CN113811771B - 用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法 - Google Patents

用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113811771B
CN113811771B CN202080036463.7A CN202080036463A CN113811771B CN 113811771 B CN113811771 B CN 113811771B CN 202080036463 A CN202080036463 A CN 202080036463A CN 113811771 B CN113811771 B CN 113811771B
Authority
CN
China
Prior art keywords
volume
solvent
binding curve
time
test surface
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202080036463.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113811771A (zh
Inventor
K·科蒂尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Creoptix AG
Original Assignee
Creoptix AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Creoptix AG filed Critical Creoptix AG
Publication of CN113811771A publication Critical patent/CN113811771A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113811771B publication Critical patent/CN113811771B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/557—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using kinetic measurement, i.e. time rate of progress of an antigen-antibody interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1434—Optical arrangements
    • G01N15/1436—Optical arrangements the optical arrangement forming an integrated apparatus with the sample container, e.g. a flow cell
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N2015/1006—Investigating individual particles for cytology

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optical Measuring Cells (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Abstract

根据本发明，提供了一种用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法，该方法包括以下步骤：a）使具有分析物浓度（co）的第一体积（V1）的样品流体在第一时间段（t1a）内在流动池（2）的附接有第一配体（4）的测试表面（3）上流动；b）使第一体积（V1’）的缓冲溶液在第一时间段（t1b）内在流动池（2）的测试表面（3）上流动；c）使至少第二体积（V2）的样品流体在第二时间段（t2a）内在测试表面上流动；其中，该第二时间段（t2a）大于第一时间段（t1a），并且其中，第二体积（V2）的样品流体具有与第一体积（V2）的样品流体中的分析物浓度（co）相同的分析物浓度（co）；d）使第二体积（V2’）的缓冲溶液在第二时间段（t2b）内在流动池（2）的测试表面（3）上流动；e）在步骤（a）‑（d）期间使用传感器来测量测试表面（3）上的结合，以获得单一测量结合曲线；f）使具有分析物浓度（co）的第一体积（V1）的样品流体在第一时间段（t1a）内在流动池（2’）的没有第一配体的测试表面（3’）上流动；g）使第一体积（V1’）的缓冲溶液在第一时间段（t1b）内在没有第一配体的测试表面（3’）上流动；h）使至少第二体积（V2）的样品流体在第二时间段（t2a）内在没有第一配体的测试表面（3’）上流动；其中，该第二时间段（t2a）大于第一时间段（t1a），并且其中，第二体积（V2）的样品流体具有与第一体积（V2）的样品流体中的分析物浓度（co）相同的分析物浓度（co）；i）使第二体积（V2’）的缓冲溶液在第二时间段（t2b）内在没有第一配体的测试表面（3’）上流动；j）在步骤（f）‑（i）期间使用传感器来测量没有第一配体的测试表面（3）上的结合，以获得单一参考结合曲线；k）使用单一测量结合曲线和单一参考结合曲线来确定动力学参数。

