ES2306509T3 - Procedimiento para el analisis de anticuerpos y dispositivo para analisis de anticuerpos. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende: realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisis se realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno de análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir así las reacciones no específicas; y en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno, o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química.
Description
Procedimiento para el análisis de anticuerpos y
dispositivo para análisis de anticuerpos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para suprimir una reacción no específica en un
inmunoanálisis en muestras de orina en el que dicho inmunoanálisis
es útil, mediante el cual los anticuerpos contra fuentes de
infección tales como bacterias y virus que se producen en muestras
de fluidos corporales clínicas, en muestras de orina, pueden
detectarse o analizarse con gran precisión, convenientemente, y con
buena especificidad.
La invención se refiere además a un kit de
reactivos para análisis de anticuerpos que resulta de utilidad para
el procedimiento anterior.
La detección de anticuerpos específicos para
varias fuentes de infección (patógenos) tales como bacterias y
virus, que pueden producirse en los fluidos corporales, es un método
indirecto útil para el diagnóstico de una infección. Por
consiguiente, las técnicas de análisis inmunológico y los
dispositivos concebidos para detectar un anticuerpo utilizando un
patógeno o un componente del patógeno como antígeno para análisis se
han utilizado hasta la actualidad en un amplio campo de
diagnóstico.
Dicho procedimiento de inmunoanálisis que
utiliza un patógeno o un componente del mismo como antígeno de
análisis presenta ventajas porque el sistema analítico necesario
puede ser creado fácilmente pero no es completamente satisfactorio
en sensibilidad y especificidad, dejando de este modo espacio para
la mejora.
Como dispositivo de inmunoanálisis para su
utilización en dichos análisis inmunológicos, puede mencionarse una
tira de material poroso en la que se realiza un ensayo de fijación
(reacción antígeno-anticuerpo). Un dispositivo de
análisis de este tipo aprovecha la propiedad capilar de un sustrato
poroso, es decir que un fluido corporal aplicado a un extremo de
una tira porosa migra hacia el otro extremo. De este modo, cuando
una muestra de ensayo (líquida) que contiene una sustancia que debe
analizarse se aplica a un extremo de la tira que lleva varios
reactivos dispuestos sucesivamente en posiciones estratégicas, la
muestra migra por acción capilar a lo largo de la tira y encuentra
los reactivos en dichas posiciones en sucesión para experimentar
las reacciones. La existencia de la sustancia que ha de analizarse
puede confirmarse y su cantidad determinarse detectando una señal
procedente del marcador detectable incluido en el sistema de
acoplamiento ligando-receptor.
La técnica de inmunoanálisis que utiliza el
principio anterior se denomina con frecuencia análisis inmunocapilar
o análisis inmunocromatográfico y ha sido descrita en los
documentos WO nº 87/02774, EP nº 0306772 y otras publicaciones. En
cuanto a las modificaciones de la técnica, pueden mencionarse las
invenciones descritas en la publicación de la patente japonesa sin
examinar nº 63865/1989, de la publicación de la patente japonesa
sin examinar nº 299464/1989 y de la publicación de la patente
japonesa sin examinar nº 167497/1994.
El dispositivo mencionado anteriormente presenta
ventajas porque no se requiere ningún instrumento específico para
la determinación y el análisis puede completarse fácilmente y en un
corto periodo pero tiene espacio para la mejora de la sensibilidad y
de la especificidad.
Además, debido a que el dispositivo realiza
solamente un análisis, una muestra de referencia negativo o positivo
puede determinarse simultáneamente, con el inconveniente
consiguiente de que es imposible interpretar si el resultado es un
dato fiable generado por la propia determinación.
Generalmente hablando, la orina y la saliva,
entre los fluidos corporales, resultan preferidas como muestras de
análisis clínico porque su recogida no requiere ningún procedimiento
invasivo y es fácil y seguro en comparación con la sangre.
Sin embargo, es habitual que las concentraciones
de anticuerpos presentes en dichas muestras sean sumamente bajas,
por ejemplo del orden de una milésima a una décima de milésima de
las concentraciones en la sangre. Además, las muestras de orina
recogidas de pacientes que han tomado grandes cantidades de agua son
sumamente finas, con el resultado de una gran variación es
inevitable en el valor de anticuerpo entre las muestras.
En dichos casos, con el dispositivo de análisis
convencional descrito anteriormente, el análisis será negativo
cuando la muestra sea demasiado fina para detectar un anticuerpo, de
modo que el problema surge en el caso de "negativo cierto" no
pueda diferenciarse del caso del "negativo (falso negativo)"
ocasionado por la baja concentración de la muestra.
Además, cuando han de analizarse muestras
escasas en anticuerpos, se requiere un sistema analítico muy
sensible pero en este caso existe el problema de que los
subproductos formados por reacciones no específicas debido a
contaminantes en las muestras son susceptibles de detectarse
simultáneamente para dar resultados de falso positivo.
A partir del documento
JP-A-180837 se supo que podrían
evitarse las señales inespecíficas mediante la adición anterior del
lisado de E. coli para diluir sus muestras de suero humano
para la detección de anticuerpos con el fin de neutralizar los
anticuerpos de E. coli en el suero; el antígeno de D1 fue
producido por técnicas de ADN recombinante utilizando anfitriones
de E. coli y señales inespecíficas fueron producidas por una
reacción específica entre una sustancia de E. coli contenida
en el antígeno recombinante y un anticuerpo anti-E. coli
contenido en el suero de la sangre humana.
A partir del documento
WO-A-95/30902 se supo que con objeto
de neutralizar reacciones no específicas debidas a otras proteínas
contenidas en los lisados víricos o en las proteínas recombinantes
que comprenden soluciones de antígeno utilizadas en el soporte
sólido, una solución del lisado de linfocitos, por ejemplo solución
de linfocitos T humanos o una solución de lisado de células
anfitrionas tal como una solución de lisado de E. coli puede
añadirse en concentraciones que oscilan específicamente entre
aproximadamente 0,01% p/p y aproximadamente 10% p/p. De este modo,
este documento da a conocer cómo neutralizar reacciones no
específicas debidas a otras proteínas contenidas en las proteínas
recombinantes preparadas utilizando un anfitrión de E.
coli.
A partir del documento US A 5.120.662 se conoció
un inmunoanálisis capaz de detectar simultáneamente cualquier
número deseado de antígenos de un agente infeccioso o cualquier
número deseado de inmunoglobulinas en un soporte sólido único. En
este documento, una muestra de análisis se pone en contacto con un
soporte sólido en el que uno o más antígenos se inmovilizan como
puntos de análisis discretos. Este documento se cita con respecto a
la función de un lisado de E. coli utilizado en la
realización de un análisis.
El documento
JP-A-5340947 da a conocer un
inmunoanálisis que incluye la utilización de un anticuerpo
específico para la parte Fc de otro anticuerpo incluido en el
análisis.
A partir del documento
DE-A-195 16 466 es conocido un
análisis para la detección de un anticuerpo diana indicador de un
agente infeccioso, por ejemplo anticuerpos anti-VIH.
Los antígenos de VIH están recubiertos sobre un soporte sólido.
El documento
WO-A-95/02822 da a conocer un
dispositivo para la detección de anticuerpos indicador de un agente
infeccioso, por ejemplo Helicobacter pylori.
Ninguno de los documentos anteriores da a
conocer o sugiere la utilización de un componente de E. coli
para suprimir una reacción no específica.
Por consiguiente, se requiere un sistema para
análisis de anticuerpos que asegure suficientemente una gran
sensibilidad de detección aun cuando se utilicen como muestras
dichos fluidos corporales como la orina y la saliva, es decir un
sistema de análisis fiable que contribuya a reducir cambios para
análisis de falsos negativos y falsos positivos a causa de una gran
especificidad.
El primer objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar un procedimiento que permita
determinaciones con gran precisión mediante la supresión de
reacciones de "falso positivo" que surgen de los contaminantes
en las muestras aun cuando las muestras sean las de orina que son
comparativamente escasas en anticuerpos diana.
El segundo objetivo de la presente invención
consiste en proporcionar dicho procedimiento como una mejora en el
análisis inmunocapilar o en el análisis inmunocromatográfico,
mediante el cual puede determinarse con precisión la existencia y
cantidad del anticuerpo diana como objeto de detección en una
muestra con una demarcación clara entre una "reacción de falso
negativo" que surge de la naturaleza de la muestra y una reacción
de "verdadero negativo".
La Fig. 1 es un diagrama que presenta un soporte
en fase sólida en forma de una tira como elemento constituyente del
dispositivo para análisis de anticuerpos de la invención. En la Fig.
1, el código 1 representa una primera zona, 2 una zona del trazador,
3 una segunda zona, 4 una tercera zona, 5 una zona de análisis y 6
una zona de referencia.
La Fig. 2 es un diagrama que ilustra el
principio del análisis del anticuerpo diana en una muestra con el
dispositivo para análisis del anticuerpo de la invención. Los
códigos respectivos utilizados tienen los mismos significados que en
la Fig. 1.
La Fig. 3 son diagramas específicos que
presentan una tira de soporte en fase sólida (A) y un alojamiento
(B) que adapta dicho soporte de la fase sólida incluido en el
dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención. En la Fig.
3, los códigos 1\sim6 tienen los mismos significados que en la
Fig. 1, y el código 7 representa una sección superior del
alojamiento, 8 una sección inferior del mismo, 9 un orificio de
entrada de la muestra y 10 una ventana de detección.
La Fig. 4 es una representación diagramática de
los resultados de la determinación del anticuerpo anti-H.
pylori en la orina en el Ejemplo 1 (5) (i). En la Fig. 4, los
círculos blancos representan los datos en las muestras de orina de
pacientes con infección por H. pylori que dan un análisis
^{13}C-UBT positivo y los círculos negros
representan datos en las muestras de orina de pacientes que dieron
un análisis ^{13}C-UBT negativo.
La Fig. 5 es una representación en diagrama de
los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina
determinados en el Ejemplo 1 (5) (ii). En la Fig. 5, la ordenada
representa la absorbancia (D.O. 450 nm) y la abscisa representa los
grupos positivos a H. pylori y negativos a H. pylori
probados según el análisis ^{13}C-UBT.
La Fig. 6 es una representación en diagrama de
los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina
determinados en el Ejemplo 1 (6). En la Fig. 6, los círculos blancos
representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un
análisis ^{13}C-UBT positivo y los círculos negros
representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un
análisis ^{13}C-UBT negativo.
La Fig. 7 es una representación en diagrama de
los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina
generados en el Ejemplo 2 (2). En la Fig. 7, los círculos negros
representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un
análisis positivo para el anticuerpo antihBc de la sangre y los
círculos blancos representan datos sobre muestras de orina de
pacientes que dieron un análisis negativo para el anticuerpo antihBc
de la sangre.
La Fig. 8 es un diagrama que presenta
cromatogramas de permeación de gel de muestras de orina que
proporcionan reacciones de falso positivo en la determinación del
anticuerpo anti-VIH en la orina y la reactividad del
anticuerpo de cada fracción (Ejemplo 3 (1)). En la Fig. 8, la
ordenada representa la absorbancia (D.O.) y la abscisa representa la
fracción cromatográfica por permeación del gel (fracción nº). La
línea llena representa la absorbancia de la proteína a 280 nm, la
línea de puntos negra representa los datos generados con el
anticuerpo antihumano (IgG+IgM), la línea de triángulos blancos
representa los datos generados con anticuerpo IgG antihumano
(específica para Fc); y la línea de triángulos negros representa los
datos generados con anticuerpo IgG antihumano (específicos para
Fab).
La Fig. 9 es una representación en diagrama de
los datos en anticuerpos anti-H. pylori determinada en el
Ejemplo 5. En la Fig. 9, la ordenada representa la absorbancia (D.O.
450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo positivo a H.
pylori (+: n=56) y el grupo negativo (-: n=44) clasificados por
el análisis ^{13}C-UBT.
La Fig. 10 es una representación en diagrama de
los datos en el anticuerpo antirrubéola en la orina como se generó
en el Ejemplo 6. En la Fig. 10, la ordenada representa la
absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el
anticuerpo antirrubéola (+: n=76) y el grupo negativo (-: n=23)
clasificados según la concentración en el suero medida con un kit
comercial.
La Fig. 11 es un diagrama que presenta el punto
de análisis y el punto de referencia en la segunda zona del
dispositivo de análisis de anticuerpos de la invención [Ejemplo 7
(3)].
La Fig. 12 es un histograma que presenta los
datos de análisis en el anticuerpo anti-H. pylori en la
orina, sangre completa y plasma tal como se genera con el
dispositivo de análisis de anticuerpo de la invención en comparación
con los datos correspondientes generados con los dispositivos de
referencia (A\simE). En la Fig. 12, "Especificidad"
representa el porcentaje de análisis negativos (proporción negativa)
en relación con el número total de análisis cuando las muestras
procedentes de pacientes comprobados por el análisis
^{13}C-UBT negativo se determinaron para cada
apartado del análisis con cada dispositivo de análisis y
"Sensibilidad" representa el porcentaje de análisis positivos
(proporción positiva) en relación con el número total de análisis
cuando las muestras procedentes de pacientes comprobados por el
análisis ^{13}C-UBT que son positivos se
determinaron para cada apartado del análisis con cada dispositivo
del análisis. Los dispositivos de referencia A\simH significan los
dispositivos siguientes.
- A:
- Helitest (fabricado por Cortecs Diagnostics)
- B:
- H. pylori-Check-1
- (fabricado por Bio-Medical Products)
- C:
- First Check H. pylori
- (fabricado por Worlwide Medical Corp)
- D:
- Biocard Helicobacter pylori IgG
- (fabricado por Anti Biotech Oy)
- E:
- Insta Test H. pylori
- (fabricado por Cortez Diagnostics Inc.)
- F:
- One Step H. pylori Test
- (fabricado por Teco Diagnostics)
\newpage
- G:
- H. pylori SPOT
- (fabricado por International Immuno-Diagnostics)
- H:
- Quick Stripe H. pylori
- (fabricado por Diatech Diagnostics Inc.)
