JP6728237B2 - アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法１１９条の該当箇所に基づき２０１５年５月１９日出願の米国特許出願公開第６２／１６３，７９３号に対する優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により組み込まれる。

（発明の分野）
本発明は、診断アッセイの分野に関し、具体的には、検出される検体が生体試料又は非生体試料中に存在する、側方流動アッセイに関する。

診断アッセイは、広く普及しており、多くの疾患の診断、治療、及び管理のために重要である。血液、血清、血漿、尿、唾液、組織検体、便、痰、皮膚又は咽頭スワブ、及び組織試料又は処理した組織試料などの臨床試料中の様々な検体の検出を簡素化するために、異なる種類の診断アッセイが長年にわたって開発されてきた。これらのアッセイは、使用が容易であり、製造が安価でありながら、迅速かつ信頼できる結果をもたらすことがしばしば期待される。当然のことながら、１つの同じアッセイにおいてこれらの要件全てを満たすことは困難である。実際に、多くのアッセイは、それらの速度によって制限される。別の重要なパラメータは、感度である。アッセイ技術における最近の開発により、微量の検体の検出並びに可能な限り早期における試料中の疾患指標の検出を可能にする、ますます感度の高い試験がもたらされている。

一般的な型の使い捨て可能なアッセイデバイスは、液体試料を受容するための区画又は領域、試薬区画としても知られる共役体区画、及び検出区画としても知られる反応区画を含む。これらのアッセイデバイスは、側方流動試験ストリップとして一般に知られている。それらは、多孔性材料、例えば、ニトロセルロースを用いて、毛管流を支持することができる流体流の経路を画定する。例としては、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５５９，０４１号、同第５，７１４，３８９号、同第５，１２０，６４３号、及び同第６，２２８，６６０号に示されるものが挙げられる。

試料添加区画は、しばしば、試料を吸収することができ、血液細胞の分離が所望される時、赤血球を捕捉するために有効でもある、より多孔性の高い材料からなる。かかる材料の例は、紙、フリース、ゲル、又は組織などの繊維性材料であり、例えば、セルロース、ウール、ガラス繊維、アスベスト、合成繊維、ポリマー、又はそれらの混合物が含まれる。

アッセイデバイスのもう１つの種類は、毛管流を生じさせるための突出部を有する非多孔性アッセイデバイスである。かかるアッセイデバイスの例としては、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ国際公開第２００３／１０３８３５号、同第２００５／０８９０８２号、同第２００５／１１８１３９号、及び同第２００６／１３７７８５号に開示される、開放側方流動デバイスが挙げられる。

既知の非多孔性アッセイデバイスを図１に示す。アッセイデバイス１は、少なくとも１つの試料添加区画２、試薬区画３、少なくとも１つの検出区画４、及び少なくとも１つのウィッキング区画５を有する。これらの区画は流路を形成し、それによって、試料が試料添加区画からウィッキング区画に流動する。更に、（コーティングなどによって）任意にデバイス上に堆積される、検体と結合することができる、検出区画４内の抗体などの捕捉素子、及び、試薬区画内のデバイス上に堆積され、検体の濃度決定を実現する反応に関与することもできる標識共役体材料であって、検出区画内に検出用の標識を保有する、標識共役体材料が含まれる。共役体材料は、試料が試薬区画を通って流動するにつれて溶解し、溶解した標識共役体材料と、下流の検出区画へと流動する試料との共役体プリュームを形成する。共役体プリュームが検出区画の中に流動するにつれて、共役体材料は、捕捉素子によって、例えば、共役体材料と検体の複合体を介して（「サンドイッチ」アッセイのように）、又は直接（「競合」アッセイのように）捕捉される。未結合の溶解共役体材料は、検出区画を越えて少なくとも１つのウィッキング区画５に流れ込む。図１に、マイクロピラー７の突出部を更に示す。

全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００６０２８９７８７Ａ１号及び同第２００７０２３１８８３Ａ１号、並びに米国特許第７，４１６，７００号及び同第６，１３９，８００号に開示されるものなどの器具は、検出区画内の結合された共役体材料を検出することができる。一般的な標識としては、蛍光染料を励起し、蛍光染料を検出することができる検出器を組み込む器具によって検出され得る、蛍光染料が挙げられる。

図１に示すような典型的なアッセイデバイスの試料サイズは、一般に約２００μＬである。かかる試料サイズは、瀉血専門医などの医療専門家が静脈血を採血することを必要とする。いわゆる「指先穿刺」採血により採取可能な血液量（約２５μＬ以下）に対応する、遥かに小さな試料サイズで機能し得る、側方流動デバイスに対する必要性が高まっている。こうした少量の試料とは、ランセットで指先を穿刺した後の一滴の血液における血液量である。在宅血糖測定器は、典型的に、かかる様式で得られた一滴の血液を使用して血液中の血糖値を提供する。かかるより小量の試料サイズは、採血するために医療専門家を必要とせず、分析のための試料を提供する患者に対してより優れた快適さを提供する。

必要な試料サイズを減少させるために、側方流動アッセイデバイスの寸法を減少させ、より少量の試料サイズに対応させる。しかしながら、試料サイズ及びデバイスの寸法を減少させると、検出区画における共役体が不十分となり、それによって器具によって読み取られ得るシグナルが減少し（一部の場合ではシグナルは最大で５倍弱くなる）、かつ感度が乏しくなることが判明している。検出区画で共役体が不十分となるのは、いくつかの条件の中でもとりわけ、試料サイズの減少、及びデバイス中における試料の非効率的な使用によるものと考えられる。寸法を減少させることのもう１つの欠点は、検出区画の幅も減少して、同じく器具によって読み取られ得る入手可能なシグナルを減少させてしまうことである。また、より小型のデバイスは、流動時間及び共役体材料接触時間を低減させ、それにより試料中の検体と共役体材料との間の結合を弱めることも判明している。

より少量の試料サイズに対応でき、多様な試料（全血など）に対応でき、かつ必要な感度及び特異性を備えた結果を提供できる、試料の容量がより少量のアッセイデバイスに対する必要性が依然として存在している。

本発明は、アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法における、こうしたアッセイデバイスの使用を目的とする。本発明による方法の利点は、改善された流動特性を備えた、液体試料をアッセイする能力である。

本発明の方法で用いられ得るアッセイデバイスは、液体試料添加区画と、試薬材料を収容する、試料添加区画の下流にあり、かつ試料添加区画と流体連通する試薬区画と、試薬区画と流体連通する検出区画と、検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、検出区画と流体連通するウィッキング区画と、を備える。デバイスでは、試料添加区画、試薬区画、検出区画、及びウィッキング区画が、流体流路を画定する。デバイスは、試料添加区画の下流かつ検出区画の上流で、流体流路に沿ってかつ流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に備える。試薬は、本発明の方法に従って、この試薬添加区画（その最も広義の概念では流体添加区画）で添加される。

本発明は、アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法を提供する。本方法は、液体試料添加区画を提供することと、試薬材料を収容する、試料添加区画の下流にあり、かつ試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することと、試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することと、を含む。試料添加区画、試薬区画、検出区画、及びウィッキング区画が、流体流路を画定する。本方法は、試料添加区画の下流かつ検出区画の上流で、流体流路に沿ってかつ流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することを含む。本方法は、試薬を試薬添加区画に添加することであって、試薬は試料添加区画に向かって上流に、かつウィッキング区画に向かって下流に流動して、流体流路を湿らせる、ことと、液体試料を試料添加区画に添加することであって、試料は試薬によって湿らされた流体流路を通って移動し、試薬によって湿らされた流体流路を通る試料の流動は、試薬が用いられていない時に流体流路を通る試料の流動よりも改善されている、ことと、を更に含む。好ましくは、試薬添加区画に添加される試薬は、洗浄試薬（洗浄液）である。更に、好ましい液体試料は全血である。

