CN115927291A - 从人外周血红细胞分离或提纯的dna及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA。本申请还提供一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA的方法、用于对受试者进行癌症检测的系统以及用途。本申请所述的从人外周血红细胞分离或提纯的DNA以及方法，由于癌细胞DNA释放至血液后，除了存在于血浆外，也可能被其它细胞吸收，如血液中的红细胞。血液中吸收来源于癌细胞DNA的红细胞。因此针对上述问题，本申请提出一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA及其制备方法和用途，通过从受试者的红细胞中提取DNA，通过对红细胞吸收的癌细胞DNA进行检测，实现对癌症的筛查和诊断。

Description

从人外周血红细胞分离或提纯的DNA及其制备方法和用途
技术领域
本案是申请日为2021年8月19日，发明名称为从人外周血红细胞分离或提纯的DNA及其制备方法和用途，申请号为202110955502.X的案件的分案申请。
背景技术
在癌症的发生、发展过程中，往往伴随有癌细胞DNA的改变，如DNA甲基化，碱基序列的改变，染色体结构变异，基因融合等。通过对癌症DNA甲基化、基因突变、基因融合，染色体结构变异的检测，可以实现癌症的筛查，诊断。通常，用于癌症筛查、诊断的DNA最初来源于癌细胞，或癌前病变的细胞。通过活体取材技术，如穿刺等对病灶部位取材，取到受检材料，进一步对受检材料提取DNA或RNA，进行DNA甲基化、基因突变、基因融合，染色体结构变异的检测和分析。
在癌细胞分裂，生长过程中，部分癌症细胞会因各种原因，如受到免疫细胞的清除作用，死亡或者凋亡等。癌细胞死亡或凋亡后，DNA被碎片化，随着其它细胞成分释放至血液中。对癌症DNA的检测，除了直接对病灶部位取材，也可以通过静脉采集外周血，实现对癌症DNA甲基化、基因突变、基因融合，染色体结构变异的检测。
外周血中肿瘤的DNA，被称作循环肿瘤DNA，即ctDNA(circulating tumor DNA)。通常采集受试者外周血，分离无细胞的血浆，对血浆游离DNA，即cfDNA(cell-free DNA)进行提取分离，ctDNA存在于cfDNA中。通过对包含ctDNA的cfDNA进行检测，实现对癌症的筛查或者诊断。血浆cfDNA的片段分布呈现为一个核小体单位的167bp主峰及2个核小体的340bp次峰。
但是由于癌细胞DNA改变多样，在血浆中容易分解变化，因此只是通过检测血浆中的DNA，来判断受试者是否患癌，会导致结果不太准确。
发明内容
由于癌细胞DNA释放至血液后，除了存在于血浆外，也可能被其它细胞吸收，如血液中的红细胞。血液中吸收来源于癌细胞DNA的红细胞。因此针对上述问题，本申请提出一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA及其制备方法和用途，通过从受试者的红细胞中提取DNA，通过对红细胞吸收的癌细胞DNA进行检测，实现对癌症的筛查和诊断。
本申请提供如下技术方案。
1、一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA。
2、根据项1所述的DNA，其特征在于，所述DNA进行亚硫酸盐转化后用于通过基因的甲基化水平来检测癌症或癌症患病风险。
3、根据项2所述的DNA，其特征在于，所述癌症为包括肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌或头颈癌。
4、一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供人外周血样品；
向所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂；
离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。
5、根据项4所述的方法，其特征在于，向所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后放置一段时间。
6、根据项4所述的方法，其特征在于，所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比为10-20：1，优选为10:1；
优选地，所述红细胞稳定剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2、甲醛聚合物、乙醛聚合物、丙醛聚合物、碱性盐、盐酸、Tris中的一种或两者以上的组合。
7、根据项4所述的方法，其特征在于，通过直接离心或密度梯度离心法将所述人外周血中的红细胞、白细胞、血浆粗分离，获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
8、根据项4所述的方法，其特征在于，采用红细胞裂解液特异性地破坏红细胞的细胞膜，使红细胞中的DNA和血红蛋白释放至裂解液中，然后通过离心除去粒细胞和其他沉淀物质；
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
优选地，所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10，优选为1:2。