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores de la presente invención
investigaron mucho para crear un sistema analítico que pueda
determinar con alta precisión los anticuerpos diana aun cuando las
muestras sean escasas en anticuerpos en las muestras de orina, y
descubrieron que en el sistema analítico existe un componente del
anticuerpo que se une de manera inespecífica al antígeno en una
reacción antígeno-anticuerpo (denominado en adelante
componente del anticuerpo de unión inespecífica) para dar lugar a
reacciones no específicas, produciendo de este modo un resultado de
falso positivo y por consiguiente reduciendo la precisión de la
detección.
Basándose en los descubrimientos anteriores los
inventores continuaron investigando y descubrieron que dichas
reacciones no específicas pueden suprimirse realizando la reacción
antígeno-anticuerpo entre el anticuerpo diana que
ha de analizarse y el antígeno específico para el anticuerpo
específico en presencia de un componente de Escherichia coli (E.
coli), con lo que la proporción de falsos positivos puede
reducirse para conseguir una mejora significativa en la precisión de
la detección.
Los inventores descubrieron además que dicho
componente del anticuerpo que se une de manera inespecífica
comprende fragmentos de IgG y/o sus productos de desnaturalización
que conservan la antigenicidad de la cadena ligera (L) o de la zona
F (ab) de la IgG y que este componente del anticuerpo reacciona en
cruz con los reactivos del análisis del anticuerpo corrientes (por
ejemplo anticuerpos secundarios) utilizados en los sistemas
analíticos del anticuerpo en el suero, conduciendo de este modo a
análisis de falsos positivos.
Basándose en los descubrimientos anteriores, los
inventores de la presente invención confirmaron además que las
reacciones no específicas en el sistema de análisis de anticuerpos
pueden inhibirse utilizando un reactivo con afinidad específica
para la zona Fc del anticuerpo IgG diana de análisis como reactivo
de análisis de anticuerpos, con lo cual la proporción de falsos
positivos puede reducirse para mejorar la precisión de la detección
en un grado significativo.
Mientras tanto, los inventores intentaron
mejorar el programa informático analítico para anticuerpos (el
dispositivo analítico inmunocapilar y el dispositivo para análisis
inmunocromatográfico) y descubrieron que pueden detectarse con
precisión reacciones de "verdaderos negativos" excluyendo las
reacciones de "falsos negativos" creando un "punto de
referencia" para detectar un anticuerpo arbitrario en las
muestras además del punto (punto de análisis) para detectar el
anticuerpo diana en la zona de reacción (zona de evaluación) de la
tira como parte del dispositivo analítico. De este modo, en dicho
sistema analítico, cuando la muestra es una muestra inapropiada que
no puede analizarse por razones tales como una concentración
demasiado baja de anticuerpo (es decir, la cantidad total del
anticuerpo es demasiado pequeña), el "punto de referencia" da
una señal negativa que indica que la muestra no es analizable. Por
otra parte, cuando la muestra presenta una concentración de
anticuerpos apropiada, el "punto de referencia" da una señal
positiva que indica que la muestra es apropiada para el análisis
deseado del anticuerpo diana. Entonces, según el resultado en este
"punto de análisis", se puede conocer con certeza la presencia
o ausencia del anticuerpo diana en la muestra, es decir si la
muestra es "positiva" o "negativa verdadera".
En relación con esto, la publicación de patente
japonesa sin examinar nº 299464/1989 y la publicación de la patente
japonesa sin examinar nº 167497/1994, que dan a conocer ambas
mejoras en el programa informático para análisis de anticuerpos
(dispositivo para análisis inmunocapilar y dispositivo para análisis
inmunocromatográfico), describen los dispositivos que incluyen un
punto de referencia además de un punto para análisis. Sin embargo,
el punto de referencia en estos dispositivos está concebido para
determinar si o no un marcador colocado en una zona corriente
arriba de la tira ha atravesado por el punto de análisis por acción
capilar y, por consiguiente, es completamente diferente del punto de
referencia según la invención.
Los presentes inventores confirmaron además que
cuando se realiza la reacción de acoplamiento entre el anticuerpo
diana y el antígeno correspondiente por medio del dispositivo de
análisis del anticuerpo mejorado anteriormente en presencia de un
componente de E. coli, se inhibe la reacción no específica en
este sistema de reacción antígeno-anticuerpo y que
cuando un reactivo con actividad específica para la zona Fc de la
IgG se utiliza como reactivo para análisis de anticuerpos, se
inhibe la reacción no específica con el inmunocomplejo, conduciendo
de este modo a una disminución significativa en la frecuencia de un
análisis de falso positivo.
La presente invención se ha desarrollado
basándose en varios descubrimientos anteriores.
En un primer aspecto de la misma, la presente
invención proporciona un procedimiento de gran precisión para
analizar un anticuerpo con una frecuencia reducida de reacción de
falso positivo.
- 1.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende:
- realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisis
- se realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno del análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir de este modo las reacciones no específicas; y
- en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno con grupos antigénicos determinantes intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química.
- 2.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1, en el que el componente de E. coli es por lo menos un elemento seleccionado de una fracción soluble y una fracción lipopolisacárida de E. coli.
- 3.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1 ó 2, en el que se inmoviliza dicho antígeno de análisis.
- 4.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según los apartados 1, 2 ó 3, en el que dicho anticuerpo diana es un anticuerpo contra una fuente de infección seleccionado de entre el grupo constituido por un virus, una bacteria y un protozoo.
- 5.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra Helicobacter pylori.
- 6.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 5, en el que la fuente de dicho antígeno de análisis se selecciona de entre el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis, el virus de la rubéola, el virus de la gripe, el virus del sarampión, el virus del herpes, citomegalovirus, Clamydia, gonococos, Helicobacter pylori y Toxoplasma gondii.
- 7.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 5, en el que dicho antígeno para análisis se selecciona de entre una bacteria, un virus, un protozoo, un componente de una bacteria que comprende un grupo antigénico determinante de la bacteria, un componente de un virus que comprende un grupo antigénico determinante de un virus y un componente de un protozoo que comprende un grupo antigénico determinante de los protozoos.
- 8.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 7, en el que dicho antígeno analítico es el Helicobacter pylori o un componente de Helicobacter pylori que comprende un grupo antigénico determinante de Helicobacter pylori.
- 9.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 8, en el que el componente de E. coli se selecciona de entre un componente proteico de E. coli, un componente de carbohidratos de E. coli, un componente lipídico de E. coli y una mezcla de los mismos.
- 10.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 9, en el que el inmunoanálisis se realiza por la técnica sándwich.
- 11.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 10, en el que el inmunoanálisis se realiza por la técnica sándwich y comprende una etapa de utilización de una sustancia con afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana como reactivo de análisis del anticuerpo.
- 12.
- Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 11, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.
- 13.
- Kit de reactivos, que comprende un antígeno analítico para detectar un anticuerpo diana, un reactivo analítico del anticuerpo y un componente de E. coli, para realizar el procedimiento destinado a suprimir una reacción no específica definida en cualquiera de los apartados 1 a 12, en el que dicho antígeno analítico es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno que tiene los grupos antigénicos determinantes intrínsecos para un patógeno que se ha preparado artificialmente por síntesis química.
- 14.
- Kit de reactivos según el apartado 13, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es una sustancia con afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana.
- 15.
- Kit de reactivos según el apartado 14, en el que el reactivo para análisis de anticuerpos es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.
En primer lugar, se describe a continuación en
detalle el procedimiento del primer aspecto de la presente
invención.
El procedimiento de la invención representa una
mejora en el procedimiento de inmunoanálisis de anticuerpos y se
caracteriza porque la frecuencia de la reacción de falsos positivos
puede disminuirse por inhibición de la reacción no específica.
La reacción antígeno-anticuerpo
entre el anticuerpo diana en una muestra y un antígeno específico
para dicho anticuerpo se realiza en presencia de un componente de
E. coli. Según este procedimiento, la reacción no específica
en la reacción antígeno-anticuerpo se inhibe de
manera significativa, con el resultado de que puede disminuir la
frecuencia de un análisis de falsos positivos.
El componente de E. coli no está
particularmente limitado con la condición de que sea un componente
de Escherichia coli, incluyendo de este modo pero sin
limitarse al componente proteico, al componente hidrocarbonado o al
componente lipídico del mismo o a una mezcla de dichos componentes.
Como ejemplo preferido, puede mencionarse una fracción soluble o una
fracción de lipopolisacáridos (LPS) de E. coli.
No existe ninguna limitación específica sobre el
procedimiento para preparar dicho componente de E. coli pero
puede utilizarse selectivamente una variedad de procedimientos. Un
procedimiento habitual puede comprender el cultivo de una cepa
arbitraria de E. coli en un medio adecuado para su
proliferación, la recogida de las células cultivadas y la
desintegración de las células físicamente por medio de un productor
de ultrasonidos o disolviéndolas con un tensioactivo o similar para
proporcionar una fracción soluble (extracto). El LPS mencionado
anteriormente puede prepararse mediante un procedimiento extractivo
utilizando un disolvente orgánico, por ejemplo fenol, cloroformo o
éter, o una mezcla de dos o tres disolventes orgánicos diferentes.
Puede prepararse también artificialmente utilizando una técnica de
ingeniería genética. Además, pueden utilizarse convenientemente
productos comerciales (por ejemplo lipopolisacáridos de E.
coli que están disponibles en Difco o Sigma).
La muestra a la que se puede aplicar la
invención es la orina.
Específicamente la presente invención resuelve
el problema de la escasa precisión de detección asociada a las
muestras no invasivas que están favorecidas como muestras para la
detección de anticuerpos, es decir la orina.
El "anticuerpo diana", objeto de la
determinación, no está particularmente limitado con la condición de
que sea un anticuerpo cuya detección se desea, incluyendo de este
modo los anticuerpos contra varias fuentes de infección que son
anticuerpos extraños para el anfitrión.
Las fuentes de infección no están
específicamente limitadas pero incluyen muchos patógenos diferentes
que infectan al hombre y a otros animales y dan lugar a anticuerpos
en los anfitriones. Más específicamente, dicho patógeno incluye una
variedad de virus tales como el VIH (virus de la inmunodeficiencia
humana), tipo A, B, C y otros virus de la hepatitis, virus de la
rubéola, virus de la gripe, virus del sarampión, citomegalovirus,
virus del herpes simple, virus de la varicela-herpes
zóster, adenovirus, enterovirus, etc.; bacterias tales como
Helicobacter pylori (denominado en adelante para abreviar
H. pylori), Clamydia spp., Mycobacterium
tuberculosis, espiroquetas, gonococos, Treponema pallidum,
Micoplasma spp., etc. (excluyendo a Escherichia coli); y
protozoos tales como Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica,
Rickettsia tsutsugamushi y así sucesivamente. Se prefieren
virus tales como VIH, virus de la hepatitis, virus de la rubéola,
virus de la gripe, virus del sarampión, virus del herpes, etc. y
bacterias representadas por Helicobacter pylori, etc., siendo
particularmente preferidas bacterias tales como H.
pylori.
El antígeno para su utilización en el
procedimiento de la invención es un antígeno que puede experimentar
la reacción antígeno-anticuerpo con el anticuerpo
diana que ha de detectarse. Así, puede utilizarse con éxito, por
ejemplo, cualquiera de los antígenos utilizados en el sistema
analítico para anticuerpos del suero convencionales. Los antígenos
pueden ser no solamente los muy patógenos tales como dichos virus y
bacterias sino también los antígenos que tienen grupos
determinantes antigénicos intrínsecos a los patógenos respectivos.
De este modo, por ejemplo, los patógenos inactivados disponibles en
el tratamiento térmico o la irradiación de patógenos, los antígenos
preparados extrayendo los patógenos con un tensioactivo o similar y
los antígenos preparados artificialmente por síntesis química o
tecnología del ADN recombinante.
Ocasionalmente, puede determinarse fácilmente si
un antígeno experimental puede utilizarse con éxito o no en el
procedimiento analítico de la invención por lo general ensayando su
reactividad con el anticuerpo diana de manera convencional.
En el procedimiento analítico de la invención,
dicho antígeno puede utilizarse opcionalmente inmovilizado de
antemano sobre una fase sólida arbitraria. La fase sólida recién
mencionada anteriormente puede ser alguna de las varias fases
sólidas en utilización rutinaria en este campo de la técnica,
incluyendo de este modo pero sin limitarse a bastones, bolitas,
placas (placas de microvaloración inclusive) y tubos de ensayo de
varios materiales, por ejemplo vidrio, polvo de celulosa, Sephadex,
Sepharose, poliestireno, papel de filtro, carboximetilcelulosa,
resinas de intercambio iónico, dextrano, película de plástico, tubo
de plástico, nilón, perlas de vidrio, seda, copolímero de
poliamina-éter metil vinílico-ácido maleico, copolímero de
aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, etc.
El procedimiento para la inmovilización no está
específicamente limitado, pero puede ser cualquiera de entre enlace
físico y enlace químico. Por ejemplo, los procedimientos de enlace
químico tales como los procedimientos de enlace covalente, por
ejemplo, procedimiento diazo, procedimiento peptídico (el
procedimiento del derivado de la amida ácida, el procedimiento de
la resina de cloruro de carboxilo, el procedimiento de la resina de
carbodiimida, el procedimiento del derivado del anhídrido maleico,
el procedimiento del derivado del isocianato, el procedimiento de
polisacárido activado por bromociano, el procedimiento del derivado
del carbonato de celulosa, el procedimiento del reactivo de
condensación, etc.), el procedimiento de alquilación, el
procedimiento de acoplamiento del agente de reticulación
(procedimiento para acoplar a un soporte que utiliza glutaraldehído,
isocianato de hexametileno o similares como agente reticulante), el
procedimiento de acoplamiento de la reacción de Ugi, etc.; los
procedimientos de fijación iónica que utilizan resinas de
intercambio iónico y soportes similares; y los procedimientos de
adsorción física utilizando perlas de vidrio u otros soportes
porosos de vidrio.
