CN105223361B - 一种检测急性t淋巴细胞白血病幼稚t细胞的试剂盒、应用及方法 - Google Patents

一种检测急性t淋巴细胞白血病幼稚t细胞的试剂盒、应用及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒、应用及方法，属于生物医药领域，采取的技术方案是：一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，所述试剂盒中配置了针对包括下述物质的单克隆抗体：TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45，所述抗体分别带有荧光标记。本发明还提供了上述试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用。采用本发明产生的有益效果在于：（1）采用本发明的试剂盒可快速、准确地对所有T‑ALL患者微量LBTC的抗原表达进行分析及定量；（2）采用本试剂盒提供的设门方法及多个抗原标志综合评判，特异度高，敏感度高。

Description

一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒、应用及 方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及细胞表型确认的专用试剂盒，具体涉及一种用于分析急性T淋巴细胞白血病的白血病幼稚T细胞（leukemic blastic T cell，LBTC）表型的试剂盒、应用及方法。
背景技术
急性T淋巴细胞白血病（T-lineage acute lymphoblastic leukemia，T-ALL）在儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）和成人ALL中分别占15%和25%，异质性大。随着治疗方案的优化，儿童ALL的诱导缓解率和长期生存率得到了显著提高，但T-ALL的预后仍然较差；成人ALL总体的5年无事件生存仅在30%左右，而T-ALL的长期生存更差。由于目前微小残留检测水平有限，复发成为T-ALL患者治疗失败的主要原因，也是影响长期生存的重要问题，复发后的患者，即使加强化疗或进行造血干细胞移植等挽救措施，预后仍然较差，多数患者因此而丧生。
T-ALL是一种骨髓中幼稚T细胞恶性增长的疾病， T细胞分化发育的主要场所是胸腺，正常机体胸腺内可见不同发育阶段的T细胞，胸腺内早期幼稚T细胞表达CD34、TdT、CD7和胞浆CD3(cCD3)，CD45表达较弱，胞膜CD3(mCD3)阴性，随着细胞成熟，CD34和TdT相继消失，CD45表达增强，mCD3转为阳性；骨髓中的正常T细胞为成熟T细胞，表型为CD45str+cCD3+CD7+mCD3+CD5+TdT-CD34-，CD34+和TdT+的幼稚T细胞比例极低。T-ALL患者主要表现为骨髓或外周血中幼稚T细胞明显增加，常伴早期抗原CD34和TdT表达、mCD3多为阴性或弱表达、CD5阴性或弱表达、CD4和CD8双阴或双阳等，与成熟T细胞表型有明显差别，这些标志均是LBTC相关免疫表型特点，用以区别正常T细胞。LBTC表型还可出现：抗原不同步表达（如mCD3和CD2同时弱阳性）、抗原系列不保真（髓系抗原CD13和CD33阳性）、抗原表达缺失（如CD2阴性）或抗原表达强度改变（如CD7强表达、CD45弱表达）等。
由于发病率较低，有关初诊及治疗后T-ALL患者的检测报道较少，且多是采用三色或四色抗体组合，在检测治疗后ALL-T幼稚细胞时国际上普遍根据初诊时的免疫表型，设计治疗后检测的抗体，一般采用3-4管3色或4色抗体组合，如果没有初诊时的免疫表型，则无法利用较少的抗体组合进行治疗后白血病细胞的检测。而国内部分患者由于初诊时就诊医院的医疗条件较差，没有进行全面的抗原检测，缺乏初诊时免疫表型资料，对此类患者，按照国际上的惯例则不能利用较少的抗体进行检测，需按照初诊时检测免疫表型的方法，使用多种抗体对患者进行全面的抗原分析，费用较高。
另一方面，早期文献报道，胸腺中的幼稚T细胞出现在骨髓或外周血时，称为异位性表达。胸腺中早期幼稚T细胞表达CD34和/或TdT，当时依据的主要抗原是TdT和CD7，因此认为当骨髓或外周血中TdT+CD7+幼稚T细胞比例增高时，则为微小残留病阳性，但对于T-ALL治疗后骨髓中CD34+TdT+cCD3+ 的T细胞比例增高的样本，其是否是LBTC、是否说明白血病细胞增加还是非特异性结合尚不清楚。因此，对治疗后患者检测LBTC时，如何准确、快速、简单的对非特异结合的细胞进行排除性鉴别也是本领域的难题之一。