Description

用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法
技术领域
本发明涉及用于确定预定义分子（即，分析物）与靶标（即，配体）之间的反应的动力学参数的方法，且特别地涉及这样的方法，即，这些方法涉及：相继地接触流动池的附接有所述配体的测试表面，该流动池具有多个样品流体体积，所述多个样品流体体积中的每一者均包含相同浓度的分析物；以及评估传感器的输出，该传感器测量所述测试表面上的结合以确定所述动力学参数。
背景技术
在许多应用（诸如，药物发现和开发、环境测试和诊断）中，需要在短时间量内分析大量液体样品。使用包括但不限于以下各者的系统来执行这种分析：光学或声学无标记传感器或生物传感器、质谱仪、色谱系统和分光光度检测器。
无标记采集方法包括但不限于基于表面等离子体共振（SPR）或波导的光学方法、或基于表面声波（SAW）的方法、热方法、或电化学方法。光学方法是基于以下原理：生物化学分子（即，分析物）表现出不同于水溶液的折射率。在传感器表面附近的折射率变化是由于分子（即，分析物）与传感器表面本身抑或与附接到该表面的另一个分子间相互作用所致的分子（即，分析物）添加到表面或从表面减去而造成。使用共振元件——在SPR的情况下，即支持表面等离子体的金属层；或者在波导传感器的情况下，即支持光学波导模式的光学波导—然后可以使用适当的照明和检测方案来探测局部折射率变化，并且实时记录这些变化以便测量分子反应事件。在这个背景下，这些变化对应于信号。除了并未物理测量折射率差异而是质量或介电常数差异之外，表面声波和电化学方法以类似方式操作。
在这个背景下，许多无标记测量或无标记感测技术或无标记测定涉及将一个或多个“配体”（反应物，诸如抗体或药物靶标）附接（固定化）到感测表面（即，在传感器芯片上的敏化表面，其适于由检测方案读出，该检测方案随时间输出组成所记录的信号的测量值）上的固体支撑件。包含感测表面的流体导管通常被称为流动池或流体腔室并且允许使包含待研究的（多种）其他反应物（“分析物”）的流体与配体接触。由此，分析物有机会与在感测表面上的固体支撑件处的固定化配体反应，并且最终产物浓度得到测量和表征。典型的分子间相互作用测量程序在于：首先，使表面结合的配体首先与中性缓冲溶液（“缓冲液”）接触，以便建立无反应的基本信号（“基线”）；接着是使表面结合的配体与包含实际分析物或样品（诸如，抗原或候选药物）的流体接触，使得表面结合的配体与分析物或样品反应，并且可以监测发生反应的缔合阶段；以及任选地接着是使表面结合的配体再次与中性缓冲溶液接触，以便通过从流动池中移除分析物来监测分析物或样品的解离阶段。换句话说，分析物的浓度以逐步方式增加以用于表征缔合阶段，并且再次以逐步方式降低以用于表征解离阶段。在缔合和解离阶段期间记录的传感器信号通常被称为结合曲线。通常，针对几种浓度的分析物重复前述步骤，以便生成可以拟合到相互作用模型的一组结合曲线。通常，在整个实验时间期间，记录测量值，得到反应网络信号，该反应网络信号可用本发明进一步进行分析以获得动力学参数。
用于将分析物从样品储器递送到流动池的流体组件在本领域中是众所周知的，并且通常包括样品存储和处理单元（“自动取样器”），该样品存储和处理单元其流体地连接到包括泵、阀和导管的样品递送单元。此外，它包括序列控制器单元，该序列控制器单元控制所述自动取样器以及样品递送单元的泵和阀，诸如它们以适当的定时操作以执行期望的测量方法。样品储器可以采用小瓶的形式，或在用于多个储器的工业标准化容器（“微量滴定板”）内采用所谓“孔（well）”的形式，通常包含96、384或1536个孔。在测量之前，微量滴定板由用户或流体处理机器人适当地填充有分析物，且然后放置在自动取样器中。在测量期间，由自动取样器从微量滴定板中吸入一种或多种分析物，且然后通过样品递送单元将所述一种或多种分析物递送或注射到一个或多个适当的流动池中，诸如使（多个）流动池内的（多个）对应的感测表面与（多种）分析物接触。样品递送单元还适于通过注射缓冲液来漂洗一个或多个适当的流动池，诸如使（多个）流动池内的（多个）对应的感测表面与缓冲液接触，从而允许分析物从配体解离。在WO2017187325中描述了示例性类型的流体组件，其适于实施根据本发明的方法实施例的示例性方法。
依赖于由于物质的存在所致的折射率变化的无标记采集方法常常容易受到本体折射率不匹配的影响，诸如缓冲液与包含样品的流体之间的微小的折射率差异。这种不匹配会引起信号偏置。为了从这种信号准确地计算动力学参数，信号偏置需要与动力学参数一起计算。
一种示例性类型的基于光学波导的生物传感器由Creoptix AG（Wädenswil，Switzerland）以商品名称WAVE®（下文中称为“WAVE仪器”）出售。这些生物传感器利用基于波导干涉测量的质量感测技术以在表面结合的配体与感兴趣分析物之间提供“实时”传感器信号。WAVE仪器产生以pg/mm2为单位的密度测量值的时间序列作为输出信号，密度测量值与传感器表面上的产物的浓度成比例。
最近，分子间相互作用的高通量筛选已获得了越来越多的兴趣，特别是在制药公司中，其中在药物发现中研究药物与药物靶标的相互作用。在（高通量）筛选期间，通常在单孔内以单一浓度（诸如，100微摩尔或100纳摩尔）制备大量分析物（在这种情况下是候选药物），且将这些分析物相继注射到包括配体（在这种情况下是药物靶标）的流动池中。通常，在这种筛选设定中，从单次注射仅评估对应于在注射期间的给定时间处的传感器信号值的结合水平。由于未知参数之间的强相关性所致，无法从单次注射的测量值中提取可靠的动力学参数，且因此尝试将单次注射的传感器信号拟合到相互作用模型导致定义不明确的问题。换句话说，对动力学参数方面不同的两种分析物的单次注射进行的测量可产生类似的结合曲线。如果对应的结合水平落在某个范围内（诸如，介于最小值与最大值之间），并且如果结合的形状没有显示与靶标或表面的非特异性相互作用的迹象，则将候选分析物标记为命中。这种方法的主要缺点是无法将结合到配体的分析物与诸如本体折射率不匹配之类的伪迹（artefact）很好地区分开来，并且无法确定关于动力学参数的定量信息。然后需要在相继的测量中针对动力学参数表征命中，通常使用从多个孔注射多种浓度的方法。应理解，使用从多个孔注射多种浓度的方法不适合初筛，因为用于筛选和制备分析物的时间增加，并且自动取样器的存储空间没有得到很好的利用。
在WO2009025680中描述了一种用于使用从单个孔进行的注射来确定分子间相互作用的动力学和亲和力参数的方法，且目前该方法由Molecular Devices（Danaher）以OneStep injection的形式销售。在A. M. Giannetti等人的“Fragment片段-Based DrugDiscovery”（S. Howard、C. Abell编辑（英国皇家化学学会，剑桥，2015年））第2章中更详细地描述了该方法的应用。该方法受到每个样品的分析时间为至少30秒的限制。此外，虽然可以常常确定亲和力的指示，但无法可靠地确定动力学参数。此外，由于梯度剖面仅由流导管几何形状和流速确定，因此很难根据特定的感兴趣动力学范围调整梯度剖面。
在WO2004109284中描述了一种用于使用分析物的顺序注射来确定分子间相互作用的动力学和亲和力参数的方法。该方法依赖于提供不同浓度的分析物，这使该方法不适合筛选应用。
分子间相互作用的最简单模型是具有可逆反应的Langmuir或1:1模型：
其中分析物A和固定化配体B与产物AB达到平衡。反应物A和B缔合以形成产物AB，而同时反应物AB解离以形成产物A和B。因此，A、B和AB同时是反应物和产物。
在数学上，由以下微分方程来描述反应网络：
其中[A]、[B]和[AB]是A、B和AB的浓度。[A]和[B]缔合以形成产物[AB]的速度由动力学参数ka来确定，并且[AB]解离以形成产物[A]和[B]的速度由动力学参数kd来确定。当依据与[AB]成比例的可观测传感器信号R以及与浓度[B]+[AB]之和成比例的最大传感器信号Rmax来表达反应并且浓度c=[A]时，可以由以下微分方程来描述反应：
因此，在简单的分子间相互作用模型中的感兴趣动力学参数是所谓的结合速率或缔合速率常数ka以及所谓的分解速率（off-rate）或解离速率常数kd。在筛选应用中，通常由研究人员选择动力学空间内的感兴趣区域。在早期药物发现的示例中，研究人员可选择的是，有效的候选药物应表现出介于105 M-1s-1与109 M-1s-1之间的ka、以及介于0.1 s-1与1000s-1之间的kd。相比之下，在抗体筛选的示例中，研究人员可选择的是，有效的候选者可表现出介于104 M-1s-1与107 M-1s-1之间的ka、以及介于10-2 s-1与10-6s-1之间的kd。通常，可测量的动力学空间取决于装置参数（诸如，可测量范围），但也取决于所选的测量参数（诸如，接触时间和浓度）。因此，研究人员可能通过选择测量参数（诸如，流速以及分析物接触和解离时间）来主动地选择该感兴趣区域，或者通过选择适当的测量实验计划（他知道该适当的测量实验计划对他选择的应用起作用）来被动地选择该感兴趣区域。
用于筛选应用的较高通量系统的示例包括Biacore® 8k仪器（在WO2017050940中描述了用于操作其的方法）或Sierra Sensors MASS-2仪器（在US7858372B2中针对其描述了流动池构型）。两种所提到的仪器都基于表面等离子体共振（SPR）的效应。然而，这些装置受到几种限制，诸如高的样品和缓冲液使用。
本发明的目的是减轻上文提到的缺点中的至少一些。本发明的一些实施例方法消除了使多种不同浓度的分析物流过流动池的需要，这可以有利地导致减少的测量时间。
根据本发明，这些目的是借助于具有独立权利要求中所叙述的特征的组件和/或方法来实现的；其中，从属权利要求叙述优选实施例的任选特征。
附图说明
图1提供了适合于实施根据本发明的方法的微流体组件的示意图；
图2示出了在执行根据本发明的方法时由图1的组件的传感器输出的单一测量结合曲线和单一参考结合曲线的示例；
图3示出了动力学参数Rmax、ka、kd的模拟结合曲线（虚线），其最佳逼近使用根据本发明的方法获得的调整后的结合曲线（实线）；
图4示出了使用根据本发明的方法获得的调整后的结合曲线（实线）和对应的最佳逼近的模拟结合曲线（虚线）的示例。
具体实施方式
借助于仅通过示例的方式给出并由附图图示的以下实施例的描述，将更好地理解本发明。
虽然在以下的详细描述和示例中，本发明是在波导干涉测量（且更特别地，Creoptix WAVE系统）的背景下图示的，但是将理解，本发明不限于这种检测方法。相反，可采用其中分析物结合到被固定化在感测表面上的配体的任何基于亲和力的检测方法，条件是可以测量感测表面处的变化，该变化定量地指示分析物与其上的固定化配体的结合。
在优选实施例中，配体使用胺偶联被固定化在薄的水凝胶层（诸如，共价结合到流动池内的传感器表面的葡聚糖或聚羧酸酯层）内；在另一个优选实施例中，配体通过合适的标签被捕获到被固定化在传感器表面上的合适的捕获结合伴侣，诸如用于被固定化在镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）上的多组氨酸标签或用以被固定化在链酶亲和素上的生物素标签或用以被固定化在链霉亲和素上的AviTagTM标签。
可以用于本发明中的典型配体包括但不限于蛋白质（例如，抗体、亲和体或适配体）、酶、受体、抗原、半抗原、肽或化学分子（例如，候选药物或其片段）。可以用于本发明中的典型分析物包括但不限于蛋白质和糖蛋白（例如，抗体或其片段、亲和体或适配体）、脂质、碳水化合物、酶、受体、抗原、半抗原、肽或化学分子（例如，候选药物或其片段、特异性或非特异性结合剂、螯合剂或聚集剂）。术语“抗体”描述了一种免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或全部合成产生的。抗体可以是单克隆或多克隆的，并且可通过本领域众所周知的技术制备，诸如宿主免疫和血清收集（多克隆）、或通过制备连续杂交细胞系并收集分泌性蛋白质（单克隆）、或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变版本、至少编码天然抗体特异性结合所需的氨基酸序列。术语“抗体”还涵盖包括抗体抗原结合位点的任何多肽或蛋白质。包括抗体抗原结合位点的抗体片段包括但不限于诸如以下各者的分子：Fab、Fab'、Fab'-SH、scFv、Fv、dAb、Fd；以及双体。
图1提供了用于实施本发明的微流体组件1的示意图。微流体组件1包括：第一流动池2，其包括第一测试表面3，该第一测试表面包括第一配体4；以及第二流动池2’，其包括第二测试表面3’，该第一测试表面没有第一配体。应理解，在本发明中，第二测试表面3’可没有任何配体，或者，第二测试表面3’可具有配体，但那些配体与第一测试表面3上的第一配体不是同一类型——在两种情况下，第二测试表面3’都将没有第一配体。第一配体4优选地使用胺偶联被固定化在薄的水凝胶层（诸如，共价结合到第一测试表面3的葡聚糖层）内；在另一个优选实施例中，第一配体4通过合适的标签（诸如，六组氨酸或谷胱甘肽-S-转移酶）在第一流动池体积内的凝胶基质（诸如，琼脂糖）内被捕获。优选地，第一测试表面3具有大于0.1平方毫米、或大于0.5平方毫米、或大于1平方毫米的面积，以便增加给定（预定义）配体表面密度的配体总量（例如，第一测试表面3上的配体密度是预定义密度；因此增加第一测试表面3的面积并保持密度等于预定义密度将增加第一流动池中的配体的数量），这可能例如受到水凝胶层厚度和/或配体尺寸的限制。该面积可以是平坦表面的面积，或包括存在于表面处的微孔的内表面。最优选地，第二测试表面3’的面积优选地等于第一测试表面3的面积。
在优选实施例中，此外，微流体组件1包括传感器45（诸如，表面等离子体共振传感器，或波导干涉测量传感器或表面声传感器），该传感器被构造成测量第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上的变化。最优选地，传感器45被构造成测量在第一测试表面3和第二测试表面3’中的每一者上发生的结合（即，测量样品流体中的分析物到第一测试表面3和第二测试表面3’上的配体的结合）。由于第二测试表面3’没有配体，因此可以预期的是，对于第二测试表面3’，传感器45将测量到很小的结合或未测量到结合。传感器45测量分析物是否已结合到第一流动池2内的第一配体4，并且优选地被构造成测量结合到第一流动池2内的第一配体4的分析物的量。所述传感器45优选地可操作地连接到第一流动池2和第二流动池2’，使得它可以执行这种测量。第一配体4可以经由其中分子配合到配体的结合袋中的简单锁钥机制抑或辅以更复杂的分子过程（诸如，构象变化）而结合到具有预定义特性（诸如，对配体4具有高亲和力）的分析物。因此，通过使样品流体经过第一流动池2的第一测试表面3且然后确定哪些分析物已结合到第一配体4，可以确定样品流体中的哪些分析物具有对配体具有高亲和力的所述预定义特性。
微流体组件1进一步包括第一导管5，该第一导管的一端流体地连接到第一流动池2的第一流体端口2a和第二流动池2’的第一流体端口2a’，并且该第一导管的另一端流体地连接到第一选择阀8。第一选择阀8可以将第一导管5选择性地流体地连接到第一废物储器7。第一废物储器7可以接收和存储不需要的流体，诸如清洁流出物。
第一选择阀8可在第一位置与第二位置之间移动；当第一选择阀8处于其第一位置中时，第一选择阀8允许流体从第一导管5传递到第一废物储器7中；并且当第一选择阀8处于其第二位置中时，第一选择阀8关闭，因此防止流体经由第一选择阀8流出第一导管5。
微流体组件1进一步包括第一缓冲液储器9，该第一缓冲液储器包含缓冲流体，该缓冲流体可以用于清洁微流体组件1的部分。在该示例中，第一缓冲液储器9包括第一注射泵9；第一注射泵9包括容纳缓冲流体的容器9b、以及可以选择性地插入到容器9b中以将缓冲流体从第一注射泵9中释放出来的柱塞9a。附加地，沿离开容器9b的方向移动柱塞产生负压以将缓冲流体吸入到第一注射泵9中。优选地，缓冲流体包括带有添加剂（诸如，小部分去污剂（例如，聚山梨醇酯20）和/或二甲基亚砜（DMSO））的生理缓冲液（诸如，磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS）或HEPES缓冲盐水溶液（HBS））。
第一缓冲液储器9借助于缓冲液导管10流体地连接到第一导管5。缓冲液导管10在第一接合部11处与第一导管5连接。如图1中所图示，在该示例中，缓冲液导管10垂直于第一导管5布置，使得第一接合部11是T形接合部11；然而，将理解，第一接合部11可采用任何形状或构型。此外，第一接合部11是无阀接合部（即，在第一接合部11处不存在阀）。在该实施例的变型中，阀设置在第一接合部11处；并且阀可在第一打开位置与第二关闭位置之间移动；在第一打开位置中，阀打开以允许缓冲液导管10与第一导管5之间的流体流动，并且在第二关闭位置中，阀关闭，阻断缓冲液导管10与第一导管5之间的流体流动。
微流体组件1进一步包括第二导管15，该第二导管的一端流体地连接到第一流动池2的第二流体端口2b和第二流动池2’的第二流体端口2b’，并且该第二导管的另一端流体地连接到第二选择阀28；第二选择阀28可以将第二导管5选择性地流体地连接到第二废物储器27。第二废物储器27可以接收和存储不需要的流体，诸如清洁流出物。
参考图1中所图示的实施例而继续，第二选择阀28可在第一位置与第二位置之间移动；当第二选择阀28处于其第一位置中时，第二选择阀28允许流体从第二导管15传递到第二废物储器27中；并且当第二选择阀28处于其第二位置中时，第二选择阀28关闭，因此防止流体流出第二导管15进入第二废物储器27中。
微流体组件1进一步包括第二缓冲液储器19，该第二缓冲液储器容纳缓冲流体，该缓冲流体可以用于清洁微流体组件1的部分。在该示例中，第二缓冲液储器19包括第二注射泵19；第二注射泵19包括容纳缓冲流体的容器19b、以及可以选择性地插入到容器19b中以将缓冲流体从第二注射泵19中释放出来的柱塞19a。附加地，沿离开容器19b的方向移动柱塞19a产生负压以将缓冲流体吸入到第二注射泵19中。优选地，缓冲流体包括生理缓冲液（诸如，磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS））。
微流体组件1进一步包括样品储器29，该样品储器包含样品流体，该样品流体包含待测试与第一配体4的结合的分析物。样品储器29优选地为小瓶或微量滴定板的孔。在该示例性实施例中，样品储器29位于x-y台50上。可以选择性移动x-y台（沿着x或y轴——如通过双头箭头所图示），以便选择性地使样品储器29与中间导管51选择性流体连接。中间导管51是具有适于从样品储器中吸入液体的一个开口端的中空导管，其优选地由不锈钢或聚醚醚酮（PEEK）制成。样品存储导管可以是由PEEK或聚四氟乙烯（PTFE）或不锈钢制成的微流体管，或者是由聚酰亚胺制成的分层歧管内的导管。
图1将x-y台示为处于其中样品储器29流体地连接到中间导管51的位置中，借此x-y台50定位成使得样品储器29定位在中间导管51的自由端下方。
微流体组件1进一步包括第三选择阀18。第三选择阀18流体地连接到中间导管51，因此样品储器29可以选择性地流体地连接到第三选择阀18。第三选择阀经由存储导管30进一步与第二注射泵19流体地连接。在该示例中，存储导管30是盘绕的导管，以便增加可以存储在存储导管30中的流体的体积。在该示例中，存储导管30具有大于100微升的内部体积。存储导管30的一端流体地连接到第二注射泵19，且存储导管30的相对端流体地连接到第三选择阀18。
存储导管30、x-y台50、第三选择阀18、第二缓冲液储器19（例如，第二注射泵19）、中间导管1、样品储器29可以被认为共同限定样品递送单元71。
在该实施例的变型中，代替样品递送单元71（即，代替包括存储导管30、x-y台50、第二缓冲液储器19、第三选择阀18、中间导管1和样品储器29的部件组），可提供用于装载和存储样品流体的任何其他合适的器件，诸如例如自动取样器；例如自动取样器模型（诸如，由Spark Holland，NL.制造的“Alias”）可提供在组件1中而不是在所述上文提到的部件组中。优选地，在实施例的该变型中，组件将进一步包括可操作地连接到自动取样器的泵。
