ES2207027T3 - Metodo de determinacion de un analito en una muestra usando una matriz de flujo que comprende la adicion de reactivos en dos o mas posiciones de la matriz. - Google Patents
Metodo de determinacion de un analito en una muestra usando una matriz de flujo que comprende la adicion de reactivos en dos o mas posiciones de la matriz.Info
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Abstract
Un método de determinación de un analito en una muestra, en una matriz de flujo por medio del uso de un flujo de transporte de uno o más reactivos de afinidad bioespecífica, de los que al menos uno es detectable analíticamente (reactivo) y el otro está firmemente anclado a la matriz (reactivo I), comprendiendo la matriz de flujo: A) una zona de aplicación del líquido (LZ), que contiene el tampón y la muestra y, opcionalmente, uno o más de los reactivos, pero no el reactivo I, B) una zona de detección (DZ) localizada corriente abajo de la LZ con el reactivo firmemente anclado (reactivo I), y C) opcionalmente, una o más zonas en las que se ha predepositado cualquiera de los reactivos, donde (i) el flujo hacia la zona de detección se inicia por la adición del líquido con la muestra en la zona de aplicación LZS para el transporte del analito y de los reactivos hacia la zona de detección (DZ), y (ii) se detecta la cantidad de reactivo unido a DZ, estando relacionada la cantidad detectada con lacantidad de analito en la muestra, caracterizado porque I. la matriz de flujo comprende al menos dos zonas de aplicación de líquido dispuestas substancialmente adyacentes entre sí donde a) LZn es una zona de aplicación de líquido, y n es la posición de la zona de aplicación LZn, b) m es el número total de zonas de aplicación en las que se inicia el flujo (m 2), c) una LZn es una zona de aplicación para la muestra (LZn''S) y otra LZn es para el reactivo (LZn"R) con n" n'', d) ----> es la dirección del flujo, y e) DZ es la zona de detección, y II. el flujo se inicia por la adición de líquido a cada zona LZm .. LZn .. LZ1 (m n) de tal manera que el líquidon+1, añadido a la zona de aplicación LZn+1'' contacte con la matriz de flujo de una forma substancialmente simultánea y se transporte a través de la matriz inmediatamente después del líquidon, añadido a la zona de aplicación más próxima corriente arriba LZn.
Description
Método de determinación de un analito en una
muestra usando una matriz de flujo que comprende la adición de
reactivos en dos o más posiciones de la matriz.
La invención se refiere a un método de
determinación de un analito en una muestra usando reactivos de
afinidad bioespecífica (reactivo 1, reactivo 2, etc.), de los que
uno es detectable desde un punto de vista analítico (reactivo*) y
otro está firmemente anclado en una zona de detección de una matriz
de flujo de transporte (reactivo I). La muestra (analito) se
transporta en la matriz por un flujo desde una zona de aplicación
de líquido (LZS) que contiene el analito (muestra) y/o un tampón,
hasta la zona de detección (DZ), en la que el reactivo I está
firmemente anclado. Al mismo tiempo que la muestra se transporta en
la matriz, también están siendo transportados los reactivos
solubles, incluyendo el reactivo*. En la zona de detección, se
captura el reactivo* en una cantidad que está relacionada con la
cantidad de analito presente en la muestra. Para conseguir esto, se
elige el reactivo* de manera que pueda unirse directamente de forma
bioespecífica al reactivo I o indirectamente a través de uno o más
reactivos de afinidad bioespecífica añadidos (incluyendo el
analito). Entonces, se determina la cantidad de analito a partir de
la cantidad de reactivo* unido a la zona de detección. El flujo de
transporte puede contener zonas en las que se hayan aplicado con
anterioridad (predepositado) diferentes reactivos de afinidad
bioespecífica (por ejemplo, el reactivo*, pero no el analito) para
que se disuelvan y se transporten junto con el flujo hacia la zona
de detección.