9、根据项4所述的方法，其特征在于，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液。
10、根据项4或9所述的方法，其特征在于，所述结合液包括硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合，优选为硫氰酸胍和蛋白酶K；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10，优选为1:1。
11、根据项4所述的方法，其特征在于，使用乙醇、异丙醇或正丁醇洗涤所述含有红细胞DNA的混合液。
12、一种用于对受试者进行癌症检测的系统，其特征在于，包括：
对受试者红细胞的DNA进行亚硫酸盐转化的构件；以及
检测甲基化的构件。
13、根据项12所述的系统，其特征在于，所述检测甲基化的构件为Septin9基因甲基化检测试剂盒。
14、根据项12或13所述的系统，其特征在于，还包括：获取受试者红细胞DNA的构件，所述构件包括
样品单元，所述样品单元用于提供人外周血样品；
稳定单元，所述稳定单元用于稳定人外周血样本中红细胞状态；
分离单元，所述分离单元用于离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
裂解单元，所述裂解单元用于在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
结合单元，所述结合单元用于在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
洗涤单元，所述洗涤单元用于洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。
15、根据项14所述的系统，其特征在于，在所述稳定单元中，所述人外周血样品与红细胞稳定剂混合、放置一端时间，以提高所述人外周血样品中的红细胞的稳定性，便于后续分离。
16、根据项14所述的系统，其特征在于，在所述分离单元中，通过直接离心或密度梯度离心法将所述人外周血中的红细胞、白细胞、血浆粗分离，获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
17、根据项14所述的系统，其特征在于，在所述裂解单元中，采用红细胞裂解液特异性地破坏红细胞的细胞膜，使红细胞中的DNA和血红蛋白释放至裂解液中，然后通过离心弃去粒细胞和其他沉淀；
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10，优选为1:2。
18、根据项14所述的系统，其特征在于，在所述结合单元中，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液。
19、根据项14所述的系统，其特征在于，所述结合液选自硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合，优选为硫氰酸胍和蛋白酶K；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10，优选为1:1。
20、根据项14所述的系统，其特征在于，在所述洗涤单元中，使用乙醇、异丙醇或正丁醇洗涤所述含有红细胞DNA的混合液。
21、一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA在利用甲基化检测癌症中的用途。
22、根据项21所述用途，其特征在于，所述从人外周血红细胞分离或提纯的DNA通过项4-11中任一项所述的方法获得。
23、根据项21所述用途，其特征在于，所述癌症为包括肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌或头颈癌。
本申请的技术方案通过从人外周血红细胞分离或提纯的DNA，然后对该DNA进行亚硫酸盐转化，从而用于通过该DNA的甲基化水平或甲基化状态来检测疾病或预测患病风险。由于癌细胞在生长过程中，部分癌症细胞会因各种原因，如受到免疫细胞的清除作用，死亡或者凋亡等，癌细胞死亡或凋亡后，DNA被碎片化，随着其它细胞成分释放至血液中，进入血液中的DNA碎片有一部分会进入红细胞中，由于DNA碎片在红细胞中存在时间较在血浆中的存在时间长，而且成熟红细胞中本身没有细胞核，因此从红细胞中分离或提纯的DNA可以用来检测癌症准确率较高。另外没有进入红细胞中的DNA片段在血浆中容易分解变化，因此只是通过检测血浆中的DNA，来判断受试者是否患癌，会导致结果不太准确。由此可知我们可以直接通过从人外周血红细胞分离或提纯的DNA连检测受试者是否患癌，也可以将上述两种方法同时使用，进一步提高检测结果的准确率。
具体实施方式
虽然本申请可以以许多不同的形式来实施，但在此公开的是验证本申请原理的其具体的举例说明性实施方案。应该强调的是，本发明不限于所举例说明的具体实施方案。此外，本文使用的任何章节标题仅用于组织目的，并不被解释为限制所描述的主题。
除非在此另外定义，否则与本申请结合使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另有要求，单数形式的术语应包括复数形式，复数形式的术语应包括单数形式。更具体地，如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种蛋白质”包括多种蛋白质；提及“一个细胞”包括细胞的混合物等。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”意指“和/或”。此外，术语“包含”以及其他形式(诸如“包括”和“含有”)的使用不是限制性的。此外，说明书和所附权利要求中提供的范围包括端点和断点之间的所有值。