La cantidad de antígeno que ha de utilizarse en
el sistema analítico no está específicamente limitada pero puede
seleccionarse libremente según la cantidad de antígeno que está en
utilización rutinaria por el sistema analítico específico. Por
ejemplo, cuando se utiliza el procedimiento sándwich,
generalmente el antígeno se utiliza en exceso sobre el anticuerpo
diana. Tomando como ejemplo el caso en el que la reacción se realiza
en un sistema de reacción de 100 \mul, puede utilizarse el
antígeno en una proporción de generalmente de aproximadamente
0,1\sim100 \mug/ml, preferentemente de aproximadamente 1\sim10
\mug/ml.
Las condiciones de la reacción
antígeno-anticuerpo entre dicho antígeno y el
anticuerpo diana no están particularmente limitadas pero pueden ser
las mismas que las de la utilización de rutina para los
inmunoanálisis convencionales excepto que la reacción debería
realizarse en presencia de un componente de E. coli. Un
procedimiento típico puede comprender incubar o dejar en reposo
dicho antígeno, anticuerpo y componente de E. coli juntos a
una temperatura generalmente no superior a 45ºC, preferentemente de
aproximadamente 4\sim40ºC, más preferentemente de aproximadamente
25\sim40ºC, durante aproximadamente 0,5\sim40 horas,
preferentemente de aproximadamente 1\sim20 horas. El disolvente
para su utilización en la reacción y su pH no están particularmente
limitados, siempre que la reacción no se interfiera. Por lo tanto,
los tampones convencionales que presentan una acción de tampón en
el intervalo de pH de aproximadamente 5\sim9, tal como el tampón
citrato, tampón fosfato, tampón tris, tampón de acetato, etc. pueden
utilizarse generalmente de manera rutinaria.
La proporción de componente de E. coli en
este sistema de reacción no está particularmente limitada pero por
ejemplo puede ser generalmente de aproximadamente 0,1\sim100
\mug, preferentemente de aproximadamente 0,5\sim50 \mug, por
\mug del antígeno en el sistema de reacción.
El procedimiento para poner en práctica el
método de la invención no está específicamente limitado excepto
para el requisito básico que comprende una etapa de reacción
antígeno-anticuerpo en la que el anticuerpo diana
se hace reaccionar con el antígeno correspondiente, que puede ser un
antígeno inmovilizado, en presencia de dicho componente de E.
coli. Preferentemente, sin embargo, el procedimiento comprende
además una etapa de detección del anticuerpo diana capturado por
dicho antígeno (inmunocomplejo), es decir una etapa de hacer
reaccionar el inmunocomplejo con un reactivo de análisis del
anticuerpo.
El procedimiento de detección y cuantificación
del inmunocomplejo obtenido mediante dicha reacción entre el
antígeno y el anticuerpo y las condiciones del mismo no están
específicamente limitadas pero pueden ser las de utilización
rutinaria para los inmunoanálisis en general.
Preferentemente la presente invención puede
realizarse en la práctica por el procedimiento sándwich. En
el procedimiento sándwich en fase sólida, por ejemplo, el
anticuerpo diana en una muestra puede analizarse por lo general por
el procedimiento siguiente.
En primer lugar, un componente de E. coli
y una muestra que contiene supuestamente el antígeno diana (un
fluido corporal tal como la orina) se añaden a un antígeno en fase
sólida que es un antígeno inmovilizado capaz de experimentar una
reacción entre el antígeno y el anticuerpo específica con el
anticuerpo diana para de este modo realizar una reacción entre el
antígeno y el anticuerpo. Una vez que las sustancias no unidas no
acopladas al antígeno en fase sólida se eliminan lavando, por
ejemplo, se añade un reactivo de análisis del anticuerpo para la
reacción con el anticuerpo diana acoplado al antígeno en fase sólida
(inmunocomplejo) y el inmunocomplejo se detecta o se cuantifica por
un método de detección correspondiente al reactivo de análisis
concreto.
La selección y modificación de varios métodos
para dichos análisis son bien conocidos por los expertos en la
materia y cualquiera de entre dichas técnicas puede utilizarse en la
práctica de la presente invención [por ejemplo "Rinsho
Kensa-hou Tello (Outline of Clinical Test)",
Kanehara Publishing Co., 1995].
El reactivo para análisis del anticuerpo para su
utilización en la presente invención no está particularmente
limitado pero incluye una variedad de reactivos en la utilización de
rutina en la técnica. Por ejemplo, pueden mencionarse los
anticuerpos secundarios tales como un anticuerpo de inmunoglobulina
antihumano capaz de unirse al anticuerpo objetivo
(inmunoglobulina). El anticuerpo inmunoglobulina antihumano
mencionado anteriormente incluye los antisueros, los productos
purificados de los mismos (anticuerpos policlonales) y los
anticuerpos monoclonales disponibles en animales arbitrarios
inmunizados utilizando una inmunoglobulina en la clase
correspondiente a la inmunoglobulina diana como inmunógeno.
Además, como reactivo de análisis del
anticuerpo, puede utilizarse también un anticuerpo
anti-IgG que presenta afinidad específica para la
zona Fc del anticuerpo diana (IgG). Como tal puede utilizarse
también un anticuerpo anti-IgG, un anticuerpo
anti-IgG específico para Fc que no sea reactivo con
la cadena ligera de IgG de la zona F(ab) de IgG o la
proteína A, la proteína G o similares que es específicamente
reactiva con la zona Fc del IgG. Éstos pueden utilizarse con
ventaja específica cuando el anticuerpo diana sea una IgG.
Los reactivos de análisis pueden prepararse de
manera convencional o adquirirse en proveedores comerciales.
Para la detección, el reactivo para análisis de
anticuerpos puede modificarse directamente con un agente de marcado
convencional o modificarse indirectamente por un método de detección
adicional.
El agente marcador no está específicamente
limitado pero puede emplearse cualquiera de los agentes conocidos
hasta ahora o previstos que se utilizarán en el futuro. Para
mencionar ejemplos específicos, pueden utilizarse también
radioisótopos tales como ^{125}I, ^{3}H, ^{14}C, etc.; enzimas
tales como la fosfatasa alcalina (ALP), peroxidasa (por ejemplo
HRP), etc.; sustancias fluorescentes tales como isotiocianato de
fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (RITC),
etc.;
1N-(2,2,6,6-tetrametil-1-oxil-4-piperidil)-5N-(aspartato)-2,4-dinitrobenceno
(TOPA), etc. Los procedimientos de inmunoanálisis que utilizan los
agentes marcadores mencionados anteriormente se denominan
radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimático, fluoroinmunoanálisis
e inmunoanálisis de rotación, respectivamente. Puede también
emplearse el método de inmunocromatoanálisis que utiliza un reactivo
para análisis de anticuerpos preparado marcando partículas de látex
teñidas con oro coloidal.
El marcado con los agentes marcadores, las
modificaciones por marcado indirecto y su detección pueden
realizarse por procedimientos conocidos de por sí [Tatsuo Iwasaki
et al.: Monoclonal Antibody, Kodansha Scientific, 1984; y
Eiji Ishikawa et al.: Enzyme Immunoassay, 2ª edición, Igaku
Shoin, 1982, entre otros].
En el procedimiento de la invención, es esencial
que el componente de E. coli esté incluido en el sistema de
reacción que comprende el anticuerpo diana que ha de analizarse y el
antígeno correspondiente y siempre que este requisito se satisfaga,
el resto del procedimiento básico está particularmente limitado
solamente por el lenguaje adicional de la reivindicación 1. Por
consiguiente, las condiciones de la reacción entre dicho
inmunocomplejo y dicho reactivo de análisis del anticuerpo no están
particularmente limitadas, pero pueden ser iguales a las utilizadas
en inmunoanálisis en general. El procedimiento más frecuente
comprende incubar o dejar en reposo el sistema analítico en las
mismas condiciones que las descritas anteriormente para la reacción
entre el antígeno y el anticuerpo, es decir, generalmente a una
temperatura no superior a 45ºC, preferentemente de aproximadamente
4\sim40ºC, más preferentemente de aproximadamente 25 a 40ºC y a un
nivel de pH entre aproximadamente 5\sim9 durante aproximadamente
0,5\sim40 horas, preferentemente de aproximadamente 1\sim20
horas.
La presencia o ausencia del anticuerpo diana en
una muestra o su contenido se evalúa midiendo la actividad del
marcador, que depende del tipo de agente marcador utilizado en el
marcado del reactivo de análisis del anticuerpo (o el marcador
indirecto), de manera rutinaria o desde el punto de vista del valor
del anticuerpo calculado a partir del valor medido.
(1-2) Como modo alternativo del
procedimiento de análisis del anticuerpo de la presente invención,
puede mencionarse un procedimiento inmunológico para el análisis
del anticuerpo diana en una muestra que comprende utilizar un
reactivo que presenta actividad específica para la zona Fc del
anticuerpo diana IgG como reactivo de análisis del anticuerpo.
Según este procedimiento, la reacción entre el
componente del anticuerpo de unión inespecífica y el reactivo de
análisis del anticuerpo puede suprimirse de manera significativa de
modo que la frecuencia de análisis de falso positivo puede
disminuir. De este modo, este método de análisis del anticuerpo
puede considerarse una mejora en el procedimiento sándwich
para inmunoanálisis de anticuerpos.
El reactivo de análisis del anticuerpo de la
invención es reactivo con el anticuerpo diana (IgG) y, por
consiguiente, puede utilizarse para la detección del anticuerpo y
se caracteriza porque no es reactivo con la cadena ligera del
anticuerpo IgG diana o con la zona F(ab) de la IgG diana, es
decir presenta afinidad específica para la zona Fc de la IgG
diana.
Más específicamente, dicho reactivo de análisis
del anticuerpo puede ser por ejemplo un anticuerpo
anti-IgG específico para Fc que puede prepararse
utilizando una zona Fc del anticuerpo IgG diana como inmunógeno, e
incluye antisueros, productos purificados de los mismos (anticuerpo
policlonales) y anticuerpo monoclonales que pueden extraerse de
animales arbitrarios inmunizados con dicho inmunógeno. Este reactivo
no se limita a dichas preparaciones de anticuerpos pero puede ser
proteína A, proteína G o similares que es reactiva específicamente
con la zona Fc del anticuerpo IgG.
Estos reactivos para análisis del anticuerpo
pueden prepararse de manera rutinaria o adquirirse en proveedores
comerciales (por ejemplo, Sigma, Cappel o Jackson Immuno Research
Laboratories, Inc.).
Para la detección, el reactivo para análisis de
anticuerpos puede modificarse directamente con un agente marcador
convencional o indirectamente modificarse por un método de detección
adicional.
El tipo de agente marcador, el procedimiento de
marcado y el procedimiento de detección del marcador puede ser el
mismo que los mencionados anteriormente (1-1).
El procedimiento analítico del anticuerpo de la
invención comprende la utilización del reactivo de análisis del
anticuerpo mencionado anteriormente como característica esencial del
mismo en la detección del anticuerpo diana, es decir el
inmunocomplejo, y siempre que este requisito se cumpla, el resto del
procedimiento básico puede ser sin restricciones el mismo que el
utilizado en los inmunoanálisis convencionales por la técnica
sándwich.
Fundamentalmente, el procedimiento de análisis
del anticuerpo de la presente invención se realiza en la práctica
haciendo reaccionar un antígeno capaz de reaccionar con el
anticuerpo diana en una muestra y detectando el antígeno diana
unido al antígeno (inmunocomplejo) con dicho reactivo analítico del
anticuerpo.
La muestra de análisis y el antígeno pueden ser
respectivamente las mismas mencionadas en (1-1), y
en cuanto al antígeno diana, también, pueden utilizarse los mismos
anticuerpos que los mencionados en (1-1), con la
condición de que el anticuerpo sea un anticuerpo IgG contra la
fuente de infección. En el procedimiento de la presente invención,
la fuente de infección puede incluir Escherichia coli.
Cuando sea necesario, el reactivo de análisis
del antígeno o del anticuerpo de la presente invención puede
utilizarse inmovilizado en una fase sólida arbitraria. La fase
sólida para su utilización en el procedimiento de inmovilización
puede ser por ejemplo la misma que la mencionada en
(1-1).
La reacción antígeno-anticuerpo
entre el antígeno y el anticuerpo diana no está limitada
específicamente pero puede realizarse en las condiciones en la
utilización rutinaria para inmunoanálisis convencional. Un
procedimiento típico comprende incubar o dejar en reposo un sistema
de reacción que comprende el antígeno y el anticuerpo diana
generalmente a una temperatura no superior a 45ºC, preferentemente
de aproximadamente 4\sim40ºC, más preferentemente de
aproximadamente 25\sim40ºC durante aproximadamente 0,5\sim40
horas, preferentemente de aproximadamente 1\sim20 horas.
Aunque no sea preceptivo, un componente de E.
coli puede producirse para estar presente en la reacción entre
el antígeno y el anticuerpo como se mencionó en
(1-1).
El inmunocomplejo resultante se lava a
continuación y se somete a una etapa en la que se hace reaccionar
con dicho reactivo de análisis del anticuerpo especificado. Esta
reacción puede realizarse en las mismas condiciones que las
utilizadas generalmente en los inmunoanálisis convencionales
(análisis sándwich) o sustancialmente de la misma manera que
en aquéllos. El disolvente, por ejemplo, no está limitado
específicamente con la condición de que no interfiera con la
reacción, incluyendo de este modo pero sin limitarse a tampones a pH
aproximadamente entre 5\sim9, tal como tampón citrato, tampón
fosfato, tampón tris y tampón acetato, para mencionar solo unos
pocos ejemplos. El tiempo de reacción y la temperatura de reacción
no están específicamente limitados, pero por ejemplo pueden ser
iguales a los mencionados para dicha reacción entre el antígeno y el
anticuerpo.
La presencia o ausencia del anticuerpo diana en
una muestra o su contenido se evalúa midiendo la actividad del
marcador, lo que depende del tipo de agente marcador utilizado en el
marcado del reactivo de análisis del anticuerpo (o el marcador
indirecto), de manera rutinaria o desde el punto de vista del valor
del anticuerpo calculado a partir del valor medido, precisamente
como se menciona en (1-1).
\vskip1.000000\baselineskip
El dispositivo de análisis del anticuerpo según
el segundo aspecto de la invención se describe a continuación con
detalle.
El dispositivo de análisis del anticuerpo de la
invención es un procedimiento mejorado mediante el que puede
determinarse con buena precisión la presencia y/o cantidad del
anticuerpo diana que ha de detectarse en una muestra mediante un
procedimiento de análisis en fase sólida.