本発明の更に別の態様は、対象となる１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体試料に対してアッセイを行う方法を目的とする。本方法は、液体試料添加区画を提供することと、試薬材料を収容する、試料添加区画の下流にあり、かつ試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することと、試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することであって、試料添加区画、試薬区画、検出区画、及びウィッキング区画は、流体流路を画定する、ことと、試料添加区画の下流かつ検出区画の上流で、流体流路に沿ってかつ流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することと、を含む。本方法は、試薬を試薬添加区画に添加することであって、試薬は試料添加区画に向かって上流に、かつウィッキング区画に向かって下流に流動して、流体流路を湿らせる、ことと、対象となる検体を含有する液体試料を試料添加区画に添加することであって、試料は試薬によって湿らされた流体流路を通って移動し、試薬によって湿らされた流体流路を通る試料の流動は、試薬が用いられていない時に流体流路を通る試料の流動よりも改善されている、ことと、を更に含む。本方法は、試料が試薬材料を溶解させる試薬区画内に、毛管作用によって試料を移動させることと、毛管作用によって試料を、中に溶解した試薬材料を有する試薬区画から離れる方向に、検出区画内に流動させることであって、生成されたシグナルを読み取ることによって検出区画内で対象となる検体を検出する、ことと、試料及び全ての未結合材料をウィッキング区画に流動させることと、を更に含む。好ましくは、試薬添加区画に添加される試薬は、洗浄試薬（洗浄液）である。更に、好ましい液体試料は全血である。

本発明の更なる目的、特徴、及び利点は、以下の好ましい実施形態の詳細な考慮から当業者には明らかとなるであろう。

既知のアッセイデバイスを示す。 本発明の一実施形態によるアッセイデバイスの概略図を示す。 本発明の別の実施形態によるアッセイデバイスの概略図を示す。 本発明によるアッセイデバイスパッケージの層状構造の分解図を示す。 本発明の一実施形態による、試料添加区画内に堆積させた様々な界面活性剤を用いた、アッセイデバイス上での全血（ＷＢ）の平均流動時間を示す。 血漿を用いて得られた結果に対する、全血を用いて割り込み洗浄（interrupting wash）手順を実施した場合の、カルバマゼピンの用量反応曲線の比較を示す。 血漿を用いて得られた結果に対する、全血を用いて割り込み洗浄手順を実施した場合の、フェノバルビタールの用量反応曲線の比較を示す。 本発明の一実施形態による、様々なＮＴｐｒｏＢＮＰ濃度を用いて、アッセイデバイス上で後洗浄（following wash）を実施した場合の、全血の平均流動時間を示す。 本発明の一実施形態による、各試験試料に関する、蛍光応答対ＮＴｐｒｏＢＮＰ濃度の平均ピーク面積、及び同様のＮＴｐｒｏＢＮＰ濃度の血清試料と比較した、アッセイデバイス上で後洗浄を施した全血試料に関して得られた用量反応曲線を示す。 検体としてＮＴｐｒｏＢＮＰを用いた、異なるアッセイデバイス設計の感度を示す。 検体としてＮＴｐｒｏＢＮＰを用いた、異なるアッセイデバイス設計の感度を示す。 全血試料及び洗浄を用いた、プロカルシトニン濃度対平均ピーク面積のプロットである。 全血試料を用いた、プロカルシトニン濃度対平均ピーク面積のプロットである。 流体流路であるチャネルを予め湿らせる場合及び予め湿らせない場合の平均流動時間を示す。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上別途明らかに示されない限り、複数の指示対象を含む。

本説明及び特許請求の範囲全体で数値に関連して使用される「約」という用語は、当業者によく知られており、許容される精度の間隔を示す。この間隔は、好ましくは±１０％である。

本明細書で用語「試料」とは、例えば、成分の存在又は不在、成分の濃度などといった、その特性のいずれかの定性的又は定量的測定を受けることを意図される、ある量の液体、溶液、又は懸濁液を意味する。本発明の文脈における試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、精液、羊水、胃液、涙といったヒト又は動物の体液などの液体試料である。他の種類の試料は、ヒト又は動物の組織試料に由来し、組織試料は、検査のために特定の組織成分を明らかにするため、液体中で処理されている。本発明の実施形態は、こうした液体試料全てに適用可能であるが、全血の試料に適用可能であることが好ましい。

他の例では、試料は、食品試験、環境試験、生物学的脅威又は生物学的危害試験などに関連し得る。これは、本発明で使用され得る液体試料のわずかな例に過ぎない。

本発明では、試料の側方流動、並びに試料中に存在する成分と、デバイス内に存在するか、又は手順の間にデバイスに添加される試薬と、の相互作用、及びこうした相互作用の定性的又は定量的のいずれかでの検出に基づく測定は、診断目的などの任意の目的のためであり得る。このような試験は多くの場合において、側方流動アッセイと称される。

診断測定の例としては、例えば、血糖、血中ケトン、尿中ブドウ糖（糖尿病）、血中コレストロール（アテローム性動脈硬化症、肥満症など）の慢性的な代謝異常などといった様々な疾患に特異的な検体（マーカーとも呼ばれる）、例えば、冠動脈梗塞マーカー（例えば、トロポニン−Ｔ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）などの急性疾患マーカー、甲状腺機能マーカー（例えば、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）の測定）、ウイルス感染マーカー（特定のウイルス抗体を検出するための側方流動イムノアッセイの使用）などの他の特定疾患マーカーの測定が挙げられるが、これらに限定されない。

更に別の重要な分野は、薬物などの治療薬が、かかる薬物を必要とする個体に投与される、コンパニオン診断の分野である。次に適切なアッセイを行って、薬物がその所望の効果を有するかどうかを決定するために適切なマーカーのレベルを決定する。代替として、本発明のアッセイデバイスを、治療薬の投与前に使用して、その治療薬がそれを必要とする個体を助けるかどうかを決定することができる。

更に別の重要な分野は、薬物の容易かつ迅速な検出、及び薬物乱用を示す薬物代謝についての薬物試験の分野、例えば、尿試料などの中の特定薬物及び薬物代謝物（例えばＴＨＣ）の測定である。

「検体」という用語は、「マーカー」という用語の同義語として使用され、定量的に又は定性的に測定される任意の化学的又は生物学的物質を包含することが意図され、小分子、タンパク質、抗体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、ウイルス成分又は無傷のウイルス、細菌成分又は無傷の細菌、細胞成分又は無傷の細胞、並びにそれらの複合体及び誘導体を挙げることができる。

「区画」、「領域」、及び「部位」という用語は、従来技術のデバイス又は本発明の一実施形態による方法で用いられるデバイスのいずれかにおける、基質上の流体流路の部分を定義する本説明、実施例、及び特許請求の範囲の文脈で用いられる。

「反応」という用語は、基質上若しくは基質中の試料の成分と少なくとも１つ若しくは複数の試薬との間で、又は試料中に存在する２つ若しくは３つ以上の成分間で起こる、任意の反応を定義するために使用される。「反応」という用語は、具体的に、検体の定性的又は定量的決定の一部として検体と試薬との間で起こる、反応を画定するために使用される。

「基質」という用語は、試料が添加されて、その上若しくはその中で決定が行われるか、又は検体と試薬との間の反応が起こる担体又はマトリックスを意味する。

本発明は、少なくとも１つの検体の存在又はその量を測定するための側方流動アッセイデバイスを用いる方法を目的とする。図２及び３は、こうしたデバイスの実施形態の概略図を示す。アッセイデバイス１０は、少なくとも１つの試料添加区画２０、少なくとも１つの試薬区画３０、少なくとも１つの検出区画４０、及び少なくとも１つのウィッキング区画５０を有する。これらの区画は流路を形成し、それによって、試料が試料添加区画からウィッキング区画に流動する。アッセイデバイスは、好ましくは試薬区画と検出区画との間に位置する少なくとも１つの試薬添加区画３５を更に含む。