通常，与本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质以及核酸化学和杂交有关的术语以及其技术是本领域众所周知和常用的术语。除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。
定义
为了更好地理解本发明，相关术语的定义和解释提供如下。
在本申请中，“DNA”即脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)。
在本申请中，“受试者”意指接受检测的对象。在某些具体实施方案中，“受试者”为人类受试者。
在本申请中，“患者”意指患有某种疾病(如肝癌)的受试者。
在本申请中，“癌症”为恶性肿瘤的总称。肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的病变。
在本申请中，“癌症受试者”或者“癌症患者”可互换地使用，意指患有某种癌症(如肝癌或结直肠癌)的受试者。
在本申请中，“非癌症受试者”意指未患有某种癌症的受试者。例如，“非肝癌受试者”意指未患有肝癌的受试者。在本文公开的具体实施方案和实施例中，“非癌症受试者”也称为“健康个体”，同样地，意指该个体或受试者未患有该种癌症。
在本申请中，“外周血”意指由造血器官释放到循环系统中、参与循环的血液。“外周血”不同于造血器官(如骨髓)中的未成熟血细胞。在本文公开中，可通过静脉、指尖或耳垂采血等本领域公知的方式，采集外周血。通常，外周血由血浆和血细胞组成，其中，血细胞进一步包括白细胞、红细胞和血小板。按体积计，红细胞约占外周血全血的45％，血浆约占外周血全血的54.3％，白细胞约占外周血全血的0.7％。白细胞为有核细胞，是粒细胞、单核细胞和淋巴细胞的总称；而正常红细胞没有细胞核，也没有基因组DNA，为无核细胞。本文中所提取的红细胞中的DNA为未成熟红细胞中的DNA和从血液中吸收到红细胞中的癌细胞DNA。因此从外周血红细胞中提取到的DNA在进行亚硫酸盐转化和甲基化后可用于检测癌症。
在癌症的发生和进展过程中，遗传信息会产生一系列的变化，包括DNA的突变、插入/缺失，染色体结构变异，拷贝数变异，以及表观遗传信息的改变。在癌症的演进过程中，DNA序列的变异是随机发生的，仅当变异发生在关键的生长控制基因时，才可以导致恶性肿瘤的产生。而大多数的基因表达异常是源于表观遗传的改变，通常是DNA甲基化水平的改变。研究表明，基因甲基化水平的改变早于基因变异，跟踪检测基因甲基化的变化，可以较早的预测癌症产生。DNA甲基化是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
在本申请中，甲基化水平或甲基化状态是指发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，作为一种对稳定的修饰状态，在DNA甲基转移酶的作用下，可随DNA的复制过程遗传给新生的子代DNA，是一种重要的表观遗传机制，DNA甲基化时，基因启动子区的甲基化可导致抑癌基因转录沉寂，因此它与肿瘤的发生关系密切。异常甲基化包括抑癌基因和DNA修复基因的高甲基化、重复序列DNA的低甲基化、某些基因的印记丢失，其与多种肿瘤的发生有关。
在本申请中，从外周血红细胞中提取到的DNA，所述DNA进行亚硫酸盐转化后用于通过基因的甲基化水平来检测癌症或癌症患病风险；可用于检测全部癌症，尤其是肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌或头颈癌等癌症。
本申请提供一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA的方法，包括如下步骤：
步骤一：提供人外周血样品；
步骤二：在所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂；
步骤三：离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
步骤四：在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
步骤五：在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
步骤六：洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。
在步骤一中：使用EDTA抗凝管采集受试者全血，2-8℃保存，分离红细胞前用等体积的组织稀释液或者PBS稀释全血。
在步骤二中：在所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后放置一段时间，该放置的时间可以为1h-72h，优选24h。
在具体实施过程中，在所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后可以放置1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、57h、58h、59h、60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h或72h。
