CN104937418A - 使用反应时间的校准分析 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，所述分析装置在所述流路上包括样品区和检测区，所述方法包括：将所述样品分配到所述样品区上；将所述样品和试剂混合，其中所述样品和试剂可在将所述样品添加至所述样品区之前或在所述分析装置上混合，通过毛细作用使所述所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的所述检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；确定反应时间或反应体积；以及通过使用所述检测信号和所述反应时间或反应体积两者确定所述分析物的浓度。

Description

使用反应时间的校准分析
相关专利申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年11月15日提交的美国临时申请No.61/726,626的优先权，该临时申请的公开内容以引用方式全文并入。
技术领域
本发明涉及诊断分析领域，并且具体地讲涉及待检测的分析物存在于生物或非生物样品中的侧向流分析。
背景技术
诊断分析广泛用于多种疾病的诊断、治疗和管理并且对多种疾病的诊断、治疗和管理十分重要。多年来已经开发出不同类型的诊断分析，以简化对诸如血液、血清、血浆、尿液、唾液、组织活检、粪便、痰、皮肤或咽拭子以及组织样品或处理过的组织样品的临床样品中的各种分析物的检测。很多情况下期望这些分析能给出快速且可靠的结果，同时易于使用并且制造成本低。可以理解，在一次同样的分析中很难满足所有这些要求。在实施过程中，许多分析受到其速度的限制。另一个重要参数为灵敏度。分析技术中的最新进展已导致灵敏度越来越高的测试，其允许检测痕量分析物以及在尽可能早的时间内检测到样品中的疾病指标。
一种常见类型的一次性分析装置包括用于接收液体样品的区或区域、也称为缀合物区的试剂区、以及也称为检测区的反应区。这些分析装置通常称为侧向流测试条。它们采用多孔材料，例如硝化纤维，从而限定能够支持毛细流动的流体流动路径。例子包括在美国专利No.5,559,041、5,714,389、5,120,643和6,228,660中示出的那些，这些专利均以引用方式全文并入本文。
样品添加区在很多情况下由更为多孔的材料组成，该材料能够吸收样品，并且当需要进行血细胞分离时还能有效地捕集红血细胞。此类材料的例子为纤维材料，诸如纸张、起绒布、凝胶或薄纸，包括例如纤维素、羊毛、玻璃纤维、石棉、合成纤维、聚合物或它们的混合物。
另一种类型的分析装置为具有突出部以引起毛细流动的无孔分析装置。此类分析装置的例子包括开放侧向流装置，如在WO 2003/103835、WO 2005/089082、WO 2005/118139和WO 2006/137785中所公开，这些专利均以引用方式全文并入本文。
已知的无孔分析装置在图1中示出。分析装置1具有至少一个样品添加区2、试剂区3、至少一个检测区4和至少一个芯吸区5。这些区形成流路，样品通过该流路从样品添加区流至芯吸区。检测区4中还包括诸如抗体的捕获元件，其能够结合到分析物，任选地沉积在装置上(诸如通过涂布)；以及带标记的缀合物材料，其也能够参与将允许确定分析物的浓度的反应，沉积在装置上的试剂区中，其中带标记的缀合物材料承载用于在检测区中检测的标记。当样品流过试剂区时，缀合物材料被溶解，形成溶解的带标记的缀合物材料的缀合物羽流和向下游流至检测区的样品。当缀合物羽流流入检测区时，缀合的材料将诸如通过缀合的材料与分析物的复合物(如在“夹心”分析中)或直接地(如在“竞争性”分析中)被捕获元件所捕集。未结合的溶解的缀合物材料将快速经过检测区进入至少一个芯吸区5。图1中还示出了突出部或微柱7。诸如在全部以引用方式全文并入的US 20060289787A1、US20070231883A1、US 7,416,700和US6,139,800中所公开的一种仪器能够在检测区中检测结合的缀合材料。常见的标记包括可由仪器检测的荧光染料，该仪器激发荧光染料并且结合了能够检测荧光染料的检测器。
为了根据测量信号(例如荧光信号)产生可报告的结果，需要将校准曲线配制成使测量信号与被分析样品中所关注的分析物的浓度相关。开发校准曲线在本领域中是熟知的并且不需要详细说明。简而言之，以类似于最终使用者在具有未知浓度的分析物的样品上进行分析的方式，在分析装置上运行具有已知不同浓度的分析物(也称为校准器流体)的多种样品。将由诸如分析物/带标记的抗体缀合物的产生分析物信号的复合物所产生的信号读出并记录为多种样品中每一种的数据点。数据点绘制在浓度与信号强度的曲线上。随后可将数据点曲线拟合到公式中，该公式提供随该具体分析的信号强度而变化的分析物浓度。例如，线性相关性可由C＝mS+b表示，其中C为分析物的浓度，S为所测量的信号并且m和b为通过实验确定的常数。非线性相关性可用非线性数学模型表示，诸如logit/log4关系。
对于许多可商购获得的分析，校准曲线在进行分析的工厂中进行开发。由于在进行分析时原料和其他因素的变化，使得可针对产生的每批次分析开发不同的批次特定的校准曲线。随后可将校准曲线数据包括在向最终使用者销售的每批次分析中。或者，当顾客通过所述批次的分析材料、其分析仪以及由制造商提供的一系列校准器材料运行校准过程时，由顾客的分析仪自动地创建校准曲线。
在工厂制作校准曲线时，使用标准校准器流体逼近将由分析装置的最终使用者使用的实际样品的特性。例如，如果将分析与血浆样品一起使用，则校准器流体通常将配制成模拟典型血浆样品的特性。对于等同形式的测量信号而言，这应当导致在待分析样品中未知的分析物浓度与校准器流体中的分析物的浓度相同。
侧向流分析的典型测量信号为沿着检测区的荧光强度与距离的迹线的峰值高度或峰值面积。然而，有时的情况是其中样品中的测量信号不仅取决于浓度。特别是对于毛细驱动的侧向流分析装置而言，除了分析物浓度之外，其他因素也可影响测量信号。如果不将这些因素考虑在内，则待分析样品的测量信号将不与样品中分析物的真实浓度精确相关。当然这可例如对患者的诊断或预后具有深远影响。
因此，需要一种可将影响毛细驱动的侧向流分析装置的测量信号的其他因素考虑在内的方法。
发明内容
本发明涉及缓解一个或多个上述问题的分析装置。
本发明的一个方面涉及一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，该装置在流路上包括样品区和检测区。方法包括：将样品分配到样品区上；将样品和试剂混合，其中样品和试剂可在将样品添加至样品区之前或在分析装置上混合，通过毛细作用使所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；确定反应时间；以及通过使用检测信号和反应时间两者确定分析物的浓度。
本发明的另一个方面涉及一种校准分析的方法。方法包括：(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体，(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置，其中方法还包括：(c)将校准器流体中的一种分配到样品区上；(d)将校准器流体和试剂混合，其中校准器流体和试剂可在将校准器流体添加至样品区之前或在分析装置上混合，(e)通过毛细作用使所混合校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；(f)确定反应时间；(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；以及(h)使用检测信号S、反应时间t和已知浓度C确定校准曲线。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，该装置在流路上包括样品区和检测区。方法包括：将样品分配到样品区上；将样品和试剂混合，其中样品和试剂可在将样品添加至样品区之前或在分析装置上混合，通过毛细作用使所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；确定反应体积；以及通过使用检测信号和反应体积两者确定分析物的浓度。
根据本发明的又一个方面，提供了一种校准分析的方法。方法包括：(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体；(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置；(c)将校准器流体中的一种分配到样品区上；(d)将校准器流体和试剂混合，其中校准器流体和试剂可在将校准器流体添加至样品区之前或在分析装置上混合，(e)通过毛细作用使所混合的校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；(f)确定反应体积；(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；(h)使用检测信号S、反应体积和已知浓度C确定校准曲线。