アッセイデバイスの構成要素（すなわち、デバイスの他の部分からの別個の部品であるかどうかに関わらず、デバイスの物理的構造体）は、コポリマー、ブレンド、積層体、金属化ホイル、金属化フィルム、又は金属から調製され得る。あるいは、デバイスの構成要素は、以下の材料、すなわちポリオレフィン、ポリエステル、スチレン含有ポリマー、ポリカーボネート、アクリルポリマー、塩素含有ポリマー、アセタールホモポリマー及びコポリマー、セルロース及びそれらのエステル、硝酸セルロース、フッ素含有ポリマー、ポリアミド、ポリイミド、ポリメチルメタクリレート、硫黄含有ポリマー、ポリウレタン、シリコン含有ポリマー、ガラス、並びにセラミック材料のうちの１つの上に堆積されたコポリマー、ブレンド、積層体、金属化ホイル、金属化フィルム、又は金属から調製され得る。あるいは、デバイスの構成要素は、プラスチック、エラストマー、ラテックス、シリコンチップ、又は金属で作製され、エラストマーは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリアクリレート、シリコンエラストマー、又はラテックスを含み得る。あるいは、デバイスの構成要素は、ラテックス、ポリスチレンラテックス、又は疎水性ポリマーから調製され得、疎水性ポリマーは、ポリプロピレン、ポリエチレン、又はポリエステルを含み得る。あるいは、デバイスの構成要素は、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ポリスチレン、ポリアクリレート、又はポリカーボネートを含み得る。あるいは、デバイス構成要素は、エンボス加工、ミル加工、若しくは射出成形可能なプラスチックから、又は様々な長鎖アルカンチオールがその上に吸着され得る銅、銀、及び金フィルムの表面から作製される。ミル加工又は射出成形可能なプラスチックの構造は、ポリスチレン、ポリカーボネート、又はポリアクリレートを含み得る。一実施形態では、アッセイデバイスは、商品名Ｚｅｏｎｏｒ（登録商標）で販売されるものなどのシクロオレフィンポリマーから射出成形される。好ましい射出成形技法は、全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第６，３７２，５４２号、同第６，７３３，６８２号、同第６，８１１，７３６号、同第６，８８４，３７０号、及び同第６，７３３，６８２号に記載されている。

流路としては、開放路又は閉鎖路、溝、及び毛管を挙げることができる。好ましくは、流路は、隣接した突出部の側方流路を含み、毛管流が流路を通って持続されるようなサイズ、形状、及び相互の間隔を有する。一実施形態では、流路は、底面及び側壁を有する基板内のチャネル内にある。この実施形態では、突出部は、チャネルの底面から突出する。側壁は、液体の毛管作用に寄与しても、寄与しなくてもよい。側壁が液体の毛管作用に寄与しない場合、次に最外突出部と側壁との間に間隙が提供され、突出部によって画定される流路内に液体を収容したまま保つことができる。図１は、突出部７を示す。

一実施形態では、流路は少なくとも部分的に開放している。別の実施形態では、流路は全体的に開放している。開放は、毛管距離で蓋又はカバーがないことを意味する。故に蓋は、流路の物理的保護として存在する場合、流路内の毛管流に寄与しない。開放側方流路は、例えば以下の国際公開特許第２００３／１０３８３５号、同第２００５／０８９０８２号、同第２００５／１１８１３９号、同第２００６／１３７７８５号、及び同第２００７／１４９０４２号で説明されており、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。突出部は、区画内の血漿、好ましくはヒト血漿などの流体の側方毛管流動が達成されるような高さ（Ｈ）、直径（Ｄ）、及び突出部（ｔ１、ｔ２）間の１つ又は２つ以上の距離を有する。これらの寸法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２８５９９６号に示されている。上述の高さ、直径、及び突出部間の１つ又は２つ以上の距離を最適化することに加えて、突出部には、例えば、突出部の表面を修飾することによって、所望の化学的、生物学的、又は物理的機能性が付与され得る。一実施形態では、突出部は、約１５〜約１５０μｍ、好ましくは約３０〜約１００μｍの間隔の高さ、約１０〜約１６０μｍ、好ましくは約４０〜約１００μｍの直径、及び相互に約３〜約２００μｍ、好ましくは約５〜約５０μｍ、若しくは約１０〜約５０μｍの突出部間の間隙を有する。流路は、約５〜約５００ｍｍ、好ましくは約１０〜約１００ｍｍの長さ、及び約０．３〜約１０ｍｍ、好ましくは約０．３〜約３ｍｍ、好ましくは約０．５〜約１．５ｍｍ、また好ましくは約０．５〜約１．２ｍｍの幅を有し得る。

大部分の検出は流体流路の検出区画部分で起こるが、検出がデバイスの他の部分で起こることも可能である。例えば、非侵襲性、非反応性試料の完全性測定は、存在する場合、好ましくはフィルタ素子の後に試料区画と試薬区画又は試薬添加区画との間で起こり得る。他の測定値は、空白読取り値、ＨｂＡ１ｃの決定などのためにヘモグロビン及び糖化ヘモグロビンの両方を測定することに関する二部反応シーケンスの一部を含んでもよい。

液体試料添加区画とも称される液体試料区画は、ピペットなどの試料ディスペンサから試料を受容する。一般的に、試料はこの区画の上部に堆積される。試料添加区画は、試料が、任意のフィルタ及び試薬添加区画を通って、好ましくは毛管流を通って試薬区画に堆積される点から液体試料を輸送することができる。毛管流を誘導する構造は、ニトロセルロースなどの多孔性材料を含み得るか、又は図１に示すように、好ましくはマイクロピラーなどの突出部を通る。指先穿刺量の血液を用いることができるこれらのデバイスでは、試料は指で直接触れて、又は、参照によりその全体が本明細書願に組み込まれる「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ」と題された同時係属出願（２０１３年８月１５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０２１００３６Ａ１号）で説明されるものなどの毛管ピペットによって、採取することができる。

試料から粒子を濾過し、又は血液から赤血球を濾過して、その結果、血漿がデバイスを通ってより遠くまで移動できるように、試料添加区画内にフィルタ材料（図４）を配置してもよい。

試料添加区画と検出区画との間に、試薬区画が位置する。試薬区画は、分析素子に統合される試薬を含むことができ、一般に反応において有用な試薬（イムノアッセイのための抗体又は抗原などの結合パートナー、酵素アッセイのための基質、分子診断アッセイのためのプローブ）であるか、又は統合された試薬を安定させる材料、干渉反応を抑制する材料などの補助材料などである。一般に、反応に有用な試薬のうちの１つは、以下に記載されるように検出可能なシグナルを有する。場合によって、試薬は、検体と直接又は反応のカスケードを通じて反応し、限定されないが、着色又は蛍光分子などの分光学を使用して検出可能な分子などの検出可能なシグナルを形成することができる。試薬区画中の試薬の量は、同じ試薬の幅を維持しながら、デバイス内に堆積される試薬の長さによって調節することができる。試薬の量は、長さを維持しながら幅を変更することによっても調節することができる。更に、試薬の量は、幅及び長さを同時に変更することによって調節することができる。好ましい一実施形態では、試薬区画は共役体材料を含む。共役体という用語は、検出素子及び結合パートナーの両方を有する任意の部分を意味する。

検出素子は、その物理的分布又は／及びそれが送達するシグナルの強度に関して検出可能な薬剤であり、蛍光分子（例えば、蛍光剤、燐光剤、化学発光剤、生物発光剤など）、着色分子、反応時に色を生成する分子、特異的結合を呈する酵素、放射性同位体、リガンドなどであるが、これらに限定されない。標識とも称される検出素子は、好ましくは発色団、蛍光団、放射活性標識、及び酵素から選択される。好適な標識は、商業的供給元から入手可能であり、抗体、タンパク質、及び核酸の標識のための広範囲の色素を提供する。例えば、実際に可視及び赤外線スペクトル全体に及ぶ蛍光団が存在する。好適な蛍光標識又は燐光標識としては、例えば、フルオレセイン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な化学発光標識は、例えば、ルミノール、サイリウムなどであるが、これらに限定されない。