Más específicamente, el dispositivo de análisis
del anticuerpo de la invención es un dispositivo de análisis que
comprende un soporte en fase sólida que presenta por lo menos (a)
una primera zona para poner en contacto con una muestra y (b) una
segunda zona para la reacción del anticuerpo en la muestra ordenada
en una secuencia tal que la muestra sea transportada por acción
capilar desde dicha primera zona a dicha segunda zona y los medios
del marcador para detectar el resultado de la reacción en dicha
segunda zona, caracterizados porque dicha (b) segunda zona tiene
(i) un punto de análisis donde un ligando para el anticuerpo diana
que ha de analizarse está inmovilizado y (ii) un punto de
referencia donde está inmovilizado un ligando para capturar un
anticuerpo arbitrario en la muestra.
La característica sobresaliente del dispositivo
de análisis de anticuerpos de la invención consiste en que se
proporciona un punto de referencia independiente de un punto de
análisis en la segunda zona, cuyo punto de referencia es tal que,
cuando se aplica y se analiza de manera apropiada una muestra
apropiada, forma una indicación que representa un análisis positivo
en presencia de un marcador independientemente de si el anticuerpo
diana está presente o no en la muestra mientras que, cuando se
aplica una muestra inapropiada o se analiza de manera inapropiada
una muestra, forma una indicación que representa un análisis
negativo en presencia de un marcador independientemente de si el
anticuerpo diana está presente o no en la muestra.
De este modo, el punto de referencia en la
segunda zona de este dispositivo es un punto que da una indicación
de si el resultado (particularmente el resultado negativo) en el
punto de análisis es un resultado analítico válido
independientemente de la presencia o ausencia del anticuerpo diana
en la muestra. Con el dispositivo analítico del anticuerpo de la
invención, gracias a la construcción anterior, es posible
determinar, cualitativa y cuantitativamente, el anticuerpo en la
muestra con gran precisión (fiabilidad alta) con una distinción
clara entre los resultados de falso negativo y verdadero
negativo.
Además, el dispositivo analítico del anticuerpo
de la invención está concebido que la reacción del anticuerpo diana
en el punto analítico se realice en presencia de un componente de
E. coli y puede concebirse para que un reactivo que presenta
afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo diana IgG se
utilice como reactivo para análisis del anticuerpo destinado a
detectar el resultados de la reacción en el punto de la prueba. Con
el dispositivo para análisis del anticuerpo de la invención, gracias
a la construcción descrita anteriormente, las reacciones no
específicas están inhibidas de modo que la frecuencia de un análisis
de falso positivo esté disminuida de forma significativa, haciendo
de este modo posible determinar, cualitativa y cuantitativamente,
el anticuerpo diana en la muestra con buena precisión y gran
sensibilidad.
En cuanto a la muestra de análisis y el
anticuerpo diana para este dispositivo de análisis del anticuerpo de
la invención, pueden emplearse por ejemplo los mencionados en
(1).
La presente invención proporciona en primer
lugar un soporte en fase sólida que comprende por lo menos una
primera zona y una segunda zona.
La primera zona es una zona en la que la muestra
aplicada se pone en contacto con el dispositivo y la segunda zona
es una zona en la que el anticuerpo (el anticuerpo completo que
puede contener el anticuerpo diana) en la muestra experimenta la
reacción y el acoplamiento en modo ligando-receptor
o en modo antígeno-anticuerpo y el resultado de la
reacción se presenta en presencia de un marcador (zona de reacción y
zona de evaluación). Las zonas se ordenan en un soporte en fase
sólida de tal manera que la muestra aplicada y que se pone en
contacto con la primera zona se transporta por acción capilar desde
dicha primera zona a la segunda zona. Preferentemente, dichas zonas
se ordenan de tal modo que toda o por lo menos una parte de la
muestra que se introduce en la primera zona se desplaza, por acción
capilar, a través de una capa sustancialmente plana del soporte en
fase sólida a la segunda zona.
Opcionalmente el soporte en fase sólida puede
presentar una tercera zona corriente abajo de la segunda zona, como
una zona que absorbe la muestra (líquida) que migra, por acción
capilar, desde la primera zona a la segunda zona y más corriente
abajo.
El soporte en fase sólida preferido se configura
en forma de una tira y dichas primera y segunda zona se ordenan en
uno y el mismo plano de la tira y de tal manera que la muestra
aplicada se desplaza, por acción capilar, desde una primera banda
(primera zona) a una segunda banda (segunda zona) y opcionalmente
además a una tercera banda (tercera zona). Aunque la forma
preferida de dicho soporte en fase sólida es una tira como se ha
mencionado anteriormente, cualquier otra forma o geometría puede
emplearse siempre que las funciones previstas del soporte en fase
sólida en la presente invención puedan realizarse.
El soporte en fase sólida puede absorber la
muestra (líquida) y, cuando se humedece con la muestra, dejar por
lo menos que el anticuerpo en la muestra se desplace, por acción
capilar, desde la primera zona a la segunda zona del soporte en
fase sólida y opcionalmente además a la tercera zona. Además, el
soporte en fase sólida es preferentemente el que puede soportar e
inmovilizar un ligando que reacciona con el anticuerpo (inclusive
del anticuerpo diana) contenido en la muestra para capturar este
último.
El soporte apropiado en fase sólida incluye una
variedad de materiales porosos, por ejemplo polietileno, fibra de
vidrio, celulosa, rayón, nilón, dextrano reticulado, varios tipos de
papel cromatográfico, nitrocelulosa y papel de filtro.
La primera zona, la segunda zona y la tercera
zona, por ejemplo, del soporte en fase sólida pueden estar
constituidas respectivamente por el mismo o diferentes elementos
seleccionados de entre los materiales mencionados anteriormente,
dependiendo la elección de los materiales de los papeles y funciones
de las zonas respectivas.
La primera zona del soporte en fase sólida está
constituida preferentemente por un material poroso adaptado para
absorber la muestra aplicada en su superficie y dejarla desplazarse,
por acción capilar, a la segunda zona. El material poroso adecuado
para la primera zona no está limitado específicamente pero
generalmente puede utilizarse polietileno (por ejemplo POREX: Porex
Technologies, Fairburn, Georgia), fibra de vidrio, rayón, nilón y
materiales celulósicos inclusive de papel. El material preferido es
un polietileno poroso o un material celulósico tal como papel de
filtro.
La segunda zona del soporte en fase sólida está
constituida preferentemente por un material poroso que puede dejar
que la muestra (líquido) ascienda por acción capilar desde la
primera zona a la segunda zona y de soportar un ligando para el
anticuerpo (inclusive del anticuerpo diana) que se produce en la
muestra en un estado no desplazado por acción capilar. El material
poroso que presenta tales propiedades incluye papel de filtro,
papel cromatográfico, fibra de vidrio, dextrano reticulado, nilón,
nitrocelulosa, etc. El material preferido es la nitrocelulosa porque
el ligando puede inmovilizarse fácilmente en la misma.
La segunda zona está prevista en un punto de
ensayo en el que se ha inmovilizado un ligando adaptado a reconocer
específicamente el anticuerpo diana en la muestra y capturarlo y se
ha inmovilizado un punto de referencia en el que un ligando
adaptado para reconocer un anticuerpo arbitrario en la muestra y
capturarlo. El punto de referencia se coloca fuera del punto de
ensayo con un intervalo dado entre éste, preferentemente corriente
abajo en la dirección del flujo capilar y está preferentemente
dispuesto de modo que ambos puntos se ponen en contacto mediante el
frente líquido de la muestra en condiciones idénticas.
El ligando para el punto de ensayo no está
específicamente limitado a condición de que esté acoplado
específicamente al anticuerpo diana que ha de analizarse pero es
preferentemente un antígeno que es reconocido específicamente y
está unido por el anticuerpo diana (reacción
antígeno-anticuerpo). Como el antígeno mencionado
anteriormente, pueden utilizarse sin limitaciones los antígenos que
se utilizan de manera rutinaria en el sistema de análisis de
anticuerpos del suero convencional. Los antígenos pueden ser muy
patógenos tales como los virus y bacterias pero también pueden ser
sustancias que contienen grupos determinantes antigénicos
intrínsecos a los patógenos respectivos. De este modo pueden
mencionarse, por ejemplo, los patógenos inactivados por
calentamiento o irradiación, los antígenos obtenidos por extracción
de los patógenos con un tensioactivo o similar, y los antígenos que
se preparan artificialmente por síntesis química o tecnología del
ADN recombinante.
El ligando para el punto de referencia no está
limitado específicamente a condición de que acople un anticuerpo
arbitrario en la muestra pero preferentemente es un anticuerpo
(anticuerpo antiinmunoglobulina) que reconoce específicamente y se
une a un anticuerpo arbitrario en la orina.
Los ligandos están inmovilizados en el material
poroso en el punto de ensayo y en el punto de referencia,
respectivamente, de modo que no serán desplazados de los respectivos
puntos por el flujo capilar de la muestra líquida. De este modo,
cada ligando está unido al punto correspondiente del soporte poroso
de modo que no dará lugar a difusión cuando la segunda zona esté
humedecida por la muestra que contiene el anticuerpo diana pero
será retenido de forma estable en el punto sin que se transporte a
la tercera zona del soporte en fase sólida.
La inmovilización de los ligandos sobre dicho
soporte poroso puede conseguirse por técnicas bien conocidas por los
expertos en la materia, es decir, por enlace físico o enlace
químico.
De este modo, por ejemplo, pueden mencionarse
los procedimientos de enlace químico tales como los procedimientos
de enlace covalente, por ejemplo, el procedimiento diazo, el
procedimiento de péptidos (procedimiento del derivado de amida
ácida, el procedimiento de la resina de cloruro de carboxilo, el
procedimiento de la resina de carbodiimida, el procedimiento del
derivado del anhídrido maleico, el procedimiento del derivado del
isocianato, el procedimiento del polisacárido activado por
bromociano, el procedimiento derivado del carbonato de celulosa, el
procedimiento del reactivo de condensación, etc.), el procedimiento
de alquilación, el procedimiento de acoplamiento del agente de
reticulación (el procedimiento para acoplar a un soporte que utiliza
glutaraldehído, isocianato de hexametileno o similares como agente
de reticulación), el procedimiento de acoplamiento de la reacción
de Ugi, etc.; los procedimientos de enlace iónico; procedimientos de
absorción física. Cuando se utiliza nitrocelulosa como soporte
poroso para la segunda zona, dicho ligando puede inmovilizarse de
manera conveniente por enlace no covalente.
La cantidad de ligando (antígeno) para su
utilización en el punto de ensayo de la segunda zona está
preferentemente en exceso de modo que esencialmente todo el
anticuerpo diana presente supuestamente en la muestra estará unido
al punto de ensayo.
La cantidad de ligando (anticuerpo
antiinmunoglobulina) para su utilización en el punto de referencia
de la segunda zona está también preferentemente en exceso de modo
que esencialmente todo el anticuerpo arbitrario (que puede contener
el anticuerpo diana) en la muestra estará unido al punto de
referencia.
La reacción de acoplamiento entre el anticuerpo
diana y el ligando (particularmente un antígeno) en el punto de
ensayo se realiza preferentemente en presencia de un componente de
E. coli. El componente de E. coli puede ser
suministrado al sistema de reacción incorporándolo en una dilución
de la muestra de análisis y aplicando la mezcla a la primera zona o
puede inmovilizarse de manera separable en el punto de ensayo del
soporte en fase sólida corriente arriba del punto de ensayo (por
ejemplo dicha primera zona o la zona del trazador que se describirá
más adelante). El componente de E. coli no está limitado
específicamente a condición de que proceda de Escherichia
coli como se mencionó anteriormente. De este modo, puede ser la
fracción proteica, la fracción de hidratos de carbono o la fracción
lipídica de las células o una mezcla de dichas fracciones. Como
ejemplo preferido pueden mencionarse la fracción soluble obtenida
por extracción de las células o la fracción de lipopolisacárido
(LPS).
A medida que la muestra se aplica a la primera
zona, la muestra migra, por acción capilar, a la segunda zona donde
el anticuerpo diana en la muestra se une y se fija al punto de
ensayo en la segunda zona y, a continuación, el anticuerpo
arbitrario restante (inclusive el residuo del anticuerpo diana que
no se ha unido al punto de ensayo) se une y se fija al punto de
referencia corriente abajo del punto de ensayo.
\newpage
El medio de marcado en la presente invención se
utiliza para detectar si el anticuerpo diana y el anticuerpo
arbitrario en la muestra se han acoplado y fijado a dicho punto de
ensayo y al punto de referencia, respectivamente.
El medio de marcado puede consistir en un
ligando para el anticuerpo y un marcador detectable acoplado a dicho
ligando.
El ligando para el anticuerpo no está
particularmente limitado con el fin de que sea una molécula que
reconozca y se una al anticuerpo presente en la muestra pero, en la
presente invención, es preferentemente el que se une no solamente
al anticuerpo diana que se ha de analizar sino también el anticuerpo
arbitrario presente en la muestra. Como ejemplo de dicho ligando,
puede mencionarse el mismo ligando que el mencionado para el punto
de referencia, específicamente el mismo anticuerpo
antiinmunoglobulina adoptado como ligando en el punto de
referencia.
El anticuerpo antiinmunoglobulina mencionado
anteriormente incluye antisueros disponibles en animales arbitrarios
inmunizados con una inmunoglobulina apropiada, por ejemplo, una
inmunoglobulina humana, como el inmunógeno, productos de
purificación de la misma (anticuerpos policlonales) y anticuerpos
monoclonales.
El anticuerpo antiinmunoglobulina como ligando
en el punto de referencia puede opcionalmente ser un anticuerpo
dirigido a todas las clases de anticuerpos de modo que puede
capturar y detectar el anticuerpo completo en la muestra o ser un
anticuerpo dirigido contra una clase deseada de anticuerpo tal como
la inmunoglobulina G (IgG). Preferentemente, el ligando es un
anticuerpo antiinmunoglobulina dirigido contra anticuerpos en la
misma clase como la clase a la que pertenece el anticuerpo diana y
se prefiere esta disposición en la que como anticuerpos de la misma
clase como anticuerpo diana detectados de este modo en el punto de
referencia, se obtiene la indicación óptima para interpretar si el
análisis ha sido realizado de manera apropiada no solamente cuando
se utiliza una muestra de orina sino cuando se utilizan como
muestras otros fluidos corporales tales como el suero.