参考图1中所图示的组件继续，第三选择阀18借助于样品导管20流体地连接到第二导管15。样品导管20在第二接合部21处与第二导管15连接。如图1中所图示，在该示例中，样品导管20垂直于第二导管15布置，使得第二接合部21是T形接合部21；然而，将理解，第二接合部21可采用任何形状或构型。在该实施例中，第二接合部21是无阀的（即，在第二接合部21处不存在阀）。在该实施例的变型中，阀设置在第二接合部21处；并且阀可在第一打开位置与第二关闭位置之间移动；在第一打开位置中，阀打开以允许样品导管20与第二导管15之间的流体流动，并且在第二关闭位置中，阀关闭，阻断样品导管20与第二导管15之间的流体流动。
第三选择阀18可在第一位置与第二位置之间移动。当第三选择阀18处于其第一位置中时，第三选择阀18将中间导管51与存储导管30流体地连接。因此，如果第三选择阀18处于其第一位置中，且x-y台定位成使得中间导管51流体地连接到样品储器29，则样品储器中的样品流体可以穿过导管51并经由第三选择阀18进入存储导管30中。
当第三选择阀18处于其第二位置中时，第三选择阀18将存储导管30与样品导管20流体地连接；因此，当第三选择阀18处于其第二位置中时，流体可以经由第三选择阀18从存储导管30流入样品导管20中，或经由第三选择阀18从样品导管20流入存储导管30中。
微流体组件1可以用于实施根据本发明的方法实施例的示例性方法，如下文将详细描述的：
步骤（a）
以预定浓度c0在样品储器29中提供待测试的样品流体。优选地，样品流体包括在缓冲流体中稀释到预定浓度c0的分析物。优选地，预定浓度c0等于或高于应在分析物与配体4之间可测量的最大预期平衡解离常数KD,max。例如，如果要在候选药物初筛中检测结合“命中”并且“命中”被定义为示出以低于100 μM的平衡解离常数KD,max结合到第一配体4的分析物，则优选地将预定浓度c0选择为100 μM或更高。本领域技术人员已知，为了使用不同浓度下的分析物的一系列注射来确定分析物与配体4之间的相互作用的动力学速率，最高分析物浓度应比最大预期平衡解离常数KD,max高大约一个数量级。有利地，为了使用本发明的方法测量动力学速率，样品流体中的分析物的预定浓度c0不需要比最大预期平衡解离常数KD,max高一个数量级。优选地，在本发明中，提供在储器29中的所述样品流体中的分析物的预定浓度c0（是c0 = 1×KD,max，或c0 = 2 ×KD,max，或c0 = 3×KD,max，其中，KD,max是最大预期平衡解离常数。较低浓度（诸如，1×KD,max）的优点是避免了不良影响，诸如分析物溶解度差或分析物聚集。稍高浓度（诸如，3×KD,max）的优点是关于针对以接近KD,max的平衡解离常数相互作用所评估的动力学速率的误差较低。
最优选地，漂洗微流体组件1的所有导管、泵、阀、以及第一流动池2和第二流动池2’，以排空剩余的空气并清洁流动路径而没有污染物。为完成此，将第三选择阀18移动到其第二位置，并且将第一选择阀8移动到其第一位置，因此第一选择阀8打开，并且将第二选择阀28移动到其第二位置，因此第二选择阀28关闭。然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使更多缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将缓冲流体推入存储导管30中并进入样品导管20中，且然后进入第二导管15中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且沿着第一导管5并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，样品流体还将存在于存储导管30、样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第一导管5中的任何空气或污染物冲洗出来进入到第一废物储器7中。然后，将第一选择阀8移动到其第二位置，因此第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置，因此第二选择阀28打开。然后，将柱塞9a插入到容器9a中，使得从第一注射泵9释放缓冲流体。缓冲流体流出第一注射泵9，通过缓冲液导管10进入第一导管5中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且进入第二导管15中，并且进入第二废物储器27中。
此时，样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第二流动池2’、以及第一导管5和缓冲液导管10全部都填充有缓冲流体。
然后，移动x-y台50，使得样品储器29与中间导管51流体地连接。然后，将第三选择阀18移动到其第一位置，使得中间导管51经由第三选择阀与存储导管30流体地连接。在第三选择阀18处于其第一位置中的情况下，沿离开容器19b的方向移动第二注射泵19的柱塞19a以便在存储导管30中产生负压。结果，总吸取体积Vt的样品流体从样品储器29吸入到中间导管51中，并经由第三选择阀18进入存储导管30中。总吸取体积Vt优选地在10 μL与500μL之间。
接下来，将第三选择阀18移动到其第二位置，使得第三选择阀18流体地连接存储导管30和样品导管20。任选地，然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将一些样品流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。由于第一选择泵8关闭，因此由存在于第一流动池2中的缓冲流体提供的压力将防止样品流体沿着第二导管15流向第一流动池2和第二流动池2’；此外，由于第二选择阀28处于其第一位置中使得第二选择阀28打开，因此样品流体将从样品导管20流入第二导管15中并经由第二选择阀28进入第二废物储器27中。
优选地，由存在于第一流动池2和第二流动池2’中的缓冲流体提供的压力防止样品流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中。在一些情况下，可忽略量的样品流体可通过沿第一流动池2和第二流动池2’的方向沿着第二导管15的一部分进行扩散而移动。为了防止或至少最小化样品流体沿着第二导管15朝向第一流动池2和第二流动池2’的扩散，优选地，当样品流体从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中时，保持缓冲流体从第一缓冲液储器9流过第一流动池2和第二流动池2’并进入第二废物储器27中。
优选地，被允许从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中的样品流体的体积超过样品导管20的体积的两倍，但小于总吸取体积Vt（即，小于从样品储器29吸入到中间导管51中并经由第三选择阀18进入存储导管30中的样品流体的体积）。因此，在存储导管30中残留了一些样品流体。
因此，在该阶段，优选地，样品导管20已用样品流体进行漂洗；并且填充有样品流体。在该阶段，优选地，缓冲液导管10、第一流动池2和第二流动池2’全部都仅包含缓冲流体；同时优选地，样品导管20仅包含样品流体。
在实施以下步骤之前以及还在实施以下步骤期间，附接到第一流动池2和第二流动池2’的传感器45被构造成输出针对第一流动池2和第二流动池2’中的每一者的结合曲线。在该步骤（a）期间由传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线将在下文被称为单一测量结合曲线；该单一测量结合曲线将是信号，其表示随时间结合到第一流动池2的第一测试表面3上的配体4的分析物的量。在该步骤（a）期间由传感器45针对第二流动池2’输出的结合曲线将在下文被称为单一参考结合曲线。应注意，由于第二流动池2’的第二测试表面3’没有配体，因此可以预期单一参考结合曲线将是指示没有结合的常数‘零’；然而，在实践中情况并非如此；在实践中，由于折射率的贡献所致，单一参考结合曲线将是非零的。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第一体积V1的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，该第一体积V1小于总吸取体积Vt。从第二注射泵19释放的缓冲流体将对应的第一体积V1的样品流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。由于第一选择阀8处于其第二位置中（即，第一选择阀8打开），因此存在于第一流动池2和第二流动池2’中的缓冲流体不再提供防止样品流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中的压力。因此，现在传递到样品导管20中的样品流体流入第二导管15中，在时间ts0处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，样品流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体冲洗出来进入第一废物储器7中（优选地，样品流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中、以及存在于第二导管15的在第二接合部21与第一流动池3之间的部分中的所有缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中）。
因此，在该阶段，样品导管20、第二导管15的在第二接合部21与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分、以及第一导管5全部都仅包含样品流体。有利地，由于在将第一选择阀8移动到其第二位置之前样品导管20中已经存在样品流体，因此这允许当将第一选择阀8移动到其第二位置时第一流动池2和第二流动池2’内的样品流体的浓度快速增加。
第一分析物持续时间t1a是第一体积V1的样品流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间。因此，第一分析物持续时间t1等于第一体积V1的样品流体被注射到第一流动池2和第二流动池2’中的持续时间（如在前一段落中概述的步骤中描述）；且更具体地，在一个示例中，参考前面段落中描述的步骤，第一分析物持续时间t1可以被定义为在开始将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中以从注射泵中排出所述第一体积V1的缓冲流体与停止将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中之间的持续时间。注射第一样品流体体积的平均流速f1a对应于V1/t1a。优选地，t1介于10毫秒与60分钟之间，并且f1介于1 μL/min与1 mL/min之间，且V1介于0.1 μL与200 μL之间。
接下来，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9释放第一体积V1’的缓冲流体（不含分析物）。从第一注射泵9释放的缓冲流体将流过第一导管5，在时间tb0同时流入第一流动池2和第二流动池2’中并进入第二导管15中以及进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与流动池2之间的部分中的样品流体至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有样品流体部分地冲洗出来进入第二废物储器27中）。当缓冲流体经过第一流动池2的第一测试表面3时，属于第一体积V1的样品流体并且先前与第一配体4结合但已从第一配体4被动地解离的分析物冲洗进入第二废物储器27中。此外，在优选实施例中，第一体积V1’的缓冲流体被构造（即，具有组合物）成引起结合到第一配体4的分析物（其属于第一体积V1的样品流体）从第一配体4解离；通过缓冲液从第一配体4解离的分析物被冲洗通过第一流动池2、第二导管15并进入第二废物储器27中。
第一缓冲液持续时间t1b是在以上步骤中将第一体积V1’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度，并且被定义为在开始将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中以便从第一注射泵9中排出第一体积V1’的缓冲流体与停止将柱塞9a插入到容器9b中之间的时间差。注射第一体积V1’的缓冲流体的平均流速f1b’对应于V1’/t1b。优选地，t1b介于10毫秒与60分钟之间，并且f1’介于0.1 μL/min与1 mL/min之间，且V1’介于1 μL与200 μL之间。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第二体积V2的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，该第二体积V2小于总吸取体积Vt。从第二注射泵19释放的第二体积V2的缓冲流体将残留在存储导管30中的对应的第二体积V2的样品流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。在优选实施例中，样品流体的第二体积V2大于样品流体的第一体积V1。由于第一选择阀8处于其第二位置中（即，第一选择阀8打开），因此存在于第一流动池2中的缓冲流体不再提供防止样品流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中的压力。因此，现在传递到样品导管20中的样品流体流入第二导管15中，且在时间ts1处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，样品流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中。当样品流体经过第一流动池2的第一测试表面3时，包含在样品流体中且具有允许它们与表面上的第一配体4结合所必要的预定义特性的分析物将与第一配体4结合。
第二分析物持续时间t2a是第二体积V2的样品流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间。因此，第二分析物持续时间t2a等于第二体积V2的样品流体被注射到第一流动池2和第二流动池2’中的持续时间（如在前面段落中概述的步骤中描述）；更具体地，在一个示例中，参考前面段落中描述的步骤，第二分析物持续时间t2可以被定义为在开始将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中以从注射泵中排出所述第二体积V2的缓冲液与停止将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中之间的时间差。注射第二体积V2的样品流体（包含分析物）的平均流速f2a对应于V2/t2a。优选地，t2介于10毫秒与60分钟之间，并且f2a介于1 μL/min与1 mL/min之间，且V1介于0.1 μL与200 μL之间。
在本发明中重要的是，第一分析物持续时间t1a比第二分析物持续时间t2a更短。重要的是，第一体积V1的样品流体中的分析物的预定浓度c0与第二体积V2的样品流体中的分析物的预定浓度c0相同。
应理解，在第一体积V1的样品流体之前和/或在注射第一体积V1的样品流体与第二体积V2的样品流体之间，可以将其他体积的样品流体注射到流动池中；换句话说，上文提到的第一体积V1的样品流体和第二体积V2的样品流体不一定需要彼此为连续的；它们两者都不需要构成以样品流体体积注射序列注射的第一体积和第二体积，而是它们可以出现在序列中的任何点处并且可以以任何顺序出现。
有利地，在本发明中，在使第一体积V1的样品流体流过样品导管20并在第一测试表面3上流动与使第二体积V2的样品流体流过样品导管20并在第一测试表面3上流动之间，不需要漂洗样品导管20（用例如缓冲液或任何其他合适的漂洗材料）。
接下来，优选地，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9中排出第二体积V2’的缓冲流体。从第一注射泵9释放的第二体积V2’的缓冲流体将流过第一导管5，且在tb1处并沿着第二导管15同时流过第一流动池2和第二流动池2’并进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管5的在第一接合部11与流动池之间的部分中的样品流体至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有样品流体冲洗出来进入第二废物储器27中）。当第二体积V2’的缓冲流体经过第一流动池2的第一测试表面3时，属于第二体积V2的样品流体并且先前与第一配体4结合但已从第一配体4被动地解离的分析物被冲洗进入第二废物储器27中。此外，在优选实施例中，第二体积V2’的缓冲流体被构造（即，具有合适的组合物）成引起与第一配体4结合的分析物（其属于第二体积V2的样品流体）从第一配体4解离；通过缓冲液从第一配体4解离的分析物被冲洗通过第一流动池2、第二导管15并进入第二废物储器27中。
第二缓冲液持续时间t2b是在以上步骤中将第二体积V2’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度，并且被定义为在开始将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中以便从第一注射泵9中排出第二体积V2’的缓冲流体与停止将柱塞9a插入到容器9b中之间的时间差。注射不含分析物的第一流体体积的平均流速f2b’对应于V2’/t2b’。优选地，t2’介于10毫秒与60分钟之间，并且f2b’介于0.1 μL/min与1 mL/min之间，且V2’介于1 μL与200 μL之间。
如所提到的，当第一体积和第二体积（V1、V2）的样品流体以及第一体积和第二体积（V1’、V2’）的缓冲流体流过第一流动池2和第二流动池2’时，传感器测量相应的第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上的结合；传感器45输出单一测量结合曲线和单一参考结合曲线。
当第一体积V1和第二体积V2的样品流体经过第一流动池2的第一测试表面3时，包含在第一体积V1和第二体积V2的样品流体中且具有允许它们与第一测试表面3上的第一配体4结合所必要的预定义特性的分析物将与第一配体4结合；该结合将在由传感器45输出的单一测量结合曲线中指示。传感器还在第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体经过第一流动池2的第一测试表面3时测量第一流动池2的第一测试表面3处的结合；在优选实施例中，第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体被构造成引起结合到第一测试表面3上的配体4的分析物从配体4解离；这种结合减少将在由传感器45输出的单一测量结合曲线中指示。
第二测试表面3’没有配体，且因此单一参考结合曲线将不指示任何结合；然而，单一参考结合曲线是非零的；在单一参考结合曲线中指示的任何活性都将是由于由第一体积V1和第二体积V2的样品流体以及第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体在它们流过第二流动池2’时引起的折射率效应所致。当第一体积V1和第二体积V2的样品流体经过第二流动池2’的第二测试表面3’时，由第一体积V1和第二体积V2的样品流体引起的折射率将引起单一参考结合曲线为非零；第一体积V1和第二体积V2的样品流体的折射率贡献将在由传感器45输出的单一参考结合曲线中指示。当第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体经过第二流动池2’的第二测试表面3’时，由第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体引起的折射率将引起单一参考结合曲线为非零；第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体的折射率贡献将在由传感器45输出的单一参考结合曲线中指示。