同様に、放射活性標識は市販されているか、又は検出素子を、それらが放射活性標識を組み込むように合成することができる。好適な放射性標識としては、例えば放射性ヨウ素及びリン、例えば、^１２５Ｉ及び^３２Ｐが挙げられるが、これらに限定されない。

好適な酵素標識は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどであるが、これらに限定されない。

２つの標識は、それらが互いに著しく妨害、干渉、又は消光することなく個別に検出されることができ、好ましくは同時に定量化され得る時、「区別可能」である。例えば、複数の検体又はマーカーが検出される時、２つ又は３つ以上の標識が使用されてもよい。

結合パートナーは、検体の存在又は量を決定するために使用され得る複合体を形成することができる材料である。例えば、「サンドイッチ」アッセイにおいて、共役体内の結合パートナーは、検体及び共役体を含む複合体を形成することができ、その複合体は、検出区画に組み込まれる、捕捉素子とも呼ばれる別の結合パートナーに更に結合することができる。競合イムノアッセイでは、検体は、共役体内の結合パートナーの、検出区画に組み込まれる、捕捉素子とも呼ばれる別の結合パートナーへの結合を干渉する。共役体に含まれる例示の結合パートナーとしては、抗体、抗原、検体、又は検体模倣体、タンパク質などが挙げられる。

流体流路内、試薬区画の前又は後、及び検出区画の前には、試薬添加区画が位置する。試薬添加区画３５を図３に示す。その最も広義の概念では、試薬添加区画は流体添加区画である。こうした流体は試薬流体であってもよく、好ましくは洗浄液である。試薬添加区画は、デバイスの外部からの試薬の添加を可能にし得る。「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ」（２０１３年７月２５日公開の、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３−０１８９６７３Ａ１号）は、試料及び流体流路内に存在するその他の未結合構成要素の洗浄に用いられ得る割り込み試薬（interrupting reagent）をウィッキング区画内に添加するための試薬添加区画の使用を開示している。好ましい実施形態では、試薬添加区画３５は、試薬区画３０の後に位置する（図３を参照）。

本発明による、アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法の好ましい一実施形態では、試薬を試薬添加区画に添加すると、試薬は試料添加区画に向かって上流に、かつウィッキング区画に向かって下流に流動して、流体流路を湿らせる。続いて液体試料を試料添加区画に添加すると、試料は試薬によって湿らされた流体流路を通って移動する。試薬によって湿らされた流体流路を通る試料の流動は、試薬が用いられていない時に流体流路を通る試料の流動よりも改善されている。こうした改善は、平均流動時間の改善によって証明され得る（図１４を参照）。好ましくは、試薬添加区画に添加される試薬は洗浄試薬であり、好ましくは、液体試料は全血である。

試薬区画からの試薬プリュームは、検出区画の幅を可能な限り被覆できるように可能な限り広くあるべきである。試薬プリュームの幅を増加させるための１つの方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ」と題された同時係属出願（２０１３年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９６７２Ａ１号）で説明されている。要約すると、試薬区画内で試薬材料を有する複数の区画（以下「試薬セル」と称する）は、複数の試薬セルを１つの流動ストリームに集束させた結果生じる複数の流動ストリームを再結合させる要素と共に、試薬区画を出て検出区画に入ると、より望ましく混合された、より広い試薬プリュームをもたらす。

液体試料区画及び試薬区画から下流は、試料添加区画と流体連通する検出区画である。検出区画は、上記で説明したものなどの突出部を含んでもよい。また上記の通り、これらの突出部は、好ましくはＺｅｏｎｏｒなどの光学プラスチック材料から、射出成形又はエンボス加工などによって基板に一体成形される。従来のサイズのデバイスの場合、検出区画における流路の幅は、一般的には約２ｍｍであるが、上記で説明されるもの、及び参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｌｏｗｅｒ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」と題された同時係属出願（２０１３年１月１８日出願の米国特許出願第１３／７４４，６１７号、代理人整理番号ＣＤＳ５１１１ＵＳＮＰ、代表発明者名：Ｐｈｉｌ Ｈｏｓｉｍｅｒ）におけるものなどの、一部のより低い容量のデバイスは、有意により狭く、例えば１．５ｍｍ以下である。

検出区画は、任意の検出可能なシグナルが読み取られる場所である。好ましい実施形態では、捕捉素子が検出区画内の突出部に取り付けられる。捕捉素子は、共役体又は上記のように共役体を含有する複合体に対する結合パートナーを含むことができる。例えば、検体が特定のタンパク質である場合、共役体は、蛍光プローブなどの検出素子に連結されたそのタンパク質に特異的に結合する抗体であってもよい。次に、捕捉素子は、同様にそのタンパク質に特異的に結合する別の抗体であり得る。別の実施例では、マーカー又は検体がＤＮＡである場合、捕捉分子は、合成オリゴヌクレオチド、その類似体、又は特異的抗体であり得るが、これらに限定されない。他の好適な捕捉素子は、検出される検体に特異的な抗体、抗体断片、アプタマー、及び核酸配列を含む。好適な捕捉素子の非限定例は、ビオチン機能性を含む共役体に結合するアビジン機能性を有する分子である。

検出区画は、複数の検出区画を含むことができる。複数の検出区画は、１つ又は２つ以上のマーカーを含むアッセイに使用され得る。複数の検出区画の場合、捕捉素子は、第１及び第２の捕捉素子などの複数の捕捉素子を含むことができる。

共役体は、例えば試薬区画内でコーティングすることによって、アッセイデバイス上に予め堆積させることができる。同様に、捕捉素子は、検出区画上のアッセイデバイス上に予め堆積させることができる。好ましくは、検出素子及び捕捉素子の両方は、アッセイデバイス上、試薬区画、及び検出区画上にそれぞれ予め堆積される。

試料は、試料区画に送達された後、試薬区画に達する。試料が試薬区画及び任意に試薬添加区画を通って流動し、相互作用した後、試料及び試薬プリュームは流体流に含有される。試薬プリュームは、反応区画内で溶解された試薬材料、又は試薬添加区画を介して添加されたもののうちのいずれかを含有することができる。試薬プリュームは、検出素子及び結合パートナーの両方を有する共役体を含むことができ、この場合、しばしば共役体プリュームと称される。

検出区画から下流は、検出区画と流体連通するウィッキング区画である。ウィッキング区画は、液体試料及び流路内の任意の他の材料、例えば、未結合試薬、洗浄液などを受容する容積を有するアッセイデバイスの区画である。ウィッキング区画は、液体試料を検出区画を通って出るように移動させ続ける毛管力を提供する。ウィッキング区画は、ニトロセルロースなどの多孔性材料を含み得るか、又は本明細書に記載される突出部などの非多孔性構造であり得る。ウィッキング区画は、蒸発加熱又はポンプを使用するなど、非毛管流体駆動手段を含むこともできる。本発明によるアッセイデバイスで使用されるウィッキング区画の更なる詳細は、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００５／００４２７６６号、及び同第２００６／０２３９８５９号に見出すことができる。ウィッキング区画は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ」と題された同時係属特許出願（２０１３年８月１５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０２１００３６Ａ１号）でも説明されている。

好ましくは、試料添加区画、検出区画、及びウィッキング区画を含む流路の全体は、基板に対して実質的に垂直な突出部を含み、流路内に試料の側方流を創出することができる高さ、直径、及び相互空間を有する。

上記の実施形態のいずれにおいても、デバイスは、好ましくは使い捨てアッセイデバイスである。アッセイデバイスは、取り扱い及び保護を容易にするためにハウジング内に収容され得る。アッセイデバイスがこうしたハウジング内に収容される場合、ハウジングは、好ましくは試料をアッセイデバイスに添加するためのポートを含む。

アッセイデバイスは、アッセイデバイス上で実施されたアッセイの結果を読み取るためのデバイス（読取り器）と併用してもよい。読取り器は、光検出器などの検出素子によって放出されるか、又はそれから反射されるシグナルを読み取るための手段と、一体型読取り器内又は別個のコンピュータ上に含まれ得るマイクロプロセッサなどの、シグナルを計算して結果を表示するための手段と、を含む。好適な読取り器は、例えば、いずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／０２３１８８３号、及び米国特許第７，４１６，７００号に記載されている。