所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比为10-20：1，优选为10:1；
在具体实施过程中，所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比可以为10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
所述红细胞稳定剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2、甲醛聚合物、乙醛聚合物、丙醛聚合物、碱性盐、盐酸、Tris中的一种或两种以上的组合。
人外周血在离开人体之后，血液中的血细胞会快速老化，而从采集到人外周血样到提取检测，需要一定的时间，在经过长时间的运输等过程后，从血样中提取DNA，并进行亚硫酸盐转化等一系列操作后，检测结果误差较大。
为了克服这个问题，在本申请的方法中，采集人外周血样后，在人外周血样中添加红细胞稳定剂，通过所述红细胞稳定剂来稳定血样中红细胞的状态，减小红细胞的老化速度，为后续运输以及提取提供充足的时间，从而提高检测的准确性。
在步骤三中，对于外周血红细胞的分离方法，包括自然沉降法、差异沉降法、氯化钠分离法、直接离心以及密度梯度离心法等。
可以利用外周血不同组分之间密度的差异，对外周血的不同组分进行分离。例如，可以通过密度梯度离心法对外周血不同组分进行分离。
在本申请的一个具体实施方案中，通过密度梯度离心法来分离外周血。具体而言，通过以下方式进行：
在离心管中加入密度为1.077±0.001g/mL的聚蔗糖溶液，将步骤一得到的稀释后的血样品小心的平铺于分离液上，室温，水平转子500-1000g，离心20-30min。血液经离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。转移离心管底部的红细胞和粒细胞至新的离心管。
在步骤四中，使用所述红细胞裂解液，破坏红细胞细胞膜，使红细胞中的DNA释放至裂解液中，同时所述红细胞裂解液不会破坏粒细胞膜，保护粒细胞形态完整，避免粒细胞中的DNA释放至裂解液。通过离心弃沉淀，保留来源于红细胞的裂解成分，弃除粒细胞和其他沉淀。
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:2。
在具体实施过程中，所述红细胞与红细胞裂解液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
在步骤五中，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液。
所述结合液包括硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组件，优选为硫氰酸胍和蛋白酶K；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:1。
例如所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
在步骤六中，向步骤四得到的含有红细胞DNA的混合液中加入等体积的无水乙醇，50μl 50mg/ml的硅羟基磁珠，旋转结合45min；然后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后再加入漂洗液I(1M异硫氰酸胍，1％TritonX-100，50％乙醇)至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；之后再加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；然后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再次加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；之后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体光泽时，再加入TE(10mM Tris-HCl pH8.0,0.1mM EDTA)，重悬磁珠，加热至65℃，保持10min，然后转移洗脱下的DNA溶液至新的离心管中，即可得到所述DNA。
本申请提供一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA的方法，包括如下步骤：
步骤一：提供人外周血样品。
步骤二：在所述人外周血样品中添加红细胞稳定剂，以提高红细胞的稳定性，便于后续分离。
在所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后放置一段时间，该放置时间可以为1h-72h，优选24h。
在具体实施过程中，在所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后可以放置1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、57h、58h、59h、60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h或72h。
所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比为10-20：1，优选为10:1；
