 직접적인 첨가를 피하는 것이 가능하며, 시스템이 그 자체로 기질을 생성하는 것도 가능하다. ATP와 함께 아세테이트 및 암모니아의 이용은 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 효소로 하여금 ADP로부터 ATP를 생성하는 동일한 효소에 의해 이용될 수 있는 아세틸 포스페이트 및 카바모일 포스페이트를 생성하게 할 것이다:
Figure 112005038051107-pct00005
2개의 기질은 또한 아세틸 포스페이트 및 카바모일 포스페이트를 각각 합성하기 위해 마이코플라스마 효소에 의해 이용될 수 있는 아세틸-CoA 및 시트룰린의 첨가에 의해 글루코오스 발효 및 아르기닌 용해 경로의 초기 부분을 이용함으로써 "전구체"로부터 생성될 수 있었다.
Figure 112005038051107-pct00006
하기 도면은 카바메이트 키나아제 경로를 통해 ATP를 우선적으로 생성하나, 또한 아세테이트 키나아제 경로를 이용하는 엠. 퍼멘탄스(M. fermentans)의 생화학적 활성 사이의 차이를 보여준다. 도 6은 효소 경로에 대한 기질을 개별적으로 및 조합된 시약으로 첨가하는 효과를 보여준다.
엠. 퍼멘탄스(M. fermentans)가 양자의 경로를 이용하는 반면, 엠. 오랄레(M. orale)는 단지 카바메이트 키나아제 경로를 이용하며, 도 7에 보여준 바와 같이, 양성 비율은 단지 단일 카바메이트 시약 또는 조합된 시약에서 관찰된다. 도 8은 검출 한계가 엠. 오랄레(M. orale)에 대해 14 CFU/웰 만큼 낮다는 것을 보여준 다.
본 발명가는 우선적으로 아세테이트 키나아제 경로를 이용하는 마이코플라스마인 엠. 히오리니스(M. hyorhinis)를 조사하였다. 데이타는 도 9에 보여준다.
본 발명가는 15개 이상의 상이한 세포주(표 3 참고)를 시험하였으며, 어느 세포도 비율에 영향을 주고, 위양성(false positive)을 제공할 정도로 충분한 배경(background) 효소 활성을 가지고 있지 않다는 것을 보여주었다. 본 발명가는 이론에 구속되기를 원하지 않으면서, 이에 대한 이유가 경로가 혐기성이며, 모든 포유동물 세포 배양이 산화 인산화를 통해 ATP를 생성할 것이라고 생각한다. 그리하여, 단지 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체 또는 단지 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체를 이용함으로써, 의심되는 마이코플라스마 오염물이 아세테이트 키나아제 경로, 카바메이트 키나아제 경로, 또는 양자를 이용하는 그룹 유래인지를 결정하도록 허용하는 본 발명의 분석 방법을 생성할 수 있다. 이는 유용한 진단 적용을 가질 수 있다.
아세테이트 키나아제 활성을 갖는 유일한 박테리아는 주로 분자 생물학 목적으로 실험실에서 취급되는 특정 대장균 종의 가능한 예외로 하고, 세포 배양물의 오염물로서 통상 발견되는 것은 아니다. 그러나, 상기 생물체에 대한 활성은 혼탁한 성장이 존재하며, 시료의 생성된 혼탁도가 육안에 의해 용이하게 관찰되는 단지 매우 높은 접종물 농도에서 관찰된다. 그리하여, 본 발명의 방법은 필요하면, 박테리아 오염에 대한 초기 스크리닝 단계를 포함하도록 변할 수 있다. 이는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으나, 바람직하게는 시료를 표준 박테리아 필터를 통과시 킴으로써 수행된다 (Baseman and Tully, 1997).
실시예 6: 본 발명의 마이코플라스마 분석 방법 및 키트에 이용하기 위한 바람직한 시약 성분
1. 마이코플라스마 검출 시약 (MDR)(100ml 당)
● 마그네슘 아세테이트 214.5mg(lOmM)
● 무기 피로포스페이트 178.4㎍ (4μM)
● 소 혈청 알부민 160mg (0.16%)
● D-루시페린 10mg (360μM)
● L-루시페린 250㎍ (8.9μM)
● 루시퍼라아제(RY) 85㎍
● ADP 250.5㎍ (5μM)
● AMP 69.44mg (2mM)
*RY는 Lucigen 사가 공급하는 재조합 루시퍼라아제에 제공된 이름이다.
D 및 L-루시페린의 혼합물은 D-루시페린 단독보다 더욱 안정한 광 생성을 제공하는 것으로 나타났다.