別の実施形態は、アッセイデバイス上で行われたアッセイの結果を読み取るためのデバイスであり、このデバイスは、アッセイデバイスの定義された場所に存在する少なくとも１つの検出素子から放出されるか、又はそれから反射されるシグナルを読み取ることができる検出器を備える。上記実施形態のうちのいずれかにおいて、読み取りは、好ましくは、色、蛍光、放射活性、又は酵素活性の検出及び／又は定量から選択される。

本発明は、更に、対象となる１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体試料に対してアッセイを実施する方法を目的とする。試薬は、試薬添加区画に添加される。試薬は、試料添加区画に向かって上流に、かつウィッキング区画に向かって下流に流動して、流体流路を湿らせる。続いて、対象となる検体を含有する液体試料を、デバイスのハウジング内のポートを介するなどして、あるいは指先穿刺採血の場合は、指を試料添加区画上に直接触れさせることによって、上記で説明した通りにアッセイデバイスの試料添加区画上に堆積させる。試料は、試薬によって湿らされた流体流路を通って移動する。試薬によって湿らされた流体流路を通る試料の流動は、試薬が用いられていない時に流体流路を通る試料の流動よりも改善されている。続いて、試料は毛管作用により任意のフィルタを通して試薬区画内へと移動し、ここで試薬材料が溶解される。好ましい実施形態では、サンドイッチ型アッセイの場合、試料は、直接的に、又は抗体を介するなどして間接的に、のいずれかで検出素子と反応する。試料は、検出区画内に流動する時、溶解した試薬プリュームを有する試薬区画から離れる方向に流動する。

次に試料は、毛管作用によって検出区画内に移動する。検出区画では、検体又は対照を表すシグナルが生成される。好ましい実施形態では、試料、又は検出素子を有する１つ若しくは２つ以上の試薬が、検出区画の表面上の抗体などによって検出区画内で捕捉されて、検体又は対照の存在又は濃度を表すシグナルが生成される。次に、上記の読取り器又は検出器具を使用して、検出区画内で生成されたシグナルを読み取り、検体又は対照の存在又は濃度を測定する。試料は、検出区画からウィッキング区画の中に移動する。読取り器は、試料が検出区画を通って移動してすぐに、又は少し後にシグナルを読み取ることができる。また、検出区画から検出素子などのあらゆる未結合試薬を洗い落とすために、１つ又は２つ以上の洗浄液が、試料に続いてデバイスを介して流され得る。

本発明による方法は多くの利点を有し、全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｌｏｗ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」（２０１３年１月１８日出願、代理人整理番号ＣＤＳ５１１１ＵＳＮＰ、代表発明者名：Ｐｈｉｌ Ｈｏｓｉｍｅｒの米国特許出願第１３／７４４，６１７号）、「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ」（２０１３年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９６７２Ａ１号）、「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｆｌｏｗ Ａｒｏｕｎｄ Ｃｏｒｎｅｒｓ」（２０１５年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９７９６Ａ１号）、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ」（２０１３年８月１５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０２１００３６Ａ１号）、及び「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ」（２０１３年７月２５日公開のＰＣＴ国際公開第２０１３／１０９８２１号）と題された同時係属出願で説明されるような様々なアッセイデバイスで使用することができる。

本発明によるアッセイデバイスは、図４に示す通りパッケージ化することができる。パッケージング１００は、トップカバー１２０、フィルタ１３０、親水性テープ１４０、アッセイデバイス（チップ）１５０、及びベースカバー１６０などのアッセイの性能に必要な機能的要素の全てを含む。

本発明は、本明細書に示す特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。以下の実施例は、例示目的のために提供され、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されるため、本発明の範囲を限定することを意図しない。

（実施例１）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定化のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ，Ｊａｐａｎ）製プラスチック基材チップを使用した。ＮＴｐｒｏＢＮＰチップの場合、蛍光標識化Ａｎｔｉ−ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、試薬区画を生成した。Ａｎｔｉ−ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のために試料の湿潤性を増加させるため、デバイス上に少量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４５を堆積させた。試料をデバイスの試料区画に添加し、マイクロピラーアレイの毛管作用が、流路を介してウィッキング区画に試料を分配した。典型的なアッセイ時間は約１０分であった。検出区画内の蛍光標識化複合体からのシグナル強度を、試作品のライン照射式蛍光スキャナで記録した。カルバマゼピンチップの場合、カルバマゼピンハプテン及び蛍光標識とウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とを共有結合させることによってカルバマゼピン検出試薬を調製した。フェノバルビタール検出試薬は、フェノバルビタールハプテン及び蛍光標識とＢＳＡとを共有結合させることによって調製した。モノクローナルカルバマゼピン及びフェノバルビタール抗体を堆積させてから乾燥させて、検出区画を生成した。様々な濃度のＮＴｐｒｏＢＮＰ、カルバマゼピン、及びフェノバルビタールを、ヒト血清にスパイクしてデータを生成した。実験は、容量を低減させたチップ設計（図２に示すもののような）、及び容量を低減させ設置面積を低減させた（reduced volume reduced footprint）チップ設計（図３に示すもののような）を用いた。

指先穿刺からの全血の試料を試験デバイス上のフィルタに直接適用して、血漿から赤血球を分離させた。血漿はフィルタからマイクロピラー試料区画内の毛管空間に流動し、毛管流によって流体流路の端部まで前進する。フィルタ膜と試料区画のマイクロピラー表面との接触は、血漿が膜から流動するために重要である。接触が起こる場所で、マイクロピラー構造内の毛管力が血漿を膜からウィッキングして、血漿流を生成する。

従来技術のチップ設計では２００ｕＬの全血をフィルタに適用するが、アッセイでは約３５ｕＬの血漿のみしか必要としない。合計試料使用量の効率はわずか１７．５％である。

この実施例では、２５ｕＬのみの全血を、容量を低減させたチップ設計、及び容量を低減させ設置面積を低減させたチップ設計上で用いる。アッセイのために必要とされる９ｕＬの血漿を得るために、ヘマトクリット値４５％の全血試料２５ｕＬの場合では、濾過効率は少なくとも３６％でなければならない。

全血は、赤血球から血漿を分離するためにフィルタ膜を用いることなく、マイクロピラー表面に直接適用することができる。全血の粘度は血清又は血漿よりも遥かに高いため、マイクロピラー空間内の流動抵抗もまた遥かに高くなり、このため非常に低速の流動、又は流動の停止が生じる。また、患者間でヘマトクリット値が大きく異なるために、全血の粘度は幅広く変化し得る。マイクロピラー空間内の全血の一定した流動を達成するためには、流動抵抗を低減させる、又は毛管力を増加させるための方法を必要とした。

この実施形態では、容量を低減させたチップ設計、及び容量を低減させ設置面積を低減させたチップ設計の試料添加区画内又はその近くに、非溶血性かつ非イオン性で良好な湿潤性の界面活性剤を含有する少量（１μＬ以下）の溶液を添加することによって、マイクロピラー空間内の全血の流動が促進された。このプリウェット溶液を添加した直後に、１０〜１５μＬの全血を試料添加区画に直接添加する。界面活性剤含有溶液は、表面張力を低減させるように作用し、また赤血球が流体フロントで堆積するのを防ぐ。マイクロピラー構造内の毛管力は、全血の流動を、試薬（共役体）区画を介して検出（反応）チャネルを通り、ウィッキング区画内へと前進させる。

親水性テープを検出（反応）チャネル上に加えることは、マイクロピラー空間内の毛管力を増加させ、チップを通る全血の流動を更に改善するように作用する。標的検体を用いた検出共役体の反応及び免疫反応物質の捕捉（capture immunomaterials）は、全血の存在下で起こる。しかしながら、赤血球は検出共役体の光学的測定に干渉するため、これらは読み取りが行われる前に除去しなければならない。これは、最終読み取りの前に洗浄工程を加えることにより達成される。