应理解，在该步骤（a）中由传感器45输出的单一测量结合曲线和/或单一参考结合曲线可以被划分成段进行处理。
在该步骤（a）中描述的上文提到的步骤可重复多次，使得对应的多个体积的样品流体穿过第一流动池2和第二流动池2’。在优选实施例中，然后，将注射样品流体体积（包含分析物）和注射缓冲流体体积（不含分析物）的步骤重复多次，使得多个体积的样品流体穿过第一流动池2和第二流动池2’；优选地，将这些步骤重复三次或四次或五次或六次或七次或八次或九次或十次。将注射样品流体体积（每个样品流体体积包含分析物）和注射缓冲流体体积（不含分析物）的步骤重复较少次数（例如，重复三次）的优点是减少了实验的总持续时间。这尤其适合于在早期阶段候选药物筛选中遇到的弱结合剂，诸如具有在uM或mM范围内的亲和力。将注射样品流体体积（包含分析物）和注射缓冲流体体积（不含分析物）的步骤重复更多次数（诸如，在五次到十次之间）的优点是可以确定更大的动力学参数范围，或者可以以更大的准确性确定动力学参数。这尤其适合于更严格的结合剂，诸如具有在nM或pM范围内的亲和力。
作为示例，图2针对示例性实施例示出了从传感器45输出的单一测量结合曲线（实线）和单一参考结合曲线（虚线）的示例，在该示例性实施例中，前述步骤（即，注射样品流体体积）（包含分析物）和注射缓冲流体体积（不含分析物）已被实施‘5’次（即，‘5’个样品流体体积和‘5’个缓冲流体体积已流过第一流动池2和第二流动池2’）。曲线图的x轴表示以秒为单位的时间，且y轴表示以pg/mm2为单位的表面质量。
在所描绘的示例中，包括在样品体积中的每一者中并且可以结合到流动池中的配体4的分析物是处于100 uM的预定浓度co的呋塞米（Sigma-Aldrich产品编号F4381）。换句话说，样品流体体积中的每一者均包括100 uM的预定浓度co的呋塞米；缓冲流体体积没有分析物，即，缓冲流体体积不包含任何呋塞米。在x=75 s时以312.5 ms的第一分析物持续时间t1a注射第一体积V1的样品流体，接着是以4.6875 s的第一缓冲液持续时间t1b注射第一体积V1’的缓冲流体，接着是以625 ms的第二分析物持续时间t2a注射第二体积V2的样品流体，接着是以4.375 s的第二缓冲液持续时间t2b注射第二体积V2’的缓冲流体，接着是以1.25 s的第三分析物持续时间t3a注射第三体积V3的样品流体，接着是以3.75 s的第三缓冲液持续时间t3b注射第三体积V3’的缓冲流体，接着是以2.5 s的第四分析物持续时间t4a注射第四体积V4的样品流体，接着是以2.5 s的第四缓冲液持续时间t4b注射第四体积V4’的缓冲流体，接着是以5 s的第五分析物持续时间t5a注射第五体积V5的样品流体，接着是以200s的第五缓冲液持续时间t5b注射第五体积V5’的缓冲流体（并未示出所有数据）。在整个测量过程中，样品流体体积和缓冲流体体积的流速为80 μl/min。
应注意，传感器45可采用任何合适的形式。Creoptix WAVEdelta系统在10 Hz的采集频率和25°C的流动池温度下操作，并且使用包括第一流动池2（其包括其第一测试表面3上的配体4）和第二流动池2’（其第二测试表面3’没有配体）的一次性传感器芯片（诸如例如，来自Creoptix AG的“WAVEchip 4PCH”）来获得图2中所示的单一测量结合曲线和单一参考结合曲线。Creoptix WAVEdelta系统在其测量过程中进行了修改，以允许从单个样品储器进行多次注射。在获得图2中所描绘的测量值之前，来自牛红细胞的碳酸酐酶同工酶II（“CAII”，Sigma-Aldrich产品编号C2522）作为配体4使用胺偶联被固定化（以约10’400 pg/mm2的密度）到在第一流动池2的第一测试表面3上的PCH WAVEchip上。第二流动池2’的第二测试表面3留空，没有配体。PBS缓冲液（pH值为7.4，3% DMSO）被用作缓冲液，即，缓冲流体体积V1’-V5’中的每一者均包括PBS缓冲液（pH值为7.4，3% DMSO）。
步骤（b）
在已执行以上步骤（a）或以下步骤（c）之后或之前，分别使多个体积的样品缓冲流体穿过第一流动池2和第二流动池2’，并且当这些样品缓冲流体体积分别穿过第一流动池2和第二流动池2’时，传感器45输出每个相应流动池2、2’的结合曲线。这些体积的样品缓冲流体以与步骤（a）中的体积（V1、V2）的样品流体相同的速率、间隔、流速和持续时间穿过第一流动池和第二流动池；例如，在该示例中，使两个体积V1、V2的样品流体穿过第一流动池2和第二流动池2’，因此在该步骤（b）中两个体积的样品缓冲流体将穿过流动池；将两个体积的样品缓冲流体注射到第一流动池2和第二流动池2’中之间的间隔将等于注射两个体积V1、V2的样品流体之间的间隔（即，等于ts0与ts1之间的间隔）；用于注射两个体积的样品缓冲流体的流速和周期也将与步骤（a）中的两个体积V1、V2的样品流体相同。当这些样品缓冲流体体积分别穿过第一流动池2时，传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线被称为单一空白测量结合曲线；并且当这些样品缓冲流体体积分别穿过第二流动池2’时，传感器45针对第二流动池输出的结合曲线被称为单一空白参考结合曲线。现在将更详细地描述该步骤（b）：
在样品储器29中提供样品缓冲流体。应理解，提供在样品储器29中的样品缓冲流体可与提供在第一注射泵9中的缓冲流体相同或不同，和/或可与提供在第二注射泵19中的缓冲流体相同或不同。
最优选地，漂洗微流体组件1的所有导管、泵、阀、以及第一流动池2和第二流动池2’，以排空剩余的空气并清洁流动路径而没有污染物。为完成此，将第三选择阀18移动到其第二位置，并且将第一选择阀8移动到其第一位置，因此第一选择阀8打开，并且将第二选择阀28移动到其第二位置，因此第二选择阀28关闭。然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使更多缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将缓冲流体推入存储导管30中并进入样品导管20中，且然后进入第二导管15中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且沿着第一导管5并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，缓冲流体还将存在于存储导管30、样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第一导管5中的任何空气或污染物冲洗出来进入第一废物储器7中。然后，将第一选择阀8移动到其第二位置，因此第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置，因此第二选择阀28打开。然后，将柱塞9a插入到容器9a中，使得从第一注射泵9释放缓冲流体。缓冲流体流出第一注射泵9，通过缓冲液导管10进入第一导管5中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且进入第二导管15中，并且进入第二废物储器27中。
此时，样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第二流动池2’、以及第一导管5和缓冲液导管10全部都填充有缓冲流体。
然后，移动x-y台50，使得样品储器29与中间导管51流体地连接。然后，将第三选择阀18移动到其第一位置，使得中间导管51经由第三选择阀与存储导管30流体地连接。在第三选择阀18处于其第一位置中的情况下，沿离开容器19b的方向移动第二注射泵19的柱塞19a以便在存储导管30中产生负压。结果，总吸取体积VBt的样品缓冲流体从样品储器29吸入到中间导管51中，并经由第三选择阀18进入存储导管30中。
接下来，将第三选择阀18移动到其第二位置，使得第三选择阀18流体地连接存储导管30和样品导管20。任选地，然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将一些样品缓冲流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。由于第一选择泵8关闭，因此由存在于第一流动池2中的缓冲流体提供的压力将防止样品缓冲流体沿着第二导管15流向第一流动池2和第二流动池2’；此外，由于第二选择阀28处于其第一位置中使得第二选择阀28打开，因此样品缓冲流体将从样品导管20流入第二导管15中并经由第二选择阀28进入第二废物储器27中。
优选地，由存在于第一流动池2和第二流动池2’中的缓冲流体提供的压力防止样品缓冲流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中。在一些情况下，可忽略量的样品缓冲流体可通过沿第一流动池2和第二流动池2’的方向沿着第二导管15的一部分进行扩散而移动。为了防止或至少最小化样品缓冲流体沿着第二导管15朝向第一流动池2和第二流动池2’的扩散，优选地，当样品缓冲流体从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中时，保持缓冲流体从第一缓冲液储器9流过第一流动池2和第二流动池2’并进入第二废物储器27中。
优选地，被允许从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中的样品缓冲流体的体积超过样品导管20的体积的两倍，但小于总吸取体积VBt（即，小于从样品储器29吸入到中间导管51中并经由第三选择阀18进入存储导管30中的样品缓冲流体的体积）。因此，在存储导管30中残留了一些样品缓冲流体。
因此，在该阶段，优选地，样品导管20已用样品缓冲流体进行漂洗；并且填充有样品缓冲流体。在该阶段，优选地，缓冲液导管10、第一流动池2和第二流动池2’全部都仅包含缓冲流体；同时优选地，样品导管20包含样品缓冲流体。
在实施以下步骤之前以及还在实施以下步骤期间，附接到第一流动池2和第二流动池2’的传感器45被构造成输出针对第一流动池2和第二流动池2’中的每一者的结合曲线。在该步骤（b）期间由传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线将在下文被称为单一空白测量结合曲线。在该步骤（b）期间由传感器45针对第二流动池2’输出的结合曲线将在下文被称为单一空白参考结合曲线。在样品储器29中提供的样品缓冲流体不包括可以结合到第一流动池2的第一测试表面3上的配体4的任何分析物；此外，第二流动池2’的第二测试表面3’不包括配体。因此，将预期，单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线将各自为常数‘零’，因为当样品缓冲流体在相应的第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动时，在第一测试表面3和第二测试表面3’上不会发生结合。然而，在实践中，单一空白测量结合曲线和/或单一空白参考结合曲线中的至少一者将包括非零值；并且由于系统误差所致，单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线将彼此不同。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第一体积V1B的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，该第一体积V1B小于总吸取体积VBt。从第二注射泵19释放的缓冲流体将对应的第一体积V1B的样品缓冲流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。
现在传递到样品导管20中的样品缓冲流体流入第二导管15中，在时间tB0处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，样品缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中（优选地，样品缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管中、以及存在于第二导管15的在第二接合部21与第一流动池3之间的部分中的所有缓冲流体冲洗出来进入第一废物储器7中）。
因此，在该阶段，样品导管20、第二导管15的在第二接合部21与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分、以及第一导管5全部都仅包含样品缓冲流体。
样品缓冲流体的第一体积V1B等于步骤（a）中的样品流体的第一体积V1。
第一体积V1B的样品缓冲流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间（t1B）等于步骤（a）中的第一分析物持续时间t1a。
注射第一体积V1B的样品缓冲流体的平均流速（V1B/t1B）等于步骤（a）中的第一样品体积的平均流速f1a。
接下来，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9释放第一体积V1’的缓冲流体。缓冲流体的第一体积V1’等于步骤（a）中的缓冲流体的第一体积V1’。从第一注射泵9释放的缓冲流体将流过第一导管5，在时间tBb0同时流入第一流动池2和第二流动池2’中并进入第二导管15中以及进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体（来自第一注射泵9）还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与流动池2之间的部分中的缓冲流体（源自样品储器29）至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有缓冲流体（源自样品储器29）冲洗出来进入第二废物储器27中）。
第一缓冲液持续时间t1b是将第一体积V1’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度的量度；该步骤（b）中的第一缓冲液持续时间t1b等于步骤（a）中的第一缓冲液持续时间t1b。
在该步骤（b）中注射第一体积V1’的缓冲流体的平均流速（V1’/t1b）等于在步骤（a）中注射第一体积V1’的缓冲流体的平均流速f1b’。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第二体积V2B的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，缓冲流体的第二体积V2B小于总吸取体积VBt。从第二注射泵19释放的第二体积V2B的缓冲流体将残留在存储导管30中的对应的第二体积V2B的样品缓冲流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。
由于第一选择阀8处于其第二位置中（即，第一选择阀8打开），因此存在于第一流动池2中的缓冲流体不再提供防止样品缓冲流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中的压力。因此，现在传递到样品导管20中的第二体积V2B的样品缓冲流体流入第二导管15中，且在时间tB1处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，第二体积V2B的样品缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中。
该步骤（b）中的tB0（第一体积V1B的样品缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与tB1（第二体积V2B的样品缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的持续时间间隔等于步骤（a）中的ts0（第一体积V1的样品流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与ts1（第二体积V2的样品流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的时间间隔。
该步骤（b）中的样品缓冲流体的第二体积V2B等于步骤（a）中的样品流体的第二体积V2。
第二体积V2B的样品缓冲流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间（t2B）等于步骤（a）中的第二分析物持续时间t2a。
注射第二体积V2s的样品缓冲流体体积的平均流速（V2B/t2B）等于步骤（a）中的第二样品体积的平均流速f2a。
接下来，优选地，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9中排出第二体积V2’的缓冲流体。从第一注射泵9释放的第二体积V2’的缓冲流体将流过第一导管5，且在时间tBb1沿着第二导管15同时流入第一流动池2和第二流动池2’中并进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管5的在第一接合部11与流动池之间的部分中的样品缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中。（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有样品缓冲流体冲洗出来进入第二废物储器27中）。
第二缓冲液持续时间t2b是将第二体积V2’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度的量度；该步骤（b）中的第二缓冲液持续时间t2b等于步骤（a）中的第二缓冲液持续时间t2b。
在该步骤（b）中注射第二体积V2’的缓冲流体的平均流速（V2’/t2b）等于在步骤（a）中注射第二体积V2’的缓冲流体的平均流速f2b’。
tBb0（在该步骤（c）中第一体积V1’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与tBb1（在该步骤（c）中第二体积V2’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的持续时间间隔等于tb0（在步骤（a）中第一体积V1’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与tb1（在步骤（a）中第二体积V2’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的时间间隔。
如所提到的，当第一体积和第二体积（V1B、V2B）的样品缓冲流体以及第一体积和第二体积（V1’、V2’）的缓冲流体流过第一流动池2和第二流动池2’时，传感器45测量相应的第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上的结合。单一空白测量结合曲线是在该步骤（b）期间由传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线；并且单一空白参考结合曲线是在该步骤（b）期间由传感器45针对第二流动池2’输出的结合曲线。
在样品储器29中提供的所述样品缓冲流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物；因此，第一体积V1B和第二体积V2B的样品缓冲流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物。此外，来自第一注射泵9和/或第二注射泵19的缓冲流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物。因此，因而，当第一体积V1B和第二体积V2B的样品缓冲流体或者第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体流过第一流动池2和第二流动池2’时，在第一流动池2抑或第二流动池2’中将不存在结合。在这种情况下，将预期，单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线两者都将保持于常数‘零’。然而，在实践中，单一空白测量结合曲线和/或单一空白参考结合曲线中的至少一者将包括非零值；并且由于系统误差所致，单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线将彼此不同。