可见，开发具有疾病特异性的、较少量抗体组合的试剂，广泛适用于初诊患者，同时对于多数治疗后T-ALL患者、T-AL L复诊患者，可不依赖于初诊时的免疫分型资料，鉴别LBTC对本领域技术的进步具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒、应用及方法，利用该试剂盒中的专用试剂和配套使用方法、借助七色流式细胞仪的辅助，可以快速、准确地分析T-ALL患者LBTC的抗原表达，对T-ALL患者体内异常幼稚T细胞快速、准确分类，还可作为组成用于制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品。
本发明采取的技术方案是：
一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，所述试剂盒中配置了针对包括下述物质的单克隆抗体：TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45，所述抗体分别带有荧光标记。
优选的，所述针对TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45的单克隆抗体依次带有下述荧光标记：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue。
优选的，所述试剂盒中还包括红细胞溶解液和和包含细胞固定液、破膜液的固定/破膜剂。
本发明还提供上述试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用，对样本依次进行下述预处理步骤：
① 将样本与CD34-PerCP-Cy5.5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和CD45-Pacific Blue混匀后避光室温孵育10-20分钟，得混合液I；
② 向混合液I加入红细胞溶解液，混匀后避光，室温放置 5-10分钟，以1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入细胞固定液，混匀后避光孵育10-20min；
③ 加入 pH 为7.2~7.4的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入破膜液，同时加入TdT-FITC和cCD3-PE，混匀，避光孵育5-10分钟；
④ 加入含血清0.5%~2%的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入pH 为7.2~7.4的PBS缓冲液，混匀即得待测样本。
优选的，所述待测样本采用流式细胞仪进行测试，并借助分析软件按下述步骤分析数据：
①先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域设门标记为P1；
②对P1内细胞建立cCD3/SSC二维散点图，将cCD3+SSC小细胞设门标记为P2；
③对P2门内细胞建立CD45/cCD3二维散点图，将cCD3+CD45+/dim+细胞设门标记为P3；
④对P3门内细胞建立CD34/CD5、TdT/CD7和CD5/mCD3二维散点图，分别显示各群细胞的比例及CD34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较CD34、TdT、CD7、CD5和mCD3的荧光表达强度与正常T细胞的表达强度。
本发明还提供了一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的方法，基于流式细胞仪，所述方法包括以下步骤：
（1）对样本依次进行下述预处理：
① 将样本与CD34-PerCP-Cy5.5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和CD45-Pacific Blue混匀后避光室温孵育10-20分钟，得混合液I；
② 向混合液I加入红细胞溶解液，混匀后避光，室温放置 5-10分钟，以1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入固定/破膜剂中细胞固定液，混匀后避光孵育10-20min；
③ 加入 pH 为7.2~7.4的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入破膜液，同时加入TdT-FITC和cCD3-PE，混匀，避光孵育5-10分钟；
④ 加入含血清0.5%~2%的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入pH 为7.2~7.4的PBS缓冲液，混匀即得待测样本；
（2）所述待测样本采用流式细胞仪进行测试，并借助分析软件按下述步骤分析数据：
①先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域设门标记为P1；
②对P1内细胞建立cCD3/SSC二维散点图，将cCD3+SSC小细胞设门标记为P2；