割り込み洗浄は、試料の容量を制御するため、並びに赤血球及びその他の干渉物質を検出区画（チャネル）から除去するために用いられ得る。試料の容量は、血液試料がウィッキング区画を所定のレベルまで充填した時点で洗浄液を添加することによって制御される。マイクロピラー構造は一列ずつ均一な様式で充填するように設計されているため、流動を手動で、又は機器によって監視して、いつ試料がチップを標的容量まで充填したかを判定することができる。標的試料容量が達成されたら、容量を低減させたチップ設計の場合は図２に示し、容量を低減させ設置面積を低減させたチップ設計の場合は図３に示すように、洗浄液を、検出チャネルの上流位置にあるマイクロピラーチャネルに添加する。

１０〜１５μＬの洗浄液滴を適用してドーム型の液滴を作り、この液滴は、両方向に流動して試料を下流の検出（反応）チャネルから効率的に除去し、上流のピラー空間内の試料が検出（反応）チャネルに侵入することを防ぐ。

洗浄液は一般的には０．１Ｍのリン酸ナトリウム、１％のウシ血清アルブミン、及び０．１％の界面活性剤からなる。界面活性剤は、表面張力を低減させて毛管力による流体の流動を実現するために、マイクロピラー空間全体で必要である。従来技術のチップ設計では、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−４５は、マイクロピラーチップの試料区画内に堆積させて乾燥させる、好ましい界面活性剤であった。全血をチップ内で安定して流動させるためには、試料区画内のＴＸ−４５の堆積は最適ではない。マイクロピラーチップ内で全血の流速を改善させるための、いくつかの他の非イオン性界面活性剤が示されている。図５は、容量を低減させたチップ設計内で、試料添加区画内に堆積した様々な界面活性剤を用いて、全血がウィッキング区画の始点に達するまでの平均流動時間、及びウィッキング区画の終点に達するまでの時間を示す。結果は、ＴＸ−４５と比較して試験した全ての界面活性剤で、全血の流動がより速いことを示す。

これらの結果は、単一の全血試料を用いて得られた。全血は個人ごとに大きく異なり得るため、流速の大きな変動が予期される。試料のヘマトクリット濃度が増加する場合は流速がより遅くなるのが観察され、高いヘマトクリット値では試料において流動の停止が観察された。試料添加区画内に好適な界面活性剤を用いることによって、かつ試料を添加する前に同じ界面活性剤を含有するプリウェット溶液を添加することによって、全血の連続流動が観察された。

好ましいプリウェット及び洗浄溶液は、界面活性剤Ｓｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）４８５又はＳｕｒｆｙｎｏｌ（登録商標）４６５を含有する。その他の好適な界面活性剤としては、Ｓｉｌｗｅｔ（登録商標）Ｌ７６００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ６４、Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ １０Ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−３０５、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４５、及びＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００が挙げられる。０．０５％〜１％の界面活性剤濃度が好ましい。

割り込み洗浄を実施した全血試験の結果：静脈内採血（venous collection）によってＥＤＴＡ全血を得て、これを表１に示す濃度に達するまでカルバマゼピン及びフェノバルビタールを添加した。ウィッキング区画及び検出区画の約２／３をテープで被覆した、容量を低減させたチップ設計（図２を参照）を用いて、割り込み洗浄手順を評価した。各多重チップは、カルバマゼピンのための固定化捕捉抗体からなる検出（反応）区画、及びフェノバルビタール捕捉抗体で固定化した第２の検出（反応）区画を含有していた。蛍光団、及び担体分子としてのＢＳＡと結合した各薬剤からなる共役体を、試薬（共役体）区画内に堆積させた。

リン酸緩衝生理食塩水中に１％のＢＳＡ、０．１％のＴＸ−１００を含有する１マイクロリットルの洗浄液を試料区画内にスポットしてマイクロピラー空間に完全に侵入させ、続いてその直後に１５マイクロリットルの全血試料を分配した。流体がウィッキング区画の５０％を充填するまで流体フロントを目視検査により監視した。続いて１５マイクロリットルの同じ洗浄液を（試薬添加区画において）チャネル上に直接適用し、ウィッキング区画が完全に充填されるまで流体フロントを監視した。チップをカートリッジ内に集め、蛍光読取り器内で読み取った。

各全血試料のアリコートを遠心分離して、全血から血漿を分離させた。各アリコートからの血漿を回収して、同じチップ設計を用いて評価した。１５マイクロリットルの血漿を試料区画に直接添加した。チップを目視検査により監視して、ウィッキング区画が完全に充填されたと判定された直後に蛍光読取り器内で読み取った。

結果として得られた図６及び７の用量反応曲線は、少量の全血を、説明された割り込み洗浄手順を用いてマイクロピラーチップに直接適用して、血漿を用いて得られたものと同様の結果を得ることができることを示す。説明されるカルバマゼピン及びフェノバルビタールの競合アッセイの両方を全血の存在下で実施し、予期されたアッセイ結果を得た。

フィルタ及び割り込み洗浄を実施した全血：上記の濾過及び割り込み洗浄の概念を組み合わせることによって、マイクロピラーデバイス内で少量の全血を用いることができる。フィルタを用いて、２５マイクロリットル以下の全血由来の血漿から赤血球を分離させた。マイクロピラー構造に移動させる血漿の量は、割り込み洗浄手順と組み合わせて用いると遥かに少なくなり得る。本実施形態では、必要な血漿の量は、アッセイのための十分な検出シグナルを得るのに十分である必要があるが、チップの総容量を充填するのに必要なまでに大量である必要はない。洗浄と組み合わせる場合、２〜６マイクロリットルの少量の血漿量を用いることができる。

本実施形態では、全血をフィルタに適用する。血漿濾液を試料添加区画内のマイクロピラー空間に移動させると、試薬区画及び検出区画を通って流動し続ける。流動フロントを、ウィッキング区画内の所定の距離に達するまで目視検査又は器具によって監視する。洗浄液を、追加の試料がチャネルに侵入することを防ぐ又は阻害することにより試料の容量を制御する上流のチャネルに適用する。洗浄液は両方の方向に流動し、これは追加の血漿がチャネルに侵入するのを防ぎ、また、血漿及び残留共役体を検出（反応）チャネルから除去する。洗浄液はまた、残留するチップの容量を充填するように作用する。流体フロントは監視され、ウィッキング区画が完全に充填された時に読み取られる。一定の容量の試料がチップに侵入した後に、割り込み洗浄を適用してよい。理想的には、この容量は試薬区画内の全ての試薬材料（共役体材料など）を完全に溶解させ得るが、適切な洗浄のためにはウィッキング区画内に十分な空間を残すべきである。

後洗浄を実施した全血：別の実施形態では、後洗浄を実施した全血を用いて、蛍光読取り器で用量反応曲線が示された。用いられたチップは、図２に示す通り、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ試薬を堆積させ、ウィッキング区画及び検出区画のチャネルをテープで被覆した、容量を低減させたチップ設計であった（検出／反応区画内に検出抗体ａＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、及び試薬／共役体区画内に捕捉抗体ａＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）。試料は、等容積の血漿を除去した後に約３５０００ｐｇ／ｍＬのＮＴｐｒｏＢＮＰを含有する血清試料をその中に添加されて、７５、２２２０、４５５０、及び８９４２ｐｇ／ｍＬの濃度のＮＴｐｒｏＢＮＰを得たＥＤＴＡ全血で構成された。プリウェット及び洗浄液として、リン酸緩衝生理食塩水中に１％のウシ血清アルブミン、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３ｍｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ、０．３ｍｇ／ｍＬのウシガンマグロブリンを含有する溶液を用いた。

アッセイ手順は、１ｕＬの洗浄液を試料添加区画に添加して流路をプリウェットし、続いて４ｕＬの全血試料を試料添加区画に添加することで構成された。試料を流路のマイクロピラー空間内に流し込み、続いて２ｕＬの洗浄液を試料添加区画の後方に添加する。洗浄液をマイクロピラー空間内に完全に流し込み、続いて洗浄工程を更に２回繰り返す。ウィッキング区画が完全に充填されるまで流体流を監視し、続いてチップを読取り器で読み取る。