在具体实施过程中，所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比可以为10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
所述红细胞稳定剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2、甲醛聚合物、乙醛聚合物、丙醛聚合物、碱性盐、盐酸、Tris中的一种或两种以上的组合。
步骤三：离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
对于外周血红细胞的分离方法，包括自然沉降法、差异沉降法、氯化钠分离法、直接离心以及密度梯度离心法等。
可以利用外周血不同组分之间密度的差异，对外周血的不同组分进行分离。例如，可以通过密度梯度离心法对外周血不同组分进行分离。
在本申请的一个具体实施方案中，通过密度梯度离心法来分离外周血。具体而言，通过以下方式进行：
在离心管中加入密度为1.077±0.001g/mL的聚蔗糖溶液，将步骤一得到的稀释后的血样品小心的平铺于分离液上，室温，水平转子500-1000g，离心20-30min。血液经离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞。转移离心管底部的红细胞和粒细胞至新的离心管。
步骤四：在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液用于特异性地裂解红细胞，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
使用所述红细胞裂解液，破坏红细胞细胞膜，使红细胞中的DNA释放至裂解液中，同时所述红细胞裂解液不会破坏粒细胞膜，保护粒细胞形态完整，避免粒细胞中的DNA释放至裂解液。通过离心弃沉淀，保留来源于红细胞的裂解成分，弃除粒细胞和其他沉淀。
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:2。
在具体实施过程中，所述红细胞与红细胞裂解液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
步骤五：在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液。
所述结合液包括硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合，优选为硫氰酸胍和蛋白酶K；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:1。
例如所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
步骤六：洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。可使用乙醇、异丙醇或正丁醇洗涤所述含有红细胞DNA的混合液。
具体的为：向步骤四得到的含有红细胞DNA的混合液中加入等体积的无水乙醇，50μl 50mg/ml的硅羟基磁珠，旋转结合45min；然后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后再加入漂洗液I(1M异硫氰酸胍，1％TritonX-100，50％乙醇)至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；之后再加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；然后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再次加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；之后将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体光泽时，再加入TE(10mMTris-HClpH8.0,0.1mM EDTA)，重悬磁珠，加热至65℃，保持10min，然后转移洗脱下的DNA溶液至新的离心管中，即可得到所述DNA。
本申请还提供一种用于对受试者进行癌症检测的系统，包括：
对受试者红细胞的DNA进行亚硫酸盐转化的构件；
检测甲基化的构件。
所述检测甲基化的构件为Septin 9基因甲基化检测试剂盒。
在本申请中，所述系统还包括：获取受试者红细胞DNA的构件，所述获取受试者红细胞DNA的构件包括：
样品单元，所述样品单元用于提供人外周血样品；
稳定单元，所述稳定单元用于稳定人外周血样本中红细胞状态；
分离单元，所述分离单元用于离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
裂解单元，所述裂解单元用于在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液特异性地裂解红细胞，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
结合单元，所述结合单元用于在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