③对P2门内细胞建立CD45/cCD3二维散点图，将cCD3+CD45+/dim+细胞设门标记为P3；
④对P3门内细胞建立CD34/CD5、TdT/CD7和CD5/mCD3二维散点图，分别显示各群细胞的比例及CD34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较CD34、TdT、CD7、CD5和mCD3的荧光表达强度与正常T细胞的表达强度。
上述技术方案中，本发明提供的试剂盒利用较少的抗体数量设计合适的抗体组合，提供一组七色抗体组合，在七色流式细胞仪的基础上，运用本发明提供的方法，在一个样本只需在同一试管中处理，特异性的设门分析，即可对LBTC的抗原表达情况综合的、准确的分析，可有效鉴别正常T细胞、微量的幼稚T细胞及非特异性结合，所述七色抗体组合可对所有初诊和复发T-ALL患者LBTC上的抗原表达进行鉴别并定量，适用于所有形态学完全缓解的T-ALL患者。本发明提供上述试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用，作为诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的一种组成。
采用本发明产生的有益效果在于：（1）采用本发明的试剂盒可对一个样本只用一个试管就快速、准确地对LBTC的抗原表达进行分析及定量；（2）该试剂盒广泛适用于所有T-ALL患者的微量LBTC分析；（3）采用本试剂盒提供的设门方法及多个抗原标志综合评判，特异度高，敏感度高；（4）所需样本量少，即可得到检测结果，时间、成本都有效降低。
附图说明
图1是采用本发明试剂盒对T-ALL患者LBTC的抗原表达进行设门分析；
图2是初诊T-ALL患者T细胞抗原表达的阳性比例。
具体实施方式
本发明提供一种检测急性T淋巴细胞白血病中LBTC抗原表达的试剂盒，其包括针对下列抗原表型的单克隆抗体：TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45，依次分别带有下述荧光标记：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue，各单克隆抗体的荧光标记及成分等信息见下表1。
表1单克隆抗体信息
。
上述试剂盒中还可以包括红细胞溶解液和细胞的固定/破膜剂，本实施例选用购于BD公司的红细胞溶解液（10×，货号：555899）和购于Multisciences公司的固定/破膜剂（货号：GAS006，包括A液20ml和B液 20ml，A液作用为固定细胞，B液用于破膜，使抗体顺利进入胞内，并使细胞形态仍然保存完整），另配制pH 为7.2~7.4的10×PBS缓冲液，10× PBS缓冲溶液的配制方法如下：称取26.3g Na2HPO4·12H2O、3.0gNaH2PO4·2H2O和85.0g NaCl，加水至1L，搅拌均匀。
采用本发明的试剂盒对T-ALL患者骨髓T细胞的抗原表达进行分析测定的步骤如下：
步骤一、试剂的制备
1、以蒸馏水：10× PBS缓冲液按照体积比9:1混合，将10× PBS缓冲液稀释为PBS缓冲液，pH 为7.2~7.4，备用；
2、以体积比计，将10×红细胞溶解液用PBS缓冲液稀释10倍，得1×红细胞溶解液，备用；
3、向PBS缓冲液中加入小牛血清和NaN3，使血清终浓度为0.5%~2%（体积比）、NaN3终浓度为0.1%（质量比），得含血清0.5%~2%的PBS缓冲液，4 ℃保存；
步骤二、待测样本的制备
1、取一支洁净的流式细胞仪专用试管，向该试管中分别加入CD34-PerCP-Cy5.52.5μL、CD5-PE-Cy7 2.5μL、CD7-APC 10ul、mCD3-APC-Cy7 2.5μL和CD45-Pacific Blue 2.5μL，再加入150μL骨髓样本（含1×106个细胞），轻轻混匀，室温（环境温度保持在22℃左右）避光孵育15分钟；
2、向试管中加入1×红细胞溶解液2mL，混匀后避光，室温放置 8分钟，溶解红细胞；
3、将试管放入离心机，以1500转/分、离心8分钟，弃上清液，向试管中加入固定/破膜剂中A液 100μL，震荡混匀，避光孵育15min；
4、加入PBS缓冲液500μL，混匀，再放入离心机，以1500转/分、离心8分钟，弃上清液，向试管中加入破膜剂中B液100μL，并同时加入5μL TdT- FITC和5ul cCD3 -PE，轻微混匀，避光孵育15min；
5、加入2mL含血清0.5%~2%的PBS缓冲液，混匀，放入离心机，以1500转/分离心8分钟，弃上清液，将未结合的游离抗体去除，再向试管中加入300μL PBS缓冲液，混匀即得待测样本。
步骤三、采用流式细胞仪进行检测
按照流式细胞仪的操作规程，对步骤二中制备的待测样本进行测试，获取750,000个有核细胞；用流式细胞仪分析软件进行数据分析。
参见附图1，设门分析过程如下：