Cuando el anticuerpo diana es IgG, el ligando
tal como dicho medio de marcado es más preferentemente un ligando
caracterizado porque tiene una afinidad específica para la zona Fc
de la IgG del anticuerpo y, como ejemplos preferidos de dicho
ligando, pueden mencionarse un anticuerpo anti-IgG
específico para Fc que no es reactivo con la cadena ligera de la
IgG del anticuerpo o la zona F(ab) del mismo o una proteína
A, proteína G o similares con reactividad específica para la zona
Fc de la IgG del anticuerpo. Dichos anticuerpos o ligandos de
antiinmunoglobulina pueden prepararse de manera rutinaria o
adquirirse en proveedores comerciales.
El componente de marcado detectable no está
específicamente limitado siempre que sea un marcador detectable que
es conocido por ser útil para ensayos de fijación específica,
particularmente inmunoanálisis, o que se utilice posiblemente en el
futuro [Tatsuo Iwasaki et al.: Monoclonal Antibody, Kodansha
Scientific, 1984; Eiji Ishikawa et al.: Enzyme Immunoassay,
2ª edición, Igaku Shoin, 1982, etc.].
El marcador preferido es el que experimenta
cambio de color en el punto de ensayo o en el punto de referencia
de la segunda zona. Aunque no está limitado, se prefiere
particularmente un marcador que experimenta un cambio de color que
puede reconocerse a simple vista sin ayuda de ningún instrumento.
Por ejemplo, pueden mencionarse varios cromógenos tales como
sustancias fluorescentes y colorantes absorbentes. El aún más
preferido es un marcador en forma de polvo que contiene un marcador
detectable a simple vista.
El marcador en partículas adecuado incluye
partículas de polímero (por ejemplo látex o perlas de poliestireno),
bolsas, liposomas, geles metálicos (por ejemplo plata coloidal, oro
coloidal, etc.), y partículas de colorante de poliestireno. Entre
ellos, se prefieren los geles metálicos tales como la plata coloidal
y el oro coloidal.
Aunque dicho marcador puede estar acoplado a un
ligando, ya sea química o físicamente, de manera convencional para
proporcionar un ligando marcado, pueden utilizarse también productos
comerciales.
Los medios de marcado que pueden utilizarse en
la presente invención pueden ser cualquier marcador que, cuando se
aplica a la segunda zona (inclusive del punto de ensayo o del punto
de referencia) del soporte en fase sólida, indica el resultado de
la reacción con el anticuerpo que se produce en la muestra que ha
tenido lugar en la segunda zona y, siempre que esta función pueda
conseguirse, no existe ninguna limitación específica sobre el modo
de su presencia. Por ejemplo, cuando el dispositivo de ensayo de la
presente invención se proporciona en forma de un flujo a través del
dispositivo, los medios de marcado pueden incluirse en el kit de
reactivo de ensayo del anticuerpo independientemente del soporte en
fase sólida.
Preferentemente, el medio de marcado está
inmovilizado de forma separable sobre un soporte en fase sólida, y
más preferentemente está inmovilizado de forma separable corriente
arriba de la segunda zona del soporte en fase sólida. El modo aún
más preferido es tal que el medio de marcado está soportado en una
zona (denominada en adelante zona del trazador) intermedia entre la
primera y segunda zonas del soporte en fase sólida. En este modo de
utilización, la muestra aplicada a la primera zona asciende por
acción capilar a la zona del trazador donde se pone en contacto con
el ligando marcado para formar el complejo anticuerpo diana/ligando
marcado y el complejo anticuerpo arbitrario/ligando marcado. Después
del paso a través de la zona del trazador, la muestra que contiene
los complejos migra, por acción capilar, además a la segunda zona.
El ligando (antígeno) colocado en el punto de ensayo dentro de la
segunda zona es específico para el anticuerpo diana y el ligando
(anticuerpo antiinmunoglobulina) colocado en el punto de referencia
es específico para el anticuerpo arbitrario. Por consiguiente, el
complejo anticuerpo diana/ligando marcado que ha migrado por acción
capilar es capturado en primer lugar en el punto de ensayo y el
complejo restante anticuerpo arbitrario/ligando arbitrario
(inclusive del complejo anticuerpo diana/ligando marcado) en la
muestra se captura a continuación en el punto de referencia.
La zona del trazador del soporte en fase sólida
no está particularmente limitada siempre que sea un soporte capaz
de transportar la muestra de ensayo que contiene el anticuerpo diana
y el anticuerpo arbitrario desde la primera zona a la segunda zona
y que soporta dicho ligando marcado de manera que este último pueda
liberarse mediante el flujo capilar. Generalmente, es un elemento
poroso de polietileno, fibra de vidrio, rayón, nilón o un material
celulósico inclusive de papel. El material preferido es un material
que apenas permite la adsorción inespecífica, por ejemplo fibra de
vidrio tratada opcionalmente con alcohol polivinílico (PVA).
Entre las formas de realización preferidas de la
invención existe una forma de realización en la que dicha zona
trazadora y dicho punto de ensayo en la segunda zona están colocados
en un intervalo dado entre éstas sobre un soporte en fase sólida.
Como tal se proporciona una zona de intervalo entre la zona del
trazador y el punto de ensayo, el anticuerpo en la muestra que se
pone en contacto con el ligando marcado en la zona del trazador se
mezcla con el ligando marcado antes de que la muestra alcance el
punto de ensayo en la segunda zona, con lo cual se asegura de
manera más positiva la reacción de acoplamiento entre el anticuerpo
y el ligando marcado. De este modo, esta zona proporciona un medio
de incubación (tiempo y espacio) para el acoplamiento del
anticuerpo diana y del anticuerpo arbitrario con los ligandos
marcados antes del contacto del anticuerpo diana y del anticuerpo
arbitrario en la muestra con el punto de ensayo y el punto de
referencia, respectivamente.
Además, el soporte en fase sólida de la presente
invención puede presentar una tercera zona corriente abajo de la
segunda zona.
La muestra continúa migrando desde la primera
zona a la zona del trazador opcional a la segunda zona y además a
la tercera zona por acción capilar. De este modo, la tercera zona
funciona como zona que recibe el líquido que procede de la segunda
zona por acción capilar.
Generalmente la tercera zona necesita solamente
descargar la función de recibir el componente líquido no unido a la
segunda zona pero puede proporcionarse además con un punto
informativo de la terminación del análisis de antemano al flujo
capilar de la muestra (que es el frente líquido) para una zona de
punto final predeterminada sobre el soporte en fase sólida.
Con el objetivo anterior, el soporte en fase
sólida puede proporcionarse con una zona indicadora visible que
contiene un colorante soluble en agua tal como la eritrosina B,
safranina O, rojo de fenol o similares corriente abajo de la
segunda zona. En este caso, como el frente líquido de la muestra
atraviesa la segunda zona en la tercera zona, circula a través de
dicha zona indicadora y el colorante colocado en esta zona es
transportado corriente abajo por el flujo capilar de la muestra
(líquido), informando de este modo que la muestra ha pasado ya en
serie a través de la primera zona, la zona del trazador y la segunda
zona (puntos de ensayo y de referencia) y por consiguiente que el
análisis se acaba de terminar.
El material para la tercera zona no está
limitado específicamente siempre que sea capaz de absorber la
muestra (líquido), incluyendo de este modo películas porosas u
hojas de polietileno, rayón, nilón y materiales celulósicos
inclusive de papel. El material preferido es el material celulósico
tal como el papel.
La presente invención se describe en detalle a
continuación, haciendo referencia a los dibujos adjuntos que
muestran el dispositivo de análisis del anticuerpo y sus elementos
constituyentes. Sin embargo, debe entenderse que el dispositivo
ilustrado es únicamente una forma de realización de la invención y
no medios definitivos de la invención.
La Fig. 1 es un diagrama que presenta un soporte
en fase sólida en forma de una tira (60 \times 5 mm) como
elemento del dispositivo de la invención. En la Fig. 1, el código 1
representa una primera zona (16 \times 5 mm, 0,92 mm de espesor)
en la que se aplica una muestra de ensayo y se pone en contacto con
la tira; el código 2 representa una zona del trazador (5 \times 5
mm, 0,79 mm de espesor) en la que está inmovilizado un ligando
marcado (por ejemplo anticuerpo IgG humano marcado con oro
coloidal); el código 3 representa una segunda zona (18 mm \times
5 mm, 0,1 mm de espesor) en la tiene lugar que la reacción con el
anticuerpo en la muestra y se indica el resultado; y el código 4
representa una tercera zona (22 \times 5 mm, 1,46 mm de espesor)
en la que se absorbe la muestra que ha migrado desde la primera zona
y la segunda zona.
El espesor de la primera zona es generalmente
0,2\sim2 mm y preferentemente 0,8\sim1,2 mm, y el espesor de la
zona del trazador es generalmente 0,2\sim1,5 mm y preferentemente
0,5\sim1 mm. El espesor de la segunda zona es generalmente de
0,03\sim0,2 mm y preferentemente 0,08\sim0,12 mm, y el espesor
de la tercera zona es generalmente 0,5\sim3 mm y preferentemente
1\sim2 mm. Sin embargo estos intervalos no son críticos.
Dentro de dicha segunda zona (3) está colocado
un punto de ensayo (línea de ensayo, aproximadamente 1 \times 5
mm) (5) donde un ligando que tiene una afinidad específica para el
anticuerpo diana está soportado en posición y punto de referencia
(línea de referencia, aproximadamente 1 \times 5 mm) (6) donde un
ligando que tiene afinidad para el anticuerpo arbitrario
(anticuerpo de inmunoglobulina antihumano) está soportado en
posición. El punto de ensayo (5) está colocado a una distancia dada
(aproximadamente 6 mm) de la zona del trazador y el punto de
referencia (6) está colocado a una distancia dada (aproximadamente 6
mm) del punto de ensayo (5). El punto de ensayo tiene la función de
reaccionar específicamente con el anticuerpo diana en la muestra e
indicar la presencia de un marcador si existe el anticuerpo diana o
no en la muestra y el punto de referencia tiene la función de
indicar la presencia de un marcador si la muestra aplicada es
apropiada o no.
Los materiales (soportes) para la primera zona,
zona del trazador, segunda zona y tercera zona que constituyen la
tira de soporte en fase sólida pueden haber sido simplemente
conectados en serie en la dirección longitudinal de la tira a lo
largo de la cual la muestra migra y no existe ninguna restricción al
modo de conexión. Preferentemente, sin embargo, la conexión entre
el extremo del frente longitudinal de la primera zona y el extremo
posterior de la zona del trazador, la conexión entre el extremo del
frente de la zona del trazador y el extremo posterior de la segunda
zona, y la conexión entre el extremo del frente de la segunda zona y
el extremo posterior de la primera zona están respectivamente en
relación superpuesta. Más preferentemente, como se ilustra en la
Fig. 1, la parte del extremo del frente longitudinal de la primera
zona se superpone sobre la parte del extremo posterior de la zona
del trazador y la parte del extremo del frente longitudinal de la
zona del trazador se superpone en la parte del extremo posterior de
la segunda zona. La parte del extremo posterior de la tercera zona
puede superponerse sobre la parte del extremo del frente de la
segunda zona. En dicho modo de conexión, la muestra aplicada a la
primera zona se deja que migre suavemente en la dirección
longitudinal de la tira. La profundidad de la tira en su dirección
longitudinal no está particularmente limitada pero puede ser por
ejemplo de 0,5\sim10 mm, preferentemente de 1\sim2 mm, más
preferentemente de 0,8\sim1,2 mm. Debe entenderse que las
relaciones parte superior-parte inferior de las
zonas respectivas en la estructura de la tira superpuesta no están
limitadas a las mencionadas anteriormente pero pueden
invertirse.
Por conveniencia en la utilización, el soporte
en fase sólida anterior se envasa preferentemente en forma de una
unidad de ensayo.
El principio del ensayo con el dispositivo de
ensayo de la invención no se explica con relación a la Fig. 2.
El tercer aspecto de la invención se refiere a
un procedimiento de ensayo en fase sólida que utiliza el dispositivo
descrito anteriormente, que específicamente es un procedimiento en
fase sólida para análisis del anticuerpo diana en una muestra que
comprende poner la muestra en contacto con la primera zona del
dispositivo de ensayo del anticuerpo y detectar el desarrollo de un
color en el punto de ensayo de la segunda zona con la condición de
que el punto de referencia de la segunda zona está indicando un
color.
En este análisis, una muestra que se sospecha
que contiene el anticuerpo diana se aplica en primer lugar a la
primera zona (1) del soporte en fase sólida.
Para la aplicación de la muestra, puede
utilizarse un fluido corporal tal como orina como está o tras la
dilución con un diluyente adecuado. El diluyente no está
particularmente limitado pero incluye varios tampones con una
acción tampón dentro del intervalo de pH aproximadamente 5\sim9,
preferentemente apropiado 6,5\sim8,5, (por ejemplo tampón
citrato, tampón fosfato, tampón tris, tampón acetato, tampón borato,
etc.), tensioactivos, etc.
Ya que las reacciones no específicas en la
reacción antígeno-anticuerpo pueden suprimirse para
reducir la frecuencia de un análisis con falso positivo realizando
la reacción antígeno-anticuerpo en presencia de un
componente de E. coli, resulta preferido utilizar un
diluyente que contenga dicho componente de E. coli. La
cantidad de componente de E. coli (LPS) que ha de
incorporarse en el diluyente no está específicamente limitada pero
preferentemente es tal que aproximadamente de 0,1\sim10 \mug,
preferentemente de aproximadamente 0,5\sim5 \mug de dicho
componente, estará disponible por \mug del ligando (antígeno) en
el sistema de reacción, es decir, el punto de ensayo.
La cantidad de componente de E. coli
(LPS) que ha de incorporarse en la muestra deber ser por ejemplo
generalmente no inferior a 5 \mug/ml, preferentemente de
5\sim100 \mug/ml, más preferentemente de 10\sim50 \mug/ml.