Por reactivos (incluyendo el analito) que
muestran afinidad bioespecífica (reactivos de bioafinidad), se
entienden miembros individuales de los pares de reactivos: antígeno/
hapteno-anticuerpo;
biotina-avidina/estreptavidina; dos cadenas
sencillas complementarias de ácido nucleico, etc. Se consideran
anticuerpos que se unen a antígenos fragmentos de anticuerpo tales
como Fab, F(ab)_{2}', anticuerpos Fv de una sola
cadena (scFv) etc. Los reactivos pertinentes no tienen que ser
naturales, sino que también pueden ser moléculas/agentes de unión
producidos de forma sintética.
El tipo de metodología de ensayo en cuestión se
ha usado con anterioridad principalmente para reactivos de afinidad
bioespecífica donde al menos una parte del par de reactivos
empleados mostraba estructura de proteína, en particular, en
relación con los denominados procesos de determinación
inmunoquímicos.
Las reacciones de afinidad bioespecífica se
llevan a cabo principalmente en medios acuosos (por ejemplo,
agua).
La técnica en cuestión es bien conocida y se ha
aplicado a menudo en las denominadas tiras de ensayo, donde la tira
funcionaba como una matriz de flujo. El flujo se iniciaba en la
zona en la que se añadía la muestra (LZS). Con frecuencia, el flujo
era lateral, es decir, paralelo a la superficie de la matriz, o de
otros tipos, por ejemplo, profundo en la matriz.
Los protocolos de ensayo fueron de los
denominados de tipo inhibidor (competitivo) o de tipo no inhibidor
(no competitivo, sándwich). Véase, por ejemplo, Behringwerke,
documento US 4.861.711; Unilever, documento WO 88/08534; Abbot,
documento US 5.120.643; Becton Dickinson, documentos EP 284.232 y
US 4,855,240; Abbot/Syntex, documento US 4.740.468; Pharmacia AB,
documento WO 96/22532, etc.
En este contexto, a menudo se mencionan métodos
(protocolos) simultáneos y secuenciales en relación con ciertos
reactivos (especialmente analito y reactivo*). En las variantes
simultáneas, el analito (muestra) y el reactivo pertinente, por
ejemplo, el reactivo*, se transportan simultáneamente a la zona de
detección. Pueden obtenerse variantes simultáneas si una muestra se
preincuba/mezcla con el reactivo* o si el reactivo* se ha
predepositado en la zona de aplicación de la muestra o en una zona
corriente abajo de la zona de aplicación de la muestra, pero antes
de la zona de detección. En las variantes secuenciales, el analito
(muestra) se transporta antes del reactivo, por ejemplo el
reactivo*, a la zona de detección. Pueden obtenerse variantes
secuenciales si el reactivo pertinente, por ejemplo el reactivo*, se
añade a la misma zona de aplicación que la muestra, después de que
la muestra (analito) se haya transportado fuera de la zona. Se
describe una variante de la metodología secuencial en el documento
US 4.855.240 (Becton & Dickinson). Como una alternativa a la
muestra (analito) que se transporta antes del "indicador" (=
reactivo*) en el mismo flujo de transporte, el documento US
4.855.240 describe flujos de transporte separados en los que el
tiempo de transporte se regula de tal forma que la muestra
(analizada) alcanza la zona de detección antes que el
"indicador" (reactivo*). En el documento EP 306.336 de Syntex
(U.S.A) Inc., se usa otra variante de la metodología secuencial
donde un dispositivo que comprende un alojamiento proporciona una
primera forma para introducir una muestra y una segunda forma para
introducir un reactivo líquido distinto de la muestra.
La expresión "ensayos simultáneos" ha
incluido a menudo todas las variantes en las que la muestra y el
reactivo* se preincuban/mezclan antes de añadirse a una matriz de
flujo o en las que la muestra se añade a una matriz de flujo donde
el reactivo* se ha predepositado en la zona de aplicación de la
muestra o corriente abajo de ésta. De forma similar, la expresión
"ensayos secuenciales", ha incluido todas las variantes en las
que el reactivo* se añade a la zona de aplicación de la muestra
después de que la muestra haya migrado de su zona de aplicación. De
ese modo, no se han tomado consideraciones sobre si el orden del
analito y del reactivo* cambia durante el transporte a la zona de
detección. Si no se indica otra cosa, esta nomenclatura también se
usa para la presente invención, pero se ha adaptado de manera que
haya varias zonas de aplicación de líquido. Esta visión significa
que principalmente se considera el orden inicial, cuando el analito
y el reactivo* están en forma soluble, y no el orden en el que
analito y reactivo* se transportan a la zona de detección.