①先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域划为P1，以排除死细胞和细胞碎片；②对P1细胞显示cCD3/SSC散点图，将cCD3+SSC小细胞划为P2，初步选定T细胞；③对P2门内细胞显示CD45/cCD3散点图，将cCD3+CD45+/dim+细胞划为P3；④对P3内细胞显示CD34/CD5、TdT/CD7和CD5/mCD3图，分别显示各群细胞的比例及CD34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较CD34、TdT、CD7、CD5和mCD3的荧光表达强度与正常T细胞的表达情况。
数据说明：计算抗原表达的阳性比例， <20%定义为阴性（-），≥20%为阳性（+），其中20%-60%和≥60%分别定义为部分表达（1+）和全部阳性（2+）；以正常T细胞的抗原表达强度为标准，当白血病细胞的抗原表达比正常T细胞抗原表达强的定义为强表达（str+），反之为弱表达（dim+）。初诊和复发患者的LBTC异常表型及所涉及的异常抗原表达情况见表3及表4。
采用上述方法，对收集的1146份样本进行LBTC抗原表达分析，样本来自2001年11月-2013年3月在北京大学人民医院、北京大学血液病研究所收治的112例初诊T-ALL患者，中位年龄20(1.5-83)岁，共112份样本；2010年1月-2013年2月期间治疗后的T-ALL患者140例，中位年龄22(2-61)岁，其中包括复发患者44例，106份样本，治疗后患者在不同时期分别采集有多个样本。
1.初诊及复发T-ALL患者的LBTC抗原表达比例分析
首先，分析112例初诊和44例复发T-ALL患者的抗原表达特点，结果见表2，所有患者全部表达CD45和cCD3，几乎全部患者表达CD7，大部分患者表达CD5，50%以上的患者表达早期抗原CD34和TdT，而mCD3的表达以阴性为主。初诊和复发患者CD34的阳性表达率均在50%-60%之间，初诊患者TdT的阳性表达较高，为74.4%，复发患者TdT的阳性表达率略低，为54.5%；初诊和复发患者的mCD3均以阴性表达为主，阴性率分别为53.2%和95.5%。初诊患者TdT和CD34的阳性表达、mCD3和CD5的阴性表达均是LBTC的特点，可与正常T细胞区分开来。
表2 初诊和复发T-ALL患者LBTC中抗原表达的比例分析
。
将上述初诊T-ALL患者的LBTC分析结果以抗原表达的阳性率形式显示，见附图2，可以看出，TdT、CD34、mCD3和CD5的阳性率差异较大，虽然异常表达率较高，但采用其中任一抗体均不能代表所有白血病细胞；而且，抗原多为部分异常表达，阳性表达比例在20%-60%之间，这样会影响LBTC的分析，因此，有必要联合采用多种抗体检测治疗后T-ALL患者体内微量的白血病细胞，以提高准确性与敏感性。
2.初诊及复发T-ALL患者的LBTC异常表型的发生率分析
进一步的采用本试剂盒的抗体组合，分析初诊及复发T-ALL患者的LBTC异常表型，由于收集患者比较困难，年份跨度比较大，实验过程中样本人员有变动，部分测定指标并非对所有样本进行测试，最终以实际所采集的样本数目为准进行统计分析并列表，初诊和复发患者的LBTC异常表型及所涉及的异常抗原表达情况见表3及表4，根据表3结果可见，在80例初诊及44例复发患者中，TdT+或CD34+或TdT和 CD34同时阳性的发生率均较高，分别占87.5%和81.8%，因此TdT+和CD34+是识别LBTC较敏感的抗原标志。少数患者为TdT-CD34-，初诊患者中占12.5%，复发患者中占18.2%。在TdT-CD34-的10例初诊和8例复发患者中，mCD3-或部分表达者各有8例，这些患者cCD3均为阳性，同时CD45dim+，与正常T细胞的mCD3+cCD3+CD45str+表型明显不同，因此mCD3-cCD3+CD45dim+也是LBTC的表型特点。
LBTC的异常表型还包括抗原表达完全缺失或部分缺失，结果见表4，尤以CD5缺失的发生率较高，112例初诊患者完全缺失和部分缺失的发生率分别为26.8%和25.9%；44例复发患者以完全缺失为主，完全缺失和部分缺失分别占20.5%和2.3%。另外，LBTC的抗原表达强度会发生变化，与正常骨髓T细胞相比，CD45dim+、CD7str+和CD5dim+最常见。
另在TdT-CD34-的10例初诊患者中，有2例表型为mCD3+cCD3+，其中1例CD45dim+CD7-，1例CD45dim+CD5-，本试剂盒均可以识别这些异常的抗原表达，从而与正常T细胞及非特异性结合进行鉴别。
以上结果说明，本发明的试剂盒几乎可以识别所有初诊和复发患者的LBTC表型，即使缺乏初诊时特异的抗原表达资料，仍可以利用本试剂盒进行分析。
表3初诊和复发T-ALL患者的LBTC异常表型发生率Ⅰ
。
表4 初诊和复发T-ALL患者的LBTC异常表型发生率Ⅱ
。
3.初诊、复发及治疗后T-ALL患者中存在微量LBTC（LBTC+）的患者LBTC表达的异常抗原数