洗涤单元，所述洗涤单元用于洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。
在本申请中，在所述稳定单元中，所述人外周血样品与红细胞稳定剂混合、放置一段时间，该段时间可以为1h-72h，优选为24h，以提高所述人外周血样品中的红细胞的稳定性，便于后续分离。
在具体实施过程中，所述人外周血样品与红细胞稳定剂混合，放置1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h、31h、32h、33h、34h、35h、36h、37h、38h、39h、40h、41h、42h、43h、44h、45h、46h、47h、48h、49h、50h、51h、52h、53h、54h、55h、56h、57h、58h、59h、60h、61h、62h、63h、64h、65h、66h、67h、68h、69h、70h、71h或72h。
所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比为10-20：1，优选为10:1。
在具体实施方式中，所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比可以为10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1或20:1。
所述红细胞稳定剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2、甲醛聚合物、乙醛聚合物、丙醛聚合物、碱性盐、盐酸、Tris中的一种或两种以上的组合。
在本申请中，在所述分离单元中，所述人外周血样品通过直接离心或密度梯度离心法，将所述人外周血中的红细胞、白细胞、血浆粗分离，获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
在本申请中，在所述裂解单元中，采用红细胞裂解液特异性地破坏红细胞的细胞膜，使红细胞中的DNA和血红蛋白释放至裂解液中，然后通过离心弃去粒细胞和其他沉淀；
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:2。
例如所述红细胞与红细胞裂解液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
在本申请中，在所述结合单元中，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液
在本申请中，所述结合液包括硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合，优选为硫氰酸胍和蛋白酶K；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10之间任一比例，优选为1:1。
例如所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比可以为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。
在本申请中，在所述洗涤单元中，使用乙醇、异丙醇或正丁醇洗涤所述含有红细胞DNA的混合液。
本申请还提供一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA通过亚硫酸盐转化和甲基化在检测癌症中的用途。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
使用EDTA抗凝管(BD，货号367863)采集受试者全血，全血放置于5℃左右的冰箱中，全血样本放置时间及样本编号见表1，在5ml全血样本中加入5ml PBS稀释全血，得到稀释后的全血样本。
在全血样本中加入红细胞稳定剂(红细胞稳定剂中包括EDTA5％、氟化钠5％、氢氧化钠溶液2.5％、Tris-HCl缓冲体系2.5％)混合。
在离心管中加入密度为1.077±0.001g/mL的聚蔗糖溶液3ml，取3ml稀释后的全血样本小心的平铺于聚蔗糖溶液上，室温，水平转子1000g，离心20min。离心后将出现明显的分层，用注射器穿透离心管壁，转移离心管底部的含有少量粒细胞的红细胞至新的离心管。
在含有少量粒细胞的红细胞的离心管中加入ACK红细胞裂解液(含有少量粒细胞的红细胞与ACK红细胞裂解液体积比为1:2)，颠倒混匀数次，使红细胞充分裂解。然后离心20min，转移上层液体至新的离心管中(上层中含有DNA和血红蛋白)。
向含有上层液体的离心管中加入等体积的结合液(2M异硫氰酸胍，2％TritonX-100)，10μl蛋白酶K(20mg/ml)，60℃裂解消化30min，将血红蛋白与DNA分离，得到含有DNA的混合液。
向含有DNA的混合液中加入等体积的无水乙醇，50μl 50mg/ml的硅羟基磁珠，常温旋转结合45min；离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再加入漂洗液I(1M异硫氰酸胍，1％TritonX-100，50％乙醇)至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；然后离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再次加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体光泽时，加入TE(10mM Tris-HCl pH8.0,0.1mM EDTA)溶解，重悬磁珠，加热至65℃，保持10min。将转移洗脱下的DNA溶液至新的离心管中，紫外分光光度法及电泳检测DNA提取效果：红细胞中的DNA大小分布为500-2000bp，区别于常见的基因组DNA的大小。提取量见下表1。