La técnica anterior a menudo ha implicado
problemas prácticos de automatización, principalmente debido a que
a menudo se requería la preincubación o la adición secuencial de
muestra y reactivos, con frecuencia en un cierto orden
predeterminado definido por el protocolo de ensayo usado. El objeto
de la invención es (a) facilitar la automatización, (b) evitar la
adición secuencial de la muestra y del reactivo detectable
analíticamente (reactivo*), y (c) permitir la predeposición del
reactivo* cuando se usa la metodología secuencial, que relaciona el
analito y el reactivo*. Los objetivos más generales son conseguir
resultados de alta calidad en los ensayos, preferiblemente mejorando
la sensibilidad y precisión dadas por las variantes anteriores.
Sorprendentemente, ahora hemos descubierto que si
el flujo se inicia por la adición casi simultánea de líquido en dos
zonas adyacentes de una matriz de flujo, el líquido añadido en la
zona corriente abajo migra antes que el líquido añadido en la zona
corriente arriba en dirección hacia la zona de detección. Nuestro
descubrimiento supone que también puede obtenerse una migración de
líquidos por zonas si la adición del líquido en una zona corriente
arriba se lleva a cabo después de la adición de líquido en la zona
corriente abajo más próxima. Aplicando este descubrimiento al tipo
pertinente de método de análisis, se pueden obtener mejoras en
relación con los objetivos indicados anteriormente.
Un primer aspecto principal de la invención se
refiere a los métodos de análisis mencionados inicialmente y se
caracteriza porque:
A. La matriz de flujo muestra al menos dos zonas
de aplicación para disponer los líquidos de una forma
substancialmente adyacente entre sí:
donde
a) LZ_{n} es una zona de aplicación de líquido,
donde n es la posición de la zona de aplicación LZ_{n} (n es un
número entero 2< n \leq m),
b) m es el número total de zonas de aplicación,
en las que se inicia el flujo,
c) una LZ_{n} es una zona de aplicación para la
muestra (LZ_{n'}S) y otra LZ_{n} es una zona de aplicación para
el reactivo* (LZ_{n''}R*) con n'' \geqn'.
d) - - - -> es la dirección del flujo, y
e) DZ es la zona de detección, y
B. El flujo se inicia añadiendo líquido a cada
zona
LZ_{m} . . LZ_{n} . . LZ_{1} de tal forma
que el líquido_{n+1'} añadido a la zona de aplicación LZ_{n+1},
se transporta a través de la matriz después del líquido_{n'},
añadido a la zona de aplicación LZ_{n} más próxima corriente
abajo.
Es fácil que el líquido_{n+1} migre
inmediatamente después del líquido_{n}, si las correspondientes
zonas de aplicación del líquido están adyacentes entre sí o si los
volúmenes de líquido añadidos se adaptan a este objetivo.
En el caso más común, lo mencionado anteriormente
implica la adición del líquido_{n+1} a LZ_{n+1} antes o
principalmente de forma simultánea a la adición del líquido_{n} a
LZ_{n}. Para n = m, falta LZ_{n+1} y, por lo tanto, para esta
zona no es posible añadir ningún líquido en LZ_{m+1}. Se obtienen
ventajas prácticas si la adición se realiza de una forma
principalmente simultánea para todas LZ_{m} . . LZ_{n} . .
LZ_{1}.
El número (m) de zonas de aplicación de líquido
(LZ_{m}. . LZ_{n} . . LZ_{1}), en principio, puede ser
cualquier número excepto el uno (m \neq 1). Por razones prácticas,
es preferible que en el futuro 2\leq m \leq 10, preferiblemente
2 \leq m \leq 6, tal como m = 2 ó 3 ó 4 ó 5.
Los líquidos añadidos (líquido_{1} ...
líquido_{m}) pueden constar sólo de solución tampón o de solución
tampón más un reactivo (reactivo 1, reactivo 2, etc.), necesarios
para conseguir que el reactivo* sea capturado en la zona de
detección en una cantidad relativa a la cantidad de analito de la
muestra. También puede incluirse el reactivo* en un líquido_{n}.