LBTC的抗原表达存在以下一种或多种异常：TdT+、CD34+、CD45dim+、cCD3dim+、CD7dim+/str+/-，CD5dim+/str+/-和mCD3dim+/str+/-。由于T-ALL发病率较低，收集患者比较困难，年份跨度比较大，对初诊患者中的79例和复发患者44例同时应用七种抗体检测表达异常的抗原数目及其所占比例，结果见表5 ，若测定结果中异常抗原数越多，表明检测的准确性和特异度越高，采用本发明试剂盒，初诊和复发患者LBTC全部具有异常表型，且所有初诊患者和复发患者的LBTC的异常抗原数≥2个，说明本试剂盒包含的抗体组合适用于初诊患者及复发患者的LBTC表型分析，且准确性和特异度高。
采用本试剂盒对治疗后T-ALL患者的不同时间点所采集的样本进行了检测，其中有6 9份样本在形态学上完全缓解，但流式结果提示存在异常表型的LBTC，数据见表5中LBTC+列，异常表型的LBTC同时有2-5个异常抗原表达异常，结果提示，采用本试剂盒可以用于对治疗后T-ALL患者体内微量的LBTC表型进行分析，其表达的异常抗原数多，准确可靠。
表5 初诊、复发及治疗后患者LBTC表达的异常抗原数目
。
4.治疗后T-ALL患者的LBTC与基因及临床综合分析
运用本发明试剂盒提供的七色抗体组合检测治疗后T-ALL患者，对92例形态学完全缓解患者在治疗后的不同时间点进行了连续追踪，共检测1040份样本。
（1） 流式结果为LBTC+患者
46例患者69份样本形态学缓解，但采用本发明试剂盒中的七色抗体组合在流式细胞仪上检测可见微量的LBTC，中位比例为0.97%（0.03%-17.67%）。14份样本初诊时特异性基因（SIL-TAL1）阳性，同时进行基因残留追踪，结果显示有13份样本阳性，1份样本阴性，说明与特异性PCR（聚合酶链反应）基因检测相比，本发明的试剂盒检测的符合率为92.9%(13/14)，说明运用本发明提供的方法具有较高的特异性和准确性。46例患者中20例最终出现血液学复发，复发率为43.5%；共包括30份样本，其中26份复发的样本同时检测泛白血病的基因标志-WT1，12份样本WT1阳性，14份样本WT1阴性。结果说明，与WT1基因检测相比，本试剂盒检测微量LBTC的敏感性高于WT1，比WT1 基因检测适用范围更广、复发的预测能力更强。
本组数据检测到的LBTC最低比例为0.03%，由于正常骨髓和外周血不存在LBTC，本组试剂盒推荐获取75万个细胞，理论上灵敏度至少可达0.01%。
（2） CD34+和/或TdT+细胞比例增高患者
A.CD34+和/或TdT+细胞在正常骨髓和外周血中的表达：
利用本发明的试剂盒，我们对10例正常骨髓和15例正常外周血进行了检测，结果发现，CD34+细胞在有核细胞中的中位比例分别为0.005%(0.000%-0.020%)和0.002%(0.000%-0.006%)，TdT+细胞在有核细胞中的中位比例分别为0.005%(0.002%-0.028%)和0.002%(0.000%-0.018%)，表型均为CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+，与胸腺CD34+TdT+且CD45dim+mCD3-幼稚T细胞的表达明显不同，所有的骨髓和外周血样本中，均未见与报道的胸腺表型相同的幼稚T细胞。因此，这些细胞应该不属于异位表达。但这些CD34+和/或TdT+CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+是否为骨髓及外周血中正常的幼稚T细胞，我们对其比例增加的样本进行了分析。
B.CD34+和/或TdT+细胞比例位于0.00%-0.10%之间：
65例治疗后T-ALL患者507份样本中，cCD3+TdT+和cCD3+CD34+细胞在有核细胞中的比例位于0.00%-0.10%之间，中位比例均为0.01%，表型为CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+，均未见抗原表达强度改变，不似LBTC，经临床随访，这些患者长期处于缓解状态，没有出现临床复发。基因结果也没有出现异常，说明所检测到的CD34+和TdT+细胞不是LBTC，也不属异位表达细胞，其在有核细胞中的比例均低于0.10%。
C.CD34+和/或TdT+细胞比例高于0.10%，但表型仍为CD45str+cCD3+
CD7+CD5+mCD3+的样本