図８は、様々なＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度で全血試料に関して得られた３つの複製の平均流動時間を示す。これらの結果は、これらの全血試料に関する流路全体で、流速が有意に変化しないことを示す。図９は、各試験試料に関して蛍光読取り器で得られた蛍光応答の平均ピーク面積対ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度をプロットしている。図９はまた、同様のＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ濃度の血清試料と比較した全血試料に関して得られた用量反応曲線を示す。かくして、これらの結果は、蛍光読取り器を用いて、図２に示す容量を低減させたチップの流路内に全血を適用すること、全血を添加する前に洗浄液を適用して流動を促進すること、及び全血を添加した後に追加の洗浄液を適用して流路を洗浄することによって、用量反応曲線を得ることができることを示す。

（実施例２）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定化のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ，Ｊａｐａｎ）製アッセイデバイスを使用した。蛍光標識されたＡｎｔｉ−ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、試薬区画を生成した。Ａｎｔｉ−ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のために試料の湿潤性を増加させるため、デバイス上に少量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４５を堆積させた。ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを加えた血清をデバイスの試料区画に添加すると、マイクロピラーアレイの毛管作用が、流路を通じてウィッキング区画に試料を分配した。１５マイクロメートルの試料容量を、低容量デバイス設計Ｒ２．０２、Ｒ２．０４、Ｒ２．０９及びＲ３．１６で用いた。Ｒ１．０２デバイス設計は、図１に示すもののような、２００マイクロリットルの全血と共に使用することを意図された対照デバイスであった。Ｒ１．０２デバイスを、この実施例で４５マイクロリットルの血清と共に試験した。典型的なアッセイ時間は約１０分であった。検出区画内の蛍光標識された複合体からのシグナル強度を、試作品のライン照射式蛍光スキャナで記録した。

図１０及び図１１に示すように、棒線及び曲線Ａ（Ｒ２．０２）は、単一の試薬セル、及び０．５ｍｍの検出区画幅を有するそのまま縮小された検出区画を有する小型デバイスであり、一方で棒線及び曲線Ｂ（Ｒ２．０９）は、２つの試薬セル及びより広い１ｍｍの検出区画を有する小型デバイスである。更に、比較のために、２つの追加的なデバイス設計のデータが含まれる。棒線及び曲線Ｃ（Ｒ１．０２）は、２００ｕＬの全血試料容量を有する従来のサイズのアッセイデバイスであり、棒線及び曲線Ｄ（Ｒ２．０４）は、１ｍｍの検出区画幅を有する単一の試薬セルデバイスである。曲線Ｅ（Ｒ３．１６）は、２つの試薬セル及び幅１ｍｍの検出区画を含む。

（実施例３）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定化のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ，Ｊａｐａｎ）製の２つの試薬セルを有する小型アッセイデバイスを使用した。蛍光標識された抗プロカルシトニンモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、試薬区画を生成した。抗プロカルシトニンモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のために試料の湿潤性を増加させるため、デバイス上に少量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４５を堆積させた。この実施例では、プロカルシトニンを含有する２５マイクロリットルの全血を、アッセイデバイスの試料添加区画と接触するフィルタに適用した。血漿は、フィルタから試料添加区画内に移送され、続いて毛管力によって流路を通じてウィッキング区画へと移動する。流体流を目視検査により監視し、流体流フロントがウィッキング区画の２０％を充填した時に、０．０１Ｍのリン酸緩衝液、０．００２７Ｍの塩化カリウム、０．１３７Ｍの塩化ナトリウム、１％のウシ血清アルブミン、及び０．１％のｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する１０マイクロリットルの洗浄液を試薬添加区画に添加した。ウィッキング区画が完全に充填されたと判定された直後に、アッセイデバイスを蛍光読取り器に挿入した。各試料に関して、検出区画内の蛍光シグナルを測定し、反応曲線下のピーク面積を決定した。正常ドナーからの全血試料を新鮮なうちにリチウムへパリン管内に回収した。１０μｇ／ｍＬのプロカルシトニンを含有する濃縮血清試料を全血のアリコートに添加して、０、０．４、５、２０、及び３５ｎｇ／ｍＬのプロカルシトニンを含む試料を生成した。図１２は、各試料に関する５つの複製の結果の平均ピーク面積対プロカルシトニン濃度をプロットしている。図１２に示す通り、小さな試料サイズ（即ち２５μＬの全血／１０μＬ洗浄液）を用いることで、広範囲の検体濃度にわたり満足な結果がもたらされる。

（実施例４）
シッフ塩基結合によるタンパク質の共有結合固定化のために、表面上に酸化デキストランを有する、Ｚｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ，Ｊａｐａｎ）製の２つの試薬セルを有する小型アッセイデバイスを使用した。蛍光標識された抗プロカルシトニンモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、試薬区画を生成した。抗プロカルシトニンモノクローナル抗体を堆積させてから乾燥させて、検出区画を生成した。より良好な毛管流のために試料の湿潤性を増加させるため、デバイス上に少量のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−４５を堆積させた。この実施例では、プロカルシトニンを含有する３５μＬの全血を、アッセイデバイスの試料添加区画と接触するフィルタに適用した。血漿は、フィルタから試料添加区画内に移送され、続いて毛管力によって流路を通じてウィッキング区画へと移動する。流体流を目視検査により監視して、ウィッキング区画が完全に充填されたと判定された直後に蛍光読取り器内に挿入した。各試料に関して、検出区画内の蛍光シグナルを測定し、反応曲線下のピーク面積を決定した。正常ドナーからの全血試料を新鮮なうちにＥＤＴＡ管内に回収した。１０μｇ／ｍＬのプロカルシトニンの濃縮血清試料を全血のアリコートに添加して、０、０．４、５、及び２０ｎｇ／ｍＬのプロカルシトニンを含む試料を生成した。図１３は、各試料に関する３つの複製の結果の平均ピーク面積対プロカルシトニン濃度をプロットしている。図１３に示す通り、小さな試料サイズ（即ち３５μＬの全血）を用いることで、広範囲の検体濃度にわたり満足な結果がもたらされる。

（実施例５）
全血試料の流動を改善するためのプリウェット試薬の使用を、本発明のデバイス上で示した。対照として、１２μＬの全血（３０％ＨＣＴ）を、プリウェットしていない試料区画に分配する。改善された流動を示すために、２μＬの洗浄液を洗浄ポート（試薬添加区画）全体に予め分配し、続いて１２μＬの全血（３０％ＨＣＴ）を試料添加区画に添加する。ウィッキング区画の始点及び印３に達するまでの流動時間を測定する（図３を参照）。以下の表２（時間を分及び秒単位で示す）及び図１４は、本発明の方法に従ってプリウェットを用いて、改善された流動時間を示す。日付は、プリウェットを用いた場合、血液がウィッキング区画の始点に約５分間速く達するように流動することを示す。印３に達するまでの総流動時間もまた約５分早く、これはウィッキング区画自体における流速がほぼ同じであることを示す。

当業者であれば、本明細書に記載される本発明及びその実施形態が、具体的に記載されるもの以外の変型及び修正に影響され易いことを理解するであろう。本発明は、全てのかかる変型及び修正を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書において言及されるステップ及び特徴の全てを個別に又は集合的に含み、また、それらのステップ又は特徴の全ての組み合わせ又は任意の２つ又は３つ以上も含む。