Como norma, la composición de los componentes transportados desde
una zona de aplicación no es la misma que la de la zona de
aplicación adyacente más próxima, en la que se inicia el flujo
(LZ_{n+1}y LZ_{n-1}con la excepción de n = m y n
= 1, para las que faltan las zonas LZ_{n+1}y
LZ_{n-1}, respectivamente).
Por la expresión "substancialmente adyacentes
entre sí" se entiende que las zonas de aplicación de líquido
están inmediatamente adyacentes entre sí o con un área de matriz
intermedia que preferiblemente no es mayor que aproximadamente 2 mm,
y particularmente no mayor que aproximadamente 1 mm.
Un líquido añadido en una zona de aplicación
puede tener tendencia a difundir desde la parte superior de la
matriz hacia partes de la misma que estén fuera de la zona. Para
las zonas adyacentes, esto significa que los líquidos pueden
mezclarse entre sí de una forma no deseada. Para evitar esto, se
colocan barreras físicas que delimitan dos zonas de aplicación
adyacentes (espaciadores de zona). Las barreras deben colocarse
principalmente en la parte superior de la matriz, pero pueden
extenderse a la parte inferior de la matriz sin detener
completamente el flujo. La delimitación principalmente es contra
una zona de aplicación de líquido adyacente, pero, por supuesto,
puede extenderse alrededor de una zona completa de aplicación de
líquido. El líquido puede también introducirse a través de
almohadillas o capas de material aplicadas en la matriz y desde el
mismo material o un material diferente que el material de la
matriz. En tal caso no se necesitan espaciadores de zona.
Los reactivos pertinentes pueden predepositarse
en una zona de aplicación de líquido (LZ_{n}) o entre dos de
estas zonas. Una zona de aplicación de líquido sólo dirigida al
transporte de componentes tamponantes y/u otros componentes que no
participan en las reacciones de afinidad bioespecífica (es decir,
líquido que no contiene ni está dirigido al transporte de ningún
reactivo o analito) se denomina LZ_{n}B más adelante. Una zona de
aplicación de líquido (LZ_{n}), donde el líquido contiene un
reactivo o está dirigido al transporte de un reactivo, por ejemplo
el reactivo*, reactivo 1, reactivo 2, etc., se denomina
LZ_{n''}R*, LZ_{n'''}R1, LZ_{n''''}R2 etc., más adelante. Si
un líquido_{n} va a transportar una combinación de componentes,
por ejemplo, reactivo* y analito (muestra), la zona de aplicación
será común para los componentes y se denominará LZ_{n'''}R2/R1,
etc. Para la combinación de muestra y reactivo*, la zona de
aplicación será LZ_{n'}R*/S (n' = n''). El hecho de que el
líquido_{n} esté destinado al transporte de un cierto reactivo
implica que el reactivo en cuestión también pueda predepositarse en
la zona LZ_{n}. Esto último implica que el reactivo puede
predepositarse en un área corriente abajo de la zona de aplicación
para el líquido pertinente pero corriente arriba de la LZ más
próxima localizada corriente abajo (LZ_{n-1}), o
si n =1 sólo corriente arriba de la zona de detección (ya que
entonces está ausente LZ_{n-1}).
Por predeposición se entiende que un reactivo se
añade a la matriz de antemano y de forma que no difunda por la
matriz hasta que sea alcanzado por el líquido que se ha aplicado
para iniciar el flujo. La predeposición de reactivos puede llevarse
a cabo de una forma conocida per se. (Véase, por ejemplo,
Behringwerke, documento US 4.851.711; Unilever, documento WO
88/08534; Abbot, documento US 5.120.643; Becton Dickinson,
documento EP 284.232). Es importante que las disposiciones se hagan
de forma que el reactivo en cuestión se disuelva rápidamente, cuando
el líquido pase a través de un área que contiene reactivo
predepositado. Para conseguir una rápida disolución, ha sido común
incorporar reactivos a substancias que se disuelven rápidamente. A
menudo, este tipo de substancias son hidrófilas con grupos polares
y/o cargados tales como hidroxi, carboxi, amino, sulfonato, etc. En
particular, se pueden mencionar polímeros hidrófilos rápidamente
solubles, por ejemplo, que tienen estructura de carbohidrato,
azúcares sencillos incluyendo mono-, di- y oligosacáridos y los
correspondientes alcoholes de azúcar (manitol, sorbitol, etc.). Es
una práctica común cubrir primero la zona de aplicación en cuestión
con una capa de la substancia rápidamente soluble, y después aplicar
el reactivo, seguido opcionalmente de una capa adicional de
substancia rápidamente soluble. Una forma alternativa es incorporar
el reactivo a partículas de material rápidamente soluble que
después se depositan en la zona pertinente de la matriz.