应理解，在步骤（b）中由传感器45输出的单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线可以被划分成段进行处理。
步骤（c）
在已执行上文提到的步骤（a）和（b）之后或之前，分别使多个体积的折射率标准流体穿过第一流动池2和第二流动池2’，并且传感器45在这些折射率标准流体体积（和缓冲液体积）分别穿过第一流动池2和第二流动池2’时输出每个相应流动池2、2’的结合曲线。折射率标准优选地包括具有诸如小分子（诸如，DMSO或葡萄糖）之类的添加剂的缓冲流体，其优选地浓度为0.1% v/v、或0.5% v/v、或1% v/v，因此折射率标准流体的折射率与缓冲流体不同。优选地，折射率标准流体中添加剂的扩散性质与待测试的分析物的扩散性质非常相似。优选地，添加剂的分子量类似于待测量的分析物的分子量。例如，添加剂的分子量可以在待测试的分析物的平均分子量±20%的范围内。这些体积的折射率标准流体以与体积（V1、V2）的样品流体相同的速率、间隔、流速和持续时间穿过第一流动池和第二流动池；例如，在该示例中，使两个体积V1、V2的样品流体穿过第一流动池2和第二流动池2’，因此在该步骤中两个体积的折射率标准流体将穿过流动池；将两个体积的折射率标准流体注射到第一流动池2和第二流动池2’中之间的间隔将等于注射两个体积V1、V2的样品流体之间的间隔（即，等于ts0与ts1之间的间隔）；用于注射两个体积的折射率标准流体的流速和周期也将与两个体积V1、V2的样品流体相同。传感器45在折射率标准流体体积（和缓冲液体积）分别穿过第一流动池2时针对第一流动池2输出的结合曲线被称为单一溶剂测量结合曲线；并且传感器45在这些折射率标准流体体积（和缓冲液体积）分别穿过第二流动池2’时针对第二流动池输出的结合曲线被称为单一溶剂参考结合曲线。现在将更详细地描述该步骤（c）：
在样品储器29中提供折射率标准流体。
最优选地，漂洗微流体组件1的所有导管、泵、阀、以及第一流动池2和第二流动池2’，以排空剩余的空气并清洁流动路径而没有污染物。为完成此，将第三选择阀18移动到其第二位置，并且将第一选择阀8移动到其第一位置，因此第一选择阀8打开，并且将第二选择阀28移动到其第二位置，因此第二选择阀28关闭。然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使更多缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将缓冲流体推入存储导管30中并进入样品导管20中，且然后进入第二导管15中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且沿着第一导管5并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，折射率标准流体还将存在于存储导管30、样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第一导管5中的任何空气或污染物冲洗出来进入第一废物储器7中。然后，将第一选择阀8移动到其第二位置，因此第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置，因此第二选择阀28打开。然后，将柱塞9a插入到容器9a中，使得从第一注射泵9释放缓冲流体。缓冲流体流出第一注射泵9，通过缓冲液导管10进入第一导管5中以及进入第一流动池2和第二流动池2’中，并且进入第二导管15中，并且进入第二废物储器27中。
此时，样品导管20、第二导管15、第一流动池2和第二流动池2’、以及第一导管5和缓冲液导管10全部都填充有缓冲流体。
然后，移动x-y台50，使得样品储器29与中间导管51流体地连接。然后，将第三选择阀18移动到其第一位置，使得中间导管51经由第三选择阀与存储导管30流体地连接。在第三选择阀18处于其第一位置中的情况下，沿离开容器19b的方向移动第二注射泵19的柱塞19a以便在存储导管30中产生负压。结果，总吸取体积Vst的折射率标准流体从样品储器29吸入到中间导管51中，并经由第三选择阀18进入存储导管30中。
接下来，将第三选择阀18移动到其第二位置，使得第三选择阀18流体地连接存储导管30和样品导管20。任选地，然后，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使缓冲流体从第二注射泵19中出来。从第二注射泵19释放的缓冲流体将一些折射率标准流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。由于第一选择泵8关闭，因此由存在于第一流动池2中的缓冲流体提供的压力将防止折射率标准流体沿着第二导管15流向第一流动池2和第二流动池2’；此外，由于第二选择阀28处于其第一位置中使得第二选择阀28打开，因此折射率标准流体将从样品导管20流入第二导管15中并经由第二选择阀28进入第二废物储器27中。
优选地，由存在于第一流动池2和第二流动池2’中的缓冲流体提供的压力防止折射率标准流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中。在一些情况下，可忽略量的折射率标准流体可通过沿第一流动池2和第二流动池2’的方向沿着第二导管15的一部分进行扩散而移动。为了防止或至少最小化折射率标准流体沿着第二导管15朝向第一流动池2和第二流动池2’的扩散，优选地，当折射率标准流体从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中时，保持缓冲流体从第一缓冲液储器9流过第一流动池2和第二流动池2’并进入第二废物储器27中。
优选地，被允许从存储导管30沿着样品导管20流动并进入第二废物储器27中的折射率标准流体的体积超过样品导管20的体积的两倍，但小于总吸取体积Vst（即，小于从样品储器29吸入到中间导管51中并经由第三选择阀18进入存储导管30中的折射率标准流体的体积）。因此，在存储导管30中残留了一些折射率标准流体。
因此，在该阶段，优选地，样品导管20已用折射率标准流体进行漂洗；并且填充有折射率标准流体。在该阶段，优选地，缓冲液导管10、第一流动池2和第一流动池2’全部都仅包含缓冲流体；同时优选地，样品导管20仅包含折射率标准流体。
在实施以下步骤之前以及还在实施以下步骤期间，附接到第一流动池2和第二流动池2’的传感器45被构造成输出第一流动池2和第二流动池2’中的每一者的结合曲线。在该步骤（c）期间由传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线将在下文被称为单一溶剂测量结合曲线。在该步骤（c）期间由传感器45针对第二流动池2’输出的结合曲线将在下文被称为单一溶剂参考结合曲线。由于第一流动池2内的体积将与第二流动池2’内的体积不同（因为存在占据了第一流动池内的部分体积的存在于第一流动池2中的配体4；而在第二流动池2’中没有配体（或者如果第二流动池2’的第二测试表面3’上存在配体，则将存在与第一测试表面3上的配体不同的类型，并且也可能是第二测试表面3’上的不同量的配体）这一事实所致，单一溶剂测量结合曲线与单一溶剂参考结合曲线之间将存在差异；第一流动池2和第二流动池2’内的这些体积差异导致不同的传感器结合曲线输出。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第一体积V1s的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，该第一体积V1s小于总吸取体积Vst。从第二注射泵19释放的缓冲流体将对应的第一体积V1s的折射率标准流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。
现在传递到样品导管20中的折射率标准流体流入第二导管15中，在时间tr0处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，折射率标准流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中（优选地，折射率标准流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中、以及存在于第二导管15的在第二接合部21与第一流动池3之间的部分中的所有缓冲流体冲洗出来进入第一废物储器7中）。
因此，在该阶段，样品导管20、第二导管15的在第二接合部21与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分、以及第一导管5全部都仅包含折射率标准流体。
折射率标准流体的第一体积V1s等于步骤（a）中的样品流体的第一体积V1。
第一体积V1s的折射率标准流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间（t1s）等于步骤（a）中的第一分析物持续时间t1a。
注射第一体积V1s的折射率标准流体的平均流速（V1s/t1a）等于步骤（a）中的第一样品体积的平均流速f1a。
接下来，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9释放第一体积V1’的缓冲流体（不含分析物）。缓冲流体的第一体积V1’等于步骤（a）中的缓冲流体的第一体积V1’。从第一注射泵9释放的缓冲流体将流过第一导管5，在时间trb0同时流入第一流动池2和第二流动池2’中并进入第二导管15中以及进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与流动池2之间的部分中的折射率标准流体至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有折射率标准流体冲洗出来进入第二废物储器27中）。
第一缓冲液持续时间t1b是将第一体积V1’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度的量度；以上步骤中的第一缓冲液持续时间t1b等于步骤（a）中的第一缓冲液持续时间t1b。
在该步骤中注射第一体积V1’的缓冲流体的平均流速（V1’/t1b）等于在步骤（a）中注射第一体积V1’的缓冲流体的平均流速f1b’。
接下来，将第一选择阀8移动到其第一位置（即，第一选择阀8打开），使得流体可以从第一导管5传递到第一废物储器7中，并且优选地，将第二选择阀28移动到其第二位置，使得它关闭。在第三选择阀18仍处于其第二位置中的情况下，将柱塞19a插入到第二注射泵19的容器19b中，以便迫使第二体积V2s的缓冲流体从第二注射泵19中出来，其中，该第二体积V2s小于总吸取体积Vst。从第二注射泵19释放的第二体积V2s的缓冲流体将残留在存储导管30中的对应的第二体积V2s的折射率标准流体推出存储导管30并使其进入样品导管20中。
由于第一选择阀8处于其第二位置中（即，第一选择阀8打开），因此存在于第一流动池2中的缓冲流体不再提供防止折射率标准流体沿着第二导管15流入第一流动池2和第二流动池2’中的压力。因此，现在传递到样品导管20中的第二体积V2s的折射率标准流体流入第二导管15中，且在时间tr1处并沿着第一导管5同时流入第一流动池2和第二流动池2’中，并经由第一选择阀8进入第一废物储器7中。当它流动时，第二体积V2s的折射率标准流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第一导管5中的缓冲流体至少部分地冲洗出来进入第一废物储器7中。
tr0（第一体积V1s的折射率标准流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与tr1（第二体积V2s的折射率标准流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的持续时间间隔等于步骤（a）中的ts0（第一体积V1的样品流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与ts1（第二体积V2的样品流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的时间间隔。
折射率标准流体的第二体积V2s等于步骤（a）中的样品流体的第二体积V2。
第二体积V2s的折射率标准流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间（t2s）等于步骤（a）中的第二分析物持续时间t2a。
注射第二体积V2s的折射率标准流体的平均流速（V2s/t2a）等于步骤（a）中的第一样品体积的平均流速f2a。
接下来，优选地，将第一选择阀8移动到其第二位置使得第一选择阀8关闭，并且将第二选择阀28移动到其第一位置使得第二选择阀可以允许流体从第二导管15流入第二废物储器27中。优选地，第三选择阀18仍处于其第二位置中并且柱塞19a的位置是固定的，以便防止流体流入或流出第二注射泵19的容器19b。然后，将第一注射泵9的柱塞9a插入到容器9b中，使得从第一注射泵9中排出第二体积V2’的缓冲流体。从第一注射泵9释放的第二体积V2’的缓冲流体将流过第一导管5，且在时间trb1沿着第二导管15同时流入第一流动池2和第二流动池2’中并进入第二废物储器27中。当它流动时，缓冲流体还将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管5的在第一接合部11与流动池之间的部分中的折射率标准流体至少部分地冲洗出来进入第二废物储器27中（优选地，缓冲流体将存在于第一流动池2和第二流动池2’以及第二导管15中、以及存在于第一导管的在第一接合部11与第一流动池2和第二流动池2’之间的部分中的所有折射率标准流体冲洗出来进入第二废物储器27中）。
第二缓冲液持续时间t2b是将第二体积V2’的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度的量度；以上步骤中的第二缓冲液持续时间t2b等于步骤（a）中的第二缓冲液持续时间t2b。
在该步骤中注射第二体积V2’的缓冲流体的平均流速（V2’/t2b）等于在步骤（a）中注射第二体积V2’的缓冲流体的平均流速f2b’。
trb0（在该步骤（c）中第一体积V1’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与trb1（在该步骤（c）中第二体积V2’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的持续时间间隔等于tb0（在步骤（a）中第一体积V1’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）与tb1（在步骤（a）中第二体积V2’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）之间的时间间隔。
如所提到的，当第一体积和第二体积（V1s、V2s）的折射率标准流体以及第一体积和第二体积（V1’、V2’）的缓冲流体流过第一流动池2和第二流动池2’时，传感器测量相应的第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上的结合。单一溶剂测量结合曲线是在该步骤（c）期间由传感器45针对第一流动池2输出的结合曲线；并且单一溶剂参考结合曲线是在该步骤（c）期间由传感器45针对第二流动池2’输出的结合曲线。所述折射率标准流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物；因此，第一体积V1s和第二体积V2s的折射率标准流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物。此外，缓冲流体不包含可以结合到第一流动池2的测试表面3上的配体4的任何分析物。
因此，因而，当第一体积V1s和第二体积V2s或者第一体积V1’和第二体积V2’的缓冲流体流过第一流动池2和第二流动池2’时，在第一流动池2抑或第二流动池2’中将不存在结合。在这种情况下，将预期，单一溶剂测量结合曲线和溶剂参考结合曲线两者都将保持于常数‘零’；然而，在实践中情况并非如此。单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线两者都将包括非零值，因为传感器45对折射率变化敏感，并且折射率标准流体具有与缓冲流体不同的折射率。重要的是，由于第一流动池2内的自由体积将与第二流动池2’内的自由体积不同（因为存在占据了第一流动池内的部分体积的存在于第一流动池2中的配体4；而在第二流动池2’中没有配体（或者如果第二流动池2’的第二测试表面3’上存在配体，则将存在与第一测试表面3上的配体不同的类型，并且也可能是第二测试表面3’上的不同量的配体）这一事实所致，单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线两者将彼此不同，因此，折射率标准流体与缓冲流体之间的折射率差异对单一溶剂测量结合曲线的影响将与对单一溶剂参考结合曲线的影响不同。
应理解，在步骤（c）中由传感器45输出的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线可以被划分成段进行处理。
重要的是，应理解，上文所描述的步骤（a）-（c）可以以任何顺序实施。本发明不限于以以上段落中叙述步骤（a）-（c）的顺序来实施这些步骤。例如，在另一个实施例中，可首先实施步骤（c），接着是实施步骤（b），接着是实施步骤（a）；在另一个实施例中，可首先实施步骤（b），接着是实施步骤（c），接着是实施步骤（a）；在另一个实施例中，可首先实施步骤（a），接着是实施步骤（b），接着是实施步骤（c）。
步骤（d）
然后，处理从步骤（a）获得的单一参考结合曲线和单一测量结合曲线；以及从步骤（b）获得的单一空白参考结合曲线和单一空白测量结合曲线；以及从步骤（c）获得的单一溶剂参考结合曲线和单一溶剂测量结合曲线，以便如下确定调整后的结合曲线：
步骤1：从单一测量结合曲线中减去单一参考结合曲线，以提供差异曲线。
步骤2：从单一空白测量结合曲线中减去单一空白参考结合曲线，以提供空白差异信号。
步骤3：从单一溶剂测量结合曲线中减去单一溶剂参考结合曲线，以提供溶剂差异信号。
步骤4：通过从差异曲线中减去差异曲线在归零时间ty处的平均y值，将差异曲线相对于y轴归零，得到经归零的单一结合曲线（zsbc）。优选地，归零时间ty是在将第一体积V1的样品流体传递到第一流动池2和第二流动池2’中之前。
步骤5：通过从空白差异信号中减去空白差异信号在归零时间ty处的平均y值，将空白差异信号相对于y轴归零，得到经归零的单一空白结合曲线（zsbbc）。
步骤6：通过从溶剂差异信号中减去溶剂差异信号在归零时间ty处的平均y值，将溶剂差异信号相对于y轴归零，得到经归零的单一溶剂结合曲线（zssbc）。
步骤7（任选的）：接下来，任选地，实施溶剂校正，其涉及：
（i）确定平均溶剂差异（‘sdiff’）。
在一个实施例中，通过以下方式确定平均溶剂差异（‘sdiff’）：确定溶剂差异信号在溶剂时间ts处的平均值，其中，溶剂差异信号在溶剂时间ts处的平均值是平均溶剂差异（‘sdiff’）。最优选地，时间ts是在第二分析物持续时间t2a中位于中途的时刻（即，在第二体积V2的样品流体同时流过第一流动池2和第二流动池2’的时间的中间）。此外，确定单一溶剂参考结合曲线在溶剂时间ts处的平均值（单一溶剂参考结合曲线d在溶剂时间ts的平均值在下文被表示为‘srbc’）。