2. 마이코플라스마 기질 (MS) (100ml 당)
● 아세틸 포스페이트 55.23mg (3mM)
● 카바모일 포스페이트 45.87mg (3mM)
마이코플라스마 기질 (Ms) 전구체
아세틸 또는 카바모일 포스페이트를 생성하는 반응의 예:
Figure 112005038051107-pct00007
바람직한 농도 범위:
아세틸-CoA 0.1mM 내지 100mM
무기 인산 0.1mM 내지 100mM
(예를 들면, 인산칼륨)
Figure 112005038051107-pct00008
바람직한 농도 범위:
시트룰린 1mM 내지 100mM
암모늄 비카보네이트 1mM 내지 200mM
Figure 112005038051107-pct00009
바람직한 농도 범위:
아세테이트(예를 들면, 소듐 또는 포타슘) 1mM 내지 500mM
ATP O.lmM 내지 100mM
Figure 112005038051107-pct00010
바람직한 농도 범위:
암모늄 비카보네이트 1mM 내지 200mM
ATP O.lmM 내지 100mM
공급사
Sigma-Aldrich Company Ltd.
Fancy Road
Poole
Dorset
BH12 4QH
United Kingdom
3. 마이코플라스마 분석 완충액 (MAB) (100ml 당)
● HEPES 1.1915g(50mM)
● EDTA 74.44mg(2mM)
● Triton X-100 250㎕(0.25%)
● pH7.50
본 발명의 마이코플라스마 분석 방법 및 키트에 이용하기 위한 성분의 바람직한 농도 범위
바람직한 농도 범위는 하기를 포함한다:
● ADP 1μM 내지 lOOmM, 바람직하게는 1 내지 100μM, 더욱 바람직하게는 5μM.
● AMP 1μM 내지 lOOmM, 바람직하게는 0.1 mM 내지 lOmM, 더욱 바람직하게는 2mM.
● 아세틸 포스페이트 1μM 내지 lOOmM, 바람직하게는 0.lmM 내지 20mM, 더욱 바람직하게는 3mM. 10 초과의 농도는 광 생성을 감소시키나, 분석은 여전히 수행된다.
● 카바모일 포스페이트 1μM 내지 lOOmM, 바람직하게는 O.1mM 내지 20mM, 더욱 바람직하게는 3mM.
실시예 7: 마이코플라스마 분석에 세제의 효과
시료내로 효소의 방출을 허용하기 위해 생존하는 마이코플라스마 세포막의 파괴는 본 발명의 분석 방법의 바람직한 구현예이다. 이는 기질의 결합 및 ATP의 생성을 허용한다. 그러나, 마이코플라스마 오염을 나타내는 양성 비율은 임의의 용해 처리의 부재하에 수득될 수 있다. 관련되는 것은 상기 효소가 생존하는 마이코플라스마에 의해 방출될 수 있다는 것이다. 기타 가능성은 일부 비생존하는 생물체가 천연 용해를 통해 이의 내용물을 방출한다는 것이다.
매우 낮은 농도의 비이온성 세제인 Triton-X100의 첨가는 시료내로 카바메이트 및 아세테이트 키나아제의 최대 방출을 확신하면서 분석의 감도를 매우 증가시킨다.
하기 실험의 목적은 마이코플라스마 오염된 K562 세포 배양물에 대해 관찰된 비율에 대한 Hepes-EDTA 완충액 중의 Triton-X100의 농도를 결정하는 것이었다. 2종류의 생물체인 엠. 히오리니스(M. hyorhinis) 및 엠. 오랄레(M. orale)를 조사하였다.
도 10은 세제 용해 단계의 부재하에 마이코플라스마 효소를 검출하는 것이 가능하다는 것을 보여준다. 또한 4-5% 미만의 농도에 대해 광 생성의 감소를 보여주는데, 이는 루시퍼라아제 효소/반응에 대한 세제의 역 효과 때문이다. 그러나, 여전히 20% (v/v) 만큼 높은 농도에 대해 양성 활성을 검출하는 것이 가능하다.
본 발명가는 또한 상기 실험에서 이용된 Triton-X100의 농도는 대장균 균주 JM109 세포로부터 임의의 검출가능한 카바메이트 또는 아세테이트 키나아제 활성을 초래하지 않는다는 것을 보여주었다.
상기 결과는 이용된 박테리아 세포 수에 대해 양성 비율이 존재하지 않는다는 것을 확인한다. Triton-X100 농도를 박테리아 세포를 용해하는 것으로 보고된 수준(1-2%)으로 증가시키는 것은 여전히 1 이상의 양성 비율을 초래하지 않았다.