Algunas de las realizaciones más importantes con
respecto a las zonas de aplicación de líquido pueden resumirse: 2
\leq m \leq 6; n' es 1, 2 o 3; n'' > n' o n'' = n';
LZ_{n''}S es la zona de aplicación de la muestra y opcionalmente
también del reactivo* u otro reactivo; y LZ_{n}'_{+1},
LZ_{n}'_{+2}; LZ_{n}'_{+3}, LZ_{n}'_{-1}, y
LZ_{n}'_{-2} son zonas de aplicación de líquidos dirigidos al
transporte del reactivo* u otro reactivo o tampón sin reactivo
hasta donde lo permitan m, n'' y n'.
El flujo de transporte a través de los tipos
particulares de matriz puede conseguirse por la acción de fuerzas
de capilaridad, por ejemplo, empezando con una matriz
substancialmente seca. Puede ponerse un cuerpo de aspiración al
final del flujo como ayuda. El flujo, que significa el transporte
principalmente sólo de componentes disueltos, puede conseguirse si
se aplica un campo eléctrico a través de la matriz.
Por medio del uso de la invención, puede hacerse
que los reactivos y el analito migren por zonas como componentes
individuales o juntos en combinaciones diferentes hacia la zona de
detección. La secuencia exacta de zonas de aplicación se determina
por el protocolo de ensayo que se utilice.
La invención puede aplicarse a variantes de
ensayo competitivas (inhibición) así como no competitivas (sin
inhibición) independientemente de que sean simultáneas o
secuenciales con respecto a cualquier reactivo. A continuación se
muestran esquemáticamente sistemas ilustrativos en forma de
complejos formados. "-" se refiere al anclaje firme a la
matriz, "- - -" se refiere a la unión a través de afinidad
bioespecífica. Para simplificar, se ha asumido que los reactivos
usados son monovalentes con respecto a los sitios de unión
utilizados.
El reactivo I y el reactivo* tienen afinidad
bioespecífica por el analito. x = número de moles de reactivo I en
la matriz e y = número de moles de analito (= número de moles de
reactivo*), unidos al reactivo I.
Complejo en la zona de detección:
Matriz (-reactivo
I)_{x-y} (-reactivo I - - - analito - -
-reactivo*)_{y}
| m = 2: | LZ_{2}R*/S | LZ_{1}B | DZ |
| m = 2: | LZ_{2}R* | LZ_{1}S | DZ | |
| m = 3: | LZ_{3}R* | LZ_{2}B | LZ_{1}S | DZ |
y alternativas donde la zona del tampón está en
la posición 1 o 3.
| m = 4: | LZ_{4}B | LZ_{3}R* | LZ_{2}B | LZ_{1}B | DZ |
y alternativas donde cualquiera de las zonas del
tampón está en la posición 1.
| m = 5 | La misma secuencia que para m = 4 con la excepción de una zona extra para el tampón situada |
| en la posición 1. |
El reactivo I muestra afinidad bioespecífica por
el reactivo II. Tanto el reactivo I como el reactivo* tienen
afinidad bioespecífica por el analito. x = número de moles de
reactivo I en la matriz, y = número de moles de analito (= número
de moles de reactivo*) unidos al reactivo I a través del reactivo
II. y + z es el número de moles del reactivo II unidos al reactivo
I.
Complejo en la zona de detección:
Matriz (-reactivo
I)_{x-z-y} (-reactivo I - -
- reactivo II)_{z} (-reactivo I - - - reactivo II - -
-analito - - -
reactivo*)_{y}
| m = 2 | Igual que para el protocolo A con la excepción de que LZ_{2}R*/S es LZ_{2}R*/S/RII o que LZ_{1}B |
| es LZ_{1}RII. |
| m = 3 | LZ_{3}R*/S | LZ_{2}B | LZ_{1}RII | DZ o LZ_{3}R*/S |
| LZ_{2}RII | LZ_{1}B | DZ. |
m = 2: Igual que para el protocolo A con la
excepción de que LZ_{1}S se reemplaza por LZ_{1}S/RII.
| m = 3: LZ_{3}R* | LZ_{2}B | LZ_{1}S/RII | DZ o | ||||
| LZ_{3}R* | LZ_{2}S | LZ_{1}RII | DZ o | ||||
| LZ_{3}R* | LZ_{2}S/RII | LZ_{1}B | DZ. |
m = 4, 5, 6: En analogía con las secuencias del
protocolo A, pueden considerarse hasta 6 zonas de aplicación de
líquido.
El reactivo I es un análogo de analito,
firmemente anclado a la matriz, el reactivo III muestra afinidad
bioespecífica por el analito y el reactivo* tiene afinidad
bioespecífica por el reactivo III. x = número de moles de reactivo I
en la matriz. y = número de moles de reactivo III (= número de
moles de reactivo*) unidos a la matriz a través del reactivo I. Las
condiciones se seleccionan de manera que y sea una medida de la
cantidad de analito en la muestra.
Complejo en la zona de detección:
Matriz (-reactivo
I)_{x-y} (-reactivo I - - - reactivo III -
-
-reactivo*)_{y}
| m = 2: | LZ_{2}R*/RIII/S | LZ_{1}B | DZ. |
| m = 2: | LZ_{2}R* | LZ_{1}/RII/S | DZ. |
| m = 3, 4 y 5 | Puede hacerse de forma análoga al protocolo A. |
El reactivo I muestra afinidad bioespecífica
tanto por el analito como por el reactivo*. El reactivo* es un
análogo de analito soluble. x + y es el número de moles de reactivo
I en la matriz, x e y son el número de moles de reactivo* y
analito, respectivamente, que están unidos a la matriz.
Complejo en la zona de detección:
Matriz (-reactivo I - - -
reactivo*)_{x} (-reactivo I - - -
analito)_{y}:
| m = 2: | LZ_{2}R*/S | LZ_{1}B | DZ |
| m = 2: | LZ_{2}R* | LZ_{1}S | DZ |
| m = 3, 4 y 5 | puede hacerse de forma análoga al protocolo A. |
La matriz define el espacio en el que se
transporta el flujo. La matriz puede ser la superficie interna de
un canal de flujo sencillo (por ejemplo, un capilar), o la
superficie interna de una matriz porosa que tiene un sistema de
canales de flujo (matriz porosa) etc. que se extienden a su través.
Para simplificar, las matrices que se pueden usar en esta variante
de la invención se denominarán matrices de flujo. Las matrices
porosas pueden existir en forma de monolitos, hojas, columnas,
membranas, canales de un solo flujo que tienen dimensiones de
capilares o sistemas agregados de dichos canales de flujo, etc.
También pueden existir en forma de partículas empaquetadas en tubos
de columnas, fibras comprimidas, etc. La superficie interna de las
matrices, es decir, la superficie de los canales de flujo, debe ser
hidrófila, de manera que el medio acuoso (normalmente agua) pueda
ser absorbido y transportado a través de las matrices. La dimensión
interna más pequeña de los canales de flujo debe ser suficientemente
grande como para permitir el transporte a través de la matriz de
los reactivos que se vayan a usar. La regla general es que las
matrices adecuadas se seleccionan entre las que tienen canales de
flujo con la menor dimensión interna (a menudo como un diámetro de
canales redondos) en el intervalo de 0,4-1000
\mum, preferiblemente de 0,4-100 \mum si la
matriz presenta un sistema de canales de flujo que se comunican
entre sí. Los canales de flujo que tiene una dimensión interna
menor en la parte superior del intervalo 0,4-1000
\mum son principalmente interesantes para canales sencillos no
ramificados, a través de los cuales el flujo se dirige por una
succión o presión aplicada externamente.