通过下文的优选实施例的详细考虑，本发明更多的目的、特征和优点对于本领域技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1示出了可结合本发明使用的已知分析装置的示意图。
图2示出了可结合本发明使用的分析装置的示意图。
图3示出了可结合本发明使用的分析装置的示意图。
图4为示出分析装置中的总流动时间与粘度的关系的曲线图。
图5为示出NT proBNP的恒定浓度的信号强度与试剂溶解时间的关系的曲线图。
图6为示出随浓度和流体类型而变化的信号强度的曲线图。
图7为示出反应体积与反应时间之间的关系的曲线图。
图8为示出流速与反应体积之间的关系的曲线图。
图9为示出缀合物(即，试剂)溶解时间与总流动时间之间的关系的曲线图。
图10A和图10B为示出不具有反应时间校正与具有反应时间校正的不同流体之间的差异的曲线图。
图11A和图11B示出了考虑反应时间与不考虑反应时间的校准模型的预测浓度与实际浓度。
具体实施方式
如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数含义。
如在整个说明书和权利要求中结合数值使用的术语“约”是指为本领域的技术人员所熟悉和接受的精度区间。该区间优选为±10％。
本文中的术语“样品”是指一定体积的液体、溶液或悬浮液，旨在经受对其任何性质的定性或定量测定，所述性质诸如组分的存在或不存在、组分的浓度等。在本发明上下文中的典型样品为人或动物体液，诸如血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、唾液、精液、羊水、胃液、粘液、痰、黏液、泪液、粪便等。其他类型的样品来源于人或动物组织样品，其中该组织样品已经被处理成液体、溶液或悬浮液，以揭示用于检查的特定组织组分。本发明的实施例适用于所有体液样品，但优选适用于全血液、尿液或痰的样品。
在其他情况下，样品可能与食品测试、环境测试、生物威胁或生物危害测试等有关。这仅仅是可以在本发明中使用的样品的一小部分例子。
定性地或定量地根据样品的侧向流和存在于样品中的组分与存在于装置中或在工序期间添加至装置的试剂的相互作用进行确定以及对此类相互作用的检测可用于任何目的，诸如诊断目的。此类测试通常称为侧向流分析。
诊断确定的例子包括但不限于特定于不同疾病(例如慢性代谢性疾病)的分析物(也称为标记物)的确定，所述分析物诸如血糖、血酮、尿糖(糖尿病)、血胆固醇(动脉粥样硬化、肥胖症等)；其他特定疾病(例如急性疾病)的标记物，诸如冠状动脉梗塞标记物(例如肌钙蛋白-T、NT-ProBNP)、甲状腺功能标记物(例如促甲状腺激素(TSH)的确定)、病毒感染标记物(使用侧向流免疫分析以用于检测特定病毒抗体)；等。
还有一个重要的领域为伴随诊断领域，其中将治疗剂(诸如药物)施用给需要此类药物的个体。随后进行适当分析来确定适当标记物的水平以确定药物是否会具有其所需效果。或者，可在施用治疗剂之前使用可结合本发明使用的分析装置，以确定该试剂是否对需要的个体有帮助。
还有一个重要的领域为药物测试领域，用于简单快速地检测药物和指示药物滥用的药物代谢物；诸如尿样中的特定药物和药物代谢物(例如THC)的确定等。
术语“分析物”用作术语“标记物”的同义词，并且旨在涵盖可定量地或定性地测量的任何化学或生物物质，并且可包括小分子、蛋白质、抗体、DNA、RNA、核酸、病毒组分或完整的病毒、细菌组分或完整的细菌、细胞组分或完整的细胞、以及它们的复合物和衍生物。
术语“区”、“区域”和“部位”用于本说明书、实例和权利要求的上下文中以限定位于现有技术装置或根据本发明实施例的装置中的基底上的流体流路部分。
术语“反应”用于限定发生在样品组分和基底上或基底中的至少一种试剂或多种试剂之间，或发生在存在于样品中的两种或更多种组分之间的任何反应。术语“反应”具体地讲用于限定发生在分析物和作为分析物定性或定量测定的一部分的试剂之间的反应。
术语“基底”是指样品添加到其中，并且在其上或其中进行测定，或者分析物和试剂之间的反应在其上发生的载体或基质。
图2和图3示出了根据本发明的此类装置的优选实施例的示意图。分析装置10具有至少一个样品添加区20、至少一个试剂区30、至少一个检测区40和至少一个芯吸区50。这些区形成流路，样品通过该流路从样品添加区流至芯吸区。检测区40中还包括捕获元件，其能够结合到分析物，任选地沉积在装置上(诸如通过涂布)；以及带标记的试剂材料，其也能够结合到分析物或捕获元件，位于装置上的试剂区中，其中带标记的试剂材料承载用于在检测区中检测的第一标记。
可用于本发明中的分析装置的部件(即，装置的物理结构是否为独立于装置的其他部分的分立件)可由共聚物、共混物、层合物、金属箔、金属膜或金属制备。或者，装置部件可由沉积在下列材料中的一种上的共聚物、共混物、层合物、金属箔、金属膜或金属制备：聚烯烃、聚酯、含苯乙烯的聚合物、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、含氯聚合物、乙缩醛均聚物和共聚物、纤维素及其酯、硝酸纤维素、含氟聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚甲基丙烯酸甲酯、含硫聚合物、聚氨酯、含硅聚合物、玻璃、以及陶瓷材料。或者，装置的部件用塑料、弹性体、乳胶、硅片或金属制成；弹性体可包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、硅弹性体或乳胶。或者，装置的部件可由乳胶、聚苯乙烯乳胶或疏水性聚合物制备；疏水性聚合物可包括聚丙烯、聚乙烯或聚酯。或者，装置的部件可包含聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚碳酸酯。或者，装置部件由塑料制成，该塑料能够压印、研磨或注射模制，或由酮、银和金膜的表面制成，在所述表面上可吸附各种长链烷烃硫醇。能够研磨或注射模制的塑料的结构可包含聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。在一个特别优选的实施例中，分析装置由环烯烃聚合物注射模制，诸如以名称销售的那些。优选的注射模制技术在美国专利No.6,372,542、6,733,682、6,811,736、6,884,370和6,733,682中有所描述，这些专利均以引用方式全文并入本文。
在一个实施例中，流路为无孔的并且可包括开放或封闭的路径、凹槽和毛细管。在一个优选的实施例中，流路包括相邻突出部的侧向流路，该流路具有一定的尺寸、形状和相互间距，使得毛细流动持续穿过流路。在一个实施例中，该流路位于具有底面和侧壁的基底内的通道中。在本实施例中，突出部从通道的底面突起。侧壁可能会或可能不会有助于液体的毛细作用。如果侧壁不有助于液体的毛细作用，则可在最外侧突出部与侧壁之间提供间隙以使液体保持在由突出部限定的流路中。图1示出了突出部7。
在一个实施例中，流路至少部分地开放。在另一个实施例中，流路完全开放。开放是指在毛细距离处无封盖或覆盖件。因此，封盖如果作为流路的物理保护存在，则不会有助于流路中的毛细流动。开放的侧向流路在例如以下公布的专利申请中有所描述：WO 2003/103835、WO2005/089082；WO 2005/118139；WO 2006/137785；和WO 2007/149042，这些申请均以引用方式全文并入。突出部具有高度(H)、直径(D)和突出部(t1，t2)之间的一个或多个距离，使得该区中流体(诸如血浆，优选人血浆)的侧向毛细流动得以实现。这些尺寸在US 2006/0285996中示出，其以引用方式全文并入。除了优化上述高度、直径和突出部之间的一个或多个距离之外，可例如通过对突出部的表面改性来赋予突出部期望的化学、生物或物理功能。在一个实施例中，突出部具有在约15至约150μm、优选约30至约100μm的区间内的高度，约10至约160μm、优选30至约100μm的直径，以及突出部之间彼此间隔约3至约200μm、优选5至约50μm的一个或多个间隙。流动通道可具有约2至约100mm、优选约5至约50mm的长度，以及约0.1至约5mm、优选约0.5至1.2mm的宽度。
在另一个实施例中，流路为多孔的并包括多孔材料，例如硝化纤维，从而限定能够支持毛细流动的流路。例子包括在美国专利No.5,559,041、5,714,389、5,120,643和6,228,660中示出的那些，这些专利均以引用方式全文并入本文。