「Ｌｏｗ Ｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」（２０１３年１月１８日出願、代理人整理番号ＣＤＳ５１１１ＵＳＮＰ、代表発明者名：Ｐｈｉｌ Ｈｏｓｉｍｅｒの米国特許出願第１３／７４４，６１７号）、「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ」（２０１３年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９６７２Ａ１号）、「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｆｌｏｗ Ａｒｏｕｎｄ Ｃｏｒｎｅｒｓ」（２０１３年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９７９６Ａ１号）、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ Ｆｌｕｉｄ Ｆｌｏｗ Ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｎ Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ」（２０１３年８月１５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０２１００３６Ａ１号）、「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ」（２０１３年７月２５日公開のＰＣＴ国際公開第２０１３／１０９８２１号）、及び「Ａｓｓａｙ Ｄｅｖｉｃｅ Ｈａｖｉｎｇ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｓｉｚｅ」（２０１３年７月２５日公開の米国特許出願公開第２０１３−０１８９６７３Ａ１号）と題された同時係属出願は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

〔実施の態様〕
（１） アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法であって、
液体試料添加区画を提供することと、
試薬材料を収容する、前記試料添加区画の下流にあり、かつ前記試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することと、
前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
前記検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、前記検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することであって、前記試料添加区画、前記試薬区画、前記検出区画、及び前記ウィッキング区画は、流体流路を画定する、ことと、
前記試料添加区画の下流かつ前記検出区画の上流で、前記流体流路に沿ってかつ前記流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することと、
試薬を前記試薬添加区画に添加することであって、前記試薬は前記試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動して、前記流体流路を湿らせる、ことと、
液体試料を前記試料添加区画に添加することであって、前記試料は前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通って移動し、前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通る前記試料の流動は、試薬が用いられていない時に前記流体流路を通る前記試料の流動よりも改善されている、ことと、を含む、方法。
（２） 前記試薬添加区画に添加される前記試薬は洗浄試薬である、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記液体試料は全血である、実施態様１に記載の方法。
（４） 対象となる１つ又は２つ以上の検体を検出するために液体試料に対してアッセイを実施する方法であって、
液体試料添加区画を提供することと、
試薬材料を収容する、前記試料添加区画の下流にあり、かつ前記試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することと、
前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
前記検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、前記検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することであって、前記試料添加区画、前記試薬区画、前記検出区画、及び前記ウィッキング区画は、流体流路を画定する、ことと、
前記試料添加区画の下流かつ前記検出区画の上流で、前記流体流路に沿ってかつ前記流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することと、
試薬を前記試薬添加区画に添加することであって、前記試薬は前記試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動して、前記流体流路を湿らせる、ことと、
対象となる検体を含有する液体試料を前記試料添加区画に添加することであって、前記試料は前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通って移動し、前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通る前記試料の流動は、試薬が用いられていない時に前記流体流路を通る前記試料の流動よりも改善されている、ことと、
前記試料が前記試薬材料を溶解させる前記試薬区画内に、毛管作用によって前記試料を移動させることと、
毛管作用によって前記試料を、中に溶解した前記試薬材料を有する前記試薬区画から離れる方向に、前記検出区画内に流動させることであって、生成されたシグナルを読み取ることによって前記検出区画内で前記対象となる検体を検出する、ことと、
前記試料及び任意の未結合材料を前記ウィッキング区画に流動させることと、を含む、方法。
（５） 前記試薬添加区画に添加される前記試薬は洗浄試薬である、実施態様４に記載の方法。

（６） 前記液体試料は全血である、実施態様４に記載の方法。

Claims (15)

1. アッセイデバイス中の液体試料の流動を改善する方法であって、
   液体試料添加区画を提供することと、
   前記液体試料添加区画の下流にあり、かつ前記液体試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することであって、前記試薬区画は試薬材料を収容する、ことと、
   前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
   前記検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、前記検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することであって、前記液体試料添加区画、前記試薬区画、前記検出区画、及び前記ウィッキング区画は、流体流路を画定する、ことと、
   前記液体試料添加区画の下流かつ前記検出区画の上流で、前記流体流路に沿ってかつ前記流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することと、
   試薬を前記試薬添加区画に添加することであって、前記試薬は前記液体試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動して、前記流体流路を湿らせる、ことと、
   液体試料を前記液体試料添加区画に添加することであって、前記液体試料は前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通って移動し、前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通る前記液体試料の流動は、試薬が用いられていない時に前記流体流路を通る前記液体試料の流動よりも改善されている、ことと、を含み、
   前記流体流路は、複数の隣接する突出部を有し、
   少なくとも前記試薬添加区画から前記液体試料添加区画及び前記ウィッキング区画へと側方毛管流が持続されて、前記試薬が前記液体試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動できるように、前記複数の隣接する突出部が、側方毛管流が達成されるような高さ、幅、及び前記突出部間の距離を有する、方法。
2. 前記試薬添加区画に添加される前記試薬は洗浄試薬である、請求項１に記載の方法。
3. 前記液体試料は全血である、請求項１に記載の方法。
4. 前記流体流路の少なくとも一部分に前記複数の隣接する突出部を提供する更なる工程を含む請求項１に記載の方法。
5. 前記複数の突出部を前記流体流路の全体にわたって提供する更なる工程を含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記流体流路は、毛管距離で蓋又はカバーが必要でないように開放している、請求項５に記載の方法。
7. 前記複数の突出部に、化学的、生物学的、又は物理的機能性を付与する更なる工程を含む、請求項４に記載の方法。
8. 前記検出区画は前記複数の隣接する突出部を含み、また、前記検出区画内の前記突出部に捕捉素子を取り付ける更なる工程を含む、請求項７に記載の方法。
9. 対象となる１つ又は２つ以上の検体を検出するために、アッセイデバイス上で液体試料に対してアッセイを実施する方法であって、
   液体試料添加区画を提供することと、
   前記液体試料添加区画の下流にあり、かつ前記液体試料添加区画と流体連通する試薬区画を提供することであって、前記試薬区画は試薬材料を収容する、ことと、
   前記試薬区画と流体連通する検出区画を提供することと、
   前記検出区画から流動する液体試料を受容する容積を有し、前記検出区画と流体連通するウィッキング区画を提供することであって、前記液体試料添加区画、前記試薬区画、前記検出区画、及び前記ウィッキング区画は、流体流路を画定する、ことと、
   前記液体試料添加区画の下流かつ前記検出区画の上流で、前記流体流路に沿ってかつ前記流体流路と流体連通する試薬添加区画を更に提供することと、
   試薬を前記試薬添加区画に添加することであって、前記試薬は前記液体試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動して、前記流体流路を湿らせる、ことと、
   液体試料を前記液体試料添加区画に添加することであって、前記液体試料は前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通って移動し、前記試薬によって湿らされた前記流体流路を通る前記液体試料の流動は、試薬が用いられていない時に前記流体流路を通る前記液体試料の流動よりも改善されている、ことと、
   前記液体試料が前記試薬材料を溶解させる前記試薬区画内に、毛管作用によって前記液体試料を移動させることと、
   毛管作用によって前記液体試料を、中に溶解した前記試薬材料を有する前記試薬区画から離れる方向に、前記検出区画内に流動させることであって、生成されたシグナルを読み取ることによって前記検出区画内で前記対象となる検体を検出する、ことと、
   前記液体試料及び任意の未結合材料を前記ウィッキング区画に流動させることと、を含み、
   前記流体流路は、複数の隣接する突出部を有し、
   少なくとも前記試薬添加区画から前記液体試料添加区画及び前記ウィッキング区画へと側方毛管流が持続されて、前記試薬が前記液体試料添加区画に向かって上流に、かつ前記ウィッキング区画に向かって下流に流動できるように、前記複数の隣接する突出部が、側方毛管流が達成されるような高さ、幅、及び前記突出部間の距離を有する、方法。
10. 前記流体流路に前記複数の隣接する突出部を提供する更なる工程を含む請求項９に記載の方法。
11. 前記流体流路は、毛管距離で蓋又はカバーが必要でないように開放している、請求項１０に記載の方法。
12. 前記複数の突出部に、化学的、生物学的、又は物理的機能性を付与する更なる工程を含む、請求項１０に記載の方法。
13. 前記検出区画内の前記突出部に捕捉素子を取り付ける更なる工程を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記試薬添加区画に添加される前記試薬は洗浄試薬である、請求項９に記載の方法。
15. 前記液体試料は全血である、請求項９に記載の方法。

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