表1为各实施例以及对比例的各项参数
Figure BDA0003377049690000151
Figure BDA0003377049690000161
注：样品1-6、10-15血样品放置时间是指采集到血样品后，血样品立即与红细胞稳定剂混合之后的放置的时间，样品7-9、16-18血样品中不添加红细胞稳定剂，血样品放置时间是指血样品采集之后放置的时间。
实施例2
使用EDTA抗凝管(BD，货号367863)采集正常人受试者全血，全血放置于5℃左右的冰箱中，分为两组，一组加入红细胞稳定剂，一组不加入，本实施例采用实施例1中最优的实验条件，即血样品与红细胞稳定剂的体积比10：1，放置24小时，具体样本信息及结果见表2，在5ml全血样本中加入5ml PBS稀释全血，得到稀释后的全血样本。
在全血样本中加入红细胞稳定剂(红细胞稳定剂中包括EDTA5％、氟化钠5％、氢氧化钠溶液2.5％、Tris-HCl缓冲体系2.5％)混合。
在离心管中加入密度为1.077±0.001g/mL的聚蔗糖溶液3ml，取3ml稀释后的全血样本小心的平铺于聚蔗糖溶液上，室温，水平转子1000g，离心20min。离心后将出现明显的分层，用注射器穿透离心管壁，转移离心管底部的含有少量粒细胞的红细胞至新的离心管。
在含有少量粒细胞的红细胞的离心管中加入ACK红细胞裂解液(含有少量粒细胞的红细胞与ACK红细胞裂解液体积比为1:2)，颠倒混匀数次，使红细胞充分裂解。然后离心20min，转移上层液体至新的离心管中(上层中含有DNA和血红蛋白)。
向含有上层液体的离心管中加入等体积的结合液(2M异硫氰酸胍，2％TritonX-100)，10μl蛋白酶K(20mg/ml)，60℃裂解消化30min，将血红蛋白与DNA分离，得到含有DNA的混合液。
向含有DNA的混合液中加入等体积的无水乙醇，50μl 50mg/ml的硅羟基磁珠，常温旋转结合45min；离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再加入漂洗液I(1M异硫氰酸胍，1％TritonX-100，50％乙醇)至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；然后离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；再次加入80％的无水乙醇，至离心管中，充分悬浮洗涤磁珠；再将离心管至于磁力架上，吸附磁珠至离心管内壁，吸弃废液，保留磁珠；然后将磁珠室温晾干至磁珠表面无明显液体光泽时，加入TE(10mM Tris-HCl pH8.0,0.1mM EDTA)溶解，重悬磁珠，加热至65℃，保持10min。将转移洗脱下的DNA溶液至新的离心管中，使用Septin 9基因甲基化检测试剂盒(博尔诚(北京)科技有限公司)对红细胞DNA和血浆cfDNA进行亚硫酸盐转化和PCR扩增，对比加入红细胞稳定剂和不加入条件下红细胞DNA的Septin9基因的甲基化状态和cfDNA的Septin9基因的甲基化状态，以cfDNA的甲基化结果为标准，看红细胞的检测结果是否与之相符，结果对比见下表2。
表2实施例的甲基化状态对比
Figure BDA0003377049690000171
Figure BDA0003377049690000181
小结：在本申请的提取步骤中，红细胞稳定剂具有保护组织细胞的作用，通过在新鲜的血样品中加入所述红细胞稳定剂，可以保持红细胞内的DNA原有的甲基化状态的同时保护DNA不降解，从表1可以看出加入红细胞稳定剂后，放置24h以及48h后的血样品提取的DNA的含量更高，同时，放置24小时的情况下，未添加红细胞稳定剂的样本DNA的甲基化程度会发生变化，亚硫酸盐转化后添加红细胞稳定剂的样本DNA结果和cfDNA一致，均未出现甲基化，而未添加红细胞稳定剂的样本DNA则为阳性，与cfDNA结果不一致，通过以上两个实验说明添加红细胞稳定剂后放置24h的样本进行癌症检测的结果准确率更高，这是因为加入红细胞稳定剂后，红细胞稳定剂需要一定的时间来稳定血样品中的红细胞。另外对于未加红细胞稳定剂的血样品，由于血样品在离开人体后，血液中的红细胞会快速老化并发生降解，因此血样品放置时间越久，从红细胞中提取出来的DNA含量越少，在进行亚硫酸盐转化后与血浆中cfDNA结果吻合度越低，从而进行癌症检测的结果准确率越低，检测结果误差越大。因此本申请中的红细胞稳定剂、红细胞裂解液及结合液的配方以及提取方法均针对甲基化基因检测实验进行了优化，选择了不干扰甲基化基因检测实验的原料，最大程度上保证基因甲基化检测实验的顺利进行。
实施例3
对肠癌1例、肝癌1例、正常人6例进行采血，采血后采用实施例1中的方法提取红细胞中的DNA，并采用博尔诚(北京)科技有限公司的Septin9基因甲基化检测试剂盒(PCR荧光探针法，国械注准20153401481)，按照说明书，对提取的DNA进行亚硫酸盐的转化和甲基化PCR检测，结果显示：6例正常人为阴性，1例肠癌患者红细胞提取的DNA Septin9甲基化呈阳性，1例肝癌患者红细胞提取的DNA Septin9甲基化呈阳性，因此采用本申请的提取方法提取到的红细胞DNA可以有效地检测癌症。