液体样品区20，也称为液体样品添加区，接收来自样品分配器诸如吸管的样品。样品通常沉积在该区的顶部。样品添加区能够将液体样品从该样品沉积到试剂区的点优选穿过毛细流动传送穿过任选的过滤器和试剂添加区。毛细流动引起结构可包括多孔材料，诸如硝化纤维，其在上文描述，或优选穿过突出部，诸如微柱，其如图1所示并且也在上文描述。在可使用指尖体积的血液的那些装置中，样品可以从手指直接触取，或通过毛细移液管获得。
可将过滤材料(未示出)置于样品添加区中而从样品中过滤出颗粒或从血液中过滤出血细胞，以使得血浆可进一步行进穿过装置。
位于样品添加区与检测区之间的为试剂区30。试剂区可包括集成在分析元素中的一种或多种试剂，并且通常是在反应中有用的试剂(结合伴侣，诸如用于免疫分析的抗体或抗原、用于酶分析的底物、用于分子诊断分析的探针)，或者是辅助材料，诸如使集成的试剂稳定的材料、抑制干扰反应的材料等。通常，在反应中有用的试剂之一携带如下所述的可检测信号。在一些情况下，试剂可直接或穿过反应级联与分析物反应以形成可检测信号，诸如但不限于可使用光谱学检测的分子，诸如有色或荧光分子。可在保持相同试剂宽度的同时通过沉积到装置内的试剂的长度来调节试剂区中的试剂的量。也可通过在保持长度的同时改变宽度来调节试剂的量。还可通过同时改变宽度和长度两者来进一步调节试剂的量。在一个优选的实施例中，试剂区包括缀合物材料。术语缀合物是指携带检测元件和结合伴侣两者的任何部分。或者，试剂(包括检测元件和缀合物)可在添加至样品添加区之前添加至样品。如果在添加至样品添加区之前将所有试剂与样品混合，则将当然不必存在单独的试剂区。
检测元件为可相对于其物理分布或/和其传送的信号强度被检测到的试剂，诸如但不限于发光分子(例如荧光剂、磷光剂、化学发光剂、生物发光剂等)、有色分子、反应时显色的分子、酶、放射性同位素、表现出特异性结合的配体等。该检测元件(也称为标记)优选地选自发色团、荧光团、放射性标记和酶。合适的标记可得自商业供应商，提供宽范围的用于标记抗体、蛋白质和核酸的染料。存在例如横跨几乎整个可见和红外光谱的荧光团。合适的荧光或磷光标记包括例如但不限于荧光素、Cy3、Cy5等。合适的化学发光标记为例如但不限于鲁米诺、光棒等。
相似地，放射性标记为可商购获得的，或检测元件可为合成的以使得它们结合放射性标记。合适的放射性标记为例如但不限于放射性碘和磷；例如，125I和32P。
合适的酶标记为例如但不限于辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。当两种标记可以单独地被检测并且优选同时定量时，两种标记为“可分辨的”而不会彼此显著干扰、妨碍或压制。两种或更多种标记可用于例如当多种分析物或标记物正在被检测的时候。
结合伴侣是可形成复合物的物质，该复合物可用于确定分析物的存在或量。例如，在“夹心”分析中，缀合物中的结合伴侣可形成包括分析物和检测元件的复合物，并且该复合物可进一步结合到集成在检测区中的另一个结合伴侣(也称为捕获元件)。在竞争性免疫分析中，分析物将干扰缀合物中的结合伴侣与集成在检测区中的另一个结合伴侣(也称为捕获元件)的结合。在缀合物中包括的示例性结合伴侣包括抗体、抗原、分析物或分析物模拟物、蛋白质等。
任选地位于流体流路中、在试剂区之前或之后、并且在检测区之前的为试剂添加区。试剂添加区在图2和图3中示为35。试剂添加区可允许从装置外面添加试剂。例如，试剂添加区可用于添加中断试剂，该中断试剂可用于将存在于流路中的样品和其他未结合的组分洗涤进芯吸区内。在一个优选的实施例中，试剂添加区35位于试剂区30之后。根据一个优选的实施例，来自试剂区中的试剂羽流应当尽可能宽以覆盖尽可能多的检测区宽度。用于增加试剂羽流宽度的一个优选实施例在于2012年1月20日提交的名称为“Assay Device Having Multiple Reagent Cells”(具有多个试剂单元的分析装置)(序列号61/588738，代理人案卷号CDS5104USPSP，第一发明人：Zhong Ding)的共同未决的专利申请中有所描述，该专利申请以引用方式全文并入本文。概括地说，试剂区中具有试剂材料的多个区域(下文中称为“试剂单元”)连同元素一起将多个试剂单元引起的多个流动料流重新混合成一个流动料流(在其离开试剂区并进入检测区时导致更有利地混合、更宽的试剂羽流)。
在液体样品区和试剂区下游为检测区40，其与样品添加区流体连通。检测区40可包括诸如上文所述那些的突出部。另外如上所述，这些突出部优选地从诸如Zeonor的光学塑性材料集成模制在基底中，诸如注射模制或压印。检测区中的流动通道的宽度对于常规尺寸的装置来说通常为大约2mm，然而，一些更小体积的装置，诸如在上面和在于2012年1月20日提交并以引用方式全文并入的名称为“Lower Volume Assay Device HavingIncreased Sensitivity”(具有增加灵敏度的更小体积分析装置)(专利申请No.61/588758，代理人案卷号CDS5111USPSP，第一发明人：PhilHosimer)的共同未决专利申请中描述的那些，明显地更狭窄，例如，1.5mm或更小。
检测区为读出任何可检测信号的位置。在一个优选的实施例中，附接到检测区中的突出部为捕获元件。捕获元件可包括如上所述含有缀合物的试剂或复合物的结合伴侣。例如，如果分析物是特定蛋白质，则该缀合物可为将特别地结合耦合到诸如荧光探针的检测元件的该蛋白质的抗体。捕获元件则可为也特别结合至该蛋白质的另一种抗体。在另一个例子中，如果标记物或分析物为DNA，则捕集分子可为但不限于合成的寡核苷酸、其类似物或特定抗体。其他合适的捕获元件包括特定于待检测分析物的抗体、抗体片段、适配体和核酸序列。合适捕获元件的一个非限制性例子是携带抗生物素蛋白官能团的分子，所述抗生物素蛋白官能团结合含有生物素官能团的缀合物。该检测区可包括多个检测区。多个检测区可用于包括一种或多种标记物的分析。在多个检测区的情况下，所述捕获元件可包括多个捕获元件，诸如第一捕获元件和第二捕获元件。如上所述，可将缀合物预沉积在分析装置上，诸如通过涂布在试剂区中。相似地，可将捕获元件预沉积在分析装置中的检测区上。优选地，将检测元件和捕获元件两者分别预沉积在分析装置上的检测区和试剂区上。
在样品已递送至样品区以后，它将遇到试剂区。在样品已经流过试剂区和任选的试剂添加区并与其相互作用以后，样品和试剂羽流将被包含在流体流中。试剂羽流可包含已溶解在试剂区中的试剂材料或通过试剂添加区添加的那些试剂材料中的任一种。试剂羽流可包括具有检测元件和结合伴侣两者的缀合物，在该情况下其通常称为缀合物羽流。
如上所述，面向本领域中的发明人与他人的一个问题为准确而精确地使侧向流分析中的测量信号与样品中的分析物的实际浓度相关。样品中分析物的预测浓度基于校准曲线，该预测浓度在实际分析之前进行，诸如在工厂，其有时偏离实际浓度，有时偏离实际浓度很大的量。除分析物的浓度之外的某种因素对由仪器测量的信号有影响。如上所述，在侧向流分析中，包含分析物的样品与检测区上游的检测元件混合，其中其随后流入检测区并且捕集检测元件或包含检测元件的复合物，并且通过仪器测量由检测元件产生的信号。
在依赖毛细力驱动流体流的侧向流装置中，粘度不同的样品将具有不同流速或流动时间。图4示出了图2和图3中所示的侧向流装置的粘度与总流动时间之间的线性关系。本发明的发明人已发现，假设所有其他条件均相同，例如，相同的装置设计、沉积的检测元件量等，在侧向流分析装置中，由具有相等浓度但具有不同流动时间的两种样品生成的信号将不同。这据信是由于以下所引起：允许检测元件(通常与上述结合伴侣缀合)与样品中的分析物相互作用(以用于夹心分析)的时间，以及允许检测元件或包含检测元件的复合物与检测区中的捕获元件相互作用并结合的时间。
如上所述，在侧向流分析装置中，试剂羽流中包含检测元件的样品流入检测区内。在样品流过检测区时，取决于分析物浓度的检测元件主要通过扩散与捕获元件接触。在流动料流中的检测元件经过捕获元件结合于其上的侧向流装置的那些特征(例如，微柱或纤维)时出现这种扩散。在包含检测元件的样品(例如，缀合物羽流)穿过检测区之后，剩下的样品或添加的洗涤剂穿过检测区并将未结合的检测元件从检测区洗掉。随后通过仪器读出结合的检测元件并记录信号。检测元件从流动料流扩散至结合捕获元件的能力将取决于多个因素，其中主要的为缀合的检测元件接近所结合的捕获元件的时间量。如上所述，检测元件(直接或以其他方式)必须与分析物相互作用的时间量也可影响信号，但是要比与捕获元件的相互作用的程度小得多。因此，更长流动时间将使检测元件接近捕获元件更长时间，并因此为缀合的检测元件扩散到所结合的捕获元件提供更多的机会。结合到捕获元件的检测元件的量随后将取决于分析物的浓度，以及检测元件从流动料流扩散到固定捕获元件的能力。由仪器测量或检测的信号取决于检测区中的缀合检测元件的量。