Las matrices pertinentes a menudo están hechas de
un polímero, por ejemplo, nitrocelulosa, nylon etc. El material de
la matriz, así como el diseño físico y geométrico de los canales de
flujo puede variar a lo largo del flujo dependiendo de qué parte de
la matriz se use (Pharmacia AB, documento WO 96/22532; Medix,
documento WO 94/15215).
En la zona de detección, el reactivo I está
firmemente anclado a la matriz con uniones que no permiten el
transporte no intencionado del reactivo I en las condiciones de
ensayo. La unión del reactivo I a la matriz puede ser covalente, a
través de adsorción física, a través de afinidad bioespecífica,
etc. Como técnica anterior en este campo, la invención puede
utilizar combinaciones de tipos de unión, por ejemplo, unión
covalente a la matriz de reactivos de afinidad bioespecífica
dirigidos al reactivo I. En particular, puede mencionarse una
matriz que muestra un miembro de un par de unión específica (par de
reactivos) adsorbido físicamente o unido covalentemente, en
combinación con el reactivo I acoplado o conjugado con el otro
miembro del par de unión específica, o una matriz que muestra un
anticuerpo unido de forma similar dirigido contra el reactivo I.
Como ejemplos de pares de unión específica podemos mencionar los
pares de unión inmunológica mencionados, tales como
antígeno-anticuerpo y
hapteno-anticuerpo,
biotina-avidina
o -estreptavidina, lectina-azúcar, hormona-receptor de hormona, y dúplex de ácido nucleico. Si el reactivo I se une a la matriz a través de otro reactivo de acuerdo con lo anterior, el reactivo I no necesita estar inmovilizado en la matriz, sino que puede predepositarse con movilidad (de manera que pueda difundir) en la matriz en un área o zona que esté separada de la zona de detección, o puede añadirse junto o por separado de la muestra. El anclaje del reactivo I a la matriz puede conseguirse por medio de partículas que se hayan depositado en/sobre la matriz y a las que el reactivo I se une covalentemente, por adsorción física o bioespecíficamente, etc. Las partículas se unen a la matriz porque su tamaño se ha seleccionado de manera que no pueden transportarse a través de la matriz o por medio de adsorción física. Véase, entre otros, Abbott/Syntex, documento US 4.740.468; Abbott, documento EP 472.376; Hybritech, documentos EP 437.287 y EP 200.381; Grace & Co., documento EP 420.053; Fuji Photo Film, documento US 4.657.739; Boehringer Mannheim, documento WO 94/06012. Para la invención, ha resultado ser buena la última variante con pequeñas partículas físicamente adsorbidas en la matriz.
o -estreptavidina, lectina-azúcar, hormona-receptor de hormona, y dúplex de ácido nucleico. Si el reactivo I se une a la matriz a través de otro reactivo de acuerdo con lo anterior, el reactivo I no necesita estar inmovilizado en la matriz, sino que puede predepositarse con movilidad (de manera que pueda difundir) en la matriz en un área o zona que esté separada de la zona de detección, o puede añadirse junto o por separado de la muestra. El anclaje del reactivo I a la matriz puede conseguirse por medio de partículas que se hayan depositado en/sobre la matriz y a las que el reactivo I se une covalentemente, por adsorción física o bioespecíficamente, etc. Las partículas se unen a la matriz porque su tamaño se ha seleccionado de manera que no pueden transportarse a través de la matriz o por medio de adsorción física. Véase, entre otros, Abbott/Syntex, documento US 4.740.468; Abbott, documento EP 472.376; Hybritech, documentos EP 437.287 y EP 200.381; Grace & Co., documento EP 420.053; Fuji Photo Film, documento US 4.657.739; Boehringer Mannheim, documento WO 94/06012. Para la invención, ha resultado ser buena la última variante con pequeñas partículas físicamente adsorbidas en la matriz.