Aunque la utilización de una cantidad superior a 100 \mug/ml no es
prohibitiva, el efecto de la inferior puede realizarse al nivel de
adición de hasta 100 \mug/ml.
A medida que se aplica la muestra a la primera
zona (1), se humedece la primera zona 1. La muestra aplicada
circula a través de la primera zona (1) en la zona del trazador (2)
por acción capilar y se pone en contacto y reacciona con el ligando
marcado (anticuerpo IgG antihumano marcado con oro coloidal)
soportado de forma separable en la zona del trazador.
Cuando se utiliza una muestra adecuada y el
anticuerpo diana está contenido en la muestra, tanto el anticuerpo
diana como el anticuerpo arbitrario contenido en la muestra se
acoplan a dicho ligando marcado en la zona del trazador (2) para
formar un complejo anticuerpo diana, ligando marcado y el complejo
anticuerpo arbitrario/ligando marcado, respectivamente. Después del
paso del mismo a través de la zona del trazador (2), los complejos
respectivos o el ligando marcado que no forman dichos complejos se
transportan junto con la muestra corriente abajo de la zona del
trazador (2). En un modo preferido, el ligando marcado que no forma
un complejo todavía se da un tiempo suficiente (espacio) para
formar complejos a medida que se desplaza con la muestra que
contiene el anticuerpo desde la zona del trazador (2) al punto de
ensayo (5) de la segunda zona (3) por acción capilar. A medida que
la muestra alcanza el punto de ensayo (5) en la segunda zona, el
complejo anticuerpo diana, ligando marcado en la muestra se acopla
al ligando soportado en el punto de ensayo (5) y se inmoviliza in
situ. La muestra migra además corriente abajo por acción
capilar para alcanzar el punto de referencia (6) donde el complejo
anticuerpo arbitrario/ligando marcado se acopla al ligando
(anticuerpo de inmunoglobulina antihumana) en este punto y se
inmoviliza ahí. Entonces, al detectar los complejos inmovilizados en
el punto de ensayo (5) y el punto de referencia (6) en la segunda
zona según el componente del marcador de ligando marcado, el
resultado del análisis puede indicarse como un ensayo positivo. En
cambio, cuando una muestra que no contiene el anticuerpo diana se
aplica, dicho complejo anticuerpo diana/ligando marcado que debe
inmovilizarse en el punto de ensayo (5) no se forma de modo que el
marcador no es detectado en este punto de ensayo (5) (ensayo
negativo).
En relación con esto, la indicación de ensayo
negativo en el punto de ensayo (5) incluye tanto una prueba
negativa (falso negativo) debido a una baja concentración de la
muestra (es decir una cantidad total pequeña de anticuerpo en la
muestra) y un ensayo negativo (verdadero negativo) debido a la
ausencia del anticuerpo diana en la muestra. Estos ensayos
negativos no pueden diferenciarse unos de otros según el resultado
en el punto de ensayo (5) solo. Sin embargo, en el caso de un
ensayo de falso negativo, dicho complejo de ligando anticuerpo
arbitrario/ligando marcado que debe inmovilizarse en el punto de
referencia (6) no se forma de modo que el punto de referencia da
una indicación negativa, mientras que en el caso de un ensayo de
verdadero negativo, se forma dicho complejo anticuerpo
arbitrario/ligando marcado de modo que el punto de referencia da
una indicación positiva. Por consiguiente, en función de si la
indicación en el punto de referencia sea negativa o positiva, es
posible decir si el resultado negativo en el punto de ensayo (5) es
un ensayo de falso negativo o un ensayo de verdadero negativo.
Además, cuando se utiliza un ligando marcado que ha sido desactivado
u otro ensayo apropiado no se realiza en un sistema apropiado, el
punto de referencia (6) da una indicación negativa de modo que puede
evitarse el descubrimiento de un ensayo de falso negativo debido a
dichas causas.
El líquido de la muestra que contiene todos los
anticuerpos no unidos, los ligandos marcados, etc. continúa hasta
migrar más corriente abajo de la segunda zona (3) hasta la tercera
zona (4). Opcionalmente, puede proporcionarse una zona indicadora
y, en este caso, el frente líquido transporta el colorante desde la
zona del indicador a la zona del punto final, indicando de este
modo el paso del líquido y del colorante a través de una tercera
zona y la terminación del ensayo.
La Fig. 3 presenta un ejemplo del dispositivo de
análisis del anticuerpo de la invención para su utilización en
posición horizontal. El soporte en fase sólida (A) que comprende la
primera zona (1), la zona del trazador (2), la segunda zona (3)
(incluyendo el punto de ensayo (5) y el punto de referencia (6) y
una tercera zona (4) se aloja en un alojamiento (B) hecho de un
material adecuado. El material del alojamiento es preferentemente
un material plástico moldeable tal como poliestireno, aunque pueden
utilizarse también otros materiales tales como vidrio, metal y
papel. El alojamiento aloja una sección superior (7) que presenta
varias aberturas y una sección inferior (8), y el soporte en fase
sólida está dispuesto sobre la sección inferior del alojamiento y
se cubre con la sección superior en la parte superior del mismo. Las
aberturas (9) y (10) en la sección superior del alojamiento están
colocadas en alineación con la serie de zonas del soporte en fase
sólida y en las posiciones correspondientes a la primera zona (1) y
segunda zona (3), respectivamente, del soporte en fase sólida.
La muestra puede aplicarse a la primera zona (1)
del soporte desde la abertura (9) (orificio de alimentación de la
muestra). La abertura (9) está preferentemente provista de una pared
periférica de proyección alrededor de ella de modo que la pared
puede ayudar al escurrimiento de la muestra líquida en la primera
zona del soporte. El procedimiento para poner en contacto la
muestra con la primera zona del soporte en fase sólida no está
particularmente limitado pero la muestra gotea preferentemente desde
dicho orificio de alimentación de la muestra perpendicularmente al
plano del soporte en fase sólida.
La abertura (10) se coloca en una posición que
permite un acceso visual a los puntos de ensayo y referencia en la
segunda zona del soporte en fase sólida, con lo que la fijación del
complejo ligando marcado/anticuerpo diana en el punto de ensayo y
el del complejo ligando marcado/anticuerpo arbitrario en el punto de
referencia, puede confirmarse a simple vista (orificio de
detección, orificio de evaluación). La abertura (10) no necesita
necesariamente ser un orificio único que permita un acceso visual a
tanto el punto de ensayo como el punto de referencia sino que puede
comprender dos orificios independientes para el punto de ensayo y el
punto de referencia, respectivamente.
Con el dispositivo de análisis del anticuerpo de
la presente invención, la presencia o ausencia del anticuerpo diana
en una muestra así como la cantidad de anticuerpo pueden
determinarse con gran precisión dejando el sistema analítico en
reposo durante unos pocos minutos hasta 30 minutos, preferentemente
de 5\sim20 minutos, después de la aplicación de la muestra,
generalmente a una temperatura no superior a 45ºC, preferentemente
de 4\sim40ºC, más preferentemente de 15\sim30ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de análisis de anticuerpos
descrito en (1) o el método de análisis en fase sólida que utilizan
el dispositivo de ensayo de anticuerpos descrito en (2) puede
realizarse de manera más conveniente cuando se utiliza el kit del
reactivo del ensayo de anticuerpos que contiene una serie completa
de varios reactivos y el equipo necesario para la determinación del
anticuerpo.
La presente invención, de este modo, proporciona
un kit de reactivo para el análisis de anticuerpos destinado de
reducir a la práctica dicho método de análisis de anticuerpos y
dicho método de análisis en fase sólida.
El kit con reactivo para análisis de anticuerpos
según la presente invención se propone para su utilización con
objeto de detectar y cuantificar un anticuerpo en una muestra
mediante una reacción de antígeno-anticuerpo e,
incluye un kit que contiene dicho componente de E. coli como
componente del kit. Este kit del reactivo comprende además un
antígeno inmovilizado opcionalmente adaptado para experimentar la
reacción antígeno-anticuerpo con un anticuerpo
diana que debe analizarse, un reactivo de análisis del anticuerpo y
así sucesivamente. Además, por conveniencia en el análisis, este
kit de reactivo puede incluir además un medio de reacción adecuado,
diluyente, tampón de cera, terminador de la reacción y/o reactivo de
ensayo de actividad del marcador.
Además, como otro modo, el kit del reactivo de
análisis del anticuerpo de la invención puede incluir también un
reactivo que presenta afinidad específica para la zona Fc del
anticuerpo IgG diana, preferentemente un anticuerpo
anti-IgG específico para Fc.
Como un modo alternativo más, el kit del
reactivo de análisis de anticuerpos de la invención puede contener
dicho dispositivo para análisis del anticuerpo. El kit reactivo
contiene además dicho componente de E. coli y opcionalmente
dicha sustancia con afinidad específica para la zona Fc del IgG del
anticuerpo diana. Además, el kit puede contener además accesorios
tales como una pipeta y una ampolla (tubo) para su utilización en
la dilución de la muestra además de dicho medio de reacción,
diluyente, tampón de lavado, terminador de la reacción y el
reactivo de análisis de actividad del marcador, entre otros
reactivos.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar la presente invención con mayor detalle y no debe
considerarse que definen el alcance técnico de la invención. Debe
apreciarse que los expertos en la materia pueden introducir
fácilmente muchos cambios y modificaciones basándose en la
descripción anterior de la invención sin apartarse del alcance
técnico de la invención.
Se cultivó H. pylori (una cepa clínica)
en medio de agar-agar de Brucella (Becton) durante
48 horas (10% de CO_{2}, 5% de O_{2}, 37ºC) y se recogieron las
células del cultivo en PBS frío. Se lavaron las células con
centrifugación con PBS en frío durante un total de 5 veces, y se
añadió PBS frío con objeto de hacer una concentración celular de
100 mg/ml. Se añadió en agitación, un equivalente de Triton
X-100 al 0,2% frío/PBS. Se agitó y se centrifugó la
mezcla durante 5 minutos y el sobrenadante se recuperó como solución
del antígeno de H. pylori y se almacenó a -80ºC.
La anterior solución de antígeno de H.
pylori (2,5 \mug de proteína/ml) se añadió a una placa de 96
pocillos, 100 \mul/pocillo y se incubó a 4ºC durante la noche. Una
vez lavados los pocillos con PBS una vez, se añadió una solución de
bloqueo (Dulbecco, PBS [D-PBS], 1% de BSA, 5% de
sorbitol, 0,05% de NaN_{3} [pH 7,4]), 300 \mul/pocillo y la
placa se incubó a 4ºC durante la noche. Una vez que la solución de
bloqueo descartada, se secó la placa a 25ºC durante la noche, se
selló junto con un desecante en una bolsa de aluminio y se almacenó
a 4ºC hasta su utilización.
Se cultivó Escherichia coli (pvc18/JM109,
Takara Shuzo) en medio LB líquido que contiene ampicilina (medio
Luria-Bertani, Nippon Seiyaku) a 37ºC durante 18
horas. Se centrifugó el cultivo para recoger las células, que se
lavaron con 2 fracciones de PBS. A las células lavadas se añadió PBS
frío para preparar 100 mg/ml, y la mezcla se descompuso y se
extrajo con un equipo de ultrasonidos (10 segundos \times 3). Se
recuperó el sobrenadante para su utilización como componente de
E. coli y se almacenó a -80ºC (denominado en adelante
extracto de E. coli).
Utilizando orina como muestra, se determinó el
anticuerpo anti-H. pylori en la muestra.
A cada pocillo de la placa del antígeno de H.
pylori preparada en (2), se añadieron 25 \mul de una primera
solución del tampón (tampón Tris-HCl 200 mM, NaCl
0,14 M, 2% de caseína, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 0,1% de
NaN_{3} [pH 7,3]) que contienen 20 \mug de proteína/ml del
extracto de E. coli y 100 \mul de la muestra de orina. Se
agitó la mezcla durante 10 segundos y se dejó reposar a 37ºC durante
1 hora. Se lavaron los pocillos con 6 porciones de PBST (0,05% de
Tween 20 y 0,05% de NaN_{3} en PBS) y se añadieron 100
\mul de una dilución de 11.000 veces de un anticuerpo IgG
antihumano marcado con enzima (HRP) (IgG antihumano de cabra pura
conjugada por afinidad con peroxidasa (Fc), Jackson Immuno Research)
en un segundo tampón (tampón Tris-HCl 50 mM, NaCl
0,14 M, 0,5% de BSA, 5% de suero de cabra, 0,05% de Tween 20, 0,1%
de XL-II [pH 7,3]). Se dejó reposar la placa a 37ºC
durante 1 hora y, a continuación, se lavó con 6 fracciones de
PBST.
A continuación, se añadieron 100 \mul de una
solución de revelador de color (citrato 50
mM-Na_{2}HPO_{4}, 50% de solución TMB, 0,0075%
de H_{2}O_{2}) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente
durante 20 minutos, al final de cuyo periodo se añadieron 100
\mul de un interruptor de la reacción (50% de solución de
interrupción TMB, 50% de H_{2}SO_{4} 1 N) se añadió y se midió
la absorbancia.
(i) En 5 casos de los casos positivos a H.
pylori y el mismo número de casos negativos a H. pylori
diagnosticados por el ensayo ^{13}C-UBT [J.
Gastroenterol., 33, págs. 6-13, (1998)]
que se considera el más exacta de todos los procedimientos de
diagnóstico actualmente disponibles para la infección por H.
pylori, se tomaron muestras de orina y se analizó el anticuerpo
anti-H. pylori en la orina por el procedimiento descrito en
(4).
Como experimento de referencia, se aplicó el
mismo procedimiento para las mismas muestras de orina excepto que
se omitió la adición del extracto de E. coli y, basándose en
los resultados, se evaluó el efecto de la adición de un extracto de
E. coli según la invención.
En la Fig. 4 se presentan los datos.
En la Fig. 4, la ordenada representa la
absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa la
adición (+) o la omisión (-) del extracto de E. coli.
Además, los círculos blancos representan los resultados en las
muestras de orina de los pacientes positivos a H. pylori por
el ensayo ^{13}C-UBT y los círculos negros
representan los resultados en las muestras de orina de los pacientes
negativos a H. pylori por el ensayo de
^{13}C-UBT.
Resulta evidente a partir de la Fig. 4 que al
realizar los análisis en presencia de un extracto de E. coli
según la presente invención, los casos positivos y negativos a H.
pylori podrían discriminarse claramente de acuerdo con los
resultados del ensayo ^{13}C-UBT, apoyando la gran
precisión del procedimiento de la invención.
(ii) Utilizando muestras de orina de 99
voluntarios sanos que no tienen antecedentes de un tratamiento de
erradicación contra H. pylori y 20 pacientes con enfermedad
estomacal (7 casos de úlcera gástrica y 13 casos de gastritis), se
ensayó el anticuerpo urinario anti-H. pylori en presencia del
extracto de E. coli según el procedimiento descrito en (4).
Los resultados se presentan en la Fig. 5. En la Fig. 5, la ordenada
representa la absorbancia (D.O. 450 nm) y la abscisa representa los
grupos según el ensayo ^{13}C-UBt (casos
positivos y negativos). Los resultados indicaron que, en el sistema
de ensayo que contiene el extracto de E. coli, todas las
muestras de orina de pacientes negativos dieron resultados
definitivamente negativos sin un resultado de falso positivo.
(iii) Las cantidades del anticuerpo anti-H.
pylori en sueros de los mismos pacientes inscritos en el
experimento (ii) se determinaron con kits comerciales de ELISA y
los resultados se compararon con los resultados de los ensayos en
orina por el procedimiento de la invención en los mismos pacientes
con respecto a la sensibilidad, especificidad y precisión. Las
muestras de suero y orina de cada paciente se recogieron
simultáneamente y se prepararon para los análisis.
Los kits comerciales de ELISA fueron los
siguientes: kit HM-CAP^{TM}, Enteric Products
(HM-CAP); kit Helico G^{TM}, Shield Diagnostic
(Helico G); y kit HEL-p Test^{TM}, Amrad Biotech
(HEL-p). Cada análisis se realizó de acuerdo con el
protocolo adjunto a cada kit. Los resultados se presentan en la
Tabla 1.
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Con relación a la Tabla 1, "Sensibilidad"
significa la proporción positiva generada con cada kit en los
pacientes positivos a H. pylori (positivos a la infección
según el ensayo ^{13}C-UBT: n=70),
"Especificidad" significa la proporción negativa genera con
cada kit en los pacientes negativos a H. pylori (negativos a
la infección según el ensayo ^{13}C-UBT: n= 49) y
"Precisión" significa el porcentaje de resultados exactos con
cada kit en la población total (70+49=119 pacientes).
Resulta evidente que a pesar de la utilización
de muestras de orina que contienen solamente trazas del anticuerpo,
la determinación del anticuerpo anti-H. pylori por el
procedimiento de la invención proporcionó mayor sensibilidad y
especificidad de la detección así como una precisión
significativamente mayor en comparación con los kits convencionales
de análisis del anticuerpo de la sangre.
Utilizando un primer tampón que contiene LPS de
E. coli (Difco) (concentración de LPS: 5 \mug/pocillo) en
lugar del extracto de E. coli, se repitió de otra manera el
procedimiento (4) para determinar el anticuerpo anti-H.
pylori en muestras de orina y los resultados se evaluaron de la
misma manera que en (5) (i). Los resultados se presentan en la Fig.
6. Resulta evidente a partir del diagrama que pueden obtenerse
resultados similares utilizando LPS de E. coli en lugar de
dicho extracto de E. coli.
Se preparó una placa de antígenos utilizando
antígeno HBc (Chemicon International) según el procedimiento del
Ejemplo 1 (2) y el análisis del anticuerpo antihepatitis B (núcleo)
(HBc) en muestras de orina se realizó según el Ejemplo 1 (4).
De este modo, se añadieron a cada pocillo de la
placa con antígeno HBc 25 \mul del primer tampón que contiene el
extracto de E. coli en una concentración variable y 100
\mul de orina de la muestra y después de agitación durante 10
segundos se dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora. Después
se lavó la placa con 6 porciones de PBST, 100 \mul de una
dilución de 11.000 veces de anticuerpo anti-IgG
humana marcado con enzima (HRP) en un segundo tampón se añadió y se
dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora y a continuación se
lavó (6 veces con PBST).
A continuación, se añadieron 100 \mul de una
solución de revelador de color y se llevó a cabo la reacción a
temperatura ambiente durante 20 minutos, tras los cuales se
añadieron 100 \mul de una solución para interrupción de la
reacción y se midió la absorbancia.
En 5 casos positivos y 5 negativos de anticuerpo
antihBc de sangre clasificados por los análisis que utilizan un kit
de análisis de anticuerpo antihBc comercial (Dinabott), se determinó
el anticuerpo antihBc en la orina por el procedimiento descrito en
(1).
Las concentraciones del extracto de E.
coli en las mezclas de la reacción se fijaron en 0, 0,78, 1,56,
3,13, 6,25 y 12,5 \mug/ml y se evaluó el efecto de la adición del
extracto. En la Fig. 7 se presentan los resultados.
En la Fig. 7, la ordenada representa la
absorbancia (D.O. 450\sim650) y la abscisa representa el nivel de
adición del extracto de E. coli. Además, los círculos negros
representan los datos sobre el anticuerpo urinario en pacientes con
anticuerpo antihBc de sangre positivo y los círculos blancos
representan los datos sobre el anticuerpo urinario en pacientes con
anticuerpo antihBc de sangre negativo. Resulta evidente a partir del
diagrama que aún cuando se utilicen muestras de orina, la
diferencia en el nivel de detección de anticuerpo antihBc entre el
grupo de pacientes con anticuerpo antihBc en sangre positivo y el
grupo de los que tienen anticuerpo antihBc en sangre negativo será
más destacado en relación con el nivel de adición del extracto de
E. coli.
Utilizando muestras de orina que dieron análisis
de falso positivo en la determinación del anticuerpo
anti-VIH en orina por un método de análisis
conocido [Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA: Arch.
Pathol. Lab. Med., 119, 139-141 (1995);
Clinical Infectious Diseases, 19, 1100-1104
(1994)], se realizó un experimento explorador para identificar el
compuesto supuestamente responsable de una reacción no específica en
el mismo sistema analítico.
(1) Cada una de las muestras de orina anteriores
se ajustó a pH 7,4 con tampón fosfato 1 M (pH 7,7) y se filtró a
través de filtros de corte de 5,0, 0,8 y 0,2 \mum. Una fracción de
20 ml del filtrado se concentró por ultrafiltración (una membrana
de corte de 10 kDa) hasta 2 ml. La orina concentrada se sometió a
cromatografía de permeación con gel (Sephacryl
S-300, Pharmacia) y en cada fracción se analizó su
reactividad al antígeno del VIH.
Se confirmó la reactividad al antígeno del VIH
dando lugar a que cada fracción reaccione con una placa inmovilizada
con antígeno del VIH preparada inmovilizando el antígeno del VIH
(gp160) y detectando el conjugado (componente de la unión
inespecífica) con el anticuerpo antihumano de cabra marcado con ALP
(IgG+IgM), anticuerpo IgG antihumano de cabra marcado con ALP
(específico para Fc) o anticuerpo IgG antihumano de cabra marcado
con HRP (específico para Fab) (disponibles todos en Jackson
ImmunoResearch Labs). Los resultados se presentan en la Fig. 8.
En la Fig. 8, la ordenada representa la
absorbancia (D.O) y la abscisa representa las fracciones
cromatográficas por permeación en gel (fracciones nº). La línea
negra representa la absorbancia de la proteína a 280 nm y la línea
de círculos negros representa el resultado de la detección con dicho
anticuerpo antihumano (IgG+IgM), la línea de triángulos blancos
representa el resultado de la detección con dicho anticuerpo IgG
antihumano (específico para Fc) y la línea de triángulos negros
representa el resultado de la detección con dicho anticuerpo IgG
antihumano (específico para Fab).
A partir de la Fig. 8 resulta evidente que en la
detección con el anticuerpo IgG antihumano (específico para Fab),
el modo de reacción (reactividad con el componente de la unión
inespecífica) es el mismo que en la detección con el anticuerpo
antihumano (IgG+IgM), aunque no se encuentra ninguna reactividad con
el anticuerpo IgG antihumano (específico para Fc). Este
descubrimiento sugería que el componente de la unión inespecífica es
un fragmento o producto de desnaturalización del IgG humano que
conserva la reactividad con el anticuerpo IgG antihumano (específico
para Fab) sin zona Fc.
Por consiguiente, resulta evidente que cuando se
utiliza un anticuerpo de la IgG antihumano (específico para Fc) no
reactivo con dicho componente de unión inespecífica como reactivo de
análisis, puede inhibirse la reacción no específica en el sistema
de detección del anticuerpo y, en consecuencia, la incidencia de un
análisis de falso positivo debida a dicha reacción no específica ,
con el resultado de que puede proporcionarse un método de análisis
del anticuerpo muy específico y muy preciso.
A cada pocillo de una placa con antígeno VIH
(Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA, Calypte BioMedical
Corp.), se añadieron 25 \mul del primer tampón (tampón de muestra
de Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA) y 200 \mul de
orina de la muestra y después de 10 segundos de agitación, se dejó
reposar la placa a 37ºC durante 1 hora. Después se lavó esta placa
6 veces (agua de lavado: D-PBS, Tween 20 al 0,05%),
se añadieron 100 \mul de una dilución de 11.000 veces de
anticuerpo (específico para Fc) de IgG antihumana de cabra marcado
con HRP ((IgG antihumana de cabra pura de Affini conjugada con
peroxidadsa, específica para el fragmento Fc, Jackson
ImmunoResearch Labs.) en el segundo tampón (tampón
Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,14 M, BSA al 0,5%, suero de
cabra al 5%, Tween 20 al 0,05%, XL-II al 0,1% (pH
7,3)) y se dejó reposar la placa a 37ºC durante 1 hora y se lavó (6
veces) de la misma manera que anteriormente.
A continuación se añadieron 100 \mul de un
revelador de color (solución TMB al 50%, citrato 50
mM-Na_{2}HPO_{4}, H_{2}O_{2} al 0,0075%) y
se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos, al
final de los cuales se añadieron 100 \mul de una solución de
interrupción de la reacción (interruptor TMB al 50%, 50% de
H_{2}SO_{4} 1 N) y se midió la absorbancia (D.O. 450 nm).
Como experimento de referencia, se analizó la
muestra por el método de análisis conocido [Calypte^{TM}
HIV-1 Urine EIA: Arch. Pathol. Lab. Med.,
119, 139-141 (1995); Clinical Infectious
Diseases, 19, 1100-1104 (1994)]
(procedimiento de referencia) utilizando el anticuerpo de
inmunoglobulina antihumano de cabra marcado con ALP como segundo
anticuerpo. Además, la referencia negativa y la referencia positiva
del kit de análisis anterior se midieron por el procedimiento
analítico anterior de la invención. Como los valores de la
absorbancia encontrados de este modo eran comparables a los
hallados con el kit anterior, el punto de corte por el método de la
invención se fijó en el valor hallado añadiendo 0,180 a la
absorbancia media de la referencia negativa anterior según el método
de cálculo de valor de corte del mismo kit.
Los resultados del análisis en 100 muestras
(orina) de pacientes con anticuerpo anti-VIH de
suero positivo (2 casos) y pacientes con anticuerpo
anti-VIH de suero negativo (98 casos) se presentan
en la Tabla 2.
- *:
- De estos 4 pacientes, 2 son pacientes con anticuerpo anti-VIH de suero positivo.
En la Tabla 2 puede apreciarse que aunque tanto
la sensibilidad del método de la invención como la del método de
referencia eran del 100% (2/2), la especificidad fue del 71,4%
(70/98) para el método de referencia frente al 98% (96/98) para el
método de la invención.
Los resultados anteriores indican que en
comparación con el método de referencia, el método de análisis del
anticuerpo de la invención es notablemente bajo en la frecuencia de
un análisis de falso positivo y muy alto en especificidad.
A una suspensión de 100 mg/ml de Helicobacter
pylori (cepa clínica) en Dulbecco-PBS frío
preparada de la forma rutinaria [J. Clin. Microbiol.,
29: 2587-2589 (1991)], se añadió un volumen
igual de solución fría de Triton-X al 0,2% en
agitación constante con un agitador y la mezcla se agitó más durante
5 minutos y se centrifugó (3.000 rpm, 20 min.). Se transfirió el
sobrenadante a un nuevo tubo para su utilización como extracto
(1\sim1,5 mg/ml como proteína).
Este extracto se diluyó con
D-PBS (2,5 \mug/ml) y la dilución se distribuyó en
una placa de 96 pocillos, 100 \mul por pocillo y se incubó a 25ºC
durante la noche. Una vez lavado cada pocillo, se añadieron 300
\mul de una solución de bloqueo (D-PBS, caseína al
0,5%, sorbitol al 5%, NaN_{3} al 0,05% (pH 7,4)), seguido de
incubación a 25ºC durante la noche. La solución de bloqueo se
descartó a continuación y se secó la placa a 25ºC durante la noche,
se secó junto con un desecante en una bolsa de aluminio y se guardó
a 4ºC hasta su utilización.
Utilizando el antígeno inmovilizado (placa)
preparado como anteriormente, se analizó el anticuerpo anti-H.
pylori en muestras de orina como en el Ejemplo 4.
De este modo, se añadieron a cada pocillo 25
\mul del primer tampón (tampón Tris-HCl 200 mM,
NaCl 0,14 M, caseína al 2%, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%,
NaN_{3} al 0,1%, 20 \mug/ml de extracto de E. coli (pH
7,3)) y 100 \mul de orina de la muestra y después de agitación
durante 10 segundos, se dejó en reposo la placa a 37ºC durante 1
hora y a continuación se lavó 6 veces. Exactamente como en el
Ejemplo 4, se añadieron 100 \mul de dicha dilución del anticuerpo
de IgG antihumano de cabra marcado con HRP (específico para Fc) en
el segundo tampón y se dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora
para detectar el anticuerpo. Los resultados obtenidos se presentan
en la Fig. 9 y en la Tabla 3.