在另一个实施例中，通过以下方式确定平均溶剂差异（‘sdiff’）：首先确定单一溶剂测量结合曲线在溶剂时间ts处的平均值（单一溶剂测量结合曲线在溶剂时间ts处的平均值在下文被表示为‘smbc’）。然后，确定单一溶剂参考结合曲线在溶剂时间ts处的平均值（单一溶剂参考结合曲线d在溶剂时间ts处的平均值在下文被表示为‘srbc’）。然后，如下确定平均溶剂差异（被表示为‘sdiff’）：
sdiff= smbc – srbc。
（ii）将上文提到的步骤（c）重复多次，以得到多条不同的单一溶剂参考结合曲线和单一溶剂测量结合曲线；以及针对所述多条不同的单一溶剂参考结合曲线和单一溶剂测量结合曲线中的每一者重复上文提到的步骤（i），以针对所有测得的溶剂测量值产生将单一溶剂参考结合曲线的平均溶剂差异sdiff与平均值srbc相关的集合srbci、sdiffi。
（iii）然后，通过通过该集合srbci、sdiffi拟合多项式函数以逼近sdiff = fs（srbc），来建立溶剂校正函数fs。例如，如果在步骤（v）中针对折射率标准流体体积中的三个不同体积进行重复，则将存在不同的三个集合srbc、sdiff值；溶剂校正函数fs是逼近函数，其拟合到那不同的三个集合srbc、sdiff值，从而建立所描述的解析关系。
（iv）通过将溶剂校正函数（fs）应用于单一参考结合曲线（被表示为‘srbc’）并从经归零的单一结合曲线（zsbc）中将它减去来如下获得溶剂校正后的单一结合曲线（被表示为‘scsbc’）：
scsbc = zsbc – fs(srbc)，
（v）通过将溶剂校正函数（fs）应用于单一空白参考结合曲线（被表示为‘sbrbc’）并从经归零的单一空白结合曲线（zsbbc）中减去结果来如下获得溶剂校正后的单一空白结合曲线（被表示为‘scsbbc’）：
scsbbc = zsbbc – fs(sbrbc)，
应理解，上文提到的溶剂校正步骤（i）-（vi）是任选的。
步骤8：最后，曲线优选地被空白引用以便获得调整后的结合曲线（被表示为‘abc’）：
在一个实施例中，通过从经归零的单一结合曲线（zsbc）中减去经归零的单一空白结合曲线（zsbbc）来如下获得调整后的结合曲线（‘abc’）：
abc = zsbc – zsbbc
在其中实施上文提到的溶剂校正步骤（i）-（vi）的另一个实施例中，通过从溶剂校正后的单一结合曲线（被表示为‘scsbc’）中减去溶剂校正后的单一空白结合曲线（被表示为‘scsbbc’）来如下获得调整后的结合曲线：
abc = scsbc – scsbbc
图3示出了在已实施了上文提到的步骤（a）-（d）（包括实施溶剂校正）之后获得的调整后的结合曲线（实线）。
步骤（e）
然后，使用调整后的结合曲线来确定动力学参数（诸如，缔合速率常数ka和解离速率常数kd）以及表征处于流过第一流动池2（和第二流动池2’）的这些体积的样品流体中的分析物（具体地，该分析物处于第一体积V1和第二体积V2的样品流体中）与流动池2的第一测试表面3上的配体4之间的相互作用。
在一个实施例中，可以使用本领域中用于处理反应曲线的任何合适的、已知的手段来处理调整后的结合曲线以确定动力学参数。
在优选实施例中，为了确定动力学参数ka和kd，将描述结合的模型拟合到调整后的结合曲线。
在一个实施例中，将模型拟合到调整后的结合曲线优选地包括通过从单一溶剂参考结合曲线（ssrbc）中减去单一空白参考结合曲线（sbrbc）来如下确定调整后的溶剂曲线（被表示为‘asc’）的步骤：
asc = ssrbc – sbrbc。
然后，通过从调整后的溶剂曲线中减去调整后的溶剂曲线在归零时间ty处的平均y值，将调整后的溶剂曲线相对于y轴归零，得到经归零的调整后的溶剂曲线（zasc）。优选地，归零时间ty是在将第一体积V1的样品流体传递到第一流动池2和第二流动池2’中之前。
在优选实施例中，然后，通过以下方式建立单一浓度曲线：将经归零的调整后的溶剂曲线除以调整后的溶剂曲线的平均最大值以获得归一化的溶剂曲线；以及然后，将归一化的溶剂曲线乘以处于第一体积V1和第二体积V2的样品流体中的分析物的预定浓度c0（回想每个体积的样品流体均具有分析物的相同的预定浓度c0）。优选地，通过确定调整后的溶剂曲线在溶剂时间ts处的平均值来获得调整后的溶剂曲线的平均最大值，其中，调整后的溶剂曲线在溶剂时间ts处的平均值为调整后的溶剂曲线的平均最大值。
假设1:1结合模型，可以由以下微分方程来描述处于在步骤（a）中流过第一流动池2和第二流动池2’的这些体积的样品流体中的分析物（具体地，在该示例中，分析物处于第一体积和第二体积（V1、V2）的样品流体中）到第一流动池2的第一测试表面3上的配体4的结合：
。
将单一浓度曲线在每个时间步处的值用作变量‘c’并且假设变量Rmax以及参数ka和kd的初始猜测值，来对以上微分方程进行数字积分，以产生模拟结合曲线（被表示为‘sbc’）。
然后，通过下式来确定模拟结合曲线（‘sbc’）的卡方（）：
。
模拟结合曲线（‘sbc’）的卡方（）是模拟结合曲线（‘sbc’）逼近调整后的结合曲线（abc）的程度的量度。通过使用最小化卡方的估计器或优化方案（诸如，众所周知的Levenberg-Marquardt算法），找到最佳逼近调整后的结合曲线（abc）的参数Rmax、ka、kd。最佳逼近调整后的结合曲线（abc）的所述参数Rmax、ka、kd定义这样的参数Rmax、ka、kd，即，这些参数表征处于流过第一流动池2的这些体积的样品流体中的分析物（具体地，在该示例中，分析物处于第一体积V1和第二体积V2的样品流体中）与流动池2的第一测试表面3上的配体4之间的相互作用。
图3示出了最佳逼近调整后的结合曲线（实线）的参数Rmax、ka、kd =5.89 x 10-2s-1的模拟（虚线），在该示例中，最佳逼近调整后的结合曲线（实线）的参数是Rmax = 63.3 pg/mm2、ka = 2.66 x 104 M-1s-1、kd =5.89 x 10-2s-1。
优选地，针对多种不同类型的样品流体重复上文提到的步骤（a）-（e），以针对不同类型的分析物来确定结合以及测量动力学。
有利地，相对于现有技术，使用本发明的方法的总测量时间是短的；可以在前一个样品已开始测试之后的一小段时间内开始测试新样品；换句话说，在第一体积的样品流体已经过第一测试表面3之后不久，第二体积的样品流体就可以经过第一流动池2的第一测试表面3。进一步地，在测试前一种样品流体之后不久（约5秒），就可以测试包含不同类型的分析物的不同类型的样品流体。换句话说，在对包含一种类型的分析物的一种类型的样品流体实施上文提到的步骤（a）-（e）以针对该类型的分析物来确定结合以及测量动力学之后很快（约5秒），就可以对包含另一种类型的分析物的另一种类型的样品流体实施上文提到的步骤（a）-（e）以针对该另一类型的分析物来确定结合以及测量动力学。
应理解，可使用可仅包括一个单一流动池的组件来实施本发明的方法；在这种情况下，在该一个单一流动池的测试表面上提供配体之前执行步骤（a）-（c），以便从步骤（a）获得单一参考结合曲线、从步骤（b）获得单一空白参考结合曲线、以及从步骤（c）获得单一溶剂参考结合曲线。此后，在该一个单一流动池的测试表面上提供配体并重复步骤（a）-（c），以便从步骤（a）获得单一测量结合曲线、从步骤（b）获得单一空白测量结合曲线、以及从步骤（c）获得单一溶剂测量结合曲线。由此断定，在图1中所示的组件1实施例的变型中，组件可替代地包括单个流动池，而不是具有第一流动池2和第二流动池2’。
应理解，可使用WO2017187325A1中描述的组件中的任一者来实施本发明的方法。
应理解，可使用生物感测领域中常用的微流体组件（诸如例如，在WO2014009286A1或WO2013055281中描述的组件中的任一者）的各种实施例来实施本发明的方法，条件是所讨论的组件允许将包含分析物的多个体积的样品流体和多个体积的缓冲流体（不含分析物）连续注射到流动池中。
优选地，在本发明的方法中，穿过第一流动池和第二流动池的样品流体体积中的每一者均来自相同的单个样品储器29。单个样品储器29可以是微量滴定板的孔。在最优选实施例中，在任何体积的样品流体在流动池的测试表面上流动之前，从相同的单个容器中吸入在流动池的测试表面上流动的所有所述相应体积的样品流体；换句话说，存在在任何体积的样品流体在流动池的测试表面上流动之前实施的单个吸入步骤，其中从单个容器中吸入单个体积的样品流体，并且随后在流动池的测试表面上流动的所有样品流体均来自被吸入的该单个体积的样品流体。换句话说，在流动池的测试表面上流动的每个体积的样品流体是从单个容器中吸入的单个体积的样品流体的一部分。
在本发明的方法的优选实施例中，流过第一流动池2和第二流动池2’的样品流体（包含分析物）体积之和小于总吸取体积Vt。/>
令人惊讶地，在本发明中，即使第一测试表面2上的配体4仅与一种共同的分析物浓度接触（因为流入第一流动池2和第二流动池2’中的样品流体体积中的每一者全部都具有分析物的相同的预定浓度co，也可以从根据本发明的方法的测量中获得关于动力学参数（诸如，缔合速率常数ka和解离速率常数kd）的信息。
在优选实施例中，第一分析物持续时间t1a是所有分析物持续时间tia中最短的，且最后分析物持续时间tNa是所有分析物持续时间tia中最长的，以允许在最短的时间量内测量可能的最宽的动力学空间。在进一步的优选实施例中，这些分析物持续时间以指数方式从第一分析物持续时间t1a至最后分析物持续时间tNa增加。例如，在其中五个体积的样品流体流入第一流动池2和第二流动池2’中的实施例中，第二分析物持续时间t2a是第一分析物持续时间t1a的三倍长，第三分析物持续时间t3a是第二分析物持续时间t2a的三倍长，第四分析物持续时间t4a是第三分析物持续时间t3a的三倍长，且第五分析物持续时间t5a是第四分析物持续时间t4a的三倍长。如上文在步骤（a）中已经详细描述的，分析物持续时间是该体积的样品流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间；因此，例如，第三分析物持续时间t3a是第三体积的样品流体在第一流动池2的第一测试表面3和第二流动池2’的第二测试表面3’上流动的持续时间。
在进一步的优选实施例中，最后缓冲液持续时间tbN是所有缓冲液持续时间tbi中最长的，以便允许在注射下一个体积的样品流体之前分析物在第一流动池2中从配体4解离。如上文在步骤（a）中已经详细描述的，缓冲液持续时间是将缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度；由此断定，最后缓冲液持续时间是将要流过第一流动池2和第二流动池2’的最后体积的缓冲流体从第一注射泵9注射到第一流动池2和第二流动池2’中的时间长度。
在优选实施例中，最后缓冲液持续时间tbN对应于大约1 / kd, min、或2 / kd, min、或3 / kd, min，其中，kd, min是特定测量的感兴趣动力学区域内的最小解离速率常数。例如，当表征在从10 nM到10 μM的亲和力范围内的结合剂时，在该亲和力范围内结合剂的感兴趣区域内的最小解离常数可以被选择为kd, min = 1e-2 s-1，并且最后缓冲液持续时间可以被选择为3 / kd, min = 300 s。
在尤其适合于紧密结合剂（诸如，在1 pM至1 nM的亲和力范围内（“皮摩尔结合剂”））的进一步的优选实施例中，通过使用促进解离的再生试剂抑或通过移除和重新捕获配体来再生流动池2、2’的测试表面3、3’，并且最后缓冲液持续时间tbN’对应于大约1 / (10kd, min)、或1 /(20 kd, min)、或1 / (50 kd, min )。例如，在皮摩尔结合剂的感兴趣区域内的最小解离常数可以被选择为kd, min = 1e-5 s-1，并且最后缓冲液持续时间可以被选择为1 /(50 kd, min ) = 2’000 s。
在进一步的优选实施例中，实时评估在步骤（a）和/或步骤（b）和/或步骤（c）中从传感器45输出的结合曲线并针对系统误差对其进行校正。在一个实施例中，如果单一测量结合曲线还没有返回到预定义基线，则增加步骤（a）中的最后缓冲液持续时间tbN。优选地，步骤（a）中的最后缓冲液持续时间tbN直到单一测量结合曲线已返回到预定义基线为止。
在进一步的优选实施例中，最后缓冲液持续时间tbN是所有缓冲液持续时间tbi中最长的，并且第一缓冲液持续时间tb1是所有缓冲液持续时间tbi中第二长的。在进一步的优选实施例中，缓冲液持续时间以指数方式从第一缓冲液持续时间tb1至倒数第二缓冲液持续时间tbN-1减少。例如，在其中‘6’个体积的缓冲流体将要被传递到第一流动池2和第二流动池2’中的实施例中，则第二缓冲液持续时间tb2是第一缓冲液持续时间tb1的三分之一，第三缓冲液持续时间tb3是第二缓冲液持续时间tb2的三分之一，第四缓冲液持续时间tb4是第三缓冲液持续时间tb3的三分之一，且第五缓冲液持续时间tb5是第四分析物持续时间tb4的三倍长。
在进一步的优选实施例中，最短缓冲液持续时间tbmin对应于大约1 / kd, max、或2/ kd, max、或3 / kd, max，其中kd, max是对应于待测量的最快解离的最大解离速率常数，诸如结合曲线几乎返回到基线以测量最快分解速率。
在进一步的优选实施例中，最短缓冲液持续时间tmin大约对应于分析物的下降时间τa’，其中分析物的下降时间τa’是从开始注射缓冲流体的时间到第一流动池2的第一测试表面3上的分析物浓度已减小到预定浓度c0的平均5%的时间。在最优选实施例中，折射率流体包括具有与分析物类似的扩散性质的添加剂，这使得能够使用溶剂结合曲线来测量分析物的下降时间τa’，因为折射率流体的下降时间至少接近分析物的下降时间τa’。优选地，分析物的下降时间τa’在经归零的调整后的溶剂曲线（zasc）上经测得为大约时间trbN（在以上步骤（c）中最后体积V2’的缓冲流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）。最短缓冲液持续时间tmin的优选值例如是tmin’=1×τa’、或tmin’=0.75×τa’、或tmin’=1.25×τa’、或tmin’ < 2 ×τa’、或tmin’ < 3×τa’。由此，可以确定最快可能的分解速率。
在进一步的优选实施例中，第一分析物持续时间ta1比分析物的上升时间τa短，其中，分析物的上升时间τa是从开始注射一个体积的样品流体的时间到第一流动池的第一测试表面3处的分析物浓度已达到预定浓度c0的平均95%的时间。在最优选实施例中，折射率流体包括具有与分析物类似的扩散性质的添加剂，这使得可以使用溶剂结合曲线来测量分析物的上升时间τa，因为折射率流体的上升时间至少接近分析物的上升时间τa。优选地，分析物的上升时间τa在经归零的调整后的溶剂曲线（zasc）上经测得为大约时间trN（最后体积VNs的折射率标准流体开始在第一测试表面3和第二测试表面3’上流动的时间）。最短缓冲液持续时间tmin的优选值例如是ta1=τa /2、或ta1=τa /5、或ta1=τa/10。由此，传感器表面处的有效浓度得以降低，从而允许测量更快的结合速率。
在进一步的优选实施例中，使用计算机模拟（诸如，蒙特卡罗模拟）来优化注射序列的参数，以最大化结合曲线的形状差异，用于动力学空间的感兴趣区域内的相互作用。
图4提供了根据本发明的示例测量的结果，其突出了本发明对于弱结合剂的高通量筛选的适合性，弱结合剂通常位于1 μM至1 mM的亲和力范围内。在该示例中，注射样品流体体积（包含分析物）和注射缓冲流体体积（不含分析物）的上述步骤已被实施‘5’次（即，‘5’个样品流体体积和‘5’个缓冲流体体积已流过第一流动池2和第二流动池2’）。曲线图的x轴表示以秒为单位的时间，且y轴表示以pg/mm2为单位的表面质量。
图4描绘了：三条调整后的结合曲线（实线），其对应于6-聚体寡核苷酸（5'-CAGTGC-3'；1792 Da）与生物素化的34-聚体(bio-34；5’-[Btn]TTTTTGGAAACTGTATTGGCACTGAGTAGACTCC-3’；11 kDa)相互作用的三次重复测量；以及对应的模拟结合曲线（虚线），其将动力学参数最佳拟合到调整后的结合曲线。该测量已使用Creoptix WAVEdelta系统在40Hz的采集频率和15°C的流动池温度下获得。使用包括四个平行流动池的PCP-S WAVEchip。该装置在其测量过程中进行了修改，以允许从单个样品储器进行多次注射。在所描绘的测量之前，生物素化的34-聚体(bio-34；5’-[Btn]TTTTTGGAAACTGTATTGGCACTGAGTAGACTCC-3’；11 kDa，“靶标”)作为链酶亲和素上的配体被捕获（以约300 pg/mm2的密度）到在流动池2和3的传感器表面上的PCP-S WAVEchip上。流动池1和流动池4留空并用作参考。包含0.05%Tween-20的PBS缓冲液（pH值7.4）被用作缓冲液。以31.25 ms的第一分析物持续时间t1a注射第一体积V1的样品流体，接着是以0.46875 s的第一缓冲液持续时间t1b注射第一体积V1’的缓冲流体，接着是以0.625 ms的第二分析物持续时间t2a注射第二体积V2的样品流体，接着是以0.4375 s的第二缓冲液持续时间t2b注射第二体积V2’的缓冲流体，接着是以0.125 s的第三分析物持续时间t3a注射第三体积V3的样品流体，接着是以0.375 s的第三缓冲液持续时间t3b注射第三体积V3’的缓冲流体，接着是以0.25 s的第四分析物持续时间t4a注射第四体积V4的样品流体，接着是以0.25 s的第四缓冲液持续时间t4b注射第四体积V4’的缓冲流体，接着是以0.5 s的第五分析物持续时间t5a注射第五体积V5的样品流体，接着是以2.5 s的第五缓冲液持续时间t5b注射第五体积V5’的缓冲流体。
在该示例中，31.25ms的第一分析物持续时间ta1比分析物的上升时间τa（经测得为时间大约125 ms）更短，特别地ta1=τa/4，并且第四缓冲液持续时间t4b是处于250 ms的最短缓冲液持续时间tmin，并且大约对应于分析物的下降时间τa’（经测得为150 ms）。
首先，出于参考目的，将空白缓冲液（buffer blank）作为分析物从单个小瓶以每流动池100 μL/min的流速与缓冲液交替地并行注射到所有四个流动池中，并且由传感器（未示出）记录对应的单一空白测量结合曲线和单一空白参考结合曲线。然后，以三次重复的方式（即，相同的测量重复三次），将100 μM浓度的6-聚体寡核苷酸（5'-CAGTGC-3'；1792Da）作为分析物从单个小瓶以每流动池100 μL/min的流速与缓冲流体交替地并行注射到所有四个流动池中，并且由传感器记录对应的单一测量结合曲线以及单一参考结合曲线。然后，将缓冲液中稀释到1%浓度的DMSO作为分析物从单个小瓶以每流动池100 μl/min的流速与缓冲液交替地并行注射到所有四个流动池中，并且由传感器（未示出）记录对应的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线。然后，针对每组单一测量结合曲线和单一参考结合曲线，使用以上步骤（d）的步骤1-8来获得调整后的结合曲线（实线）。使用以上步骤（e），然后，使用调整后的结合曲线来确定三条调整后的结合曲线中的每一者的动力学参数缔合速率常数ka和解离速率常数kd。从三条结合曲线到相互作用模型的拟合所确定的动力学参数的平均值和标准偏差为ka = 5.95±0.53×104 M-1s-1、kd = 2.32±0.09 s-1、以及Rmax为29.7±1.8 pg/mm2。
有利地，在以上示例中，用仅5秒的总测量时间就已确定相互作用的动力学参数，从而允许在筛选中确定动力学速率的高通量。
在进一步的优选实施例中，使用模拟数据来训练神经网络，所述模拟数据针对给定的一组注射序列参数和给定的一组时序参数t1, t2..tN和t1’, t2’..tN’、以及给定的物料浓度来覆盖给定的动力学参数范围，并且针对误差参数来覆盖一定的偏差范围以便补偿系统误差。误差参数可包括但不限于有效流速、或有效流动池高度、或有效扩散常数。然后，使用所述神经网络来确定误差参数、以及关于结合速率和分解速率的筛选结果。
有利地，通过以不同的流速操作相同注射序列内的不同注射脉冲，可以将传质效应与动力学参数区分开来。
有利地，发明性方法的短接触时间降低了分析物损坏传感器表面上的配体的可能性，诸如通过非特异性结合或聚集效应。