如果用于校准分析的校准器流体与被分析样品流体之间的流体特性(例如，粘度)不同，则甚至对于相同浓度的分析物也将产生不同量的信号。这是由于缀合的检测元件从流动料流扩散到上述固定捕获元件的不同能力(即，时间量)所引起。因此，本发明的发明人确定，校准曲线需要能够将穿过分析装置的流体流时间及其对信号强度而不仅仅是对分析物浓度的影响考虑在内。因此，检测信号S不仅仅取决于浓度C(S＝f(C))，相反检测信号取决于浓度和流动时间两者t(S＝g(C，t))。因此，本发明的广义方面提供了一种将浓度和流动时间两者考虑在内的确定样品中分析物的浓度的方法。
流动时间可由术语“反应时间”表示，其广义地限定为检测元件必须与检测区中的捕获元件结合的时间。在优选的实施例中，反应时间本身可使用在流路中的点处由检测元件生成并由用于检测用于生成可报告结果的信号的相同仪器所检测的信号进行测量。然而，也可使用确定反应时间的其他方法，其不依赖于检测由检测元件提供的信号。
存在多种用于测量反应时间表示的可测定方法。一种为“试剂溶解时间”，该时间为在沿着试剂区之后的基底流路的点处首先检测到所混合样品/试剂的时间至在基底中的该点处不再检测到所混合样品/试剂的时间。
与反应时间成比例或表示反应时间的另一个时间可通过测量总流动时间获得，所述总流动时间为样品从样品区流至芯吸区末端所花费的时间。
与反应时间成比例或表示反应时间的另一个时间也可通过测量总芯吸时间获得，所述总芯吸时间为样品进入芯吸区至到达芯吸区末端的时间。这可以通过检测来自从检测区洗掉的检测元件的信号来完成。
或者，可将与反应时间成比例的时间确定为润湿时间，该润湿时间为样品完全渗透侧向流动装置所需的时间。
最终，也可通过仅测量移动穿过分析装置的样品的流速来确定与反应时间成反比的速率。速率可由任何已知的方法测量，诸如测量流动前端经过装置上的一个点到与第一点相距已知距离的装置上的另一个点所需的时间。对于测量反应时间表示的上述技术中的任何一种，流动穿过分析装置的被测量为生成可报告结果的检测元件也可用于反应时间的测量。这也具有使用用于测量表示样品中分析物的信号的相同仪器来测量反应时间的能力的优点。不需要另外的可检测剂，诸如不同标记。然而，在一些实施例中，可能有利的是读出另一个信号，诸如使用红外检测器检测分析装置的一部分何时润湿等。
图5以图表方式示出了试剂溶解时间对由样品生成的信号量的影响，所述样品具有相同浓度的NT-proBNP(夹心分析)但具有由不同流体粘度形成的不同试剂溶解速率(即，反应时间)。在该例子中，包含相同浓度的NT-proBNP但不同流体粘度的样品通过将不同量的聚合物聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解到不同流体等分试样内来表示不同粘度的患者血清样品而制备。如图5所示，试剂溶解时间的增加导致相同浓度分析物的测量信号增加。
图6示出了样品类型对反应时间以及从而对信号强度的影响的另一个例子。在图6中，相对于信号强度绘制在血清中(具有较高粘度以及从而较长反应时间)和缓冲液(较低粘度、较短反应时间)中的全段甲状旁腺激素(iPTH)的不同浓度，其为夹心分析。如图所示，对于相同浓度而言，与血清相比，在缓冲溶液中产生显著较小的信号。因此，如图5和图6中明显可见，需要一种用于进行将浓度和反应时间两者考虑在内的分析的方法。换句话讲，需要一种方法，该方法使具有不同流体特性的样品之间的反应时间波动对分析物的计算浓度的影响最小化。
除了对检测信号具有影响的反应时间之外，本发明的发明人还发现了可影响给定浓度分析物的检测信号的另外因素。具体地讲，除了反应时间之外，反应体积也影响检测信号，特别是对于竞争性分析而言，因为反应体积的变化导致溶解的试剂浓度的变化(沉积试剂的总量相同)。在一个优选的实施例中，将反应体积确定为流速和反应时间的乘积。当将样品施加于分析装置时，样品将首先接触试剂区中的试剂。在样品流过试剂区时将溶解试剂。在试剂溶解时，流过试剂区的剩余样品将不再与试剂相遇，并从而将不含试剂。样品的该部分将用于从检测区中洗掉未结合的试剂。因此，存在两个样品部分。用于溶解试剂区中试剂的样品以及不含试剂并用作洗涤剂的样品的以下部分。用于溶解试剂的样品部分称为反应体积。如上所述，将反应体积优选确定为反应时间和流速的乘积(反应体积＝流速×反应时间)。因此，反应体积的发现为认识到对于一些分析(例如，竞争性分析)而言，检测信号取决于反应体积以及分析物浓度。
图7示出了反应体积与反应时间之间的关系。如图7所示，增加的反应体积导致减少的反应时间。
图8示出了流速与反应体积之间的关系。如图8所示，增加的流速导致增加的反应体积。
图9示出了总流动时间与缀合物溶解时间(即，反应时间)之间的关系。如图9所示，增加的总流动时间导致增加的缀合物溶解时间。因此图7-图9示出了较慢流速是指较长流动时间、较长试剂溶解时间和较小反应体积。
如上所述，反应体积基本为用于溶解上述沉积缀合物以创建样品缀合物混合物的样品体积。假设未添加任何洗涤剂流体，在侧向流分析中，仅样品的一部分溶解并与沉积缀合物混合。溶解缀合物的总样品的该部分(即，在缀合物溶解时间期间流过试剂区的样品的该体积)为反应体积。
当流速较快(即，粘度较低)时，用于溶解缀合物的样品总量将较大(即，较大反应体积)。因此，缀合物浓度将较小(即，较大反应体积)。对于样品中给定浓度的分析物而言，与较低流速相比反应体积中分析物的总量将增加。当流速较慢(即，粘度较高)时情况相反。即，用于溶解缀合物的样品总量将较小。对于样品中给定浓度的分析物，与较高流速相比反应体积中分析物的总量将减少。
对于夹心型分析而言，和与分析物结合所需的缀合物相比，缀合物区中的带标记缀合物通常显著过量(通常100倍或更多)。因此，虽然带标记缀合物浓度将由于较大反应体积一定程度地较低，但由于带标记缀合物的显著较大过量，这不会显著影响分析物与带标记缀合物的结合。分析物标记的缀合物复合物的浓度因此由分析物浓度主导。因此由于流速变化稍微增加或降低缀合物浓度仅对分析物缀合物浓度具有很小影响。假定分析物浓度相同，则较长反应时间导致分析物缀合物复合物与柱形表面更多结合以生成信号。因此信号受反应时间影响。由于反应时间也与图7所示的反应体积相关，因此反应体积也可用于调节夹心类型分析的信号。
对于竞争性类型分析而言，较大反应体积将导致带标记分析物的较低浓度。由于带标记分析物与检测区中的样品中的未标记分析物竞争，因此样品中的游离分析物/带标记分析物的增加比率导致检测区中的带标记分析物的较少捕集。浓度(以及因此反应体积)和反应时间两者均影响信号。由于反应体积和反应时间相关(较长反应时间与较低反应体积相对应)，因此体积调节方法(即，反应体积)和时间调节方法(即，反应时间)两者均可使用。
穿过侧向流动装置(诸如图2和图3所示的那些)的流速穿过芯吸区基本不变。因此，如果芯吸区的体积为已知的并且芯吸区中的流动时间为已知的，则可容易地计算流速。例如在图3中：
·t2为样品流体到达芯吸区起点(图3中的位置2)的时间。
·t3为样品流体到达芯吸区终点(图3中的位置3)的时间。
·芯吸区的体积为Vwz(μL)。
·芯吸区处的流速不变并且使用下式计算：
流速＝Vwz(uL)/(t3-t2)(μL/min)。
如上所述，一旦流速为已知的，就通过反应体积＝流速×反应时间来确定反应体积。
使用反应时间和反应体积，可对分析的信号或响应进行两次调节并在下文称为经调节响应(或经调节信号)。如上所述，信号本身为通过在样品流至芯吸区末端之后扫描穿过检测区获得的峰值面积或峰值高度。
存在两种类型的经调节响应(也称为经调节信号)。
类型1，通过乘以反应体积来调节信号或响应，即，经调节响应＝响应×(反应体积)＝响应×流速×反应时间
类型2，信号或响应除以反应时间，即，经调节响应＝响应/反应时间。如下面例子所示，使用任一经调节响应精度均可显著改善。
在确定分析物浓度时将反应时间和反应体积波动考虑在内的一种优选方法是开发校准曲线，该曲线也对反应时间或反应体积中的波动进行考虑，即，开发识别到信号取决于浓度和反应时间或反应体积两者的公式。使用具有变化的已知浓度的标准校准器流体和多个分析装置确定校准模型(通常但不总是在制备分析装置的工厂中实施)。将校准器流体施加于分析装置。针对每种校准器流体测量所选位置处的信号和流动时间。基于测量结果计算流速和反应时间。随后将每个信号和反应时间用于确定校准模型，其可如下所述为线性或更复杂的非线性。
本发明的一个优点为流体状况(例如粘度)不需要为已知的以便将流体状况对反应时间的影响考虑在内。所需要的只是能够确定反应时间(例如，试剂溶解时间或反应体积)的某个指标。
根据本发明的一个方面，用于进行分析的一种方法包括进行如上所述的分析的步骤，例如，将样品分配在分析装置上，使样品流过装置，读出所得信号等。除了上述步骤之外，方法还包括确定如上所限定的反应时间和任选流速，并使用反应时间或反应体积以及检测信号两者确定样品中分析物的浓度。
对于类型2经调节响应(即，仅使用反应时间)的情况，根据分析，函数S＝f(C，t)可为线性或更复杂的非线性函数。在一个实施例中，校准模型为线性的并且函数可由以下表示：
S＝(βt+α)(kC+b)     (1)