일반적으로 생물학적 세제는 지질의 양극성 막을 파괴하여 막 결합 단백질을 방출 및 가용화하기 위해 통상적으로 이용된다. 비이온성 세제는 비변성이며, 생물학적 활성을 방해하지 않고 막의 가용화를 허용한다.
이는 주로 단백질 형태의 연구 및 막을 가로지르는 소수성 단백질로부터 친수성 단백질의 분리에 이용되었다. 음이온성 및 양이온성 세제는 단백질 구조의 더 큰 변형을 초래하며, 단백질 응집물을 파괴하는데 더욱 효과적이다. 양쪽성 세제는 또한 저변성이나, 단백질의 응집물의 파괴에 효과적이다.
상기 상이한 그룹의 세제가 진핵세포 및 원핵세포 생물체의 단백질 함량을 효율적으로 용해, 방출 및 보존하기 위해 수 많은 상이한 세포 유형에 대해 연구되었다.
본 발명의 바람직한 분석을 위해, 필요한 용해 물질은 마이코플라스마 막의 파괴를 야기하고, 기질과 반응하기 위해 필요한 대사 효소의 방출을 허용하는 물질이다. 세제 제거 또는 중화 단계가 없기 때문에, 선택된 시스템은 카바메이트 및/또는 아세테이트 키나아제의 활성, 또는 루시퍼라아제/루시페린/ATP 반응을 간섭하지 않는다는 것이 중요하다. 또한, 세포 배양물/시료의 잠재적인 오염 물질일 수 있는 박테리아에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않으면서, 마이코플라스마의 용해를 선택적으로 야기하는 시스템을 이용하는 것이 바람직하다.
그러나, 0.45㎛ 필터를 통한 여과 단계의 존재는 임의의 오염시키는 더 큰 미생물을 제거해야 한다.
박테리아와 마이코플라스마의 주요 차이는 세포벽의 부족이며, 박테리아를 더욱 용해하기 어렵게 하는 것은 박테리아 세포벽이다. 전체 용해를 일으킬 수 있는 수많은 꽤 가혹한 방법이 존재하며, 이는 압력(프렌치 프레스) 및 초음파처리를 포함한다. 기타 효소 소화 방법은 리소자임에 이은 세제의 첨가를 포함한다. 그러나, 마이코플라스마는 약 1-2%의 농도의 Triton-X100에 대해 용해될 수 있다.
낮은 농도의 기타 비이온성 세제, 예를 들면, Brij
Figure 112005038051107-pct00011
35 (0.4%) (Sigma-Aldrich Company Ltd.) 및 B-PER (1%) (Perbio Science UK Ltd.)는 루시퍼라아제 효소에 대해 역효과를 갖지 않으며, 루시퍼라아제 반응에 악영향을 주지 않고, 마이코플라스마 막을 파괴할 수 있다. 상기 세제의 농도는 마이코플라스마 검출의 감도의 손실을 없이 10%까지 올릴 수 있다.
오염 마이코플라스마는 마이코플라스마 막을 파괴하는 용해 단계의 부재하에 검출될 수 있다. 그러나, 부드러운 용해 단계(Hepes-EDTA 완충액 중의 0.25% Triton X-100)의 첨가는 반응 혼합물내로 목적하는 마이코플라스마 효소를 방출함으로써 분석의 감도를 증가시킨다.
용해 단계는 바람직하게는 박테리아 세포에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않으면서 마이코플라스마의 선택적인 용해를 야기할 수 있다. 저농도의 대부분의 비이온성 세제는 이를 수행해야 한다. 그러나, 여과 단계는 물리적으로 임의의 오염 박테리아를 제거하며, 임의의 세제, 바람직하게는 루시퍼라아제 반응 또는 카바메이트 키나아제 및 아세테이트 키나아제의 활성을 저해하지 않는 것의 이용을 허용한다.
실시예 8: 바람직한 키트 내용물
LT07 -118 (10개의 시험에 충분)
1. LT27-217 마이코플라스마 검출 시약, 동결건조됨. 2 × 600 ㎕ 바이얼.
2. LT27-218 마이코플라스마 분석 완충액. 1 × 10 ml 병.
3. LT27-221 마이코플라스마 기질. 동결건조됨. 2 × 600 ㎕ 바이얼.
LT07 -218 (25개의 시험에 충분)
1. LT27-217 마이코플라스마 검출 시약. 동결건조됨. 5 × 600 ㎕ 바이얼.
2. LT27-218 마이코플라스마 분석 완충액. 1 × 10 ml 병.
3. LT27-221 마이코플라스마 기질. 동결건조됨. 5 × 600 ㎕ 바이얼.
LT07 -318 (100개의 시험에 충분)
1. LT27-216 마이코플라스마 검출 시약. 동결건조됨. 1 × 10ml 바이얼.
2. LT27-220 마이코플라스마 분석 완충액. 1 × 20 ml 병.
3. LT27-224 마이코플라스마 기질. 동결건조됨. 1 × 10 ml 바이얼.
본 발명의 키트 및 방법에 바람직한 시약 조성
1. 마이코플라스마 검출 시약 (MDR)(100ml 당)
● 마그네슘 아세테이트1 214.5mg (10mM)
● 무기 피로포스페이트1 178.4㎍ (4μM)
● 소 혈청 알부민1 160mg (0.16%)
● D-루시페린2 10mg (360μM)
● L-루시페린2 250㎍ (8.9μM)
● 루시퍼라아제(RY)3 85㎍
● ADP1 250.5㎍ (5μM)
● AMP1 69.44mg (2mM)
2. 마이코플라스마 기질 (MS)(100ml 당)
● 아세틸 포스페이트1 55.23mg (3mM)
● 카바모일 포스페이트1 45.87mg (3mM)
3. 마이코플라스마 분석 완충액 (MAB)(100ml 당)
● HERPES1 1.1915g (50mM)
● EDTA1 74.44mg (2mM)
● Triton X-1001 250㎕ (0.25%)
● pH 7.50
바람직한 농도 범위:
● ADP 1 μM 내지 100mM
● AMP 1 μM 내지 100mM
● 아세틸 포스페이트 1 μM 내지 100mM, 바람직하게는, 1mM 내지 lOmM
● 카바모일 포스페이트 1 μM 내지 100mM
공급사
1.
Sigma-Aldrich Company Ltd.
Fancy Road
Poole
Dorset
BH12 4QH
United Kingdom
2.
Resem BV
Goudenregenstraat 84
NL-4131 BE Vanen
Netherlands
3.
Lucigen Ltd
Porton Down Science Park
Porton, Salisbury
Wiltshire SP4 OJQ
U. K.
본 발명의 바람직한 구현예는 특정 마이코플라스마 효소의 활성을 이용하는 선택적인 생화학적 시험을 제공한다. 상기 효소의 존재는 신속한 스크리닝 절차를 제공하며, 시험 시료에서 오염 마이코플라스마의 민감한 검출을 허용한다. 생존하는 마이코플라스마를 용해하고, 효소는 ADP의 ATP로의 전환을 촉매하는 마이코플라스마 기질과 반응한다.
마이코플라스마 기질의 첨가 전(A) 및 후(B)에 시료 중의 ATP의 수준을 측정함으로써, 마이코플라스마의 존재 또는 부재의 표시인 비율 B/A가 수득될 수 있다. 상기 효소가 존재하지 않는다면, 두번째 판독은 첫번째(A)에 대해 증가를 보여주지 않는 반면, 마이코플라스마 효소의 마이코플라스마 기질 시약에서 이의 특이적인 기질과의 반응은 증가된 ATP 수준을 초래한다. ATP에서 상기 증가는 하기 생물발광 반응을 이용하여 검출될 수 있다.
Figure 112005038051107-pct00012
발광된 빛 강도는 ATP 농도와 직선으로 관련되며, 발광측정기를 이용하여 측정된다. 상기 분석은 바람직하게는 루시퍼라아제 활성의 최적 온도인 주위 실온(18-22℃)에서 수행된다.
본 발명의 간단한 시험 프로토콜
검출 시약 (MDR)을 시료에 첨가
→ 기다림 (예를 들면, 5 분)
→ 발광 측정 (판독 A)
→ 마이코플라스마 기질 (MS)을 시료에 첨가
→ 기다림 (예를 들면, 10 분)
→ 발광 측정 (판독 B)
B/A가 1 보다 크면 마이코플라스마 오염된 시료.
B/A가 1 이하이면 마이코플라스마 없는 시료.
본 방법의 요약
배양물 상층액이 세포를 제거하기 위해 원심분리되고, 임의로, 분석을 수행하기 전에 박테리아 필터를 통과시키는 것이 바람직하다.
키트는 분석을 수행하기에 필요한 모든 시약을 포함한다.
1OO㎕의 배양물 상층액을 시료로 취한다.
마이코플라스마 검출 시약 (MDR)을 첨가한다.
5분간 기다린다.
발광(A)을 판독한다.
마이코플라스마 기질 (MS)을 첨가한다.
10분간 기다린다.
발광(B)을 판독한다.