Claims (15)

1.一种用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)使具有分析物浓度(co)的第一体积(V1)的样品流体在第一时间段(t1a)内在流动池(2)的附接有第一配体(4)的测试表面(3)上流动，使得所述第一体积(V1)的样品流体中的分析物可以结合到所述测试表面(3)上的所述第一配体(4)；
(b)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在第一时间段(t1b)内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，以引起在步骤(a)期间结合到所述测试表面上的第一配体(4)的来自所述第一体积(V1)的样品流体的分析物变为从那些配体(4)解离；
(c)使至少第二体积(V2)的样品流体在第二时间段(t2a)内在所述测试表面上流动，使得所述第二体积(V2)的样品流体中的分析物可以结合到所述测试表面(3)上的所述第一配体(4)；其中，所述第二时间段(t2a)大于所述第一时间段(t1a)，并且其中，所述第二体积(V2)的样品流体具有与所述第一体积(V1)的样品流体中的所述分析物浓度(co)相同的分析物浓度(co)；
(d)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段(t2b)内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，以引起在步骤(a)期间结合到所述测试表面上的所述第一配体(4)的来自所述第二体积(V2)的样品流体的分析物变为从那些第一配体(4)解离；
(e)在步骤(a)-(d)期间使用传感器来测量所述测试表面(3)上的所述结合，以获得单一测量结合曲线；
(f)使具有分析物浓度(co)的第一体积(V1)的样品流体在第一时间段(t1a)内在流动池(2’)的没有第一配体的测试表面(3’)上流动；
(g)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在第一时间段(t1b)内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动；
(h)使至少第二体积(V2)的样品流体在第二时间段(t2a)内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动；其中，所述第二时间段(t2a)大于所述第一时间段(t1a)，并且其中，所述第二体积(V2)的样品流体具有与所述第一体积(V1)的样品流体中的所述分析物浓度(co)相同的分析物浓度(co)；
(i)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段(t2b)内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动；
(j)在步骤(f)-(i)期间使用传感器来测量没有第一配体的所述测试表面(3’)上的所述结合，以获得单一参考结合曲线；
(k)使用所述单一测量结合曲线和所述单一参考结合曲线来确定所述动力学参数。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，使用第一流动池(2)和第二流动池(2’)来实施所述方法，所述第一流动池包括附接有第一配体(4)的第一测试表面(3)，所述第二流动池包括没有第一配体的第二测试表面(3’)；并且
其中，同时实施步骤(a)和(f)，并且同时实施步骤(b)和(g)，并且同时实施步骤(c)和(h)，并且同时实施步骤(d)和(i)，并且同时实施步骤(e)和(j)。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，使用单个流动池来实施所述方法，所述单个流动池包括测试表面，所述单个流动池的所述测试表面最初处于它没有第一配体的状态，并且当所述测试表面处于它没有第一配体的状态时，使用所述单个流动池来实施所述步骤(f)-(j)；
其中，所述方法进一步包括：在已实施了步骤(f)-(j)之后，然后在所述单个流动池的所述测试表面上提供第一配体(4)；
在第一配体已提供在所述单个流动池的所述测试表面上之后，然后使用所述单个流动池来实施步骤(a)-(e)。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(a’)使第一体积(V1B)的样品缓冲流体在时间段(t1B)内在流动池(2)的附接有第一配体(4)的测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(a)的所述第一时间段(t1a)；
(b’)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在一时间段内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(b)的所述第一时间段(t1b)；
(c’)使至少第二体积(V2B)的样品缓冲流体在第二时间段(t2B)内在所述测试表面上流动，所述第二时间段等于步骤(c)中的所述第二时间段(t2a)；
(d’)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，所述第二时间段等于步骤(d)的所述第二时间段(t2b)；
(e’)在步骤(a’)-(d’)期间使用传感器来测量所述测试表面(3)上的所述结合，以获得单一空白测量结合曲线；
(f’)使第一体积(V1B)的样品缓冲流体在时间段(t1B)内在流动池(2’)的没有第一配体的测试表面(3’)上流动，所述时间段等于步骤(f)的所述第一时间段(t1a)；
(g’)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在一时间段内在没有第一配体的所述测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(f)的所述第一时间段(t1a)；
(h’)使至少第二体积(V2)的样品流体在第二时间段(t1B)内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动，所述第二时间段等于步骤(h)的所述第二时间段(t2a)；
(i’)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动，所述第二时间段等于步骤(i)的所述第二时间段(t2b)；
(j’)在步骤(f’)-(i’)期间使用传感器来测量所述测试表面(3)上的所述结合，以获得单一空白参考结合曲线。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(a”)使第一体积(V1s)的折射率标准流体在时间段(t1s)内在流动池(2)的附接有第一配体(4)的测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(a)的所述第一时间段(t1a)；
(b”)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在一时间段内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(b)的所述第一时间段(t1b)；
(c”)使至少第二体积(V2s)的折射率标准流体在第二时间段(t2s)内在所述测试表面上流动，所述第二时间段等于步骤(c)中的所述第二时间段(t2a)；
(d”)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段内在所述流动池(2)的所述测试表面(3)上流动，所述第二时间段等于步骤(d)的所述第二时间段(t2b)；
(e”)在步骤(a”)-(d”)期间使用传感器来测量所述测试表面(3)上的所述结合，以获得单一溶剂测量结合曲线(ssmbc)；
(f”)使第一体积(V1s)的折射率标准流体在时间段(t1s)内在流动池(2’)的没有第一配体的测试表面(3’)上流动，所述时间段等于步骤(f)的所述第一时间段(t1a)；
(g”)使第一体积(V1’)的缓冲溶液在一时间段内在没有第一配体的所述测试表面(3)上流动，所述时间段等于步骤(f)的所述第一时间段(t1a)；
(h”)使至少第二体积(V2s)的折射率标准流体在第二时间段(t1s)内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动，所述第二时间段等于步骤(h)的所述第二时间段(t2a)；
(i”)使第二体积(V2’)的缓冲溶液在第二时间段内在没有第一配体的所述测试表面(3’)上流动，所述第二时间段等于步骤(i)的所述第二时间段(t2b)；
(j”)在步骤(f”)-(i”)期间使用传感器来测量所述测试表面(3)上的所述结合，以获得单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(k)包括：
从所述单一测量结合曲线(smbc)中减去所述单一参考结合曲线(srbc)，以提供差异曲线；从所述单一空白测量结合曲线(sbmbc)中减去所述单一空白参考结合曲线(sbrbc)，以提供空白差异信号；
通过从所述差异曲线中减去所述差异曲线在归零时间ty处的平均y值，将所述差异曲线相对于y轴归零，以提供经归零的单一结合曲线(zsbc)；
通过从所述空白差异信号中减去所述空白差异信号在所述归零时间ty处的平均y值，将所述空白差异信号相对于y轴归零，以提供经归零的单一空白结合曲线(zsbbc)；
从经归零的单一结合曲线(zsbc)中减去所述经归零的单一空白结合曲线(zsbbc)，以提供调整后的结合曲线(abc)；
使用所述调整后的结合曲线来确定所述动力学参数。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤(k)包括：
从所述单一测量结合曲线(smbc)中减去所述单一参考结合曲线(srbc)，以提供差异曲线；
从所述单一空白测量结合曲线(sbmbc)中减去所述单一空白参考结合曲线(sbrbc)，以提供空白差异信号；
从所述单一溶剂测量结合曲线(ssmbc)中减去所述单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)，以提供溶剂差异信号；
通过从所述差异曲线中减去所述差异曲线在归零时间ty处的平均y值，将所述差异曲线相对于y轴归零，以提供经归零的单一结合曲线(zsbc)；
通过从所述空白差异信号中减去所述空白差异信号在所述归零时间ty处的平均y值，将所述空白差异信号相对于y轴归零，以提供经归零的单一空白结合曲线(zsbbc)；
通过从所述溶剂差异信号中减去所述溶剂差异信号在归零时间ty处的平均y值，将所述溶剂差异信号相对于y轴归零，得到经归零的单一溶剂结合曲线(zssbc)；
实施溶剂校正以便提供溶剂校正后的单一空白结合曲线(‘scsbbc’)和溶剂校正后的单一结合曲线(‘scsbc’)；
从所述溶剂校正后的单一结合曲线(‘scsbc’)中减去所述溶剂校正后的单一空白结合曲线(‘scsbbc’)，以提供调整后的结合曲线(abc)；
使用所述调整后的结合曲线来确定所述动力学参数。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述溶剂校正包括：
(i)通过以下方式确定平均溶剂差异(‘sdiff’)：通过从所述单一溶剂测量结合曲线(ssmbc)中减去所述单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)来首先确定溶剂差异曲线(‘sdc’)；以及然后，确定溶剂差异曲线在溶剂时间ts处的平均值，其中，溶剂差异曲线在溶剂时间ts处的所述平均值是所述平均溶剂差异(‘sdiff’)；
(ii)确定所述单一溶剂参考结合曲线(srbc)在所述溶剂时间ts处的平均值；
(iii)重复权利要求5的步骤，以提供多条不同的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线；以及针对所述多条不同的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线中的每一者重复步骤(i)和(ii)，以产生包含所述单一溶剂参考结合曲线的平均值的集合(srbci)和平均溶剂差异的集合(sdiffi)；
(iv)通过通过所述集合来拟合多项式函数以逼近sdiff＝fs(srbc)，来确定溶剂校正函数(fs)；
(v)通过将所述溶剂校正函数(fs)应用于所述单一参考结合曲线(srbc)并从所述经归零的单一结合曲线(zsbc)中将它减去来如下获得溶剂校正后的单一结合曲线(scsbc)：
scsbc＝zsbc–fs(srbc)；
(vi)通过将所述溶剂校正函数(fs)应用于所述单一空白参考结合曲线(sbrbc)并从所述经归零的单一空白结合曲线(zsbbc)中减去结果来如下获得溶剂校正后的单一空白结合曲线(scsbbc)：
scsbbc＝zsbbc–fs(sbrbc)。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，所述溶剂校正包括：
(i)确定所述单一溶剂测量结合曲线(‘smbc’)在溶剂时间ts处的平均值；
(ii)确定所述单一溶剂参考结合曲线(‘srbc’)在所述溶剂时间ts处的平均值；
(iii)通过从所述单一溶剂测量结合曲线(‘smbc’)的所述平均值中减去所述单一溶剂参考结合曲线(‘srbc’)的所述平均值来根据以下方程确定平均溶剂差异(‘sdiff’)：
sdiff＝smbc-srbc
(iv)重复权利要求5的步骤，以提供多条不同的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线；以及针对所述多条不同的单一溶剂测量结合曲线和单一溶剂参考结合曲线中的每一者重复步骤(i)-(iii)，以产生包含所述单一溶剂参考结合曲线的平均值的集合(srbci)和平均溶剂差异的集合(sdiffi)；
(v)通过通过所述集合来拟合多项式函数以逼近sdiff＝fs(srbc)，来确定溶剂校正函数(fs)；
(vi)通过将所述溶剂校正函数(fs)应用于所述单一参考结合曲线(srbc)并从所述经归零的单一结合曲线(zsbc)中将它减去来如下获得溶剂校正后的单一结合曲线(scsbc)：
scsbc＝zsbc–fs(srbc)；
(vii)通过将所述溶剂校正函数(fs)应用于所述单一空白参考结合曲线(sbrbc)并从所述经归零的单一空白结合曲线(zsbbc)中减去结果来如下获得溶剂校正后的单一空白结合曲线(scsbbc)：
scsbbc＝zsbbc–fs(sbrbc)。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其进一步包括：通过将所述溶剂校正函数(fs)应用于所述单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)并从所述经归零的单一溶剂结合曲线(zssbc)中减去结果来如下获得溶剂校正后的单一溶剂结合曲线(scssbc)：
scssbc＝zssbc–fs(ssrbc)。
11.根据权利要求2和6所述的方法，其中，使用所述调整后的结合曲线来确定所述动力学参数的所述步骤包括：将模型拟合到所述调整后的结合曲线，其中，最佳拟合所述调整后的结合曲线的所述模型的动力学参数被视为所述第一体积(V1)和第二体积(V2)的样品流体中的所述分析物与所述第一流动池的所述第一测试表面上的所述第一配体之间的所述反应的所述动力学参数。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，将模型拟合到所述调整后的结合曲线的所述步骤包括：
通过从所述单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)中减去所述单一空白参考结合曲线(sbrbc)来确定调整后的溶剂曲线(asc)；通过从所述空白差异信号中减去所述调整后的溶剂曲线(asc)在所述归零时间ty处的平均y值，将所述调整后的溶剂曲线(asc)相对于y轴归零，以提供经归零的调整后的溶剂曲线(zasc)；
通过以下方式确定单一浓度曲线：将所述经归零的调整后的溶剂曲线(zasc)除以所述经归零的调整后的溶剂曲线(zasc)的平均最大值，以获得归一化的溶剂曲线；以及将所述归一化的溶剂曲线乘以处于所述第一体积(V1)和第二体积(V2)的样品流体体积中的所述分析物的所述浓度c0；
将所述单一浓度曲线用作变量‘c’并且假设变量Rmax以及参数ka和kd的初始猜测值，来对以下微分方程求积分，以产生模拟结合曲线(sbc)：
确定所述模拟结合曲线(sbc)的卡方(x2)；
最小化所述卡方(x2)以找到最佳拟合所述调整后的结合曲线的所述模拟结合曲线；其中，最佳拟合所述调整后的结合曲线的所述模拟结合曲线的动力学参数被视为所述分析物与第一配体之间的所述反应的所述动力学参数。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，将模型拟合到所述调整后的结合曲线的所述步骤包括：
将所述单一溶剂参考结合曲线(ssrbc)用作变量‘c’并且假设变量Rmax以及参数ka和kd的初始猜测值，来对以下微分方程求积分，以产生模拟结合曲线(sbc)：
确定所述模拟结合曲线(sbc)的卡方(x2)；
最小化所述卡方(χ2)以找到最佳拟合所述调整后的结合曲线的所述模拟结合曲线；其中，最佳拟合所述调整后的结合曲线的所述模拟结合曲线的动力学参数被视为所述第一体积(V1)和第二体积(V2)的样品流体中的所述分析物与所述第一流动池的所述第一测试表面上的所述第一配体之间的所述反应的所述动力学参数。
14.根据权利要求4所述的方法，其中，使用第一流动池(2)和第二流动池(2’)来实施所述方法，所述第一流动池包括附接有第一配体(4)的第一测试表面(3)，所述第二流动池包括没有第一配体的第二测试表面(3’)；并且
其中，同时实施步骤(a’)和(f’)，并且同时实施步骤(b’)和(g’)，并且同时实施步骤(c’)和(h’)，并且同时实施步骤(d’)和(i’)，并且同时实施步骤(e’)和(j’)。
15.根据权利要求4所述的方法，其中，使用单个流动池来实施所述方法，所述单个流动池包括测试表面，所述单个流动池的所述测试表面最初处于它没有第一配体的状态，并且当所述测试表面处于它没有第一配体的状态时，使用所述单个流动池来实施所述步骤(f’)-(j’)；
其中，所述方法进一步包括：在已实施了步骤(f’)-(j’)之后，然后在所述单个流动池的所述测试表面上提供第一配体(4)；
在第一配体已提供在所述单个流动池的所述测试表面上之后，然后使用所述单个流动池来实施步骤(a’)-(e’)。
CN202080036463.7A 2019-05-17 2020-05-12 用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法 Active CN113811771B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH6482019 2019-05-17
CH00648/19 2019-05-17
PCT/IB2020/054472 WO2020234691A1 (en) 2019-05-17 2020-05-12 Methods for determining kinetic parameters of a reaction between analyte and ligands