尽管以上结合对本申请的实施方案进行了描述，但本申请并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本申请权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本申请保护之列。

Claims (16)

1.一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA，所述DNA进行亚硫酸盐转化后用于通过基因的甲基化水平来检测癌症或癌症患病风险。
2.根据权利要求1所述的DNA，其特征在于，所述癌症包括肝癌、结直肠癌、胃癌、食管癌、肺癌、宫颈癌、胰腺癌、乳腺癌或头颈癌。
3.一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA的方法，其特征在于，包括如下步骤：
提供人外周血样品；
向所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂；
离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得DNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，向所述人外周血样品中加入红细胞稳定剂后放置一段时间；
所述人外周血样品与所述红细胞稳定剂的体积比为10-20：1；
所述红细胞稳定剂选自EDTA、柠檬酸盐、氟化钠、原矾酸钠、甘油磷酸钠、焦磷酸钠、四咪唑盐酸盐、苯甲基磺酰氟、胃蛋白酶抑制剂、EDTA-Na2、甲醛聚合物、乙醛聚合物、丙醛聚合物、碱性盐、盐酸、Tris中的一种或两种以上的组合。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，通过直接离心或密度梯度离心法将所述人外周血中的红细胞、白细胞、血浆粗分离，获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，采用红细胞裂解液特异性地破坏红细胞的细胞膜，使红细胞中的DNA和血红蛋白释放至裂解液中，然后通过离心除去粒细胞和其他沉淀物质；
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液；
所述结合液包括硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10。
8.一种用于对受试者进行癌症检测的系统，其特征在于，包括：
对受试者红细胞的DNA进行亚硫酸盐转化的构件；以及
检测所述DNA甲基化水平的构件。
9.根据权利要求8所述的系统，其特征在于，检测甲基化水平的构件为Septin 9基因甲基化检测试剂盒。
10.根据权利要求8或9所述的系统，其特征在于，还包括：获取受试者红细胞DNA的构件，所述构件包括：
样品单元，所述样品单元用于提供人外周血样品；
稳定单元，所述稳定单元用于稳定人外周血样本中红细胞状态；
分离单元，所述分离单元用于离心分离获得含有少量粒细胞的红细胞样品；
裂解单元，所述裂解单元用于在含有少量粒细胞的红细胞样品中加入红细胞裂解液，从而获得含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液；
结合单元，所述结合单元用于在所述含有红细胞DNA和血红蛋白的混合液中加入结合液，从而获得含有红细胞DNA的混合液；
洗涤单元，所述洗涤单元用于洗涤所述含有红细胞DNA的混合液，获得所述DNA。
11.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，在所述稳定单元中，所述人外周血样品与红细胞稳定剂混合、放置一段时间，以提高所述人外周血样品中的红细胞的稳定性。
12.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，在所述分离单元中，通过直接离心或密度梯度离心法将所述人外周血中的红细胞、白细胞、血浆粗分离，获得含有少量粒细胞的红细胞样品。
13.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，在所述裂解单元中，采用红细胞裂解液特异性地破坏红细胞的细胞膜，使红细胞中的DNA和血红蛋白释放至裂解液中，然后通过离心弃去粒细胞和其他沉淀物质；
所述红细胞裂解液选自NH4Cl、KHCO3、EDTA-Na2或Tris中的一种或两种以上的组合；
所述红细胞与红细胞裂解液的体积比为1:1-10。
14.根据权利要求10所述的系统，其特征在于，在所述结合单元中，所述结合液用于结合血红蛋白，从而将红细胞中的DNA和血红蛋白分离，获得含有红细胞DNA的混合液；
所述结合液选自硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠、尿素或作用于蛋白的酶中的一种或两种以上的组合；
所述结合液与所述红细胞DNA和血红蛋白的混合液的体积比为1:1-10。
15.一种从人外周血红细胞分离或提纯的DNA在利用甲基化水平来检测癌症或预测癌症患病风险中的用途。
16.根据权利要求15所述用途，其特征在于，所述从人外周血红细胞分离或提纯的DNA通过权利要求3-7中任一项所述的方法获得。
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