在上述公式中，S为检测信号，t为反应时间，α为第一常数，并且β为第二常数，以及k为第三常数并且b为第四常数。通过使用具有至少两种不同浓度和至少两种不同反应时间的校准器流体确定这些常数，其使用本领域中熟知的涉及解出联立公式的技术。
在上述公式(1)中，浓度可由以下表示：
C = 1 k [ S ( β t + α ) - b ] - - - ( 2 )
一旦在校准过程期间确定常数，常数就包括在该特定批次分析的批次数据中。在一个优选的实施例中，仪器可自动地读出批次数据，包括进行分析时的校准常数。仪器也将以在工厂校准期间进行操作的相同或成比例的方式确定反应时间，例如，与试剂溶解时间、总芯吸时间、流速等以及进行分析时的所得信号相同或成比例的方式。使用上述公式，仪器将报告将浓度和反应时间波动两者考虑在内的浓度。
采用类似方式，可校准非线性分析。例如，使用logit/log4数学模型的分析物的浓度C可由以下公式表示：
C = e { - 1 β 3 [ β 2 + ln ( β 1 S β t + α - β 0 - 1 ) ] } - - - ( 3 )
其中C为分析物的浓度，S为信号，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。在根据本发明的校准工序期间确定常数β0-β3，该工序测量反应时间和信号强度两者。
在本发明的另一个优选方面，通过使用信号速率确定分析物浓度而在校准模型中将反应时间t考虑在内。将信号速率R限定为仪器随反应时间t所测量的信号S：
R＝S/t     (4)
这与上述的类型2经调节响应相同。对于具有线性关系的分析而言，浓度可表示为：
C＝(R-α)/β   (5)
其中C为分析物的浓度，R为信号速率，α为第一常数，并且β为第二常数。采用上述类似方式在校准模型的开发期间确定常数，其通常在工厂进行。使用信号速率方法确定分析物浓度的优点是在校准过程期间需要较少公式，因为与上述公式(2)的四个常数相反，仅需要解出两个常数。
一旦在校准过程期间确定常数，常数就包括在该特定批次分析的批次数据中。在使用期间，仪器可自动地读出批次数据，包括校准常数。仪器也将以在工厂校准期间进行操作的相同方式确定反应时间，例如，与试剂溶解时间、总芯吸时间、流速等以及进行分析时的所得信号相同的方式。使用上述公式，仪器将报告将浓度和反应时间波动两者考虑在内的浓度。
以类似方式，可使用信号速率R校准非线性分析。例如，使用logit/log4关系的分析物的浓度C可由以下公式表示：
C = e { - 1 β 3 [ β 2 + ln ( β 1 R - β 0 - 1 ) ] } - - - ( 6 )
其中C为分析物的浓度，R为信号速率，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。在根据本发明的校准工序期间确定常数β0-β3，该工序测量反应时间和信号强度两者。
以与类型1经调节响应(R＝S/t)类似的方式，可使用上述校准公式确定类型2经调节响应R＝S×反应体积，优选地R＝(S*t*流速)。
可结合本发明使用的装置优选为一次性分析装置。可将分析装置包含在壳体中以易于抓握和保护。如果将分析装置包含在此类壳体中，则壳体将优选包括用于将样品添加至分析装置的口。
可用于本发明的方法中的分析装置可与用于读出(读出器)对本发明分析进行的分析装置的结果的装置一起使用。读出器包括用于读出由检测元件发出或从检测元件反射的信号的装置，诸如光电检测器，以及用于计算信号并显示结果的装置，诸如可包括在所集成读出器内或单独计算机上的微处理器。合适的读出器例如在美国2007/0231883和美国专利No.7,416,700中有所描述，这些专利均以引用方式全文并入。
本发明的另一个方面涉及一种在用于检测一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法。将包含一种或多种所关注分析物的液体样品沉积到分析装置的样品区上，诸如通过装置的壳体中的口，或通过在指尖抽血的情况下将手指直接触及到样品添加区上。样品通过毛细作用移动穿过任选过滤器，并进入其使试剂材料溶解的试剂区内。或者如上所述，样品和试剂材料在检测区之前的某一点处混合。在一个优选的实施例中，样品诸如通过抗体在夹心类型分析的情况下与检测元件直接或间接反应。样品在流入检测区时流动离开具有溶解试剂羽流的试剂区。
接下来，样品通过毛细作用移入检测区内。在检测区中，产生表示分析物或对照物的信号。在一个优选的实施例中，诸如通过检测区表面上的抗体在检测区中捕集样品或具有检测元件的所述一种或多种试剂，并且产生表示一种或多种分析物或者一种或多种对照物的存在或浓度的信号。随后使用如上所述的读出器或检测仪器读出在检测区中产生的信号，以确定一种或多种分析物或者一种或多种对照物的存在或浓度。样品移动离开检测区并进入芯吸区。读出器可在样品移动穿过检测区之后立即或短时间内读出检测区中的信号。另外，可在样品穿过装置后进行一次或多次洗涤，以便从检测区中洗掉任何未结合的试剂，诸如检测元件。反应时间也使用上述技术中的一种确定。
仪器使用随分析提供的批次校准数据、检测区中读出的信号和反应时间，随后自动地确定分析物的浓度。或者，校准模型可在出厂设置之外确定。例如，当分析批次结合通常由分析制造商提供的已知分析器浓度的校准器使用时，可由分析仪自动地创建校准曲线。分析器随后将使用其创建的校准曲线计算在测试样品时分析物的浓度。或者，可使用上面导出的公式手动计算分析物的浓度。
根据本发明的一个实施例的方法、分析装置和读出器具有多个优点，主要与改进的免疫化学反应的反应动力学和增加的分析灵敏度有关。
应当理解，本发明不限于此处所示的具体实施例。以下实例是为了进行示意性的说明而提供，并且不旨在限制本发明的范围，因为本发明的范围仅受所附权利要求及其等同权利要求的限制。
实例
实例1
使用由Zeonor(日本瑞翁公司(Zeon，Japan))制备的塑料基板芯片，其在表面上具有氧化的葡聚糖，以用于经由席夫碱偶联共价地固定蛋白质。将荧光标记的Anti-NT-proBNP单克隆抗体沉积并干燥以创建试剂区。将Anti-NT-proBNP单克隆抗体沉积并干燥以创建检测区。将少量Triton X-45沉积在装置上以增加样品的可润湿性，以便更利于毛细流动。将具有下表1所示的样品浓度的样品添加至装置的样品区，随后微柱阵列的毛细作用将样品分散通过流动通道，然后进入芯吸区。为了提供不同反应时间，使用不同芯片设计(A和B)，其提供表1以及图10A和10B所示的两种反应时间。将来自检测区中的荧光标记的复合物的信号强度记录在原型线照明荧光扫描仪中。结果示于下文所述的图10A和10B中。
表1
芯片设计 NT-1 NT-2 NT-3 NT-4 NT-5
[NT-proBNP]，pg/mL 反应时间 5.63 62.01 327.45 1594.19 5212.03
A 0:05:00 0.136 0.501 2.552 8.993 44.76
B 0:03:20 0.111 0.259 1.272 5.486 22.575
图10A示出了信号强度与NT-proBNP的浓度的曲线图。如图10A所示，对于相等浓度的分析物而言，检测信号对于具有较长反应时间(5分钟与3分钟20秒)显著较大。对于具有相同NT-proBNP浓度的分析而言，使用常规的校准模型将导致显著不同的报告结果。图10B为信号速率与NT-proBNP浓度的曲线图。在该图中，通过使用本身与信号相对的信号速率考虑反应时间。因此，针对不同反应时间的信号速率大致相同。因此，具有不同反应时间的两种不同样品之间的分析物浓度的报告结果将大约相同。
实例2
采用与实例1中类似的方式制备分析装置，全部使用相同芯片设计。制备两组具有不同粘度但相同NT-proBNP浓度的样品。表2中的样品具有43.3pg/mL的分析物。表3中的样品具有750pg/mL的NT-proBN。
表2
表3
如表2和表3所示，对于相同浓度的分析物而言，不同粘度样品产生不同反应时间(CD时间)和不同信号强度。因此，对于仅使用信号和仅使用信号的校准模型的包含43.3pg/mL的分析物(表2)的样品而言，预测浓度在24.61至67.65范围内，从而导致变异系数为50.4％。对于仅使用信号和仅使用信号的校准模型的包含750mg/mL的NT-proBNP的样品而言，范围为522至971mg/L，从而导致变异系数为29.8％。另一方面，使用信号速率以及使用信号速率(信号/反应时间)的校准模型针对1.0％的cv％产生42.66至43.52mg/mL(表2)或针对8.2％的cv％产生679至797mg/mL(表3)范围的浓度。
图11A和图11B以图表方式示出了表3中的数据。如图所示，根据仅使用信号和仅使用信号的校准模型的预测浓度(图11A)与实际浓度具有较差相关性(R2＝0.8815)，其中使用信号和反应时间(即，信号速率)以及使用信号速率的校准模型(图11B)的预测浓度与实际浓度具有极好的相关性(R2＝0.99)
实例3
使用由Zeonor(日本瑞翁公司)制备的塑料基板芯片，其在表面上具有氧化的葡聚糖，以用于经由席夫碱偶联共价地固定蛋白质。向多路复用NT-proBNP和利培酮提供两个检测区。将荧光标记的Anti-NT-proBNP单克隆抗体沉积并干燥以创建试剂区。将Anti-NT-proBNP单克隆抗体沉积并干燥以创建检测区。将具有共价附接利培酮的荧光标记BSA沉积并干燥以创建试剂区。将抗利培酮单克隆抗体沉积并干燥以创建第二检测区。将少量Triton X-45沉积在装置上以增加样品的可润湿性，以便更利于毛细流动。将具有下表4所示的样品浓度的样品添加至装置的样品区，随后微柱阵列的毛细作用将样品分散通过流动通道，然后进入芯吸区。为了提供不同反应时间，使用PVP修改粘度以提供不同粘度血清。将来自检测区中的荧光标记复合物的信号强度记录在原型线照明荧光扫描仪中。结果示于下述表5中。对于表4和表5而言，“平均CJ溶解时间”为试剂溶解时间，“大约CJ溶解体积”为反应体积，并且“平均面积”为信号强度指示。
表4：具有添加的PVP的较高粘度导致较慢流动(较长流动时间)和较长 缀合物溶解时间(即，试剂溶解时间)和较小缀合物溶解体积(即，反应 体积)
表5示出了随着流动时间增加NTpro-NBP和利培酮两者的增加响应。
表5：对于夹心分析和竞争性分析两者而言，较长流动时间导致较高信号 (即，响应)
如表4和表5所示，对于相同浓度的分析物而言，不同粘度样品产生不同反应时间(CD时间)和不同信号强度。
表6对来自具有不同粘度的样品的初始响应与来自实例3中数据的两种类型经调节响应的精度(％CV)进行比较。NTproBNP为夹心分析并且利培酮为竞争性分析。
表6：与初始未调节的响应(峰值面积)相比，RISP和NTproBNP两者的 经调节响应的精度随体积或时间调节得到改进
对于样品流体Lv1而言，未校正的CV为57％，而类型1校正为29％并且类型2为17％，其为显著改进。对于利培酮而言，未校正的CV为79％，而类型1为52％并且类型2为37％，其同样为显著改进。对于样品流体Lv2而言，未校正的CV为29％，而类型1校正为8％并且类型2为8％，其为显著改进。对于利培酮而言，未校正的CV为74％，而类型1为40％并且类型2为39％，其同样为显著改进。
在另一组实验中，对降钙素原(PCT)进行测试，其为夹心类型分析。
实例4
使用由Zeonor(日本瑞翁公司)制备的塑料基板芯片，其在表面上具有氧化的葡聚糖，以用于经由席夫碱偶联共价地固定蛋白质。将荧光标记的Anti-PCT单克隆抗体沉积并干燥以创建试剂区。将Anti-PCT单克隆抗体沉积并干燥以创建检测区。将少量Triton X-45沉积在装置上以增加样品的可润湿性，以便更利于毛细流动。将具有表7所示的PCT浓度的样品添加至装置的样品区，随后微柱阵列的毛细作用将样品分散通过流动通道，然后进入芯吸区。通过在表7所示的浓度中添加三甘油酯(Trig)修改粘度。另外将三甘油酯添加至样品(在表7中称为“干扰物”)。增加三甘油酯的浓度增加了样品粘度。将来自检测区中的荧光标记复合物的信号强度(峰值面积)记录在原型线照明荧光扫描仪中。
表7：增加样品中的三甘油酯浓度导致较慢流动、较长反应时间和较高 PCT信号
如表7所示，增加的粘度(即，增加的Trig浓度)导致较长流动时间(即，反应时间的量度)以及从而导致较高信号。这与随增加的反应时间展示出增加的信号的其他分析(夹心和竞争性分析两者)的数据一致。在另一组实验中，添加总蛋白质(白蛋白和γ-球蛋白)作为粘度调节剂。下表8示出了增加总蛋白浓度导致减少信号(峰值面积)，但流动时间变长。这与发明人的其他发现不一致。通过修改粘度或修改分析装置以影响总流动时间从而修改流动时间(即，反应时间)的进一步实验确认了发明人的初始发现，即增加的反应时间导致增加的信号。据信，蛋白质一定程度地干扰PCT并随后给出错误结果。
表8：增加样品中的总蛋白质浓度增加对PCT的干扰，从而导致减少信号 (峰值面积)，但流动时间随样品中的增加总蛋白质浓度而增加
附加的实施例
1.一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，该分析装置在流路上包括样品区和检测区，其中方法包括：将样品分配到样品区上；将样品和试剂混合，其中样品和试剂可在将样品添加至样品区之前或在分析装置上混合，通过毛细作用使所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；确定反应时间；以及通过使用检测信号和反应时间两者确定分析物的浓度。
2.如实施例1中所公开的方法，还包括确定流速以及通过反应时间、流速和检测信号确定浓度。
3.如实施例2中所公开的方法，其中流速由反应体积表示，该反应体积为反应时间和流速的乘积。
4.如实施例3中所公开的方法，其中通过用以下方式调节检测信号来确定浓度：(1)将检测信号乘以反应体积(经调节信号(R)＝检测信号×反应体积)；或(2)将检测信号除以反应时间(经调节信号(R)＝响应/反应时间)。
5.如实施例1中所公开的方法，其中通过将检测信号除以反应时间调节检测信号(经调节信号(R)＝响应/反应时间)来确定浓度。
6.如实施例1中所公开的方法，其中反应时间为所混合样品/试剂穿过检测区所花费的时间。
7.如实施例6中所公开的方法，其中将反应时间确定为试剂溶解时间，该试剂溶解时间是在沿着流路的点处首先检测到所混合样品/试剂的时间至在流路中的该点处不再检测到所混合样品/试剂的时间。
8.如实施例6中所公开的方法，其中通过检测由检测元件产生的信号确定反应时间。
9.如实施例1中所公开的方法，其中样品和试剂在分配到样品区上之前混合。
10.如实施例1中所公开的方法，其中流路还包括芯吸区，该芯吸区位于检测区下游并具有容量来接收从检测区流出并进一步使样品从检测区流入芯吸区的液体。
11.如实施例10中所公开的方法，其中通过测量总流动时间获得与反应时间成比例的时间，所述总流动时间为样品从样品区流至芯吸区末端所花费的时间。
12.如实施例10中所公开的方法，其中通过测量总芯吸时间获得与反应时间成比例的时间，所述总芯吸时间为样品进入芯吸区至到达芯吸区末端之间的时间。
13.如实施例10中所公开的方法，其中将与反应时间成比例的时间确定为润湿时间，所述润湿时间为样品完全渗透穿过分析装置所需的时间。
14.如实施例1中所公开的方法，其中将与反应时间成反比的速率确定为流速。
15.如实施例5中所公开的方法，其中通过限定为S/t的信号速率R调节检测信号来确定浓度，其中S为检测信号并且t为反应时间。
16.如实施例15中所公开的方法，其中通过以下公式确定浓度：
C＝(R-α)/β
其中C为分析物的浓度，R为信号速率，α为第一常数，并且β为第二常数。
17.如实施例16中所公开的方法，其中在分析的校准期间确定α和β。
18.如实施例15中所公开的方法，其中通过以下公式确定浓度：
C = e { - 1 β 3 [ β 2 + ln ( β 1 R - β 0 - 1 ) ] }
其中C为分析物的浓度，R为信号速率，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
19.如实施例18中所公开的方法，其中在分析的校准期间确定β0-β3。
20.如实施例1中所公开的方法，其中通过使用S和t确定浓度，其中S为检测信号并且t为反应时间。
21.如实施例20中所公开的方法，其中通过以下公式确定浓度C：
C = 1 k [ S ( β t + α ) - b ]
其中S为检测信号，t为反应时间，α为第一常数，β为第二常数，并且k为第三常数。
22.如实施例21中所公开的方法，其中在分析的校准期间确定α、β和k。
23.如实施例20中所公开的方法，其中通过以下公式确定浓度C：
C = e { - 1 β 3 [ β 2 + ln ( β 1 S β t + α - β 0 - 1 ) ] }
其中C为分析物的浓度，R为信号速率，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
24.如实施例23中所公开的方法，其中在分析的校准期间确定β0-β3。
25.如实施例1中所公开的方法，其中将样品和试剂混合的步骤还包括提供包含试剂的样品区与检测区之间的试剂区，其中从样品区流出的样品使试剂溶解并形成包含液体样品和溶解试剂的试剂羽流。
26.如实施例25中所公开的方法，其中反应时间与试剂溶解时间成比例，所述试剂溶解时间与在沿着基底的点处首先检测到试剂羽流的时间至不再检测到试剂羽流时的时间成比例。
27.如实施例1中所公开的方法，其中检测区包括从基底基本垂直延伸的突出部，其中突出部具有高度、横截面和彼此之间的距离，其限定能够生成与基底表面平行的毛细流动的突出部之间的毛细空间。
28.如实施例1中所公开的方法，其中在夹心类型分析的情况下，试剂包含能够结合至样品中的分析物的带标记抗体缀合物，或在竞争性分析的情况下，试剂包含带标记抗体结合于其上的分析物。