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113811771A CN113811771A (zh) 2021-12-17
CN113811771B true CN113811771B (zh) 2024-01-05

Family

ID=70740718

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080036463.7A Active CN113811771B (zh) 2019-05-17 2020-05-12 用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20220162697A1 (zh)
EP (1) EP3969910A1 (zh)
JP (1) JP2022532479A (zh)
CN (1) CN113811771B (zh)
WO (1) WO2020234691A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023153782A1 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Seegene, Inc. Device and method for providing interface for setting parameters

Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2045929A (en) * 1979-01-18 1980-11-05 Tarkkanen V Photometric analysis of a succession of samples adding reagents in situ
JP2010537194A (ja) * 2007-08-20 2010-12-02 ノーマディックス インコーポレイテッド バイオセンシングのための勾配注入
CN102652259A (zh) * 2010-03-12 2012-08-29 小利兰·斯坦福大学托管委员会 基于磁性传感器的定量结合动力学分析
CN103582813A (zh) * 2011-05-31 2014-02-12 安捷伦科技有限公司 通过使用两个具有长短路径的流动池检测器的扩展的线性范围
CN103620410A (zh) * 2011-06-30 2014-03-05 通用电气健康护理生物科学股份公司 通过免校正分析法确定活性浓度的方法
WO2015114056A1 (en) * 2014-01-29 2015-08-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method and system for interaction analysis
CN104937418A (zh) * 2012-11-15 2015-09-23 奥索临床诊断有限公司 使用反应时间的校准分析
CN105181658A (zh) * 2014-05-27 2015-12-23 中央研究院 感测装置及应用其的感测系统及感测方法
WO2017050940A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Biosensor and use thereof
WO2017187325A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Creoptix Ag Methods and assemblies for molecule recovery
CN107430123A (zh) * 2014-11-28 2017-12-01 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于在传感器表面上检测分析物‑配体结合的方法
US9990464B1 (en) * 2012-10-09 2018-06-05 Pall Corporation Label-free biomolecular interaction analysis using a rapid analyte dispersion injection method
CN108139321A (zh) * 2015-10-12 2018-06-08 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于确定表面等离子体共振生物传感器系统的仪器依赖参数的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10005301A1 (de) * 2000-02-07 2001-08-09 Trutnau Hans Heinrich Multi-Schritt-Kinetik molekularer Interaktionen als analytisches Mess- und Auswerte-Verfahren
WO2004109284A1 (en) 2003-06-06 2004-12-16 Biacore Ab Method and system for determination of molecular interaction parameters
US20080033705A1 (en) * 2006-08-07 2008-02-07 Magdalena Bynum Kinetic measurements of binding interaction with curvature evaluation
US7858372B2 (en) 2007-04-25 2010-12-28 Sierra Sensors Gmbh Flow cell facilitating precise delivery of reagent to a detection surface using evacuation ports and guided laminar flows, and methods of use
EP2761295B1 (en) 2011-09-30 2016-02-10 GE Healthcare Bio-Sciences AB Multi-channel flowcell
EP2872901B1 (en) * 2012-07-07 2021-02-17 Creoptix AG Flow conduit system for a biochemical sensor
GB201517279D0 (en) * 2015-09-30 2015-11-11 Ge Healthcare Bio Sciences Ab Method and system for improving the evaluation of an interaction between an analyte and a ligand using a biosensor
US10658072B2 (en) * 2017-02-09 2020-05-19 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method and system for interaction analysis

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2045929A (en) * 1979-01-18 1980-11-05 Tarkkanen V Photometric analysis of a succession of samples adding reagents in situ
JP2010537194A (ja) * 2007-08-20 2010-12-02 ノーマディックス インコーポレイテッド バイオセンシングのための勾配注入
CN102652259A (zh) * 2010-03-12 2012-08-29 小利兰·斯坦福大学托管委员会 基于磁性传感器的定量结合动力学分析
CN103582813A (zh) * 2011-05-31 2014-02-12 安捷伦科技有限公司 通过使用两个具有长短路径的流动池检测器的扩展的线性范围
CN103620410A (zh) * 2011-06-30 2014-03-05 通用电气健康护理生物科学股份公司 通过免校正分析法确定活性浓度的方法
US9990464B1 (en) * 2012-10-09 2018-06-05 Pall Corporation Label-free biomolecular interaction analysis using a rapid analyte dispersion injection method
CN104937418A (zh) * 2012-11-15 2015-09-23 奥索临床诊断有限公司 使用反应时间的校准分析
WO2015114056A1 (en) * 2014-01-29 2015-08-06 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method and system for interaction analysis
CN105181658A (zh) * 2014-05-27 2015-12-23 中央研究院 感测装置及应用其的感测系统及感测方法
CN107430123A (zh) * 2014-11-28 2017-12-01 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于在传感器表面上检测分析物‑配体结合的方法
WO2017050940A1 (en) * 2015-09-25 2017-03-30 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Biosensor and use thereof
CN108139321A (zh) * 2015-10-12 2018-06-08 通用电气健康护理生物科学股份公司 用于确定表面等离子体共振生物传感器系统的仪器依赖参数的方法
WO2017187325A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Creoptix Ag Methods and assemblies for molecule recovery
CN108883414A (zh) * 2016-04-29 2018-11-23 建奥迪斯有限公司 用于分子回收的方法和组件

Also Published As

Publication number Publication date
US20220162697A1 (en) 2022-05-26
CN113811771A (zh) 2021-12-17
JP2022532479A (ja) 2022-07-15
EP3969910A1 (en) 2022-03-23
WO2020234691A1 (en) 2020-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5561069A (en) Surface plasmon resonance detector having collector for eluted ligate
JP5670975B2 (ja) 分子相互作用パラメータの決定のための方法及びシステム
US8906672B2 (en) Gradient injection for biosensing
EP1766398B1 (en) Method for detecting molecular surface interactions
US20050019933A1 (en) Method and apparatus for characterization of interactions
JP5855246B2 (ja) 校正不要分析による活性濃度の決定方法
US20120264233A1 (en) Method of analysis with improved mixing
Pei et al. Real-time immunoassay of antibody activity in serum by surface plasmon resonance biosensor
US20150192574A1 (en) Flow conduit system for a biochemical sensor
EP2859325A2 (en) Optical detection system for liquid samples
US11796536B2 (en) Method for determining analyte-ligand binding on a sensor surface
US20200103343A1 (en) Measuring System, Such as an Interaction Measuring System and a Measuring Method
CN113811771B (zh) 用于确定分析物与配体之间的反应的动力学参数的方法
JP4495151B2 (ja) 相互作用の特性決定のための方法および装置
JP5830523B2 (ja) 結合化学量論の決定方法
Hashimoto Principles of BIACORE
JP4751387B2 (ja) 分子表面相互作用を検出する方法
Chun-Yan et al. Real-Time, Automatic Detection Of A Small Biomolecule Using The Novel Portable On-line Biomolecules Analyzer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant