ES2306509T3 - Procedimiento para el analisis de anticuerpos y dispositivo para analisis de anticuerpos. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende: realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisis se realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno de análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir así las reacciones no específicas; y en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno, o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química.

Description

Procedimiento para el análisis de anticuerpos y dispositivo para análisis de anticuerpos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis en muestras de orina en el que dicho inmunoanálisis es útil, mediante el cual los anticuerpos contra fuentes de infección tales como bacterias y virus que se producen en muestras de fluidos corporales clínicas, en muestras de orina, pueden detectarse o analizarse con gran precisión, convenientemente, y con buena especificidad.

La invención se refiere además a un kit de reactivos para análisis de anticuerpos que resulta de utilidad para el procedimiento anterior.

Antecedentes de la técnica

La detección de anticuerpos específicos para varias fuentes de infección (patógenos) tales como bacterias y virus, que pueden producirse en los fluidos corporales, es un método indirecto útil para el diagnóstico de una infección. Por consiguiente, las técnicas de análisis inmunológico y los dispositivos concebidos para detectar un anticuerpo utilizando un patógeno o un componente del patógeno como antígeno para análisis se han utilizado hasta la actualidad en un amplio campo de diagnóstico.

Dicho procedimiento de inmunoanálisis que utiliza un patógeno o un componente del mismo como antígeno de análisis presenta ventajas porque el sistema analítico necesario puede ser creado fácilmente pero no es completamente satisfactorio en sensibilidad y especificidad, dejando de este modo espacio para la mejora.

Como dispositivo de inmunoanálisis para su utilización en dichos análisis inmunológicos, puede mencionarse una tira de material poroso en la que se realiza un ensayo de fijación (reacción antígeno-anticuerpo). Un dispositivo de análisis de este tipo aprovecha la propiedad capilar de un sustrato poroso, es decir que un fluido corporal aplicado a un extremo de una tira porosa migra hacia el otro extremo. De este modo, cuando una muestra de ensayo (líquida) que contiene una sustancia que debe analizarse se aplica a un extremo de la tira que lleva varios reactivos dispuestos sucesivamente en posiciones estratégicas, la muestra migra por acción capilar a lo largo de la tira y encuentra los reactivos en dichas posiciones en sucesión para experimentar las reacciones. La existencia de la sustancia que ha de analizarse puede confirmarse y su cantidad determinarse detectando una señal procedente del marcador detectable incluido en el sistema de acoplamiento ligando-receptor.

La técnica de inmunoanálisis que utiliza el principio anterior se denomina con frecuencia análisis inmunocapilar o análisis inmunocromatográfico y ha sido descrita en los documentos WO nº 87/02774, EP nº 0306772 y otras publicaciones. En cuanto a las modificaciones de la técnica, pueden mencionarse las invenciones descritas en la publicación de la patente japonesa sin examinar nº 63865/1989, de la publicación de la patente japonesa sin examinar nº 299464/1989 y de la publicación de la patente japonesa sin examinar nº 167497/1994.

El dispositivo mencionado anteriormente presenta ventajas porque no se requiere ningún instrumento específico para la determinación y el análisis puede completarse fácilmente y en un corto periodo pero tiene espacio para la mejora de la sensibilidad y de la especificidad.

Además, debido a que el dispositivo realiza solamente un análisis, una muestra de referencia negativo o positivo puede determinarse simultáneamente, con el inconveniente consiguiente de que es imposible interpretar si el resultado es un dato fiable generado por la propia determinación.

Generalmente hablando, la orina y la saliva, entre los fluidos corporales, resultan preferidas como muestras de análisis clínico porque su recogida no requiere ningún procedimiento invasivo y es fácil y seguro en comparación con la sangre.

Sin embargo, es habitual que las concentraciones de anticuerpos presentes en dichas muestras sean sumamente bajas, por ejemplo del orden de una milésima a una décima de milésima de las concentraciones en la sangre. Además, las muestras de orina recogidas de pacientes que han tomado grandes cantidades de agua son sumamente finas, con el resultado de una gran variación es inevitable en el valor de anticuerpo entre las muestras.

En dichos casos, con el dispositivo de análisis convencional descrito anteriormente, el análisis será negativo cuando la muestra sea demasiado fina para detectar un anticuerpo, de modo que el problema surge en el caso de "negativo cierto" no pueda diferenciarse del caso del "negativo (falso negativo)" ocasionado por la baja concentración de la muestra.

Además, cuando han de analizarse muestras escasas en anticuerpos, se requiere un sistema analítico muy sensible pero en este caso existe el problema de que los subproductos formados por reacciones no específicas debido a contaminantes en las muestras son susceptibles de detectarse simultáneamente para dar resultados de falso positivo.

A partir del documento JP-A-180837 se supo que podrían evitarse las señales inespecíficas mediante la adición anterior del lisado de E. coli para diluir sus muestras de suero humano para la detección de anticuerpos con el fin de neutralizar los anticuerpos de E. coli en el suero; el antígeno de D1 fue producido por técnicas de ADN recombinante utilizando anfitriones de E. coli y señales inespecíficas fueron producidas por una reacción específica entre una sustancia de E. coli contenida en el antígeno recombinante y un anticuerpo anti-E. coli contenido en el suero de la sangre humana.

A partir del documento WO-A-95/30902 se supo que con objeto de neutralizar reacciones no específicas debidas a otras proteínas contenidas en los lisados víricos o en las proteínas recombinantes que comprenden soluciones de antígeno utilizadas en el soporte sólido, una solución del lisado de linfocitos, por ejemplo solución de linfocitos T humanos o una solución de lisado de células anfitrionas tal como una solución de lisado de E. coli puede añadirse en concentraciones que oscilan específicamente entre aproximadamente 0,01% p/p y aproximadamente 10% p/p. De este modo, este documento da a conocer cómo neutralizar reacciones no específicas debidas a otras proteínas contenidas en las proteínas recombinantes preparadas utilizando un anfitrión de E. coli.

A partir del documento US A 5.120.662 se conoció un inmunoanálisis capaz de detectar simultáneamente cualquier número deseado de antígenos de un agente infeccioso o cualquier número deseado de inmunoglobulinas en un soporte sólido único. En este documento, una muestra de análisis se pone en contacto con un soporte sólido en el que uno o más antígenos se inmovilizan como puntos de análisis discretos. Este documento se cita con respecto a la función de un lisado de E. coli utilizado en la realización de un análisis.

El documento JP-A-5340947 da a conocer un inmunoanálisis que incluye la utilización de un anticuerpo específico para la parte Fc de otro anticuerpo incluido en el análisis.

A partir del documento DE-A-195 16 466 es conocido un análisis para la detección de un anticuerpo diana indicador de un agente infeccioso, por ejemplo anticuerpos anti-VIH. Los antígenos de VIH están recubiertos sobre un soporte sólido.

El documento WO-A-95/02822 da a conocer un dispositivo para la detección de anticuerpos indicador de un agente infeccioso, por ejemplo Helicobacter pylori.

Ninguno de los documentos anteriores da a conocer o sugiere la utilización de un componente de E. coli para suprimir una reacción no específica.

Por consiguiente, se requiere un sistema para análisis de anticuerpos que asegure suficientemente una gran sensibilidad de detección aun cuando se utilicen como muestras dichos fluidos corporales como la orina y la saliva, es decir un sistema de análisis fiable que contribuya a reducir cambios para análisis de falsos negativos y falsos positivos a causa de una gran especificidad.

El primer objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un procedimiento que permita determinaciones con gran precisión mediante la supresión de reacciones de "falso positivo" que surgen de los contaminantes en las muestras aun cuando las muestras sean las de orina que son comparativamente escasas en anticuerpos diana.

El segundo objetivo de la presente invención consiste en proporcionar dicho procedimiento como una mejora en el análisis inmunocapilar o en el análisis inmunocromatográfico, mediante el cual puede determinarse con precisión la existencia y cantidad del anticuerpo diana como objeto de detección en una muestra con una demarcación clara entre una "reacción de falso negativo" que surge de la naturaleza de la muestra y una reacción de "verdadero negativo".

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un diagrama que presenta un soporte en fase sólida en forma de una tira como elemento constituyente del dispositivo para análisis de anticuerpos de la invención. En la Fig. 1, el código 1 representa una primera zona, 2 una zona del trazador, 3 una segunda zona, 4 una tercera zona, 5 una zona de análisis y 6 una zona de referencia.

La Fig. 2 es un diagrama que ilustra el principio del análisis del anticuerpo diana en una muestra con el dispositivo para análisis del anticuerpo de la invención. Los códigos respectivos utilizados tienen los mismos significados que en la Fig. 1.

La Fig. 3 son diagramas específicos que presentan una tira de soporte en fase sólida (A) y un alojamiento (B) que adapta dicho soporte de la fase sólida incluido en el dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención. En la Fig. 3, los códigos 1\sim6 tienen los mismos significados que en la Fig. 1, y el código 7 representa una sección superior del alojamiento, 8 una sección inferior del mismo, 9 un orificio de entrada de la muestra y 10 una ventana de detección.

La Fig. 4 es una representación diagramática de los resultados de la determinación del anticuerpo anti-H. pylori en la orina en el Ejemplo 1 (5) (i). En la Fig. 4, los círculos blancos representan los datos en las muestras de orina de pacientes con infección por H. pylori que dan un análisis ^{13}C-UBT positivo y los círculos negros representan datos en las muestras de orina de pacientes que dieron un análisis ^{13}C-UBT negativo.

La Fig. 5 es una representación en diagrama de los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina determinados en el Ejemplo 1 (5) (ii). En la Fig. 5, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450 nm) y la abscisa representa los grupos positivos a H. pylori y negativos a H. pylori probados según el análisis ^{13}C-UBT.

La Fig. 6 es una representación en diagrama de los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina determinados en el Ejemplo 1 (6). En la Fig. 6, los círculos blancos representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un análisis ^{13}C-UBT positivo y los círculos negros representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un análisis ^{13}C-UBT negativo.

La Fig. 7 es una representación en diagrama de los datos sobre anticuerpo anti-H. pylori en la orina generados en el Ejemplo 2 (2). En la Fig. 7, los círculos negros representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un análisis positivo para el anticuerpo antihBc de la sangre y los círculos blancos representan datos sobre muestras de orina de pacientes que dieron un análisis negativo para el anticuerpo antihBc de la sangre.

La Fig. 8 es un diagrama que presenta cromatogramas de permeación de gel de muestras de orina que proporcionan reacciones de falso positivo en la determinación del anticuerpo anti-VIH en la orina y la reactividad del anticuerpo de cada fracción (Ejemplo 3 (1)). En la Fig. 8, la ordenada representa la absorbancia (D.O.) y la abscisa representa la fracción cromatográfica por permeación del gel (fracción nº). La línea llena representa la absorbancia de la proteína a 280 nm, la línea de puntos negra representa los datos generados con el anticuerpo antihumano (IgG+IgM), la línea de triángulos blancos representa los datos generados con anticuerpo IgG antihumano (específica para Fc); y la línea de triángulos negros representa los datos generados con anticuerpo IgG antihumano (específicos para Fab).

La Fig. 9 es una representación en diagrama de los datos en anticuerpos anti-H. pylori determinada en el Ejemplo 5. En la Fig. 9, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo positivo a H. pylori (+: n=56) y el grupo negativo (-: n=44) clasificados por el análisis ^{13}C-UBT.

La Fig. 10 es una representación en diagrama de los datos en el anticuerpo antirrubéola en la orina como se generó en el Ejemplo 6. En la Fig. 10, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el anticuerpo antirrubéola (+: n=76) y el grupo negativo (-: n=23) clasificados según la concentración en el suero medida con un kit comercial.

La Fig. 11 es un diagrama que presenta el punto de análisis y el punto de referencia en la segunda zona del dispositivo de análisis de anticuerpos de la invención [Ejemplo 7 (3)].

La Fig. 12 es un histograma que presenta los datos de análisis en el anticuerpo anti-H. pylori en la orina, sangre completa y plasma tal como se genera con el dispositivo de análisis de anticuerpo de la invención en comparación con los datos correspondientes generados con los dispositivos de referencia (A\simE). En la Fig. 12, "Especificidad" representa el porcentaje de análisis negativos (proporción negativa) en relación con el número total de análisis cuando las muestras procedentes de pacientes comprobados por el análisis ^{13}C-UBT negativo se determinaron para cada apartado del análisis con cada dispositivo de análisis y "Sensibilidad" representa el porcentaje de análisis positivos (proporción positiva) en relación con el número total de análisis cuando las muestras procedentes de pacientes comprobados por el análisis ^{13}C-UBT que son positivos se determinaron para cada apartado del análisis con cada dispositivo del análisis. Los dispositivos de referencia A\simH significan los dispositivos siguientes.

A:

Helitest (fabricado por Cortecs Diagnostics)

B:

H. pylori-Check-1

(fabricado por Bio-Medical Products)

C:

First Check H. pylori

(fabricado por Worlwide Medical Corp)

D:

Biocard Helicobacter pylori IgG

(fabricado por Anti Biotech Oy)

E:

Insta Test H. pylori

(fabricado por Cortez Diagnostics Inc.)

F:

One Step H. pylori Test

(fabricado por Teco Diagnostics)

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G:

H. pylori SPOT

(fabricado por International Immuno-Diagnostics)

H:

Quick Stripe H. pylori

(fabricado por Diatech Diagnostics Inc.)

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Exposición de la invención

Los inventores de la presente invención investigaron mucho para crear un sistema analítico que pueda determinar con alta precisión los anticuerpos diana aun cuando las muestras sean escasas en anticuerpos en las muestras de orina, y descubrieron que en el sistema analítico existe un componente del anticuerpo que se une de manera inespecífica al antígeno en una reacción antígeno-anticuerpo (denominado en adelante componente del anticuerpo de unión inespecífica) para dar lugar a reacciones no específicas, produciendo de este modo un resultado de falso positivo y por consiguiente reduciendo la precisión de la detección.

Basándose en los descubrimientos anteriores los inventores continuaron investigando y descubrieron que dichas reacciones no específicas pueden suprimirse realizando la reacción antígeno-anticuerpo entre el anticuerpo diana que ha de analizarse y el antígeno específico para el anticuerpo específico en presencia de un componente de Escherichia coli (E. coli), con lo que la proporción de falsos positivos puede reducirse para conseguir una mejora significativa en la precisión de la detección.

Los inventores descubrieron además que dicho componente del anticuerpo que se une de manera inespecífica comprende fragmentos de IgG y/o sus productos de desnaturalización que conservan la antigenicidad de la cadena ligera (L) o de la zona F (ab) de la IgG y que este componente del anticuerpo reacciona en cruz con los reactivos del análisis del anticuerpo corrientes (por ejemplo anticuerpos secundarios) utilizados en los sistemas analíticos del anticuerpo en el suero, conduciendo de este modo a análisis de falsos positivos.

Basándose en los descubrimientos anteriores, los inventores de la presente invención confirmaron además que las reacciones no específicas en el sistema de análisis de anticuerpos pueden inhibirse utilizando un reactivo con afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana de análisis como reactivo de análisis de anticuerpos, con lo cual la proporción de falsos positivos puede reducirse para mejorar la precisión de la detección en un grado significativo.

Mientras tanto, los inventores intentaron mejorar el programa informático analítico para anticuerpos (el dispositivo analítico inmunocapilar y el dispositivo para análisis inmunocromatográfico) y descubrieron que pueden detectarse con precisión reacciones de "verdaderos negativos" excluyendo las reacciones de "falsos negativos" creando un "punto de referencia" para detectar un anticuerpo arbitrario en las muestras además del punto (punto de análisis) para detectar el anticuerpo diana en la zona de reacción (zona de evaluación) de la tira como parte del dispositivo analítico. De este modo, en dicho sistema analítico, cuando la muestra es una muestra inapropiada que no puede analizarse por razones tales como una concentración demasiado baja de anticuerpo (es decir, la cantidad total del anticuerpo es demasiado pequeña), el "punto de referencia" da una señal negativa que indica que la muestra no es analizable. Por otra parte, cuando la muestra presenta una concentración de anticuerpos apropiada, el "punto de referencia" da una señal positiva que indica que la muestra es apropiada para el análisis deseado del anticuerpo diana. Entonces, según el resultado en este "punto de análisis", se puede conocer con certeza la presencia o ausencia del anticuerpo diana en la muestra, es decir si la muestra es "positiva" o "negativa verdadera".

En relación con esto, la publicación de patente japonesa sin examinar nº 299464/1989 y la publicación de la patente japonesa sin examinar nº 167497/1994, que dan a conocer ambas mejoras en el programa informático para análisis de anticuerpos (dispositivo para análisis inmunocapilar y dispositivo para análisis inmunocromatográfico), describen los dispositivos que incluyen un punto de referencia además de un punto para análisis. Sin embargo, el punto de referencia en estos dispositivos está concebido para determinar si o no un marcador colocado en una zona corriente arriba de la tira ha atravesado por el punto de análisis por acción capilar y, por consiguiente, es completamente diferente del punto de referencia según la invención.

Los presentes inventores confirmaron además que cuando se realiza la reacción de acoplamiento entre el anticuerpo diana y el antígeno correspondiente por medio del dispositivo de análisis del anticuerpo mejorado anteriormente en presencia de un componente de E. coli, se inhibe la reacción no específica en este sistema de reacción antígeno-anticuerpo y que cuando un reactivo con actividad específica para la zona Fc de la IgG se utiliza como reactivo para análisis de anticuerpos, se inhibe la reacción no específica con el inmunocomplejo, conduciendo de este modo a una disminución significativa en la frecuencia de un análisis de falso positivo.

La presente invención se ha desarrollado basándose en varios descubrimientos anteriores.

En un primer aspecto de la misma, la presente invención proporciona un procedimiento de gran precisión para analizar un anticuerpo con una frecuencia reducida de reacción de falso positivo.

1.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende:

realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisis

se realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno del análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir de este modo las reacciones no específicas; y

en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno con grupos antigénicos determinantes intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química.

2.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1, en el que el componente de E. coli es por lo menos un elemento seleccionado de una fracción soluble y una fracción lipopolisacárida de E. coli.

3.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1 ó 2, en el que se inmoviliza dicho antígeno de análisis.

4.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según los apartados 1, 2 ó 3, en el que dicho anticuerpo diana es un anticuerpo contra una fuente de infección seleccionado de entre el grupo constituido por un virus, una bacteria y un protozoo.

5.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra Helicobacter pylori.

6.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 5, en el que la fuente de dicho antígeno de análisis se selecciona de entre el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus de la hepatitis, el virus de la rubéola, el virus de la gripe, el virus del sarampión, el virus del herpes, citomegalovirus, Clamydia, gonococos, Helicobacter pylori y Toxoplasma gondii.

7.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 5, en el que dicho antígeno para análisis se selecciona de entre una bacteria, un virus, un protozoo, un componente de una bacteria que comprende un grupo antigénico determinante de la bacteria, un componente de un virus que comprende un grupo antigénico determinante de un virus y un componente de un protozoo que comprende un grupo antigénico determinante de los protozoos.

8.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 7, en el que dicho antígeno analítico es el Helicobacter pylori o un componente de Helicobacter pylori que comprende un grupo antigénico determinante de Helicobacter pylori.

9.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 8, en el que el componente de E. coli se selecciona de entre un componente proteico de E. coli, un componente de carbohidratos de E. coli, un componente lipídico de E. coli y una mezcla de los mismos.

10.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 9, en el que el inmunoanálisis se realiza por la técnica sándwich.

11.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de los apartados 1 a 10, en el que el inmunoanálisis se realiza por la técnica sándwich y comprende una etapa de utilización de una sustancia con afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana como reactivo de análisis del anticuerpo.

12.

Procedimiento para suprimir una reacción no específica según el apartado 11, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.

13.

Kit de reactivos, que comprende un antígeno analítico para detectar un anticuerpo diana, un reactivo analítico del anticuerpo y un componente de E. coli, para realizar el procedimiento destinado a suprimir una reacción no específica definida en cualquiera de los apartados 1 a 12, en el que dicho antígeno analítico es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno que tiene los grupos antigénicos determinantes intrínsecos para un patógeno que se ha preparado artificialmente por síntesis química.

14.

Kit de reactivos según el apartado 13, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es una sustancia con afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana.

15.

Kit de reactivos según el apartado 14, en el que el reactivo para análisis de anticuerpos es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.

(1) Procedimiento de supresión

En primer lugar, se describe a continuación en detalle el procedimiento del primer aspecto de la presente invención.

El procedimiento de la invención representa una mejora en el procedimiento de inmunoanálisis de anticuerpos y se caracteriza porque la frecuencia de la reacción de falsos positivos puede disminuirse por inhibición de la reacción no específica.

La reacción antígeno-anticuerpo entre el anticuerpo diana en una muestra y un antígeno específico para dicho anticuerpo se realiza en presencia de un componente de E. coli. Según este procedimiento, la reacción no específica en la reacción antígeno-anticuerpo se inhibe de manera significativa, con el resultado de que puede disminuir la frecuencia de un análisis de falsos positivos.

El componente de E. coli no está particularmente limitado con la condición de que sea un componente de Escherichia coli, incluyendo de este modo pero sin limitarse al componente proteico, al componente hidrocarbonado o al componente lipídico del mismo o a una mezcla de dichos componentes. Como ejemplo preferido, puede mencionarse una fracción soluble o una fracción de lipopolisacáridos (LPS) de E. coli.

No existe ninguna limitación específica sobre el procedimiento para preparar dicho componente de E. coli pero puede utilizarse selectivamente una variedad de procedimientos. Un procedimiento habitual puede comprender el cultivo de una cepa arbitraria de E. coli en un medio adecuado para su proliferación, la recogida de las células cultivadas y la desintegración de las células físicamente por medio de un productor de ultrasonidos o disolviéndolas con un tensioactivo o similar para proporcionar una fracción soluble (extracto). El LPS mencionado anteriormente puede prepararse mediante un procedimiento extractivo utilizando un disolvente orgánico, por ejemplo fenol, cloroformo o éter, o una mezcla de dos o tres disolventes orgánicos diferentes. Puede prepararse también artificialmente utilizando una técnica de ingeniería genética. Además, pueden utilizarse convenientemente productos comerciales (por ejemplo lipopolisacáridos de E. coli que están disponibles en Difco o Sigma).

La muestra a la que se puede aplicar la invención es la orina.

Específicamente la presente invención resuelve el problema de la escasa precisión de detección asociada a las muestras no invasivas que están favorecidas como muestras para la detección de anticuerpos, es decir la orina.

El "anticuerpo diana", objeto de la determinación, no está particularmente limitado con la condición de que sea un anticuerpo cuya detección se desea, incluyendo de este modo los anticuerpos contra varias fuentes de infección que son anticuerpos extraños para el anfitrión.

Las fuentes de infección no están específicamente limitadas pero incluyen muchos patógenos diferentes que infectan al hombre y a otros animales y dan lugar a anticuerpos en los anfitriones. Más específicamente, dicho patógeno incluye una variedad de virus tales como el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), tipo A, B, C y otros virus de la hepatitis, virus de la rubéola, virus de la gripe, virus del sarampión, citomegalovirus, virus del herpes simple, virus de la varicela-herpes zóster, adenovirus, enterovirus, etc.; bacterias tales como Helicobacter pylori (denominado en adelante para abreviar H. pylori), Clamydia spp., Mycobacterium tuberculosis, espiroquetas, gonococos, Treponema pallidum, Micoplasma spp., etc. (excluyendo a Escherichia coli); y protozoos tales como Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica, Rickettsia tsutsugamushi y así sucesivamente. Se prefieren virus tales como VIH, virus de la hepatitis, virus de la rubéola, virus de la gripe, virus del sarampión, virus del herpes, etc. y bacterias representadas por Helicobacter pylori, etc., siendo particularmente preferidas bacterias tales como H. pylori.

El antígeno para su utilización en el procedimiento de la invención es un antígeno que puede experimentar la reacción antígeno-anticuerpo con el anticuerpo diana que ha de detectarse. Así, puede utilizarse con éxito, por ejemplo, cualquiera de los antígenos utilizados en el sistema analítico para anticuerpos del suero convencionales. Los antígenos pueden ser no solamente los muy patógenos tales como dichos virus y bacterias sino también los antígenos que tienen grupos determinantes antigénicos intrínsecos a los patógenos respectivos. De este modo, por ejemplo, los patógenos inactivados disponibles en el tratamiento térmico o la irradiación de patógenos, los antígenos preparados extrayendo los patógenos con un tensioactivo o similar y los antígenos preparados artificialmente por síntesis química o tecnología del ADN recombinante.

Ocasionalmente, puede determinarse fácilmente si un antígeno experimental puede utilizarse con éxito o no en el procedimiento analítico de la invención por lo general ensayando su reactividad con el anticuerpo diana de manera convencional.

En el procedimiento analítico de la invención, dicho antígeno puede utilizarse opcionalmente inmovilizado de antemano sobre una fase sólida arbitraria. La fase sólida recién mencionada anteriormente puede ser alguna de las varias fases sólidas en utilización rutinaria en este campo de la técnica, incluyendo de este modo pero sin limitarse a bastones, bolitas, placas (placas de microvaloración inclusive) y tubos de ensayo de varios materiales, por ejemplo vidrio, polvo de celulosa, Sephadex, Sepharose, poliestireno, papel de filtro, carboximetilcelulosa, resinas de intercambio iónico, dextrano, película de plástico, tubo de plástico, nilón, perlas de vidrio, seda, copolímero de poliamina-éter metil vinílico-ácido maleico, copolímero de aminoácidos, copolímero de etileno-ácido maleico, etc.

El procedimiento para la inmovilización no está específicamente limitado, pero puede ser cualquiera de entre enlace físico y enlace químico. Por ejemplo, los procedimientos de enlace químico tales como los procedimientos de enlace covalente, por ejemplo, procedimiento diazo, procedimiento peptídico (el procedimiento del derivado de la amida ácida, el procedimiento de la resina de cloruro de carboxilo, el procedimiento de la resina de carbodiimida, el procedimiento del derivado del anhídrido maleico, el procedimiento del derivado del isocianato, el procedimiento de polisacárido activado por bromociano, el procedimiento del derivado del carbonato de celulosa, el procedimiento del reactivo de condensación, etc.), el procedimiento de alquilación, el procedimiento de acoplamiento del agente de reticulación (procedimiento para acoplar a un soporte que utiliza glutaraldehído, isocianato de hexametileno o similares como agente reticulante), el procedimiento de acoplamiento de la reacción de Ugi, etc.; los procedimientos de fijación iónica que utilizan resinas de intercambio iónico y soportes similares; y los procedimientos de adsorción física utilizando perlas de vidrio u otros soportes porosos de vidrio.

La cantidad de antígeno que ha de utilizarse en el sistema analítico no está específicamente limitada pero puede seleccionarse libremente según la cantidad de antígeno que está en utilización rutinaria por el sistema analítico específico. Por ejemplo, cuando se utiliza el procedimiento sándwich, generalmente el antígeno se utiliza en exceso sobre el anticuerpo diana. Tomando como ejemplo el caso en el que la reacción se realiza en un sistema de reacción de 100 \mul, puede utilizarse el antígeno en una proporción de generalmente de aproximadamente 0,1\sim100 \mug/ml, preferentemente de aproximadamente 1\sim10 \mug/ml.

Las condiciones de la reacción antígeno-anticuerpo entre dicho antígeno y el anticuerpo diana no están particularmente limitadas pero pueden ser las mismas que las de la utilización de rutina para los inmunoanálisis convencionales excepto que la reacción debería realizarse en presencia de un componente de E. coli. Un procedimiento típico puede comprender incubar o dejar en reposo dicho antígeno, anticuerpo y componente de E. coli juntos a una temperatura generalmente no superior a 45ºC, preferentemente de aproximadamente 4\sim40ºC, más preferentemente de aproximadamente 25\sim40ºC, durante aproximadamente 0,5\sim40 horas, preferentemente de aproximadamente 1\sim20 horas. El disolvente para su utilización en la reacción y su pH no están particularmente limitados, siempre que la reacción no se interfiera. Por lo tanto, los tampones convencionales que presentan una acción de tampón en el intervalo de pH de aproximadamente 5\sim9, tal como el tampón citrato, tampón fosfato, tampón tris, tampón de acetato, etc. pueden utilizarse generalmente de manera rutinaria.

La proporción de componente de E. coli en este sistema de reacción no está particularmente limitada pero por ejemplo puede ser generalmente de aproximadamente 0,1\sim100 \mug, preferentemente de aproximadamente 0,5\sim50 \mug, por \mug del antígeno en el sistema de reacción.

El procedimiento para poner en práctica el método de la invención no está específicamente limitado excepto para el requisito básico que comprende una etapa de reacción antígeno-anticuerpo en la que el anticuerpo diana se hace reaccionar con el antígeno correspondiente, que puede ser un antígeno inmovilizado, en presencia de dicho componente de E. coli. Preferentemente, sin embargo, el procedimiento comprende además una etapa de detección del anticuerpo diana capturado por dicho antígeno (inmunocomplejo), es decir una etapa de hacer reaccionar el inmunocomplejo con un reactivo de análisis del anticuerpo.

El procedimiento de detección y cuantificación del inmunocomplejo obtenido mediante dicha reacción entre el antígeno y el anticuerpo y las condiciones del mismo no están específicamente limitadas pero pueden ser las de utilización rutinaria para los inmunoanálisis en general.

Preferentemente la presente invención puede realizarse en la práctica por el procedimiento sándwich. En el procedimiento sándwich en fase sólida, por ejemplo, el anticuerpo diana en una muestra puede analizarse por lo general por el procedimiento siguiente.

En primer lugar, un componente de E. coli y una muestra que contiene supuestamente el antígeno diana (un fluido corporal tal como la orina) se añaden a un antígeno en fase sólida que es un antígeno inmovilizado capaz de experimentar una reacción entre el antígeno y el anticuerpo específica con el anticuerpo diana para de este modo realizar una reacción entre el antígeno y el anticuerpo. Una vez que las sustancias no unidas no acopladas al antígeno en fase sólida se eliminan lavando, por ejemplo, se añade un reactivo de análisis del anticuerpo para la reacción con el anticuerpo diana acoplado al antígeno en fase sólida (inmunocomplejo) y el inmunocomplejo se detecta o se cuantifica por un método de detección correspondiente al reactivo de análisis concreto.

La selección y modificación de varios métodos para dichos análisis son bien conocidos por los expertos en la materia y cualquiera de entre dichas técnicas puede utilizarse en la práctica de la presente invención [por ejemplo "Rinsho Kensa-hou Tello (Outline of Clinical Test)", Kanehara Publishing Co., 1995].

El reactivo para análisis del anticuerpo para su utilización en la presente invención no está particularmente limitado pero incluye una variedad de reactivos en la utilización de rutina en la técnica. Por ejemplo, pueden mencionarse los anticuerpos secundarios tales como un anticuerpo de inmunoglobulina antihumano capaz de unirse al anticuerpo objetivo (inmunoglobulina). El anticuerpo inmunoglobulina antihumano mencionado anteriormente incluye los antisueros, los productos purificados de los mismos (anticuerpos policlonales) y los anticuerpos monoclonales disponibles en animales arbitrarios inmunizados utilizando una inmunoglobulina en la clase correspondiente a la inmunoglobulina diana como inmunógeno.

Además, como reactivo de análisis del anticuerpo, puede utilizarse también un anticuerpo anti-IgG que presenta afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo diana (IgG). Como tal puede utilizarse también un anticuerpo anti-IgG, un anticuerpo anti-IgG específico para Fc que no sea reactivo con la cadena ligera de IgG de la zona F(ab) de IgG o la proteína A, la proteína G o similares que es específicamente reactiva con la zona Fc del IgG. Éstos pueden utilizarse con ventaja específica cuando el anticuerpo diana sea una IgG.

Los reactivos de análisis pueden prepararse de manera convencional o adquirirse en proveedores comerciales.

Para la detección, el reactivo para análisis de anticuerpos puede modificarse directamente con un agente de marcado convencional o modificarse indirectamente por un método de detección adicional.

El agente marcador no está específicamente limitado pero puede emplearse cualquiera de los agentes conocidos hasta ahora o previstos que se utilizarán en el futuro. Para mencionar ejemplos específicos, pueden utilizarse también radioisótopos tales como ^{125}I, ^{3}H, ^{14}C, etc.; enzimas tales como la fosfatasa alcalina (ALP), peroxidasa (por ejemplo HRP), etc.; sustancias fluorescentes tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), isotiocianato de tetrametilrodamina (RITC), etc.; 1N-(2,2,6,6-tetrametil-1-oxil-4-piperidil)-5N-(aspartato)-2,4-dinitrobenceno (TOPA), etc. Los procedimientos de inmunoanálisis que utilizan los agentes marcadores mencionados anteriormente se denominan radioinmunoanálisis, inmunoanálisis enzimático, fluoroinmunoanálisis e inmunoanálisis de rotación, respectivamente. Puede también emplearse el método de inmunocromatoanálisis que utiliza un reactivo para análisis de anticuerpos preparado marcando partículas de látex teñidas con oro coloidal.

El marcado con los agentes marcadores, las modificaciones por marcado indirecto y su detección pueden realizarse por procedimientos conocidos de por sí [Tatsuo Iwasaki et al.: Monoclonal Antibody, Kodansha Scientific, 1984; y Eiji Ishikawa et al.: Enzyme Immunoassay, 2ª edición, Igaku Shoin, 1982, entre otros].

En el procedimiento de la invención, es esencial que el componente de E. coli esté incluido en el sistema de reacción que comprende el anticuerpo diana que ha de analizarse y el antígeno correspondiente y siempre que este requisito se satisfaga, el resto del procedimiento básico está particularmente limitado solamente por el lenguaje adicional de la reivindicación 1. Por consiguiente, las condiciones de la reacción entre dicho inmunocomplejo y dicho reactivo de análisis del anticuerpo no están particularmente limitadas, pero pueden ser iguales a las utilizadas en inmunoanálisis en general. El procedimiento más frecuente comprende incubar o dejar en reposo el sistema analítico en las mismas condiciones que las descritas anteriormente para la reacción entre el antígeno y el anticuerpo, es decir, generalmente a una temperatura no superior a 45ºC, preferentemente de aproximadamente 4\sim40ºC, más preferentemente de aproximadamente 25 a 40ºC y a un nivel de pH entre aproximadamente 5\sim9 durante aproximadamente 0,5\sim40 horas, preferentemente de aproximadamente 1\sim20 horas.

La presencia o ausencia del anticuerpo diana en una muestra o su contenido se evalúa midiendo la actividad del marcador, que depende del tipo de agente marcador utilizado en el marcado del reactivo de análisis del anticuerpo (o el marcador indirecto), de manera rutinaria o desde el punto de vista del valor del anticuerpo calculado a partir del valor medido.

(1-2) Como modo alternativo del procedimiento de análisis del anticuerpo de la presente invención, puede mencionarse un procedimiento inmunológico para el análisis del anticuerpo diana en una muestra que comprende utilizar un reactivo que presenta actividad específica para la zona Fc del anticuerpo diana IgG como reactivo de análisis del anticuerpo.

Según este procedimiento, la reacción entre el componente del anticuerpo de unión inespecífica y el reactivo de análisis del anticuerpo puede suprimirse de manera significativa de modo que la frecuencia de análisis de falso positivo puede disminuir. De este modo, este método de análisis del anticuerpo puede considerarse una mejora en el procedimiento sándwich para inmunoanálisis de anticuerpos.

El reactivo de análisis del anticuerpo de la invención es reactivo con el anticuerpo diana (IgG) y, por consiguiente, puede utilizarse para la detección del anticuerpo y se caracteriza porque no es reactivo con la cadena ligera del anticuerpo IgG diana o con la zona F(ab) de la IgG diana, es decir presenta afinidad específica para la zona Fc de la IgG diana.

Más específicamente, dicho reactivo de análisis del anticuerpo puede ser por ejemplo un anticuerpo anti-IgG específico para Fc que puede prepararse utilizando una zona Fc del anticuerpo IgG diana como inmunógeno, e incluye antisueros, productos purificados de los mismos (anticuerpo policlonales) y anticuerpo monoclonales que pueden extraerse de animales arbitrarios inmunizados con dicho inmunógeno. Este reactivo no se limita a dichas preparaciones de anticuerpos pero puede ser proteína A, proteína G o similares que es reactiva específicamente con la zona Fc del anticuerpo IgG.

Estos reactivos para análisis del anticuerpo pueden prepararse de manera rutinaria o adquirirse en proveedores comerciales (por ejemplo, Sigma, Cappel o Jackson Immuno Research Laboratories, Inc.).

Para la detección, el reactivo para análisis de anticuerpos puede modificarse directamente con un agente marcador convencional o indirectamente modificarse por un método de detección adicional.

El tipo de agente marcador, el procedimiento de marcado y el procedimiento de detección del marcador puede ser el mismo que los mencionados anteriormente (1-1).

El procedimiento analítico del anticuerpo de la invención comprende la utilización del reactivo de análisis del anticuerpo mencionado anteriormente como característica esencial del mismo en la detección del anticuerpo diana, es decir el inmunocomplejo, y siempre que este requisito se cumpla, el resto del procedimiento básico puede ser sin restricciones el mismo que el utilizado en los inmunoanálisis convencionales por la técnica sándwich.

Fundamentalmente, el procedimiento de análisis del anticuerpo de la presente invención se realiza en la práctica haciendo reaccionar un antígeno capaz de reaccionar con el anticuerpo diana en una muestra y detectando el antígeno diana unido al antígeno (inmunocomplejo) con dicho reactivo analítico del anticuerpo.

La muestra de análisis y el antígeno pueden ser respectivamente las mismas mencionadas en (1-1), y en cuanto al antígeno diana, también, pueden utilizarse los mismos anticuerpos que los mencionados en (1-1), con la condición de que el anticuerpo sea un anticuerpo IgG contra la fuente de infección. En el procedimiento de la presente invención, la fuente de infección puede incluir Escherichia coli.

Cuando sea necesario, el reactivo de análisis del antígeno o del anticuerpo de la presente invención puede utilizarse inmovilizado en una fase sólida arbitraria. La fase sólida para su utilización en el procedimiento de inmovilización puede ser por ejemplo la misma que la mencionada en (1-1).

La reacción antígeno-anticuerpo entre el antígeno y el anticuerpo diana no está limitada específicamente pero puede realizarse en las condiciones en la utilización rutinaria para inmunoanálisis convencional. Un procedimiento típico comprende incubar o dejar en reposo un sistema de reacción que comprende el antígeno y el anticuerpo diana generalmente a una temperatura no superior a 45ºC, preferentemente de aproximadamente 4\sim40ºC, más preferentemente de aproximadamente 25\sim40ºC durante aproximadamente 0,5\sim40 horas, preferentemente de aproximadamente 1\sim20 horas.

Aunque no sea preceptivo, un componente de E. coli puede producirse para estar presente en la reacción entre el antígeno y el anticuerpo como se mencionó en (1-1).

El inmunocomplejo resultante se lava a continuación y se somete a una etapa en la que se hace reaccionar con dicho reactivo de análisis del anticuerpo especificado. Esta reacción puede realizarse en las mismas condiciones que las utilizadas generalmente en los inmunoanálisis convencionales (análisis sándwich) o sustancialmente de la misma manera que en aquéllos. El disolvente, por ejemplo, no está limitado específicamente con la condición de que no interfiera con la reacción, incluyendo de este modo pero sin limitarse a tampones a pH aproximadamente entre 5\sim9, tal como tampón citrato, tampón fosfato, tampón tris y tampón acetato, para mencionar solo unos pocos ejemplos. El tiempo de reacción y la temperatura de reacción no están específicamente limitados, pero por ejemplo pueden ser iguales a los mencionados para dicha reacción entre el antígeno y el anticuerpo.

La presencia o ausencia del anticuerpo diana en una muestra o su contenido se evalúa midiendo la actividad del marcador, lo que depende del tipo de agente marcador utilizado en el marcado del reactivo de análisis del anticuerpo (o el marcador indirecto), de manera rutinaria o desde el punto de vista del valor del anticuerpo calculado a partir del valor medido, precisamente como se menciona en (1-1).

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(2) Dispositivo de análisis del anticuerpo

El dispositivo de análisis del anticuerpo según el segundo aspecto de la invención se describe a continuación con detalle.

El dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención es un procedimiento mejorado mediante el que puede determinarse con buena precisión la presencia y/o cantidad del anticuerpo diana que ha de detectarse en una muestra mediante un procedimiento de análisis en fase sólida.

Más específicamente, el dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención es un dispositivo de análisis que comprende un soporte en fase sólida que presenta por lo menos (a) una primera zona para poner en contacto con una muestra y (b) una segunda zona para la reacción del anticuerpo en la muestra ordenada en una secuencia tal que la muestra sea transportada por acción capilar desde dicha primera zona a dicha segunda zona y los medios del marcador para detectar el resultado de la reacción en dicha segunda zona, caracterizados porque dicha (b) segunda zona tiene (i) un punto de análisis donde un ligando para el anticuerpo diana que ha de analizarse está inmovilizado y (ii) un punto de referencia donde está inmovilizado un ligando para capturar un anticuerpo arbitrario en la muestra.

La característica sobresaliente del dispositivo de análisis de anticuerpos de la invención consiste en que se proporciona un punto de referencia independiente de un punto de análisis en la segunda zona, cuyo punto de referencia es tal que, cuando se aplica y se analiza de manera apropiada una muestra apropiada, forma una indicación que representa un análisis positivo en presencia de un marcador independientemente de si el anticuerpo diana está presente o no en la muestra mientras que, cuando se aplica una muestra inapropiada o se analiza de manera inapropiada una muestra, forma una indicación que representa un análisis negativo en presencia de un marcador independientemente de si el anticuerpo diana está presente o no en la muestra.

De este modo, el punto de referencia en la segunda zona de este dispositivo es un punto que da una indicación de si el resultado (particularmente el resultado negativo) en el punto de análisis es un resultado analítico válido independientemente de la presencia o ausencia del anticuerpo diana en la muestra. Con el dispositivo analítico del anticuerpo de la invención, gracias a la construcción anterior, es posible determinar, cualitativa y cuantitativamente, el anticuerpo en la muestra con gran precisión (fiabilidad alta) con una distinción clara entre los resultados de falso negativo y verdadero negativo.

Además, el dispositivo analítico del anticuerpo de la invención está concebido que la reacción del anticuerpo diana en el punto analítico se realice en presencia de un componente de E. coli y puede concebirse para que un reactivo que presenta afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo diana IgG se utilice como reactivo para análisis del anticuerpo destinado a detectar el resultados de la reacción en el punto de la prueba. Con el dispositivo para análisis del anticuerpo de la invención, gracias a la construcción descrita anteriormente, las reacciones no específicas están inhibidas de modo que la frecuencia de un análisis de falso positivo esté disminuida de forma significativa, haciendo de este modo posible determinar, cualitativa y cuantitativamente, el anticuerpo diana en la muestra con buena precisión y gran sensibilidad.

En cuanto a la muestra de análisis y el anticuerpo diana para este dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención, pueden emplearse por ejemplo los mencionados en (1).

La presente invención proporciona en primer lugar un soporte en fase sólida que comprende por lo menos una primera zona y una segunda zona.

La primera zona es una zona en la que la muestra aplicada se pone en contacto con el dispositivo y la segunda zona es una zona en la que el anticuerpo (el anticuerpo completo que puede contener el anticuerpo diana) en la muestra experimenta la reacción y el acoplamiento en modo ligando-receptor o en modo antígeno-anticuerpo y el resultado de la reacción se presenta en presencia de un marcador (zona de reacción y zona de evaluación). Las zonas se ordenan en un soporte en fase sólida de tal manera que la muestra aplicada y que se pone en contacto con la primera zona se transporta por acción capilar desde dicha primera zona a la segunda zona. Preferentemente, dichas zonas se ordenan de tal modo que toda o por lo menos una parte de la muestra que se introduce en la primera zona se desplaza, por acción capilar, a través de una capa sustancialmente plana del soporte en fase sólida a la segunda zona.

Opcionalmente el soporte en fase sólida puede presentar una tercera zona corriente abajo de la segunda zona, como una zona que absorbe la muestra (líquida) que migra, por acción capilar, desde la primera zona a la segunda zona y más corriente abajo.

El soporte en fase sólida preferido se configura en forma de una tira y dichas primera y segunda zona se ordenan en uno y el mismo plano de la tira y de tal manera que la muestra aplicada se desplaza, por acción capilar, desde una primera banda (primera zona) a una segunda banda (segunda zona) y opcionalmente además a una tercera banda (tercera zona). Aunque la forma preferida de dicho soporte en fase sólida es una tira como se ha mencionado anteriormente, cualquier otra forma o geometría puede emplearse siempre que las funciones previstas del soporte en fase sólida en la presente invención puedan realizarse.

El soporte en fase sólida puede absorber la muestra (líquida) y, cuando se humedece con la muestra, dejar por lo menos que el anticuerpo en la muestra se desplace, por acción capilar, desde la primera zona a la segunda zona del soporte en fase sólida y opcionalmente además a la tercera zona. Además, el soporte en fase sólida es preferentemente el que puede soportar e inmovilizar un ligando que reacciona con el anticuerpo (inclusive del anticuerpo diana) contenido en la muestra para capturar este último.

El soporte apropiado en fase sólida incluye una variedad de materiales porosos, por ejemplo polietileno, fibra de vidrio, celulosa, rayón, nilón, dextrano reticulado, varios tipos de papel cromatográfico, nitrocelulosa y papel de filtro.

La primera zona, la segunda zona y la tercera zona, por ejemplo, del soporte en fase sólida pueden estar constituidas respectivamente por el mismo o diferentes elementos seleccionados de entre los materiales mencionados anteriormente, dependiendo la elección de los materiales de los papeles y funciones de las zonas respectivas.

La primera zona del soporte en fase sólida está constituida preferentemente por un material poroso adaptado para absorber la muestra aplicada en su superficie y dejarla desplazarse, por acción capilar, a la segunda zona. El material poroso adecuado para la primera zona no está limitado específicamente pero generalmente puede utilizarse polietileno (por ejemplo POREX: Porex Technologies, Fairburn, Georgia), fibra de vidrio, rayón, nilón y materiales celulósicos inclusive de papel. El material preferido es un polietileno poroso o un material celulósico tal como papel de filtro.

La segunda zona del soporte en fase sólida está constituida preferentemente por un material poroso que puede dejar que la muestra (líquido) ascienda por acción capilar desde la primera zona a la segunda zona y de soportar un ligando para el anticuerpo (inclusive del anticuerpo diana) que se produce en la muestra en un estado no desplazado por acción capilar. El material poroso que presenta tales propiedades incluye papel de filtro, papel cromatográfico, fibra de vidrio, dextrano reticulado, nilón, nitrocelulosa, etc. El material preferido es la nitrocelulosa porque el ligando puede inmovilizarse fácilmente en la misma.

La segunda zona está prevista en un punto de ensayo en el que se ha inmovilizado un ligando adaptado a reconocer específicamente el anticuerpo diana en la muestra y capturarlo y se ha inmovilizado un punto de referencia en el que un ligando adaptado para reconocer un anticuerpo arbitrario en la muestra y capturarlo. El punto de referencia se coloca fuera del punto de ensayo con un intervalo dado entre éste, preferentemente corriente abajo en la dirección del flujo capilar y está preferentemente dispuesto de modo que ambos puntos se ponen en contacto mediante el frente líquido de la muestra en condiciones idénticas.

El ligando para el punto de ensayo no está específicamente limitado a condición de que esté acoplado específicamente al anticuerpo diana que ha de analizarse pero es preferentemente un antígeno que es reconocido específicamente y está unido por el anticuerpo diana (reacción antígeno-anticuerpo). Como el antígeno mencionado anteriormente, pueden utilizarse sin limitaciones los antígenos que se utilizan de manera rutinaria en el sistema de análisis de anticuerpos del suero convencional. Los antígenos pueden ser muy patógenos tales como los virus y bacterias pero también pueden ser sustancias que contienen grupos determinantes antigénicos intrínsecos a los patógenos respectivos. De este modo pueden mencionarse, por ejemplo, los patógenos inactivados por calentamiento o irradiación, los antígenos obtenidos por extracción de los patógenos con un tensioactivo o similar, y los antígenos que se preparan artificialmente por síntesis química o tecnología del ADN recombinante.

El ligando para el punto de referencia no está limitado específicamente a condición de que acople un anticuerpo arbitrario en la muestra pero preferentemente es un anticuerpo (anticuerpo antiinmunoglobulina) que reconoce específicamente y se une a un anticuerpo arbitrario en la orina.

Los ligandos están inmovilizados en el material poroso en el punto de ensayo y en el punto de referencia, respectivamente, de modo que no serán desplazados de los respectivos puntos por el flujo capilar de la muestra líquida. De este modo, cada ligando está unido al punto correspondiente del soporte poroso de modo que no dará lugar a difusión cuando la segunda zona esté humedecida por la muestra que contiene el anticuerpo diana pero será retenido de forma estable en el punto sin que se transporte a la tercera zona del soporte en fase sólida.

La inmovilización de los ligandos sobre dicho soporte poroso puede conseguirse por técnicas bien conocidas por los expertos en la materia, es decir, por enlace físico o enlace químico.

De este modo, por ejemplo, pueden mencionarse los procedimientos de enlace químico tales como los procedimientos de enlace covalente, por ejemplo, el procedimiento diazo, el procedimiento de péptidos (procedimiento del derivado de amida ácida, el procedimiento de la resina de cloruro de carboxilo, el procedimiento de la resina de carbodiimida, el procedimiento del derivado del anhídrido maleico, el procedimiento del derivado del isocianato, el procedimiento del polisacárido activado por bromociano, el procedimiento derivado del carbonato de celulosa, el procedimiento del reactivo de condensación, etc.), el procedimiento de alquilación, el procedimiento de acoplamiento del agente de reticulación (el procedimiento para acoplar a un soporte que utiliza glutaraldehído, isocianato de hexametileno o similares como agente de reticulación), el procedimiento de acoplamiento de la reacción de Ugi, etc.; los procedimientos de enlace iónico; procedimientos de absorción física. Cuando se utiliza nitrocelulosa como soporte poroso para la segunda zona, dicho ligando puede inmovilizarse de manera conveniente por enlace no covalente.

La cantidad de ligando (antígeno) para su utilización en el punto de ensayo de la segunda zona está preferentemente en exceso de modo que esencialmente todo el anticuerpo diana presente supuestamente en la muestra estará unido al punto de ensayo.

La cantidad de ligando (anticuerpo antiinmunoglobulina) para su utilización en el punto de referencia de la segunda zona está también preferentemente en exceso de modo que esencialmente todo el anticuerpo arbitrario (que puede contener el anticuerpo diana) en la muestra estará unido al punto de referencia.

La reacción de acoplamiento entre el anticuerpo diana y el ligando (particularmente un antígeno) en el punto de ensayo se realiza preferentemente en presencia de un componente de E. coli. El componente de E. coli puede ser suministrado al sistema de reacción incorporándolo en una dilución de la muestra de análisis y aplicando la mezcla a la primera zona o puede inmovilizarse de manera separable en el punto de ensayo del soporte en fase sólida corriente arriba del punto de ensayo (por ejemplo dicha primera zona o la zona del trazador que se describirá más adelante). El componente de E. coli no está limitado específicamente a condición de que proceda de Escherichia coli como se mencionó anteriormente. De este modo, puede ser la fracción proteica, la fracción de hidratos de carbono o la fracción lipídica de las células o una mezcla de dichas fracciones. Como ejemplo preferido pueden mencionarse la fracción soluble obtenida por extracción de las células o la fracción de lipopolisacárido (LPS).

A medida que la muestra se aplica a la primera zona, la muestra migra, por acción capilar, a la segunda zona donde el anticuerpo diana en la muestra se une y se fija al punto de ensayo en la segunda zona y, a continuación, el anticuerpo arbitrario restante (inclusive el residuo del anticuerpo diana que no se ha unido al punto de ensayo) se une y se fija al punto de referencia corriente abajo del punto de ensayo.

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El medio de marcado en la presente invención se utiliza para detectar si el anticuerpo diana y el anticuerpo arbitrario en la muestra se han acoplado y fijado a dicho punto de ensayo y al punto de referencia, respectivamente.

El medio de marcado puede consistir en un ligando para el anticuerpo y un marcador detectable acoplado a dicho ligando.

El ligando para el anticuerpo no está particularmente limitado con el fin de que sea una molécula que reconozca y se una al anticuerpo presente en la muestra pero, en la presente invención, es preferentemente el que se une no solamente al anticuerpo diana que se ha de analizar sino también el anticuerpo arbitrario presente en la muestra. Como ejemplo de dicho ligando, puede mencionarse el mismo ligando que el mencionado para el punto de referencia, específicamente el mismo anticuerpo antiinmunoglobulina adoptado como ligando en el punto de referencia.

El anticuerpo antiinmunoglobulina mencionado anteriormente incluye antisueros disponibles en animales arbitrarios inmunizados con una inmunoglobulina apropiada, por ejemplo, una inmunoglobulina humana, como el inmunógeno, productos de purificación de la misma (anticuerpos policlonales) y anticuerpos monoclonales.

El anticuerpo antiinmunoglobulina como ligando en el punto de referencia puede opcionalmente ser un anticuerpo dirigido a todas las clases de anticuerpos de modo que puede capturar y detectar el anticuerpo completo en la muestra o ser un anticuerpo dirigido contra una clase deseada de anticuerpo tal como la inmunoglobulina G (IgG). Preferentemente, el ligando es un anticuerpo antiinmunoglobulina dirigido contra anticuerpos en la misma clase como la clase a la que pertenece el anticuerpo diana y se prefiere esta disposición en la que como anticuerpos de la misma clase como anticuerpo diana detectados de este modo en el punto de referencia, se obtiene la indicación óptima para interpretar si el análisis ha sido realizado de manera apropiada no solamente cuando se utiliza una muestra de orina sino cuando se utilizan como muestras otros fluidos corporales tales como el suero.

Cuando el anticuerpo diana es IgG, el ligando tal como dicho medio de marcado es más preferentemente un ligando caracterizado porque tiene una afinidad específica para la zona Fc de la IgG del anticuerpo y, como ejemplos preferidos de dicho ligando, pueden mencionarse un anticuerpo anti-IgG específico para Fc que no es reactivo con la cadena ligera de la IgG del anticuerpo o la zona F(ab) del mismo o una proteína A, proteína G o similares con reactividad específica para la zona Fc de la IgG del anticuerpo. Dichos anticuerpos o ligandos de antiinmunoglobulina pueden prepararse de manera rutinaria o adquirirse en proveedores comerciales.

El componente de marcado detectable no está específicamente limitado siempre que sea un marcador detectable que es conocido por ser útil para ensayos de fijación específica, particularmente inmunoanálisis, o que se utilice posiblemente en el futuro [Tatsuo Iwasaki et al.: Monoclonal Antibody, Kodansha Scientific, 1984; Eiji Ishikawa et al.: Enzyme Immunoassay, 2ª edición, Igaku Shoin, 1982, etc.].

El marcador preferido es el que experimenta cambio de color en el punto de ensayo o en el punto de referencia de la segunda zona. Aunque no está limitado, se prefiere particularmente un marcador que experimenta un cambio de color que puede reconocerse a simple vista sin ayuda de ningún instrumento. Por ejemplo, pueden mencionarse varios cromógenos tales como sustancias fluorescentes y colorantes absorbentes. El aún más preferido es un marcador en forma de polvo que contiene un marcador detectable a simple vista.

El marcador en partículas adecuado incluye partículas de polímero (por ejemplo látex o perlas de poliestireno), bolsas, liposomas, geles metálicos (por ejemplo plata coloidal, oro coloidal, etc.), y partículas de colorante de poliestireno. Entre ellos, se prefieren los geles metálicos tales como la plata coloidal y el oro coloidal.

Aunque dicho marcador puede estar acoplado a un ligando, ya sea química o físicamente, de manera convencional para proporcionar un ligando marcado, pueden utilizarse también productos comerciales.

Los medios de marcado que pueden utilizarse en la presente invención pueden ser cualquier marcador que, cuando se aplica a la segunda zona (inclusive del punto de ensayo o del punto de referencia) del soporte en fase sólida, indica el resultado de la reacción con el anticuerpo que se produce en la muestra que ha tenido lugar en la segunda zona y, siempre que esta función pueda conseguirse, no existe ninguna limitación específica sobre el modo de su presencia. Por ejemplo, cuando el dispositivo de ensayo de la presente invención se proporciona en forma de un flujo a través del dispositivo, los medios de marcado pueden incluirse en el kit de reactivo de ensayo del anticuerpo independientemente del soporte en fase sólida.

Preferentemente, el medio de marcado está inmovilizado de forma separable sobre un soporte en fase sólida, y más preferentemente está inmovilizado de forma separable corriente arriba de la segunda zona del soporte en fase sólida. El modo aún más preferido es tal que el medio de marcado está soportado en una zona (denominada en adelante zona del trazador) intermedia entre la primera y segunda zonas del soporte en fase sólida. En este modo de utilización, la muestra aplicada a la primera zona asciende por acción capilar a la zona del trazador donde se pone en contacto con el ligando marcado para formar el complejo anticuerpo diana/ligando marcado y el complejo anticuerpo arbitrario/ligando marcado. Después del paso a través de la zona del trazador, la muestra que contiene los complejos migra, por acción capilar, además a la segunda zona. El ligando (antígeno) colocado en el punto de ensayo dentro de la segunda zona es específico para el anticuerpo diana y el ligando (anticuerpo antiinmunoglobulina) colocado en el punto de referencia es específico para el anticuerpo arbitrario. Por consiguiente, el complejo anticuerpo diana/ligando marcado que ha migrado por acción capilar es capturado en primer lugar en el punto de ensayo y el complejo restante anticuerpo arbitrario/ligando arbitrario (inclusive del complejo anticuerpo diana/ligando marcado) en la muestra se captura a continuación en el punto de referencia.

La zona del trazador del soporte en fase sólida no está particularmente limitada siempre que sea un soporte capaz de transportar la muestra de ensayo que contiene el anticuerpo diana y el anticuerpo arbitrario desde la primera zona a la segunda zona y que soporta dicho ligando marcado de manera que este último pueda liberarse mediante el flujo capilar. Generalmente, es un elemento poroso de polietileno, fibra de vidrio, rayón, nilón o un material celulósico inclusive de papel. El material preferido es un material que apenas permite la adsorción inespecífica, por ejemplo fibra de vidrio tratada opcionalmente con alcohol polivinílico (PVA).

Entre las formas de realización preferidas de la invención existe una forma de realización en la que dicha zona trazadora y dicho punto de ensayo en la segunda zona están colocados en un intervalo dado entre éstas sobre un soporte en fase sólida. Como tal se proporciona una zona de intervalo entre la zona del trazador y el punto de ensayo, el anticuerpo en la muestra que se pone en contacto con el ligando marcado en la zona del trazador se mezcla con el ligando marcado antes de que la muestra alcance el punto de ensayo en la segunda zona, con lo cual se asegura de manera más positiva la reacción de acoplamiento entre el anticuerpo y el ligando marcado. De este modo, esta zona proporciona un medio de incubación (tiempo y espacio) para el acoplamiento del anticuerpo diana y del anticuerpo arbitrario con los ligandos marcados antes del contacto del anticuerpo diana y del anticuerpo arbitrario en la muestra con el punto de ensayo y el punto de referencia, respectivamente.

Además, el soporte en fase sólida de la presente invención puede presentar una tercera zona corriente abajo de la segunda zona.

La muestra continúa migrando desde la primera zona a la zona del trazador opcional a la segunda zona y además a la tercera zona por acción capilar. De este modo, la tercera zona funciona como zona que recibe el líquido que procede de la segunda zona por acción capilar.

Generalmente la tercera zona necesita solamente descargar la función de recibir el componente líquido no unido a la segunda zona pero puede proporcionarse además con un punto informativo de la terminación del análisis de antemano al flujo capilar de la muestra (que es el frente líquido) para una zona de punto final predeterminada sobre el soporte en fase sólida.

Con el objetivo anterior, el soporte en fase sólida puede proporcionarse con una zona indicadora visible que contiene un colorante soluble en agua tal como la eritrosina B, safranina O, rojo de fenol o similares corriente abajo de la segunda zona. En este caso, como el frente líquido de la muestra atraviesa la segunda zona en la tercera zona, circula a través de dicha zona indicadora y el colorante colocado en esta zona es transportado corriente abajo por el flujo capilar de la muestra (líquido), informando de este modo que la muestra ha pasado ya en serie a través de la primera zona, la zona del trazador y la segunda zona (puntos de ensayo y de referencia) y por consiguiente que el análisis se acaba de terminar.

El material para la tercera zona no está limitado específicamente siempre que sea capaz de absorber la muestra (líquido), incluyendo de este modo películas porosas u hojas de polietileno, rayón, nilón y materiales celulósicos inclusive de papel. El material preferido es el material celulósico tal como el papel.

La presente invención se describe en detalle a continuación, haciendo referencia a los dibujos adjuntos que muestran el dispositivo de análisis del anticuerpo y sus elementos constituyentes. Sin embargo, debe entenderse que el dispositivo ilustrado es únicamente una forma de realización de la invención y no medios definitivos de la invención.

La Fig. 1 es un diagrama que presenta un soporte en fase sólida en forma de una tira (60 \times 5 mm) como elemento del dispositivo de la invención. En la Fig. 1, el código 1 representa una primera zona (16 \times 5 mm, 0,92 mm de espesor) en la que se aplica una muestra de ensayo y se pone en contacto con la tira; el código 2 representa una zona del trazador (5 \times 5 mm, 0,79 mm de espesor) en la que está inmovilizado un ligando marcado (por ejemplo anticuerpo IgG humano marcado con oro coloidal); el código 3 representa una segunda zona (18 mm \times 5 mm, 0,1 mm de espesor) en la tiene lugar que la reacción con el anticuerpo en la muestra y se indica el resultado; y el código 4 representa una tercera zona (22 \times 5 mm, 1,46 mm de espesor) en la que se absorbe la muestra que ha migrado desde la primera zona y la segunda zona.

El espesor de la primera zona es generalmente 0,2\sim2 mm y preferentemente 0,8\sim1,2 mm, y el espesor de la zona del trazador es generalmente 0,2\sim1,5 mm y preferentemente 0,5\sim1 mm. El espesor de la segunda zona es generalmente de 0,03\sim0,2 mm y preferentemente 0,08\sim0,12 mm, y el espesor de la tercera zona es generalmente 0,5\sim3 mm y preferentemente 1\sim2 mm. Sin embargo estos intervalos no son críticos.

Dentro de dicha segunda zona (3) está colocado un punto de ensayo (línea de ensayo, aproximadamente 1 \times 5 mm) (5) donde un ligando que tiene una afinidad específica para el anticuerpo diana está soportado en posición y punto de referencia (línea de referencia, aproximadamente 1 \times 5 mm) (6) donde un ligando que tiene afinidad para el anticuerpo arbitrario (anticuerpo de inmunoglobulina antihumano) está soportado en posición. El punto de ensayo (5) está colocado a una distancia dada (aproximadamente 6 mm) de la zona del trazador y el punto de referencia (6) está colocado a una distancia dada (aproximadamente 6 mm) del punto de ensayo (5). El punto de ensayo tiene la función de reaccionar específicamente con el anticuerpo diana en la muestra e indicar la presencia de un marcador si existe el anticuerpo diana o no en la muestra y el punto de referencia tiene la función de indicar la presencia de un marcador si la muestra aplicada es apropiada o no.

Los materiales (soportes) para la primera zona, zona del trazador, segunda zona y tercera zona que constituyen la tira de soporte en fase sólida pueden haber sido simplemente conectados en serie en la dirección longitudinal de la tira a lo largo de la cual la muestra migra y no existe ninguna restricción al modo de conexión. Preferentemente, sin embargo, la conexión entre el extremo del frente longitudinal de la primera zona y el extremo posterior de la zona del trazador, la conexión entre el extremo del frente de la zona del trazador y el extremo posterior de la segunda zona, y la conexión entre el extremo del frente de la segunda zona y el extremo posterior de la primera zona están respectivamente en relación superpuesta. Más preferentemente, como se ilustra en la Fig. 1, la parte del extremo del frente longitudinal de la primera zona se superpone sobre la parte del extremo posterior de la zona del trazador y la parte del extremo del frente longitudinal de la zona del trazador se superpone en la parte del extremo posterior de la segunda zona. La parte del extremo posterior de la tercera zona puede superponerse sobre la parte del extremo del frente de la segunda zona. En dicho modo de conexión, la muestra aplicada a la primera zona se deja que migre suavemente en la dirección longitudinal de la tira. La profundidad de la tira en su dirección longitudinal no está particularmente limitada pero puede ser por ejemplo de 0,5\sim10 mm, preferentemente de 1\sim2 mm, más preferentemente de 0,8\sim1,2 mm. Debe entenderse que las relaciones parte superior-parte inferior de las zonas respectivas en la estructura de la tira superpuesta no están limitadas a las mencionadas anteriormente pero pueden invertirse.

Por conveniencia en la utilización, el soporte en fase sólida anterior se envasa preferentemente en forma de una unidad de ensayo.

El principio del ensayo con el dispositivo de ensayo de la invención no se explica con relación a la Fig. 2.

(3) Procedimiento de análisis en fase sólida

El tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento de ensayo en fase sólida que utiliza el dispositivo descrito anteriormente, que específicamente es un procedimiento en fase sólida para análisis del anticuerpo diana en una muestra que comprende poner la muestra en contacto con la primera zona del dispositivo de ensayo del anticuerpo y detectar el desarrollo de un color en el punto de ensayo de la segunda zona con la condición de que el punto de referencia de la segunda zona está indicando un color.

En este análisis, una muestra que se sospecha que contiene el anticuerpo diana se aplica en primer lugar a la primera zona (1) del soporte en fase sólida.

Para la aplicación de la muestra, puede utilizarse un fluido corporal tal como orina como está o tras la dilución con un diluyente adecuado. El diluyente no está particularmente limitado pero incluye varios tampones con una acción tampón dentro del intervalo de pH aproximadamente 5\sim9, preferentemente apropiado 6,5\sim8,5, (por ejemplo tampón citrato, tampón fosfato, tampón tris, tampón acetato, tampón borato, etc.), tensioactivos, etc.

Ya que las reacciones no específicas en la reacción antígeno-anticuerpo pueden suprimirse para reducir la frecuencia de un análisis con falso positivo realizando la reacción antígeno-anticuerpo en presencia de un componente de E. coli, resulta preferido utilizar un diluyente que contenga dicho componente de E. coli. La cantidad de componente de E. coli (LPS) que ha de incorporarse en el diluyente no está específicamente limitada pero preferentemente es tal que aproximadamente de 0,1\sim10 \mug, preferentemente de aproximadamente 0,5\sim5 \mug de dicho componente, estará disponible por \mug del ligando (antígeno) en el sistema de reacción, es decir, el punto de ensayo.

La cantidad de componente de E. coli (LPS) que ha de incorporarse en la muestra deber ser por ejemplo generalmente no inferior a 5 \mug/ml, preferentemente de 5\sim100 \mug/ml, más preferentemente de 10\sim50 \mug/ml. Aunque la utilización de una cantidad superior a 100 \mug/ml no es prohibitiva, el efecto de la inferior puede realizarse al nivel de adición de hasta 100 \mug/ml.

A medida que se aplica la muestra a la primera zona (1), se humedece la primera zona 1. La muestra aplicada circula a través de la primera zona (1) en la zona del trazador (2) por acción capilar y se pone en contacto y reacciona con el ligando marcado (anticuerpo IgG antihumano marcado con oro coloidal) soportado de forma separable en la zona del trazador.

Cuando se utiliza una muestra adecuada y el anticuerpo diana está contenido en la muestra, tanto el anticuerpo diana como el anticuerpo arbitrario contenido en la muestra se acoplan a dicho ligando marcado en la zona del trazador (2) para formar un complejo anticuerpo diana, ligando marcado y el complejo anticuerpo arbitrario/ligando marcado, respectivamente. Después del paso del mismo a través de la zona del trazador (2), los complejos respectivos o el ligando marcado que no forman dichos complejos se transportan junto con la muestra corriente abajo de la zona del trazador (2). En un modo preferido, el ligando marcado que no forma un complejo todavía se da un tiempo suficiente (espacio) para formar complejos a medida que se desplaza con la muestra que contiene el anticuerpo desde la zona del trazador (2) al punto de ensayo (5) de la segunda zona (3) por acción capilar. A medida que la muestra alcanza el punto de ensayo (5) en la segunda zona, el complejo anticuerpo diana, ligando marcado en la muestra se acopla al ligando soportado en el punto de ensayo (5) y se inmoviliza in situ. La muestra migra además corriente abajo por acción capilar para alcanzar el punto de referencia (6) donde el complejo anticuerpo arbitrario/ligando marcado se acopla al ligando (anticuerpo de inmunoglobulina antihumana) en este punto y se inmoviliza ahí. Entonces, al detectar los complejos inmovilizados en el punto de ensayo (5) y el punto de referencia (6) en la segunda zona según el componente del marcador de ligando marcado, el resultado del análisis puede indicarse como un ensayo positivo. En cambio, cuando una muestra que no contiene el anticuerpo diana se aplica, dicho complejo anticuerpo diana/ligando marcado que debe inmovilizarse en el punto de ensayo (5) no se forma de modo que el marcador no es detectado en este punto de ensayo (5) (ensayo negativo).

En relación con esto, la indicación de ensayo negativo en el punto de ensayo (5) incluye tanto una prueba negativa (falso negativo) debido a una baja concentración de la muestra (es decir una cantidad total pequeña de anticuerpo en la muestra) y un ensayo negativo (verdadero negativo) debido a la ausencia del anticuerpo diana en la muestra. Estos ensayos negativos no pueden diferenciarse unos de otros según el resultado en el punto de ensayo (5) solo. Sin embargo, en el caso de un ensayo de falso negativo, dicho complejo de ligando anticuerpo arbitrario/ligando marcado que debe inmovilizarse en el punto de referencia (6) no se forma de modo que el punto de referencia da una indicación negativa, mientras que en el caso de un ensayo de verdadero negativo, se forma dicho complejo anticuerpo arbitrario/ligando marcado de modo que el punto de referencia da una indicación positiva. Por consiguiente, en función de si la indicación en el punto de referencia sea negativa o positiva, es posible decir si el resultado negativo en el punto de ensayo (5) es un ensayo de falso negativo o un ensayo de verdadero negativo. Además, cuando se utiliza un ligando marcado que ha sido desactivado u otro ensayo apropiado no se realiza en un sistema apropiado, el punto de referencia (6) da una indicación negativa de modo que puede evitarse el descubrimiento de un ensayo de falso negativo debido a dichas causas.

El líquido de la muestra que contiene todos los anticuerpos no unidos, los ligandos marcados, etc. continúa hasta migrar más corriente abajo de la segunda zona (3) hasta la tercera zona (4). Opcionalmente, puede proporcionarse una zona indicadora y, en este caso, el frente líquido transporta el colorante desde la zona del indicador a la zona del punto final, indicando de este modo el paso del líquido y del colorante a través de una tercera zona y la terminación del ensayo.

La Fig. 3 presenta un ejemplo del dispositivo de análisis del anticuerpo de la invención para su utilización en posición horizontal. El soporte en fase sólida (A) que comprende la primera zona (1), la zona del trazador (2), la segunda zona (3) (incluyendo el punto de ensayo (5) y el punto de referencia (6) y una tercera zona (4) se aloja en un alojamiento (B) hecho de un material adecuado. El material del alojamiento es preferentemente un material plástico moldeable tal como poliestireno, aunque pueden utilizarse también otros materiales tales como vidrio, metal y papel. El alojamiento aloja una sección superior (7) que presenta varias aberturas y una sección inferior (8), y el soporte en fase sólida está dispuesto sobre la sección inferior del alojamiento y se cubre con la sección superior en la parte superior del mismo. Las aberturas (9) y (10) en la sección superior del alojamiento están colocadas en alineación con la serie de zonas del soporte en fase sólida y en las posiciones correspondientes a la primera zona (1) y segunda zona (3), respectivamente, del soporte en fase sólida.

La muestra puede aplicarse a la primera zona (1) del soporte desde la abertura (9) (orificio de alimentación de la muestra). La abertura (9) está preferentemente provista de una pared periférica de proyección alrededor de ella de modo que la pared puede ayudar al escurrimiento de la muestra líquida en la primera zona del soporte. El procedimiento para poner en contacto la muestra con la primera zona del soporte en fase sólida no está particularmente limitado pero la muestra gotea preferentemente desde dicho orificio de alimentación de la muestra perpendicularmente al plano del soporte en fase sólida.

La abertura (10) se coloca en una posición que permite un acceso visual a los puntos de ensayo y referencia en la segunda zona del soporte en fase sólida, con lo que la fijación del complejo ligando marcado/anticuerpo diana en el punto de ensayo y el del complejo ligando marcado/anticuerpo arbitrario en el punto de referencia, puede confirmarse a simple vista (orificio de detección, orificio de evaluación). La abertura (10) no necesita necesariamente ser un orificio único que permita un acceso visual a tanto el punto de ensayo como el punto de referencia sino que puede comprender dos orificios independientes para el punto de ensayo y el punto de referencia, respectivamente.

Con el dispositivo de análisis del anticuerpo de la presente invención, la presencia o ausencia del anticuerpo diana en una muestra así como la cantidad de anticuerpo pueden determinarse con gran precisión dejando el sistema analítico en reposo durante unos pocos minutos hasta 30 minutos, preferentemente de 5\sim20 minutos, después de la aplicación de la muestra, generalmente a una temperatura no superior a 45ºC, preferentemente de 4\sim40ºC, más preferentemente de 15\sim30ºC.

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(4) Kit de reactivos para análisis de anticuerpos

El procedimiento de análisis de anticuerpos descrito en (1) o el método de análisis en fase sólida que utilizan el dispositivo de ensayo de anticuerpos descrito en (2) puede realizarse de manera más conveniente cuando se utiliza el kit del reactivo del ensayo de anticuerpos que contiene una serie completa de varios reactivos y el equipo necesario para la determinación del anticuerpo.

La presente invención, de este modo, proporciona un kit de reactivo para el análisis de anticuerpos destinado de reducir a la práctica dicho método de análisis de anticuerpos y dicho método de análisis en fase sólida.

El kit con reactivo para análisis de anticuerpos según la presente invención se propone para su utilización con objeto de detectar y cuantificar un anticuerpo en una muestra mediante una reacción de antígeno-anticuerpo e, incluye un kit que contiene dicho componente de E. coli como componente del kit. Este kit del reactivo comprende además un antígeno inmovilizado opcionalmente adaptado para experimentar la reacción antígeno-anticuerpo con un anticuerpo diana que debe analizarse, un reactivo de análisis del anticuerpo y así sucesivamente. Además, por conveniencia en el análisis, este kit de reactivo puede incluir además un medio de reacción adecuado, diluyente, tampón de cera, terminador de la reacción y/o reactivo de ensayo de actividad del marcador.

Además, como otro modo, el kit del reactivo de análisis del anticuerpo de la invención puede incluir también un reactivo que presenta afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana, preferentemente un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.

Como un modo alternativo más, el kit del reactivo de análisis de anticuerpos de la invención puede contener dicho dispositivo para análisis del anticuerpo. El kit reactivo contiene además dicho componente de E. coli y opcionalmente dicha sustancia con afinidad específica para la zona Fc del IgG del anticuerpo diana. Además, el kit puede contener además accesorios tales como una pipeta y una ampolla (tubo) para su utilización en la dilución de la muestra además de dicho medio de reacción, diluyente, tampón de lavado, terminador de la reacción y el reactivo de análisis de actividad del marcador, entre otros reactivos.

Mejor modo de poner en práctica la invención

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención con mayor detalle y no debe considerarse que definen el alcance técnico de la invención. Debe apreciarse que los expertos en la materia pueden introducir fácilmente muchos cambios y modificaciones basándose en la descripción anterior de la invención sin apartarse del alcance técnico de la invención.

Ejemplo 1 Análisis de H. pylori (1) Preparación del antígeno de H. pylori

Se cultivó H. pylori (una cepa clínica) en medio de agar-agar de Brucella (Becton) durante 48 horas (10% de CO_{2}, 5% de O_{2}, 37ºC) y se recogieron las células del cultivo en PBS frío. Se lavaron las células con centrifugación con PBS en frío durante un total de 5 veces, y se añadió PBS frío con objeto de hacer una concentración celular de 100 mg/ml. Se añadió en agitación, un equivalente de Triton X-100 al 0,2% frío/PBS. Se agitó y se centrifugó la mezcla durante 5 minutos y el sobrenadante se recuperó como solución del antígeno de H. pylori y se almacenó a -80ºC.

(2) Preparación de una placa con antígeno de H. pylori

La anterior solución de antígeno de H. pylori (2,5 \mug de proteína/ml) se añadió a una placa de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo y se incubó a 4ºC durante la noche. Una vez lavados los pocillos con PBS una vez, se añadió una solución de bloqueo (Dulbecco, PBS [D-PBS], 1% de BSA, 5% de sorbitol, 0,05% de NaN_{3} [pH 7,4]), 300 \mul/pocillo y la placa se incubó a 4ºC durante la noche. Una vez que la solución de bloqueo descartada, se secó la placa a 25ºC durante la noche, se selló junto con un desecante en una bolsa de aluminio y se almacenó a 4ºC hasta su utilización.

(3) Preparación de un componente de E. coli

Se cultivó Escherichia coli (pvc18/JM109, Takara Shuzo) en medio LB líquido que contiene ampicilina (medio Luria-Bertani, Nippon Seiyaku) a 37ºC durante 18 horas. Se centrifugó el cultivo para recoger las células, que se lavaron con 2 fracciones de PBS. A las células lavadas se añadió PBS frío para preparar 100 mg/ml, y la mezcla se descompuso y se extrajo con un equipo de ultrasonidos (10 segundos \times 3). Se recuperó el sobrenadante para su utilización como componente de E. coli y se almacenó a -80ºC (denominado en adelante extracto de E. coli).

(4) Determinación del anticuerpo anti-H. pylori en la orina

Utilizando orina como muestra, se determinó el anticuerpo anti-H. pylori en la muestra.

A cada pocillo de la placa del antígeno de H. pylori preparada en (2), se añadieron 25 \mul de una primera solución del tampón (tampón Tris-HCl 200 mM, NaCl 0,14 M, 2% de caseína, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 0,1% de NaN_{3} [pH 7,3]) que contienen 20 \mug de proteína/ml del extracto de E. coli y 100 \mul de la muestra de orina. Se agitó la mezcla durante 10 segundos y se dejó reposar a 37ºC durante 1 hora. Se lavaron los pocillos con 6 porciones de PBST (0,05% de Tween 20 y 0,05% de NaN_{3} en PBS) y se añadieron 100 \mul de una dilución de 11.000 veces de un anticuerpo IgG antihumano marcado con enzima (HRP) (IgG antihumano de cabra pura conjugada por afinidad con peroxidasa (Fc), Jackson Immuno Research) en un segundo tampón (tampón Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,14 M, 0,5% de BSA, 5% de suero de cabra, 0,05% de Tween 20, 0,1% de XL-II [pH 7,3]). Se dejó reposar la placa a 37ºC durante 1 hora y, a continuación, se lavó con 6 fracciones de PBST.

A continuación, se añadieron 100 \mul de una solución de revelador de color (citrato 50 mM-Na_{2}HPO_{4}, 50% de solución TMB, 0,0075% de H_{2}O_{2}) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 20 minutos, al final de cuyo periodo se añadieron 100 \mul de un interruptor de la reacción (50% de solución de interrupción TMB, 50% de H_{2}SO_{4} 1 N) se añadió y se midió la absorbancia.

(5) Resultados

(i) En 5 casos de los casos positivos a H. pylori y el mismo número de casos negativos a H. pylori diagnosticados por el ensayo ^{13}C-UBT [J. Gastroenterol., 33, págs. 6-13, (1998)] que se considera el más exacta de todos los procedimientos de diagnóstico actualmente disponibles para la infección por H. pylori, se tomaron muestras de orina y se analizó el anticuerpo anti-H. pylori en la orina por el procedimiento descrito en (4).

Como experimento de referencia, se aplicó el mismo procedimiento para las mismas muestras de orina excepto que se omitió la adición del extracto de E. coli y, basándose en los resultados, se evaluó el efecto de la adición de un extracto de E. coli según la invención.

En la Fig. 4 se presentan los datos.

En la Fig. 4, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa la adición (+) o la omisión (-) del extracto de E. coli. Además, los círculos blancos representan los resultados en las muestras de orina de los pacientes positivos a H. pylori por el ensayo ^{13}C-UBT y los círculos negros representan los resultados en las muestras de orina de los pacientes negativos a H. pylori por el ensayo de ^{13}C-UBT.

Resulta evidente a partir de la Fig. 4 que al realizar los análisis en presencia de un extracto de E. coli según la presente invención, los casos positivos y negativos a H. pylori podrían discriminarse claramente de acuerdo con los resultados del ensayo ^{13}C-UBT, apoyando la gran precisión del procedimiento de la invención.

(ii) Utilizando muestras de orina de 99 voluntarios sanos que no tienen antecedentes de un tratamiento de erradicación contra H. pylori y 20 pacientes con enfermedad estomacal (7 casos de úlcera gástrica y 13 casos de gastritis), se ensayó el anticuerpo urinario anti-H. pylori en presencia del extracto de E. coli según el procedimiento descrito en (4). Los resultados se presentan en la Fig. 5. En la Fig. 5, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450 nm) y la abscisa representa los grupos según el ensayo ^{13}C-UBt (casos positivos y negativos). Los resultados indicaron que, en el sistema de ensayo que contiene el extracto de E. coli, todas las muestras de orina de pacientes negativos dieron resultados definitivamente negativos sin un resultado de falso positivo.

(iii) Las cantidades del anticuerpo anti-H. pylori en sueros de los mismos pacientes inscritos en el experimento (ii) se determinaron con kits comerciales de ELISA y los resultados se compararon con los resultados de los ensayos en orina por el procedimiento de la invención en los mismos pacientes con respecto a la sensibilidad, especificidad y precisión. Las muestras de suero y orina de cada paciente se recogieron simultáneamente y se prepararon para los análisis.

Los kits comerciales de ELISA fueron los siguientes: kit HM-CAP^{TM}, Enteric Products (HM-CAP); kit Helico G^{TM}, Shield Diagnostic (Helico G); y kit HEL-p Test^{TM}, Amrad Biotech (HEL-p). Cada análisis se realizó de acuerdo con el protocolo adjunto a cada kit. Los resultados se presentan en la Tabla 1.

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TABLA 1

1

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Con relación a la Tabla 1, "Sensibilidad" significa la proporción positiva generada con cada kit en los pacientes positivos a H. pylori (positivos a la infección según el ensayo ^{13}C-UBT: n=70), "Especificidad" significa la proporción negativa genera con cada kit en los pacientes negativos a H. pylori (negativos a la infección según el ensayo ^{13}C-UBT: n= 49) y "Precisión" significa el porcentaje de resultados exactos con cada kit en la población total (70+49=119 pacientes).

Resulta evidente que a pesar de la utilización de muestras de orina que contienen solamente trazas del anticuerpo, la determinación del anticuerpo anti-H. pylori por el procedimiento de la invención proporcionó mayor sensibilidad y especificidad de la detección así como una precisión significativamente mayor en comparación con los kits convencionales de análisis del anticuerpo de la sangre.

(6) Análisis del anticuerpo anti-H. pylori en orina

Utilizando un primer tampón que contiene LPS de E. coli (Difco) (concentración de LPS: 5 \mug/pocillo) en lugar del extracto de E. coli, se repitió de otra manera el procedimiento (4) para determinar el anticuerpo anti-H. pylori en muestras de orina y los resultados se evaluaron de la misma manera que en (5) (i). Los resultados se presentan en la Fig. 6. Resulta evidente a partir del diagrama que pueden obtenerse resultados similares utilizando LPS de E. coli en lugar de dicho extracto de E. coli.

Ejemplo 2 Análisis del anticuerpo del virus antihepatitis B (HBc) (1) Análisis del anticuerpo del virus antihepatitis B (HBc)

Se preparó una placa de antígenos utilizando antígeno HBc (Chemicon International) según el procedimiento del Ejemplo 1 (2) y el análisis del anticuerpo antihepatitis B (núcleo) (HBc) en muestras de orina se realizó según el Ejemplo 1 (4).

De este modo, se añadieron a cada pocillo de la placa con antígeno HBc 25 \mul del primer tampón que contiene el extracto de E. coli en una concentración variable y 100 \mul de orina de la muestra y después de agitación durante 10 segundos se dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora. Después se lavó la placa con 6 porciones de PBST, 100 \mul de una dilución de 11.000 veces de anticuerpo anti-IgG humana marcado con enzima (HRP) en un segundo tampón se añadió y se dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora y a continuación se lavó (6 veces con PBST).

A continuación, se añadieron 100 \mul de una solución de revelador de color y se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 20 minutos, tras los cuales se añadieron 100 \mul de una solución para interrupción de la reacción y se midió la absorbancia.

(2) Resultados

En 5 casos positivos y 5 negativos de anticuerpo antihBc de sangre clasificados por los análisis que utilizan un kit de análisis de anticuerpo antihBc comercial (Dinabott), se determinó el anticuerpo antihBc en la orina por el procedimiento descrito en (1).

Las concentraciones del extracto de E. coli en las mezclas de la reacción se fijaron en 0, 0,78, 1,56, 3,13, 6,25 y 12,5 \mug/ml y se evaluó el efecto de la adición del extracto. En la Fig. 7 se presentan los resultados.

En la Fig. 7, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650) y la abscisa representa el nivel de adición del extracto de E. coli. Además, los círculos negros representan los datos sobre el anticuerpo urinario en pacientes con anticuerpo antihBc de sangre positivo y los círculos blancos representan los datos sobre el anticuerpo urinario en pacientes con anticuerpo antihBc de sangre negativo. Resulta evidente a partir del diagrama que aún cuando se utilicen muestras de orina, la diferencia en el nivel de detección de anticuerpo antihBc entre el grupo de pacientes con anticuerpo antihBc en sangre positivo y el grupo de los que tienen anticuerpo antihBc en sangre negativo será más destacado en relación con el nivel de adición del extracto de E. coli.

Ejemplo 3

Utilizando muestras de orina que dieron análisis de falso positivo en la determinación del anticuerpo anti-VIH en orina por un método de análisis conocido [Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA: Arch. Pathol. Lab. Med., 119, 139-141 (1995); Clinical Infectious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)], se realizó un experimento explorador para identificar el compuesto supuestamente responsable de una reacción no específica en el mismo sistema analítico.

(1) Cada una de las muestras de orina anteriores se ajustó a pH 7,4 con tampón fosfato 1 M (pH 7,7) y se filtró a través de filtros de corte de 5,0, 0,8 y 0,2 \mum. Una fracción de 20 ml del filtrado se concentró por ultrafiltración (una membrana de corte de 10 kDa) hasta 2 ml. La orina concentrada se sometió a cromatografía de permeación con gel (Sephacryl S-300, Pharmacia) y en cada fracción se analizó su reactividad al antígeno del VIH.

Se confirmó la reactividad al antígeno del VIH dando lugar a que cada fracción reaccione con una placa inmovilizada con antígeno del VIH preparada inmovilizando el antígeno del VIH (gp160) y detectando el conjugado (componente de la unión inespecífica) con el anticuerpo antihumano de cabra marcado con ALP (IgG+IgM), anticuerpo IgG antihumano de cabra marcado con ALP (específico para Fc) o anticuerpo IgG antihumano de cabra marcado con HRP (específico para Fab) (disponibles todos en Jackson ImmunoResearch Labs). Los resultados se presentan en la Fig. 8.

En la Fig. 8, la ordenada representa la absorbancia (D.O) y la abscisa representa las fracciones cromatográficas por permeación en gel (fracciones nº). La línea negra representa la absorbancia de la proteína a 280 nm y la línea de círculos negros representa el resultado de la detección con dicho anticuerpo antihumano (IgG+IgM), la línea de triángulos blancos representa el resultado de la detección con dicho anticuerpo IgG antihumano (específico para Fc) y la línea de triángulos negros representa el resultado de la detección con dicho anticuerpo IgG antihumano (específico para Fab).

A partir de la Fig. 8 resulta evidente que en la detección con el anticuerpo IgG antihumano (específico para Fab), el modo de reacción (reactividad con el componente de la unión inespecífica) es el mismo que en la detección con el anticuerpo antihumano (IgG+IgM), aunque no se encuentra ninguna reactividad con el anticuerpo IgG antihumano (específico para Fc). Este descubrimiento sugería que el componente de la unión inespecífica es un fragmento o producto de desnaturalización del IgG humano que conserva la reactividad con el anticuerpo IgG antihumano (específico para Fab) sin zona Fc.

Por consiguiente, resulta evidente que cuando se utiliza un anticuerpo de la IgG antihumano (específico para Fc) no reactivo con dicho componente de unión inespecífica como reactivo de análisis, puede inhibirse la reacción no específica en el sistema de detección del anticuerpo y, en consecuencia, la incidencia de un análisis de falso positivo debida a dicha reacción no específica , con el resultado de que puede proporcionarse un método de análisis del anticuerpo muy específico y muy preciso.

Ejemplo 4 Análisis de anticuerpo anti-VIH en orina

A cada pocillo de una placa con antígeno VIH (Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA, Calypte BioMedical Corp.), se añadieron 25 \mul del primer tampón (tampón de muestra de Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA) y 200 \mul de orina de la muestra y después de 10 segundos de agitación, se dejó reposar la placa a 37ºC durante 1 hora. Después se lavó esta placa 6 veces (agua de lavado: D-PBS, Tween 20 al 0,05%), se añadieron 100 \mul de una dilución de 11.000 veces de anticuerpo (específico para Fc) de IgG antihumana de cabra marcado con HRP ((IgG antihumana de cabra pura de Affini conjugada con peroxidadsa, específica para el fragmento Fc, Jackson ImmunoResearch Labs.) en el segundo tampón (tampón Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,14 M, BSA al 0,5%, suero de cabra al 5%, Tween 20 al 0,05%, XL-II al 0,1% (pH 7,3)) y se dejó reposar la placa a 37ºC durante 1 hora y se lavó (6 veces) de la misma manera que anteriormente.

A continuación se añadieron 100 \mul de un revelador de color (solución TMB al 50%, citrato 50 mM-Na_{2}HPO_{4}, H_{2}O_{2} al 0,0075%) y se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 10 minutos, al final de los cuales se añadieron 100 \mul de una solución de interrupción de la reacción (interruptor TMB al 50%, 50% de H_{2}SO_{4} 1 N) y se midió la absorbancia (D.O. 450 nm).

Como experimento de referencia, se analizó la muestra por el método de análisis conocido [Calypte^{TM} HIV-1 Urine EIA: Arch. Pathol. Lab. Med., 119, 139-141 (1995); Clinical Infectious Diseases, 19, 1100-1104 (1994)] (procedimiento de referencia) utilizando el anticuerpo de inmunoglobulina antihumano de cabra marcado con ALP como segundo anticuerpo. Además, la referencia negativa y la referencia positiva del kit de análisis anterior se midieron por el procedimiento analítico anterior de la invención. Como los valores de la absorbancia encontrados de este modo eran comparables a los hallados con el kit anterior, el punto de corte por el método de la invención se fijó en el valor hallado añadiendo 0,180 a la absorbancia media de la referencia negativa anterior según el método de cálculo de valor de corte del mismo kit.

Los resultados del análisis en 100 muestras (orina) de pacientes con anticuerpo anti-VIH de suero positivo (2 casos) y pacientes con anticuerpo anti-VIH de suero negativo (98 casos) se presentan en la Tabla 2.

TABLA 2

2

*:

De estos 4 pacientes, 2 son pacientes con anticuerpo anti-VIH de suero positivo.

En la Tabla 2 puede apreciarse que aunque tanto la sensibilidad del método de la invención como la del método de referencia eran del 100% (2/2), la especificidad fue del 71,4% (70/98) para el método de referencia frente al 98% (96/98) para el método de la invención.

Los resultados anteriores indican que en comparación con el método de referencia, el método de análisis del anticuerpo de la invención es notablemente bajo en la frecuencia de un análisis de falso positivo y muy alto en especificidad.

Ejemplo 5 Análisis del anticuerpo anti-H. pylori en orina (1) Preparación de una placa con antígenos de H. pylori

A una suspensión de 100 mg/ml de Helicobacter pylori (cepa clínica) en Dulbecco-PBS frío preparada de la forma rutinaria [J. Clin. Microbiol., 29: 2587-2589 (1991)], se añadió un volumen igual de solución fría de Triton-X al 0,2% en agitación constante con un agitador y la mezcla se agitó más durante 5 minutos y se centrifugó (3.000 rpm, 20 min.). Se transfirió el sobrenadante a un nuevo tubo para su utilización como extracto (1\sim1,5 mg/ml como proteína).

Este extracto se diluyó con D-PBS (2,5 \mug/ml) y la dilución se distribuyó en una placa de 96 pocillos, 100 \mul por pocillo y se incubó a 25ºC durante la noche. Una vez lavado cada pocillo, se añadieron 300 \mul de una solución de bloqueo (D-PBS, caseína al 0,5%, sorbitol al 5%, NaN_{3} al 0,05% (pH 7,4)), seguido de incubación a 25ºC durante la noche. La solución de bloqueo se descartó a continuación y se secó la placa a 25ºC durante la noche, se secó junto con un desecante en una bolsa de aluminio y se guardó a 4ºC hasta su utilización.

(2) Análisis

Utilizando el antígeno inmovilizado (placa) preparado como anteriormente, se analizó el anticuerpo anti-H. pylori en muestras de orina como en el Ejemplo 4.

De este modo, se añadieron a cada pocillo 25 \mul del primer tampón (tampón Tris-HCl 200 mM, NaCl 0,14 M, caseína al 2%, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, NaN_{3} al 0,1%, 20 \mug/ml de extracto de E. coli (pH 7,3)) y 100 \mul de orina de la muestra y después de agitación durante 10 segundos, se dejó en reposo la placa a 37ºC durante 1 hora y a continuación se lavó 6 veces. Exactamente como en el Ejemplo 4, se añadieron 100 \mul de dicha dilución del anticuerpo de IgG antihumano de cabra marcado con HRP (específico para Fc) en el segundo tampón y se dejó la placa en reposo a 37ºC durante 1 hora para detectar el anticuerpo. Los resultados obtenidos se presentan en la Fig. 9 y en la Tabla 3.

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TABLA 3

3

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En la Fig. 9, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo de infección por H. pylori positivo (+; n=56) y el grupo de infección por H. pylori negativo (-; n=44) según el ensayo ^{13}C-UBT [J. Gastroenterol., 33: págs. 6-13 (1998)].

En la Tabla 3, "Sensibilidad" indica el porcentaje de casos detectados como positivos entre los casos positivos según el ensayo ^{13}C-UBT; "Especificidad" indica el porcentaje de casos detectados como negativos entre los casos negativos según el ensayo ^{13}C-UBT; y "Precisión" significa el porcentaje de casos detectados como positivos y negativos, respectivamente, entre los casos positivos y negativos según el ensayo ^{13}C-UBT, las respectivas figuras correspondiente al punto de corte de M+3SD o M+5SD. Como experimento de referencia, se analizaron las mismas muestras de orina con un kit de análisis del anticuerpo anti-H. pylori en el suero [HM-CAP; EPI/Kyowa Medics (K.K.)] y los resultados se tabularon también (método de referencia).

Los resultados anteriores indican que el procedimiento de la invención es superior al método de referencia en sensibilidad y precisión en concreto.

Ejemplo 6 Análisis del anticuerpo del virus antirrubéola en la orina (1) Preparación de la placa con antígenos de rubéola

Utilizando un antígeno comercial de rubéola [disponible en BIO-DESIGN] a una concentración de 1 \mug/ml y un agente de bloqueo compuesto por D-PBS, BSA al 1%, sorbitol al 5% y NaN_{3} al 0,05% (pH 7,4), se repitió de otra manera el procedimiento del Ejemplo 5 (1) para proporcionar una placa con antígenos de rubéola.

(2) Análisis

Utilizando la placa con antígenos anterior, se analizó el anticuerpo de la rubéola en muestras de orina de la misma manera que en el Ejemplo 5 (2). Los resultados se presentan en la Fig. 10 y en la Tabla 4.

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TABLA 4

4

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En la Fig. 10, la ordenada representa la absorbancia (D.O. 450\sim650 nm) y la abscisa representa el grupo positivo al anticuerpo antirrubéola en el suero (n=76) y el grupo negativo (n=23) según los resultados de la determinación con un kit comercial (Rubella IgG (II)-EIA, SEIKEN; disponible en Denka Seiken). Los datos proporcionados en la Tabla 4 indican un acuerdo completo entre el resultado obtenido en la orina por el procedimiento de la invención y el resultado obtenido en los sueros por el procedimiento de referencia.

Según los datos anteriores, el grado de coincidencia entre el procedimiento de la invención y el procedimiento de control es tan elevado como el 100% (99/99), indicando de este modo que la invención permite la detección del anticuerpo con gran sensibilidad y gran especificidad aun en la orina que es segura y conveniente y es, por consiguiente, de gran utilización en el examen de laboratorio.

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Ejemplo 7 Construcción de un dispositivo de análisis del anticuerpo (1) Preparación de un antígeno de H. pylori

Se preparó una solución del antígeno de H. pylori por el mismo procedimiento que en el Ejemplo 1 (1) y se guardó a -80ºC.

(2) Preparación de una fibra de vidrio seca que contiene anticuerpo IgG antihumano marcado

A una hoja de fibra de vidrio (espesor 5,0 mm \times 260 mm \times 0,8 mm; Whatman) se le añadió 1 ml de una solución del anticuerpo de IgG antihumano marcado con oro coloidal de 40 nm (diámetro) (específico para Fc) y la hoja se secó durante la noche. Esta hoja se almacenó junto con un desecante a temperatura ambiente hasta su utilización.

(3) Preparación de una membrana

La solución del antígeno de H. pylori (3 mg/ml) preparada en (1) anterior y la solución del anticuerpo de IgG antihumano (0,3 mg/ml) se aplicaron respectivamente a una membrana de nitrocelulosa (26,5 mm \times 260 mm \times espesor de 0,1 mm; Advance MicroDevice) atomizando (1,5 \mul/cm) en líneas a un espaciado predeterminado como se ilustra en la Fig. 11 y se secó a 37ºC durante 120 minutos. Después del secado, la membrana se sumergió y se lavó en un tampón de Borax que contenía crema de leche (pH 8,2) durante 30 minutos. La membrana lavada se secó a 37ºC durante 1 hora y se guardó en presencia de un desecante a temperatura ambiente.

(4) Montaje (soporte en fase sólida)

Como se ilustra en la Fig. 3 (A), la membrana (3) anterior, se pegaron una almohadilla de papel de filtro absorbente (4) (espesor 22 \times 260 mm \times 1,5 mm; Whatman), dicha hoja de fibra de vidrio que contiene el anticuerpo marcado (2) y una almohadilla de la muestra (1) (espesor 15 \times 260 mm \times 1,0 mm; papel de filtro, Whatman) junto con un adhesivo y se cortaron en 5 mm de espesor.

El soporte en fase sólida de este modo se colocó en posición en una sección del fondo (8) de un alojamiento plástico y una sección superior (7) provista de un orificio de entrada de la muestra (9) y una ventana de detección (10) en serie se colocó sobre el soporte en fase sólida y se ajustó con seguridad en la sección del fondo (8).

Ejemplo 8 Análisis del anticuerpo anti-H. pylori en orina

Utilizando el dispositivo construido en el Ejemplo 7, se realizó el análisis del anticuerpo anti-H. pylori en 3 tipos de muestras de orina, a saber muestras de orina de pacientes con infección por H. pylori, muestras de orina de pacientes sin infección de H. pylori y muestras sumamente pobres de orina de pacientes con infección por H. pylori.

En primer lugar, se añadieron 500 \mul de orina de la muestra a 500 \mul de un diluyente de la muestra [tampón Tris-HCl 200 mM, NaCl 0,14 M, caseína al 2%, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05%, NaN_{3} al 0,1% (pH 7,3), LPS 50 \mul/ml de E. coli (Difco)], seguido de mezclado. Se añadieron seis gotas (aproximadamente 150 \mul) de la dilución resultante desde el orificio de entrada para la muestra (9) del dispositivo construido en el Ejemplo 7 para adsorción sobre el soporte que se dejó a continuación reposar durante 20 minutos. Como resultado, cuando se utilizó una muestra de orina calificada, apareció una banda de color rosa \sim rojo en la zona de referencia de la ventana de detección (10). Por otra parte, cuando se utilizó una muestra de orina sin calificar extremadamente pobre, ni la zona de ensayo ni la zona de referencia de la ventana de detección (10) presentaban un desarrollo de color, lo que indica que la muestra no era evaluable. Cuando la muestra era una muestra de orina calificada de un paciente sin infección por H. pylori, aparecía una banda de color rosa \sim rojo solamente en la zona de referencia de la ventana de detección (10) que presenta un análisis negativo (verdadero negativo) para la infección por H. pylori, mientras que en presencia de infección por H. pylori, aparecía una banda de color rosa \sim rojo tanto en la zona de ensayo como en la zona de control de la ventana de detección (10), que presenta un análisis positivo para H. pylori.

Ejemplo 9 Análisis del anticuerpo anti-H. pylori en orina (1) Preparación de un componente de E. coli

Se cultivó Escherichia coli (pvc18/JM109; Takara Shuzo) en medio LB líquido que contenía ampicilina (medio Luria-Bertani; Nihon Seiyaku) a 37ºC durante 18 horas y las células cultivadas se recogieron por centrifugación y se lavaron con 2 fracciones de PBS. A continuación, se añadió PBS frío a una concentración final de células de 100 mg/ml y las células se descompusieron y extrajeron utilizando un aparato de ultrasonidos (10 segundos \times 3 veces). Se utilizó el sobrenadante resultante como extracto proteico de E. coli.

(2) Utilizando el extracto de proteínas de E. coli preparado anterior (1) en lugar del LPS de E. coli añadido al diluyente de la muestra en el Ejemplo 8, el procedimiento del Ejemplo 8 se repitió de otra manera para determinar los anticuerpos anti-H. pylori en muestras de orina. Como resultado, se obtuvieron los mismos resultados que los descritos en el Ejemplo 8.

Ejemplo 10

Utilizando la referencia de la sangre completa, la referencia del plasma y la orina de 21 pacientes positivos a la infección por H. pylori y el mismo número de pacientes negativos a la infección por H. pylori (un total de 42 casos) según el ensayo ^{13}C-UBT [J. Gastroenterol., 33: 6-13 (1998)], se analizaron los anticuerpos anti-H. pylori en las muestras por el procedimiento descrito en el Ejemplo 8.

Como experimento de referencia, se analizaron las muestras de los mismos pacientes respectivamente utilizando kits para análisis del anticuerpo de H. pylori comercial dirigidas a la sangre completa o al plasma y se evaluó la eficacia del dispositivo de la invención a partir de los datos. Los resultados se presentan en la Fig. 12.

En la Fig. 12, los kits de referencia A a H fueron los siguientes.

A:

Helitest (fabricado por Cortecs Diagnostics)

B:

H. pylori-Check-1

(fabricado por Bio-Medical Products)

C:

First Check H. pylori

(fabricado por Worlwide Medical Corp)

D:

Biocard Helicobacter pylori IgG

(fabricado por Anti Biotech Oy)

E:

Insta Test H. pylori

(fabricado por Cortez Diagnostics Inc.)

F:

One Step H. pylori Test

(fabricado por Teco Diagnostics)

G:

H. pylori SPOT

(fabricado por International Immuno-Diagnostics)

H:

Quick Stripe H. pylori

(fabricado por Diatech Diagnostics Inc.)

En la Fig. 12, "Especificidad" indica el porcentaje de análisis negativos (proporción negativa) tal como se encuentra analizando las muestras negativas por el análisis ^{13}C-UBT con el correspondiente kit y "Sensibilidad" indica el porcentaje de análisis positivos (proporción positiva) tal como se encuentra analizando las muestras positivas por el análisis ^{13}C-UBT con el correspondiente kit.

Resulta evidente a partir de los datos en la Fig. 12 que el dispositivo de análisis de anticuerpos y el método de análisis en fase sólida de la presente invención proporciona sistemas de análisis excelentes con gran especificidad y precisión de detección aun cuando se apliquen a muestras de orina, sin hablar de muestras de sangre (sangre completa, plasma) a título de referencia.

Resulta asimismo evidente a partir de los resultados anteriores que aun cuando la muestra sea una muestra de orina que es segura y conveniente, la presente invención permite gran sensibilidad, gran especificidad de detección de anticuerpos, siendo de este modo de gran utilidad en el examen de laboratorio.

Ejemplo 11 Efecto de un componente de E. coli sobre el análisis de anticuerpos en orina

(1) El efecto de un componente de E. coli sobre el análisis de anticuerpos en orina se evalúa utilizando el dispositivo de análisis construido en el Ejemplo 8. De este modo, utilizando la orina de pacientes positivos y negativos a la infección por H. pylori seleccionados mediante el análisis ^{13}C-UBT, los anticuerpos anti-H. pylori en muestras de orina se analizaron en un sistema utilizando un diluyente de la muestra que no contiene LPS de E. coli (diluyente 1) y sistemas que utilizan el mismo diluyente enriquecido con LPS de E. coli a varias concentraciones mostradas en la Tabla 5. El desarrollo del color de la línea en la zona de ensayo y en la zona de referencia se evaluó a partir de la intensidad lineal medida con un densitómetro (fabricado por ATTO). En la Tabla 5 se presentan los resultados.

TABLA 5

5

Se descubrió que cuando se añadía LPS de E. coli a la muestra a 11,1 \mug/ml a concentraciones superiores, la reacción no específica observada con el diluyente 1 desaparecía de modo que un análisis de falso positivo (error de detección) podría preverse.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona una tecnología para análisis de anticuerpos mediante la que los anticuerpos diana específicos para fuentes de infección pueden detectarse con gran sensibilidad y gran especificidad aun cuando las muestras de orina que son comparativamente pobres en anticuerpos se utilicen como muestras de análisis. Según el método de análisis del anticuerpo de la invención, las reacciones de "falso positivo" debidas a contaminantes en muestras pueden inhibirse significativamente de modo que pueden obtenerse resultados analíticos muy precisos y fiables. Además, la presente invención proporciona mejoras en inmunocapilaridad o análisis inmunocromatográficos, con lo cual la existencia de anticuerpos diana y sus cantidades en muestras puede detectarse con precisión con una clara distinción entre un "falso negativo" y "verdadero negativo".

Claims (15)

1. \global\parskip0.900000\baselineskip

   1. Procedimiento para suprimir una reacción no específica en un inmunoanálisis, que comprende:

   realizar un inmunoanálisis en una muestra de orina, en el que dicha muestra de orina comprende un anticuerpo diana, y en el que, en dicho inmunoanálisis

   se realiza una reacción entre dicho anticuerpo diana y un antígeno de análisis en presencia de un componente de E. coli para suprimir así las reacciones no específicas; y

   en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno, o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que ha sido preparado artificialmente por síntesis química.
2. 2. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, en el que el componente de E. coli es por lo menos un elemento seleccionado de entre una fracción soluble y una fracción lipopolisacárida de E. coli.
3. 3. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1 ó 2, en el que se inmoviliza dicho antígeno de análisis.
4. 4. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra una fuente de infección seleccionada de entre el grupo constituido por un virus, una bacteria y un protozoo.
5. 5. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en el que el anticuerpo diana es un anticuerpo contra Helicobacter pylori.
6. 6. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la fuente de dicho antígeno de análisis se selecciona de entre virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la hepatitis, virus de la rubéola, virus de la gripe, virus del sarampión, virus del herpes, citomegalovirus, Clamydia, gonococos, Helicobacter pylori y Toxoplasma gondii.
7. 7. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho antígeno de análisis se selecciona de entre una bacteria, un virus, un protozoo, un componente de una bacteria que comprende un grupo determinante antigénico de la bacteria, un componente de un virus que comprende un grupo determinante antigénico de un virus y un componente de un protozoo que comprende un grupo determinante antigénico de los protozoos.
8. 8. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho antígeno de análisis es el Helicobacter pylori o un componente de Helicobacter pylori que comprende un grupo determinante antigénico de Helicobacter pylori.
9. 9. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el componente de E. coli se selecciona de entre un componente proteico de E. coli, un componente de carbohidratos de E. coli, un componente lipídico de E. coli y una mezcla de los mismos.
10. 10. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el inmunoanálisis se realiza mediante la técnica sándwich.
11. 11. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el inmunoanálisis se realiza mediante la técnica sándwichy comprende una etapa de utilización de una sustancia que presenta afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana como reactivo de análisis del anticuerpo.
12. 12. Procedimiento para suprimir una reacción no específica según la reivindicación 11, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.
13. 13. Kit de reactivos, que comprende un antígeno de análisis para detectar el anticuerpo diana, un reactivo de análisis del anticuerpo y un componente de E. coli, para realizar el procedimiento para suprimir una reacción no específica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho antígeno de análisis es un patógeno, un patógeno inactivado, un antígeno preparado extrayendo un patógeno o un antígeno que presenta los grupos determinantes antigénicos intrínsecos para un patógeno que se ha preparado artificialmente por síntesis química.
14. 14. Kit de reactivos según la reivindicación 13, en el que el reactivo de análisis del anticuerpo es una sustancia que presenta una afinidad específica para la zona Fc del anticuerpo IgG diana.
15. 15. Kit de reactivos según la reivindicación 14, en el que el reactivo para análisis de anticuerpos es un anticuerpo anti-IgG específico para Fc.