29.如实施例28中所公开的方法，其中分析为夹心类型分析。
30.一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，该分析装置在流路上包括样品区和检测区，其中方法包括：将样品分配到样品区上；将样品和试剂混合，其中样品和试剂可在将样品添加至样品区之前或在分析装置上混合，通过毛细作用使所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；确定反应体积；以及通过使用检测信号和反应体积两者确定分析物的浓度。
31.如实施例30中所公开的方法，其中反应体积为反应时间和流速的乘积。
32.如实施例31中所公开的方法，其中反应时间为所混合样品/试剂穿过检测区所花费的时间。
33.如实施例33中所公开的方法，其中将检测时间确定为试剂溶解时间，该试剂溶解时间为在沿着流路的点处首先检测到所混合样品/试剂的时间至在流路中的该点处不再检测到所混合样品/试剂的时间。
34.一种校准分析的方法，包括：(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体；(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置；(c)将校准器流体中的一种分配到样品区上；(d)将校准器流体和试剂混合，其中校准器流体和试剂可在将校准器流体添加至样品区之前或在分析装置上混合，(e)通过毛细作用使所混合校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；(f)确定反应时间；(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；(h)使用检测信号S、反应时间t和已知浓度C确定校准曲线。
35.如实施例34中所公开的校准分析的方法，其中反应时间为所混合样品/试剂穿过检测区所花费的时间。
36.如实施例34中所公开的校准分析的方法，其中检测信号S、反应时间t和已知浓度C用于确定关系S＝f(C，t)中的函数f。
37.如实施例34中所公开的校准分析的方法，其中函数f为线性的并且校准曲线由以下限定：
S＝(βt+α)(kC+b)
其中β、α、k和b为常数。
38.如实施例35中所公开的校准分析的方法，其中函数f为非线性的并且校准曲线由以下限定：
S = ( β t + α ) [ β 0 + β 1 1 + e - ( β 2 + β 3 ln C ) ]
其中β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
39.如实施例34中所公开的校准分析的方法，其中将信号速率变化R计算为R＝S/t并且信号速率和浓度用于确定关系R＝f(C)中的函数f。
40.如实施例39中所公开的校准分析的方法，其中函数为线性的并且校准曲线由以下限定：
R＝mC+b，
其中m和b为常数。
41.如实施例39中所公开的校准分析的方法，其中函数为非线性的并且校准曲线由以下限定：
R = β 0 + β 1 1 + e - ( β 2 + β 3 ln C )
其中β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
42.如实施例34中所公开的校准分析的方法，还包括提供试剂区，其中样品溶解并与试剂区中的试剂混合。
43.如实施例1中所公开的方法，还包括提供试剂区，其中样品溶解并与试剂区中的试剂混合。
44.一种校准分析的方法，包括：(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体；(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置；(c)将校准器流体中的一种分配到样品区上；(d)将校准器流体和试剂混合，其中校准器流体和试剂可在将校准器流体添加至样品区之前或在分析装置上混合，(e)通过毛细作用使所混合校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；(f)确定反应体积；(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；(h)使用检测信号S、反应体积和已知浓度C确定校准曲线。
45.如实施例44中所公开的校准分析的方法，其中通过反应时间和流速的乘积确定反应体积。
46.如实施例45中所公开的校准分析的方法，其中通过将检测信号乘以反应体积来调节检测信号S。
本领域的技术人员将会认识到，本文所述的本发明及其实施例易受除特别描述的变型形式和修改形式之外的变型形式和修改形式影响。应当理解，本发明包括所有这些变型形式和修改形式。本发明还包括在本说明书中单独地或全体地提到的所有步骤和结构，以及任何两个或更多个步骤或结构的任意和所有组合。
共同未决的专利申请，名称为“Low Volume Assay Device HavingIncreased Sensitivity”(具有增加的灵敏度的小体积分析装置)(专利申请No.61/588758，代理人案卷号CDS 5111USPSP，第一发明人：PhilHosimer)、“Assay Device Having Multiplexing”(具有多路复用的分析装置)(专利申请No.61/588779，代理人案卷号No.CDS 5113USPSP，第一发明人：Sue Danielson)、“Assay Device Having Multiple Reagent Cells”(具有多个试剂单元的分析装置)(序列号61/588738，代理人案卷号No.CDS5104USPSP，第一发明人Zhong Ding)、“Assay Device HavingUniform Flow Around Corners”(在拐角周围具有具有均匀流动的分析装置)(专利申请No.61/588745，代理人案卷号CDS5110USPSP，第一发明人James Kanaley)、“Controlling Fluid Flow Through An Assay Device”(控制穿过分析装置的流体流)(专利申请No.61/588772，代理人案卷号CDS5112USPSP，第一发明人James Kanaley)和“Assay Device HavingControllable Sample Size”(具有可控样品尺寸的分析装置)(专利申请No.61/588899，代理人案卷号CDS5114USPS，第一发明人Ed Scalice)，这些专利申请均提交于2012年1月20日，并且全部均以引用方式全文并入。

Claims (47)

1.一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，所述分析装置在所述流路上包括样品区和检测区，其中所述方法包括：
将所述样品分配到所述样品区上；
将所述样品和试剂混合，其中所述样品和试剂可在将所述样品添加至所述样品区之前或在所述分析装置上混合，
通过毛细作用使所述所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合至其上的所述检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；
确定反应时间；以及
通过使用所述检测信号和所述反应时间两者确定所述分析物的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分析物为NT-proBNP。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述分析物为利培酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述分析物为降钙素原。
5.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述检测信号除以所述反应时间调节所述检测信号(经调节信号(R)＝响应/反应时间)来确定所述浓度。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应时间为所述所混合样品/试剂穿过所述检测区所花费的时间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述反应时间确定为试剂溶解时间，所述试剂溶解时间为在沿着所述流路的点处首先检测到所述所混合样品/试剂的时间至在所述流路中的该点处不再检测到所述所混合样品/试剂的时间。
8.根据权利要求6所述的方法，其中通过检测由检测元件产生的信号确定所述反应时间。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品和试剂在分配到所述样品区上之前混合。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述流路还包括芯吸区，所述芯吸区位于所述检测区下游并具有容量来接收从所述检测区流出并进一步使所述样品从所述检测区流入所述芯吸区的液体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中通过测量总流动时间获得与反应时间成比例的时间，所述总流动时间为所述样品从所述样品区流至所述芯吸区末端所花费的时间。
12.根据权利要求10所述的方法，其中通过测量所述总芯吸时间获得与反应时间成比例的时间，所述总芯吸时间为所述样品进入所述芯吸区至到达所述芯吸区末端之间的时间。
13.根据权利要求10所述的方法，其中将与所述反应时间成比例的时间确定为润湿时间，所述润湿时间为所述样品完全渗透穿过所述分析装置所需的时间。
14.根据权利要求1所述的方法，其中将与所述反应时间成反比的速率确定为所述流速。
15.根据权利要求5所述的方法，其中通过限定为S/t的信号速率R调节所述检测信号来确定浓度，其中S为所述检测信号并且t为所述反应时间。
16.根据权利要求15所述的方法，其中通过所述公式确定浓度：
C＝(R-α)/β
其中C为所述分析物的浓度，R为所述信号速率，α为第一常数，并且β为第二常数。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在所述分析的校准期间确定α和β。
18.根据权利要求15所述的方法，其中通过所述公式确定浓度：
其中C为所述分析物的浓度，R为所述信号速率，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
19.根据权利要求18所述的方法，其中在所述分析的校准期间确定β0-β3。
20.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用S和t确定浓度，其中S为所述检测信号并且t为所述反应时间。
21.根据权利要求20所述的方法，其中通过所述公式确定浓度C：
其中S为所述检测信号，t为所述反应时间，α为第一常数，β为第二常数，并且k为第三常数。
22.根据权利要求21所述的方法，其中在所述分析的校准期间确定α、β和k。
23.根据权利要求20所述的方法，其中通过所述公式确定浓度C：
其中C为所述分析物的浓度，R为所述信号速率，并且β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
24.根据权利要求23所述的方法，其中在所述分析的校准期间确定β0-β3。
25.根据权利要求1所述的方法，其中将所述样品和试剂混合的所述步骤还包括提供包含所述试剂的所述样品区与检测区之间的试剂区，其中从所述样品区流出的所述样品使所述试剂溶解并且形成包含液体样品和溶解试剂的试剂羽流。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述反应时间与试剂溶解时间成比例，所述试剂溶解时间与在沿着所述基底的点处首先检测到所述试剂羽流的时间至不再检测到所述试剂羽流的时间成比例。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测区包括从所述基底基本垂直延伸的突出部，其中所述突出部具有高度、横截面和彼此之间的距离，所述距离限定能够生成与所述基底表面平行的毛细流动的所述突出部之间的毛细空间。
28.根据权利要求1所述的方法，其中在夹心类型分析的情况下，所述试剂包含能够结合至所述样品中的分析物的带标记抗体缀合物，或在竞争性分析的情况下，所述试剂包含带标记抗体结合至其上的分析物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述分析为夹心类型分析。
30.一种在用于检测具有流路的分析装置中的一种或多种所关注分析物的液体样品上进行分析的方法，所述分析装置在所述流路上包括样品区和检测区，其中所述方法包括：
将所述样品分配到所述样品区上；
将所述样品和试剂混合，其中所述样品和试剂可在将所述样品添加至所述样品区之前或在所述分析装置上混合，
通过毛细作用使所述所混合样品/试剂流入并穿过捕获元件结合至其上的所述检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；
确定反应体积；以及
通过使用所述检测信号和所述反应体积两者确定所述分析物的浓度。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述反应体积为反应时间和流速的乘积。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述反应时间为所述所混合样品/试剂穿过所述检测区所花费的时间。
33.根据权利要求32所述的方法，其中将所述反应时间确定为所述试剂溶解时间，所述试剂溶解时间为在沿着所述流路的点处首先检测到所述所混合样品/试剂的时间至在所述流路中的该点处不再检测到所述所混合样品/试剂的时间。
34.根据权利要求30所述的方法，其中通过将所述检测信号乘以反应体积调节所述检测信号(经调节信号(R)＝检测信号×反应体积)来确定所述浓度。
35.一种校准分析的方法，包括：
(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体；
(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置；
(c)将所述校准器流体中的一种分配到所述样品区上；
(d)将所述校准器流体和试剂混合，其中所述校准器流体和试剂可在将所述校准器流体添加至所述样品区之前或在所述分析装置上混合；
(e)通过毛细作用使所述所混合校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的所述检测区，其中产生并检测至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；
(f)确定反应时间；
(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；
(h)使用所述检测信号S、所述反应时间t和所述已知浓度C确定校准曲线。
36.根据权利要求35所述的校准分析的方法，其中所述反应时间为所述所混合样品/试剂穿过所述检测区所花费的时间。
37.根据权利要求35所述的校准分析的方法，其中所述检测信号S、所述反应时间t和所述已知浓度C用于确定所述关系S＝f(C，t)中的所述函数f。
38.根据权利要求35所述的校准分析的方法，其中所述函数f为线性的并且所述校准曲线由以下限定：
S＝(βt+α)(kC+b)
其中β、α、k和b为常数。
39.根据权利要求36所述的校准分析的方法，其中所述函数f为非线性的并且所述校准曲线由以下限定：
其中β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
40.根据权利要求35所述的校准分析的方法，其中将信号速率变化R计算为R＝S/t并且信号速率和浓度用于确定所述关系R＝f(C)中的所述函数f。
41.根据权利要求40所述的校准分析的方法，其中所述函数为线性的并且所述校准曲线由以下限定：
R＝mC+b，
其中m和b为常数。
42.根据权利要求40所述的校准分析的方法，其中所述函数为非线性的并且所述校准曲线由以下限定：
其中β0-β3分别为第一常数、第二常数、第三常数和第四常数。
43.根据权利要求35所述的校准分析的方法，还包括提供试剂区，其中所述样品溶解并与所述试剂区中的所述试剂混合。
44.根据权利要求1所述的方法，还包括提供试剂区，其中所述样品溶解并与所述试剂区中的所述试剂混合。
45.一种校准分析的方法，包括：
(a)提供在其中具有已知的分析物浓度的多种校准器流体；
(b)提供包括样品区和检测区的具有基底的分析装置；
(c)将所述校准器流体中的一种分配到所述样品区上；
(d)将所述校准器流体和试剂混合，其中所述校准器流体和试剂可在将所述校准器流体添加至所述样品区之前或在所述分析装置上混合；
(e)通过毛细作用使所述所混合校准器流体/试剂流入并穿过捕获元件结合于其上的所述检测区，其中产生并检测到至少部分地表示一种或多种分析物的存在或浓度的信号；
(f)确定反应体积；
(g)对每种校准器流体重复步骤(b)-(f)；
(h)使用所述检测信号S、所述反应体积和所述已知浓度C确定校准曲线。
46.根据权利要求45所述的校准分析的方法，其中通过反应时间和流速的所述乘积确定所述反应体积。
47.根据权利要求46所述的校准分析的方法，其中通过将所述检测信号乘以所述反应体积来调节所述检测信号S。
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