8份（8/1040）份样本中，CD34+和/或TdT+细胞比例高于0.10%且表型均为CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+，比例位于0.11%-0.27%之间。因这些患者均不存在特异基因异常，故无法与特异基因进行比较以鉴别是否为LBTC。其中2份样本同时WT1表达稍高于正常，但在随后的随访中全部归于正常。其他患者全部为WT1阴性；8份样本中3份在随访过程中曾出现异常的LBTC，但与此表型不符，除CD34和/或TdT表达外，均存在其它抗原表达异常，与发病时相同；剩余5份样本随访过程中未出现LBTC，且随访期内（16m-60m）未见复发。另外，此8份样本均具有较多增殖期B细胞，这些B细胞部分表达CD34和TdT，通过同时标记B细胞抗原CD10和CD19证实，CD34+和/或TdT+且CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+细胞同时表达B细胞标志。结果说明，这些CD34+和/或TdT+细胞不是LBTC，是因为骨髓处于增生期而造成的非特异性结合。因此，提示在分析中，尤其是对增生较旺盛的骨髓样本，要注意与这些非特异性结合染色造成的假的CD34+和/或TdT+“幼稚T细胞”进行鉴别。
D.CD34和TdT在LBTC的表达分析
69份样本检测到LBTC，CD34+和/或TdT+细胞比例增高的样本共54份，均可见其它抗原标志异常，无1份表型与正常T细胞的CD45str+cCD3+CD7+CD5+mCD3+相同。。
结果提示，利用本发明的试剂盒检测LBTC时，通过全面的抗原分析，可以鉴别LBTC、正常的T细胞及非特异性信号；尤其是骨髓处于增殖期，存在较高比例的幼稚B细胞时，可以有效避免将非特异的CD34+和/或TdT+细胞判断为LBTC，从而为临床提供准确的分析结果。
综上所述，本研究结果表明，通过本发明的试剂盒并借助七色流式细胞仪有助于精确识别LBTC，适用于所有复发和治疗后T-ALL患者LBTC的分析，具有较高的敏感性，可与基因检测互相补充，为临床诊疗评价疗效及预测复发提供参考。

Claims (5)

1.一种检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，该试剂盒的应用基于流式细胞仪，其特征在于，所述试剂盒中配置了单克隆抗体，所述单克隆抗体由分别针对TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45的7种组成，所述抗体分别带有荧光标记。
2.根据权利要求1所述的检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，其特征在于，所述针对TdT、cCD3、CD34、CD5、CD7、mCD3和CD45的单克隆抗体依次带有下述荧光标记：FITC、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和Pacific Blue。
3.根据权利要求1所述的检测急性T淋巴细胞白血病幼稚T细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括红细胞溶解液和包含细胞固定液、破膜液的固定/破膜剂。
4.权利要求2所述的试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用，其特征在于，应用时对样本依次进行下述预处理步骤：
① 将样本与CD34-PerCP-Cy5.5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和CD45-PacificBlue混匀后避光室温孵育10-20分钟，得混合液I；
② 向混合液I加入红细胞溶解液，混匀后避光，室温放置 5-10分钟，以1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入细胞固定液，混匀后避光孵育10-20min；
③ 加入 pH 为7.2~7.4的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分、离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入破膜液，同时加入TdT-FITC和cCD3-PE，混匀，避光孵育5-10分钟；
④ 加入含血清0.5%~2%的PBS缓冲液，混匀，1000-2000转/分离心5-10分钟，弃上清，向沉淀中加入的PBS缓冲液，混匀即得待测样本。
5.根据权利要求4所述的试剂盒在制备诊断急性T淋巴细胞白血病的产品中的应用，其特征在于，所述待测样本采用流式细胞仪进行测试，并借助分析软件按下述步骤分析数据：
①先建立FSC/SSC密度图，将有核细胞区域设门标记为P1；
②对P1内细胞建立cCD3/SSC二维散点图，将cCD3+SSC小细胞设门标记为P2；
③对P2门内细胞建立CD45/cCD3二维散点图，将cCD3+CD45+/dim+细胞设门标记为P3；
④对P3门内细胞建立CD34/CD5、TdT/CD7和CD5/mCD3二维散点图，分别显示各群细胞的比例及CD34+和TdT+细胞在有核细胞中的比例，比较CD34、TdT、CD7、CD5和mCD3的荧光表达强度与正常T细胞的表达强度。
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