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En la Fig. 9, la ordenada representa la
absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo
de infección por H. pylori positivo (+; n=56) y el grupo de
infección por H. pylori negativo (-; n=44) según el ensayo
^{13}C-UBT [J. Gastroenterol., 33: págs.
6-13 (1998)].
En la Tabla 3, "Sensibilidad" indica el
porcentaje de casos detectados como positivos entre los casos
positivos según el ensayo ^{13}C-UBT;
"Especificidad" indica el porcentaje de casos detectados como
negativos entre los casos negativos según el ensayo
^{13}C-UBT; y "Precisión" significa el
porcentaje de casos detectados como positivos y negativos,
respectivamente, entre los casos positivos y negativos según el
ensayo ^{13}C-UBT, las respectivas figuras
correspondiente al punto de corte de M+3SD o M+5SD. Como experimento
de referencia, se analizaron las mismas muestras de orina con un
kit de análisis del anticuerpo anti-H. pylori en el suero
[HM-CAP; EPI/Kyowa Medics (K.K.)] y los resultados
se tabularon también (método de referencia).
Los resultados anteriores indican que el
procedimiento de la invención es superior al método de referencia en
sensibilidad y precisión en concreto.
Utilizando un antígeno comercial de rubéola
[disponible en BIO-DESIGN] a una concentración de 1
\mug/ml y un agente de bloqueo compuesto por
D-PBS, BSA al 1%, sorbitol al 5% y NaN_{3} al
0,05% (pH 7,4), se repitió de otra manera el procedimiento del
Ejemplo 5 (1) para proporcionar una placa con antígenos de
rubéola.
Utilizando la placa con antígenos anterior, se
analizó el anticuerpo de la rubéola en muestras de orina de la misma
manera que en el Ejemplo 5 (2). Los resultados se presentan en la
Fig. 10 y en la Tabla 4.
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En la Fig. 10, la ordenada representa la
absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo
positivo al anticuerpo antirrubéola en el suero (n=76) y el grupo
negativo (n=23) según los resultados de la determinación con un kit
comercial (Rubella IgG (II)-EIA, SEIKEN; disponible
en Denka Seiken). Los datos proporcionados en la Tabla 4 indican un
acuerdo completo entre el resultado obtenido en la orina por el
procedimiento de la invención y el resultado obtenido en los sueros
por el procedimiento de referencia.
Según los datos anteriores, el grado de
coincidencia entre el procedimiento de la invención y el
procedimiento de control es tan elevado como el 100% (99/99),
indicando de este modo que la invención permite la detección del
anticuerpo con gran sensibilidad y gran especificidad aun en la
orina que es segura y conveniente y es, por consiguiente, de gran
utilización en el examen de laboratorio.
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Se preparó una solución del antígeno de H.
pylori por el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1) y se
guardó a -80ºC.
A una hoja de fibra de vidrio (espesor 5,0 mm
\times 260 mm \times 0,8 mm; Whatman) se le añadió 1 ml de una
solución del anticuerpo de IgG antihumano marcado con oro coloidal
de 40 nm (diámetro) (específico para Fc) y la hoja se secó durante
la noche. Esta hoja se almacenó junto con un desecante a temperatura
ambiente hasta su utilización.
La solución del antígeno de H. pylori (3
mg/ml) preparada en (1) anterior y la solución del anticuerpo de
IgG antihumano (0,3 mg/ml) se aplicaron respectivamente a una
membrana de nitrocelulosa (26,5 mm \times 260 mm \times espesor
de 0,1 mm; Advance MicroDevice) atomizando (1,5 \mul/cm) en líneas
a un espaciado predeterminado como se ilustra en la Fig. 11 y se
secó a 37ºC durante 120 minutos. Después del secado, la membrana se
sumergió y se lavó en un tampón de Borax que contenía crema de leche
(pH 8,2) durante 30 minutos. La membrana lavada se secó a 37ºC
durante 1 hora y se guardó en presencia de un desecante a
temperatura ambiente.
Como se ilustra en la Fig. 3 (A), la membrana
(3) anterior, se pegaron una almohadilla de papel de filtro
absorbente (4) (espesor 22 \times 260 mm \times 1,5 mm;
Whatman), dicha hoja de fibra de vidrio que contiene el anticuerpo
marcado (2) y una almohadilla de la muestra (1) (espesor 15 \times
260 mm \times 1,0 mm; papel de filtro, Whatman) junto con un
adhesivo y se cortaron en 5 mm de espesor.
El soporte en fase sólida de este modo se colocó
en posición en una sección del fondo (8) de un alojamiento plástico
y una sección superior (7) provista de un orificio de entrada de la
muestra (9) y una ventana de detección (10) en serie se colocó
sobre el soporte en fase sólida y se ajustó con seguridad en la
sección del fondo (8).
Utilizando el dispositivo construido en el
Ejemplo 7, se realizó el análisis del anticuerpo anti-H.
pylori en 3 tipos de muestras de orina, a saber muestras de
orina de pacientes con infección por H. pylori, muestras de
orina de pacientes sin infección de H. pylori y muestras
sumamente pobres de orina de pacientes con infección por H.
pylori.
En primer lugar, se añadieron 500 \mul de
orina de la muestra a 500 \mul de un diluyente de la muestra
[tampón Tris-HCl 200 mM, NaCl 0,14 M, caseína al 2%,
BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, NaN_{3} al 0,1% (pH 7,3), LPS 50
\mul/ml de E. coli (Difco)], seguido de mezclado. Se
añadieron seis gotas (aproximadamente 150 \mul) de la dilución
resultante desde el orificio de entrada para la muestra (9) del
dispositivo construido en el Ejemplo 7 para adsorción sobre el
soporte que se dejó a continuación reposar durante 20 minutos. Como
resultado, cuando se utilizó una muestra de orina calificada,
apareció una banda de color rosa \sim rojo en la zona de
referencia de la ventana de detección (10). Por otra parte, cuando
se utilizó una muestra de orina sin calificar extremadamente pobre,
ni la zona de ensayo ni la zona de referencia de la ventana de
detección (10) presentaban un desarrollo de color, lo que indica
que la muestra no era evaluable. Cuando la muestra era una muestra
de orina calificada de un paciente sin infección por H.
pylori, aparecía una banda de color rosa \sim rojo solamente
en la zona de referencia de la ventana de detección (10) que
presenta un análisis negativo (verdadero negativo) para la
infección por H. pylori, mientras que en presencia de
infección por H. pylori, aparecía una banda de color rosa
\sim rojo tanto en la zona de ensayo como en la zona de control
de la ventana de detección (10), que presenta un análisis positivo
para H. pylori.
Se cultivó Escherichia coli (pvc18/JM109;
Takara Shuzo) en medio LB líquido que contenía ampicilina (medio
Luria-Bertani; Nihon Seiyaku) a 37ºC durante 18
horas y las células cultivadas se recogieron por centrifugación y
se lavaron con 2 fracciones de PBS. A continuación, se añadió PBS
frío a una concentración final de células de 100 mg/ml y las
células se descompusieron y extrajeron utilizando un aparato de
ultrasonidos (10 segundos \times 3 veces). Se utilizó el
sobrenadante resultante como extracto proteico de E.
coli.
(2) Utilizando el extracto de proteínas de E.
coli preparado anterior (1) en lugar del LPS de E. coli
añadido al diluyente de la muestra en el Ejemplo 8, el procedimiento
del Ejemplo 8 se repitió de otra manera para determinar los
anticuerpos anti-H. pylori en muestras de orina. Como
resultado, se obtuvieron los mismos resultados que los descritos en
el Ejemplo 8.
Utilizando la referencia de la sangre completa,
la referencia del plasma y la orina de 21 pacientes positivos a la
infección por H. pylori y el mismo número de pacientes
negativos a la infección por H. pylori (un total de 42
casos) según el ensayo ^{13}C-UBT [J.
Gastroenterol., 33: 6-13 (1998)], se analizaron
los anticuerpos anti-H. pylori en las muestras por el
procedimiento descrito en el Ejemplo 8.
Como experimento de referencia, se analizaron
las muestras de los mismos pacientes respectivamente utilizando
kits para análisis del anticuerpo de H. pylori comercial
dirigidas a la sangre completa o al plasma y se evaluó la eficacia
del dispositivo de la invención a partir de los datos. Los
resultados se presentan en la Fig. 12.
En la Fig. 12, los kits de referencia A a H
fueron los siguientes.
- A:
- Helitest (fabricado por Cortecs Diagnostics)
- B:
- H. pylori-Check-1
- (fabricado por Bio-Medical Products)
- C:
- First Check H. pylori
- (fabricado por Worlwide Medical Corp)
- D:
- Biocard Helicobacter pylori IgG
- (fabricado por Anti Biotech Oy)
- E:
- Insta Test H. pylori
- (fabricado por Cortez Diagnostics Inc.)
- F:
- One Step H. pylori Test
- (fabricado por Teco Diagnostics)
- G:
- H. pylori SPOT
- (fabricado por International Immuno-Diagnostics)
- H:
- Quick Stripe H. pylori
- (fabricado por Diatech Diagnostics Inc.)
En la Fig. 12, "Especificidad" indica el
porcentaje de análisis negativos (proporción negativa) tal como se
encuentra analizando las muestras negativas por el análisis
^{13}C-UBT con el correspondiente kit y
"Sensibilidad" indica el porcentaje de análisis positivos
(proporción positiva) tal como se encuentra analizando las muestras
positivas por el análisis ^{13}C-UBT con el
correspondiente kit.
Resulta evidente a partir de los datos en la
Fig. 12 que el dispositivo de análisis de anticuerpos y el método
de análisis en fase sólida de la presente invención proporciona
sistemas de análisis excelentes con gran especificidad y precisión
de detección aun cuando se apliquen a muestras de orina, sin hablar
de muestras de sangre (sangre completa, plasma) a título de
referencia.
Resulta asimismo evidente a partir de los
resultados anteriores que aun cuando la muestra sea una muestra de
orina que es segura y conveniente, la presente invención permite
gran sensibilidad, gran especificidad de detección de anticuerpos,
siendo de este modo de gran utilidad en el examen de
laboratorio.
(1) El efecto de un componente de E. coli
sobre el análisis de anticuerpos en orina se evalúa utilizando el
dispositivo de análisis construido en el Ejemplo 8. De este modo,
utilizando la orina de pacientes positivos y negativos a la
infección por H. pylori seleccionados mediante el análisis
^{13}C-UBT, los anticuerpos anti-H. pylori
en muestras de orina se analizaron en un sistema utilizando un
diluyente de la muestra que no contiene LPS de E. coli
(diluyente 1) y sistemas que utilizan el mismo diluyente enriquecido
con LPS de E. coli a varias concentraciones mostradas en la
Tabla 5. El desarrollo del color de la línea en la zona de ensayo y
en la zona de referencia se evaluó a partir de la intensidad lineal
medida con un densitómetro (fabricado por ATTO). En la Tabla 5 se
presentan los resultados.
Se descubrió que cuando se añadía LPS de E.
coli a la muestra a 11,1 \mug/ml a concentraciones superiores,
la reacción no específica observada con el diluyente 1 desaparecía
de modo que un análisis de falso positivo (error de detección)
podría preverse.
La presente invención proporciona una tecnología
para análisis de anticuerpos mediante la que los anticuerpos diana
específicos para fuentes de infección pueden detectarse con gran
sensibilidad y gran especificidad aun cuando las muestras de orina
que son comparativamente pobres en anticuerpos se utilicen como
muestras de análisis. Según el método de análisis del anticuerpo de
la invención, las reacciones de "falso positivo" debidas a
contaminantes en muestras pueden inhibirse significativamente de
modo que pueden obtenerse resultados analíticos muy precisos y
fiables. Además, la presente invención proporciona mejoras en
inmunocapilaridad o análisis inmunocromatográficos, con lo cual la
existencia de anticuerpos diana y sus cantidades en muestras puede
detectarse con precisión con una clara distinción entre un "falso
negativo" y "verdadero negativo".
Claims (15)
-
\global\parskip0.900000\baselineskip
1. Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende:realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisisse realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno de análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir así las reacciones no específicas; yen el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno, o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química. - 2. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, en el que el componente de E. coli es por lo menos un elemento seleccionado de entre una fracción soluble y una fracción lipopolisacárida de E. coli.
- 3. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1 ó 2, en el que se inmoviliza dicho antígeno de análisis.
- 4. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra una fuente de infección seleccionada de entre el grupo constituido por un virus, una bacteria y un protozoo.
- 5. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra Helicobacter pylori.
- 6. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fuente de dicho antígeno de análisis se selecciona de entre virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, virus de la rubéola, virus de la gripe, virus del sarampión, virus del herpes, citomegalovirus, Clamydia, gonococos, Helicobacter pylori y Toxoplasma gondii.
- 7. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho antígeno de análisis se selecciona de entre una bacteria, un virus, un protozoo, un componente de una bacteria que comprende un grupo determinante antigénico de la bacteria, un componente de un virus que comprende un grupo determinante antigénico de un virus y un componente de un protozoo que comprende un grupo determinante antigénico de los protozoos.
- 8. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho antígeno de análisis es el Helicobacter pylori o un componente de Helicobacter pylori que comprende un grupo determinante antigénico de Helicobacter pylori.
- 9. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el componente de E. coli se selecciona de entre un componente proteico de E. coli, un componente de carbohidratos de E. coli, un componente lipídico de E. coli y una mezcla de los mismos.
- 10. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el inmunoanálisis se realiza mediante la técnica sándwich.
- 11. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el inmunoanálisis se realiza mediante la técnica sándwichy comprende una etapa de utilización de una sustancia que presenta afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana como reactivo de análisis del anticuerpo.
- 12. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 11, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.
- 13. Kit de reactivos, que comprende un antígeno de análisis para detectar el anticuerpo diana, un reactivo de análisis del anticuerpo y un componente de E. coli, para realizar el procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que se ha preparado artificialmente por síntesis química.
- 14. Kit de reactivos según la reivindicación 13, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es una sustancia que presenta una afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana.
- 15. Kit de reactivos según la reivindicación 14, en el que el reactivo para análisis de anticuerpos es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.
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