시약 재구성 및 저장
관련된 키트(10, 25 또는 100 분석 포인트)에 적용가능한 올바른 시약 재구성을 따른다는 것을 확신하라.
상기 절차는 통상 15분 이상의 평형 시간을 요한다.
마이코플라스마 검출 시약 (MDR) 및 마이코플라스마 기질 (MS)은 바람직하게는 동결건조된 펠렛으로서 공급된다. 이는 분석에 이용하기 위한 작동액을 제조하기 위해 마이코플라스마 분석 완충액 (MAB)에서 재구성된다.
10개 시험용 (키트 LT07-118):
1. 마이코플라스마 검출 시약의 제조
600㎕의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 검출 시약을 포함하는 바이얼에 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
2. 마이코플라스마 기질의 제조
600㎕의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 기질을 포함하는 바이얼내로 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
3. 마이코플라스마 분석 완충액
이는 바람직하게는 사용 준비된 상태로 제공된다. 이용하지 않을 때에는 2-8℃에서 저장한다.
25개 시험용 (키트 LT07-218):
1. 마이코플라스마 검출 시약의 제조
600㎕의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 검출 시약을 포함하는 바이얼에 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
2. 마이코플라스마 기질의 제조
600㎕의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 기질을 포함하는 바이얼내로 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
3. 마이코플라스마 분석 완충액
이는 바람직하게는 사용 준비된 상태로 제공된다. 이용하지 않을 때에는 2- 8℃에서 저장한다.
100개 시험용 (키트 LT07-318):
1. 마이코플라스마 검출 시약의 제조
10ml의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 검출 시약을 포함하는 바이얼에 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
2. 마이코플라스마 기질의 제조
600㎕의 마이코플라스마 분석 완충액을 동결건조된 마이코플라스마 기질을 포함하는 바이얼내로 첨가한다.
캡을 교환하고, 부드럽게 혼합한다.
시약을 실온에서 15분간 평형화시킨다.
3. 마이코플라스마 분석 완충액
이는 바람직하게는 사용 준비된 상태로 제공된다. 이용하지 않을 때에는 2-8℃에서 저장한다.
장치
1. 기구
키트는 발광 측정기의 이용을 요한다. 발광 측정기의 변수는 평가되어야 하며, 기계의 올바른 프로그래밍을 생성하기 위해 하기 조건을 이용해야 한다.
본 발명의 바람직한 분석은 큐벳/튜브 발광 측정기를 이용한 이용에 대해 디 자인되었다. 플레이트 발광 측정기를 이용한 이용에 대해, 하기를 참고한다.
큐벳/튜브 발광 측정기:
시간 1초를 판독한다 (적분함(integrated)).
2. 부가적인 장치 및 1회용품
a. 10 ml 멸균 피펫
b. 발광 측정기 큐벳
c. 마이크로피펫- 50-200㎕; 200-1000㎕
d. 벤치 원심분리기.
바람직한 시험 프로토콜
배양 배지의 시료는 임의의 추가의 가공 단계, 예를 들면, 트립신처리 전에 취해야 함을 주의해야 한다.
1. 이용 전에 모든 시약을 실온으로 가지고 온다.
2. 마이코플라스마 분석 완충액에서 마이코플라스마 검출 시약 및 마이코플라스마 기질을 재구성한다. 실온에서 15분 동안 방치하여 완전한 재수화를 확인한다.
3. 2 ml의 세포 배양물 또는 배양물 상층액을 원심분리 튜브로 옮기고, 임의의 세포를 1500 rpm (200 x g)에서 5분간 펠렛팅한다.
4. 100㎕의 투명해진 상층액을 발광 측정기 큐벳/튜브로 옮긴다.
5. 1초 적분 판독을 하도록 발광 측정기를 프로그램한다 (이는 통상 대부분의 큐벳 발광 측정기 상에서 디폴트 세팅이다).
6. 100㎕의 마이코플라스마 검출 시약을 각 시료에 첨가하고, 5분간 기다린다 .
7. 발광 측정기에 큐벳을 위치하고, 프로그램을 시작한다 (판독 A).
8. 100㎕의 마이코플라스마 기질을 각 시료에 첨가하고, 10분간 기다린다.
9. 발광 측정기에 큐벳을 위치하고, 프로그램을 시작한다 (판독 B).
10. 비율 = 판독값 B/판독값 A을 계산한다.
결과의 해석
판독값 B 대 판독값 A의 비율은 세포 배양물이 마이코플라스마에 의해 오염되었는지를 결정하기 위해 이용된다.
본 발명에 따른 키트에 의해 제공된 속도 및 편리함은 마이코플라스마의 존재에 대해 배양물을 스크리닝하는 유일한 방법을 제공한다는 것을 의미한다. 이와 같이, 배양 중인 세포의 통상적인 시험에 이상적으로 적합하다. 본 발명의 시험 방법의 빈번한 이용은 세포주가 감염되어 신속한 치료 작용이 취해질 때를 나타낼 것이다. 본 발명의 시험 방법은 또한 수입 세포주 및 완전 배지의 통상적으로 이용되는 성분에 확장될 수 있다.
각 실험 상황 내에서 수득된 상이한 비율의 해석은 이용된 세포 유형 및 조건에 따라 변할 것이다. 그러나, 시험은 미감염 배양물에 대해 1 미만의 B/A 비율을 제공한다. 마이코플라스마로 감염된 세포는 통상적으로 1 초과의 비율을 생성할 것이다.
분석 결과의 해석: 건강한 세포주 및 감염된 세포주의 예시예
세포주 마이코플라스마 비율 결론
감염된 세포
K562 123.26 양성
A549 4.10 양성
U937 8.26 양성
HepG2 1.27* 경계선, 24시간에 격리 및 재시험
건강한 세포
HL60 0.72 음성
COS-7 0.46 음성
플레이트 발광 측정기에 대한 프로토콜
1. 이용 전에 모든 시약을 실온으로 가지고 온다.
2. 마이코플라스마 분석 완충액에서 마이코플라스마 검출 시약 및 마이코플라스마 기질을 재구성한다. 실온에서 15분 동안 방치하여 완전한 재수화를 확인한다.
3. 2 ml의 세포 배양물 또는 배양물 상층액을 원심분리 튜브로 옮기고, 임의의 세포를 1500 rpm (200 x g)에서 5분간 펠렛팅한다.
4. 100㎕의 투명해진 상층액을 발광 상용성 플레이트로 옮긴다.
5. 1초 적분 판독을 하도록 발광 측정기를 프로그램한다.
6. 100㎕의 마이코플라스마 검출 시약을 각 시료에 첨가하고, 5분간 기다린다.
7. 발광 측정기에 플레이트를 위치하고, 프로그램을 시작한다 (판독 A).
8. 100㎕의 마이코플라스마 기질을 각 시료에 첨가하고, 10분간 기다린다.
9. 발광 측정기에 플레이트를 위치하고, 프로그램을 시작한다 (판독 B).
10. 비율 = 판독값 B/판독값 A을 계산한다.
임의의 시약을 취급할 때 매우 주의해야 한다. 피부는 거짓으로 높은 판독을 초래하는 시약을 오염시킬 수 있는 이의 표면 상에 높은 수준의 ATP를 가진다. 라텍스 장갑은 상기 문제를 피한다.
모든 시약에 대한 최적의 작업 온도는 22℃이다. 시약이 냉장된다면, 항상 이용 전에 이를 실온(18-22℃)에 도달하도록 시간을 허용한다.
분석의 감도는 숨겨진 오염의 검출을 허용하며, 비율이 간신히 1 초과라면 (예를 들면 1.3 이하), 시료를 재시험하는 것이 바람직하다. 격리 상태에서 유지된 임의의 배양물은 비율이 증가되었는지를 알아보기 위해 배양에서 추가의 24-48시간 후에 시험할 수 있다.
요약
본 발명의 분석은 세포의 존재 또는 부재하에 수행될 수 있다. 공지된 마이코플라스마 검출 시스템과 달리, 이는 시료를 값싼 휴대용(hand-held) 발광 측정기 시스템을 이용하여 신속하게 스크리닝할 수 있도록 허용하며, 오염된 시료의 적절한 취급을 허용하도록 15분 내에 결과를 제공할 수 있다.
PCR 및 DAPI/Hoechst 염색은 생존 또는 비생존 마이코플라스마이든지 간에, 모든 DNA에 결합할 것이다. 그리하여, 마이코플라스마를 처리하고 제거하고자 한다면, 마이코플라스마가 제거될 수 없을지라도 PCR/DNA 염색을 이용할 때 위양성으로 끝날 수 있다.
상기 분석은 생존하는 마이코플라스마를 검출할 수 있지만, PCR 과 같은 공지의 방법은 생존 및 비생존 마이코플라스마 사이를 구별할 수 없다.
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Claims (43)

  1. 하기 단계를 포함하는, 시험 시료에서 오염 마이코플라스마의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 시험 시료를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 시험 시료에 마이코플라스마 기질(MS) 시약을 첨가하는 단계로서, 상기 MS 시약은 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체, 및 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    (iii) 상기 시험 시료에서 오염 마이코플라스마의 존재를 표시하는 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 중 하나 이상의 활성(B)을 검출 또는 측정하는 단계; 및
    (iv) 단계(iii)에서의 상기 활성의 검출 또는 측정에 기초하여 상기 시험 시료를 마이코플라스마에 의해 오염된 것으로 확인(identify)하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계(iii) 후에, 그러나, 상기 단계(iv) 전에 수행되는 하기 단계를 더 포함하는 것인 방법:
    (iiia) 상응하는(corresponding) 대조군 시료에서 검출 또는 측정된 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 중 하나 이상의 활성 정보 (A)를 수득하는 단계; 및
    (iiib) 상기 시험 시료에서 검출 또는 측정된 활성(B)과 상기 대조군 시료에서의 활성(A)을 비교하는 단계로서, 상기 단계(iii)에서 시험 시료에서 검출 또는 측정된 활성 (B)가 상기 단계 (iiia)에서의 대조군 시료의 활성(A)보다 크면, 즉 비율 B/A가 1보다 크면 상기 시험 시료는 상기 단계 (iv)에서 마이코플라스마에 의해 오염된 것으로서 확인되는 것인 단계.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (iii)의 시험 시료에서 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 중 하나 이상의 활성 (B)를 검출 또는 측정하는 단계 또는 상기 단계 (iiia)의 상응하는 대조군 시료에서 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 중 하나 이상의 활성 정보 (A)를 수득하는 단계는 하기 반응의 기질 및 생성물 중 하나 이상의 출현 및 소멸 중 하나 이상을 검출 또는 측정하는 것을 포함하는 것인 방법:
    Figure 712012000478316-pct00013
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단계(i) 후, 그러나, 상기 단계(ii) 전에 수행되는, 마이코플라스마 용해제(mycoplasma lysis agent)에 의한 상기 시험 시료의 처리에 의해 상기 시료 내로 마이코플라스마 세포 내용물을 방출시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 용해제는 세제(detergent)인 것인 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세제 용해 처리는 박테리아 세포를 용해할 수 없는 것인 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 상응하는 대조군 시료는 마이코플라스마 용해 처리 전의 시험 시료와 동일한 것인 방법.
  8. 제 2 항에 있어서, 상기 상응하는 대조군 시료는 상기 시험 시료와 동일하나, 상기 시험 시료 활성 정보에 대한 검출 또는 측정의 수득이 상기 대조군 시료에 대한 검출 또는 측정 정보의 수득 후 시간 간격 후에 수행되는 것인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 시간 간격은 30 분 이상인 것인 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 검출 또는 측정 단계는 ATP의 검출 또는 측정을 포함하는 것인 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 ATP는 광 발광 반응에 의해 검출 또는 측정되는 것인 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 광 발광 반응은 생물발광 반응인 것인 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, ADP는 상기 검출 또는 측정 단계(iii) 전에 상기 시험 시료에 첨가되는 것인 방법.
  14. 삭제
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 아세틸 포스페이트의 전구체는 아세틸-CoA인 것인 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 카바모일 포스페이트의 전구체는 시트룰린 또는 암모니아인 것인 방법.
  17. 제 2 항에 있어서, 상기 대조군 시료는 마이코플라스마 용해제 및 마이코플라스마 기질 시약이 첨가되지 않은 시험 시료의 전부 또는 분취량이며, 상기 마이코플라스마 기질 시약은 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체, 및 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
  18. 제 2 항에 있어서, 상기 대조군 시료는 별도의 방법에 의해 마이코플라스마가 없는 것으로 확인된 것인 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 대조군 시료는 하나 이상의 PCR 시험, DNA 형광 염색 또는 마이코플라스마 배양 방법에 의해 마이코플라스마가 없는 것으로 확인된 것인 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시험 시료 또는 대조군 시료는 세포 배양물 시료인 것인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 배양물 시료 중의 세포는 포유동물 세포인 것인 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 배양물 시료 중의 포유동물 세포는 현탁 상태로(suspension) 성장하는 것인 방법.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 배양물은 식물 세포 배양물인 것인 방법.
  24. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 배양물 시료는 세포 배양물로부터 유래하나, 그 자체는 세포성 물질을 포함하지 않는 시료인 것인 방법.
  25. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 시험 시료 또는 대조군 시료는 세포-불포함(cell-free) 시약으로 이루어지는 것인 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 세포-불포함 시약은 트립신인 것인 방법.
  27. 하기 단계를 포함하는, 마이코플라스마 오염을 제거하기 위해 세포 배양물을 처리하는 방법:
    마이코플라스마로 오염된 세포 배양물을 마이코플라스마를 제거 또는 파괴하는 물질로 처리하는 단계; 및 이어서 제 1 항 또는 제 2 항의 방법을 이용하여 마이코플라스마 오염에 대해 상기 배양물로부터의 시료를 시험하는 단계; 필요하다면, 상기 시료에서 마이코플라스마 오염이 검출되지 않을 때까지 상기 방법을 1회 이상 반복하는 단계.
  28. 하기 단계를 포함하는, 시험 시료에서 마이코플라스마의 존재를 검출하는 방법:
    (i) 시험 시료를 제공하는 단계;
    (ii) 상기 시험 시료에 마이코플라스마 기질(MS) 시약을 첨가하는 단계로서, 상기 MS 시약은 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체, 및 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체 중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    (iii) ADP를 ATP로 전환하는 외래 시약을 첨가하지 않고, ATP 또는 광 생성(output) 측정값(A)을 수득하기 위해 생물발광 반응을 이용하여 상기 시험 시료에서 ATP를 검출 또는 측정하는 것에 의해 상기 시험 시료에서 아세테이트 키나아제 및 카바메이트 키나아제 중 하나 이상의 활성을 검출 또는 측정하는 단계;
    (iv) 상응하는 대조군 시료로부터 ATP 또는 광 생성 측정값(B)을 수득하는 단계;
    (v) ATP 또는 광 생성 측정값 비 A/B를 비교하는 단계; 및
    (vi) 상기 A/B의 비가 1보다 큰 경우에 상기 시험 시료를 마이코플라스마에 의해 오염된 시험 시료로 확인하는 단계.
  29. 제 1 항 또는 제 28 항에 있어서, 상기 방법은 상기 시험 시료를 박테리아 세포를 보유하는 필터를 통해 통과시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  30. 삭제
  31. 하기 성분을 포함하는 마이코플라스마 오염의 검출에 이용하기 위한 키트:
    (i) 아세틸 포스페이트 또는 이의 전구체, 및 카바모일 포스페이트 또는 이의 전구체 중 하나 이상;
    (ii) ATP 형성의 방향으로 효소 반응을 이끌기 위한 과량의 ADP;
    (iii) 마이코플라스마를 용해하기 위한 하나 이상의 물질.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 마이코플라스마를 용해하는 물질은 세제를 포함하는 것인 키트.
  33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 광 발광 반응에 의해 ATP를 검출 또는 측정하는 수단을 더 포함하는 것인 키트.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 수단은 마그네슘 아세테이트, 무기 피로포스페이트, 소 혈청 알부민, 루시페린, 루시퍼라아제, ADP 및 AMP를 포함하는 마이코플라스마 검출 시약(MDR)을 포함하는 것인 키트.
  35. 제 31 항에 있어서, 상기 키트의 성분은 동결건조된 상태로 공급되는 것인 키트.
  36. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 동결건조된 성분을 재구성할 수 있는 완충액을 더 포함하는 것인 키트.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 완충액은 7.5의 pH를 유지하는 것인 키트.
  38. 제 33 항에 있어서, 발광 측정기를 더 포함하는 것인 키트.
  39. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 박테리아 필터를 더 포함하는 것인 키트.
  40. 제 20 항에 있어서, 상기 세포 배양물 시료 중의 세포는 부착성 세포이거나 또는 동물 기원으로부터 분리된 부착성 일차 세포인 것인 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 부착성 세포는 Vero(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포), MRC5(인간 태아 폐 세포), HUVEC(인간 배꼽정맥 내피 세포), BSMC(인간 기관지 평활근 세포), NHEK(정상 인간 표피 각질세포), MCF-7(인간 유방 샘암종 세포), AoSMC(대동맥 평활근 세포), A549(인간 폐 암종 세포), HepG2(인간 간세포 암종), FM3A(마우스 유선 암종 세포), PC12(래트 부신 갈색세포종), ARPE-19(인간 망막색소 상피 세포), CHO(중국 햄스터 난소 세포) 및 COS(SV40 형질전환된 원숭이 신장 세포) 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  42. 제 22 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 K562(인간 만성 골수백혈병 세포), U937(인간 조직구림프종 세포), HL-60(인간 전골수구성 백혈병 세포), Cem-7(인간 급성 T-림프모구백혈병 세포) 및 Jurkats(인간 T세포 백혈병 세포)로부터 선택되는 것인 방법.
  43. 제 38 항에 있어서, 상기 발광 측정기는 휴대용(hand-held) 발광 측정기인 것인 키트.
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