En el mismo flujo de transporte puede haber
varias zonas de detección (DZ1, DZ2, etc.). Una o más de las zonas
de detección pueden referirse al mismo o a diferentes analitos. Si
los analitos son diferentes, el reactivo I normalmente es diferente
para cada DZ.
En la invención, el reactivo* no puede ser un
analito. Normalmente, la detectabilidad analítica se obtiene porque
un reactivo natural, por ejemplo, un anticuerpo, un antígeno o un
hapteno, dispone de un grupo detectable analíticamente. Son ejemplos
bien conocidos de grupos usados a menudos grupos enzimáticamente
activos (enzima, cofactor, coenzima, substrato de enzima, etc.),
fluorogénicos, cromofóricos, quimioluminiscentes, radiactivos, etc.
Los grupos detectados por medio de un reactivo de afinidad
bioespecífica normalmente también están referidos en esta categoría,
por ejemplo, biotina, hapteno, determinantes de inmunoglobulinas
específicos de clase, subclase y especie, etc.
Un grupo marcador preferido es el de las
partículas que contienen de forma opcional cualquiera de los grupos
detectables anteriores, tales como grupos fluorofóricos o grupos
cromogénicos (partículas coloreadas). Las partículas útiles a menudo
tienen un tamaño en el intervalo de 0,001-5 \mum.
Las partículas pueden tener dimensiones coloidales, lo que se
denomina sol (es decir, normalmente esféricas y monodispersas que
tienen un tamaño en el intervalo de 0,001-1 \mum).
Pueden mencionarse especialmente partículas de metal (por ejemplo,
sol de oro), partículas no metálicas (por ejemplo, SiO_{2},
carbono, látex y eritrocitos y bacterias inactivados). También se
han usado partículas de dimensiones no coloidales centrándose en su
capacidad de no sedimentación. Éstas han sido más o menos
irregulares y más o menos polidispersas (partículas de carbono <
1 \mum; Pharmacia AB, documento WO 96/22532).
En Unilever, documento WO 88/08534; Abbott,
documento US 5.120.643; y Becton Dickinson, documento EP 284.232,
entre otros, se mencionan partículas como grupos marcadores.
En relación con el desarrollo que ha conducido a
la presente invención, se descubrió sorprendentemente que pueden
obtenerse buenos resultados si se utilizan simultáneamente:
(a) reactivo* con partículas marcadoras como
grupo detectable de acuerdo con lo anterior, y
(b) una zona de detección, en la que el reactivo
I se ha anclado a la matriz a través de partículas con dimensiones
substanciales que permitirían el transporte de las partículas como
tales a través de la matriz.
Hemos conseguido sistemas funcionales en los que
las partículas marcadoras y las partículas ancladas tienen
substancialmente las mismas dimensiones. Esto significa con gran
probabilidad que las partículas marcadoras pueden ser mayores que
las partículas ancladas y viceversa, siempre que sigan siendo más
pequeñas que los canales de flujo definidos por la matriz. El
sistema puede funcionar con y sin predeposición del reactivo* en la
zona de aplicación deseada. Esta realización es parte de una
invención descrita en Pharmacia Diagsnostics, AB, documento WO
99/36780.
La invención está adaptada principalmente para la
determinación de reactivos de afinidad bioespecífica de los tipos
mencionados inicialmente. Los reactivos pueden ser una célula, un
virus o una parte de los mismos. En particular, puede mencionarse un
antígeno, tal como una inmunoglobulina o anticuerpo. En el caso de
las inmunoglobulinas, la determinación puede estar relacionada con
una cierta Ig y/o una cierta subclase de Ig. En el caso de los
anticuerpos, la determinación puede estar relacionada con una
cierta especificidad, opcionalmente también la clase de Ig o
subclase de Ig del anticuerpo. Son clases de Ig pertinentes IgA,
IgD, IgE, IgG e IgM. Son subclases de IgG pertinentes IgG1, IgG2,
IgG3 e IgG4.
En las variantes de sándwich (de acuerdo con los
protocolos A y B, anteriores), el analito puede ser un anticuerpo,
dirigido contra un alergeno/antígeno/hapteno y puede proceder de
una cierta especie, una cierta clase de Ig o una cierta subclase de
Ig. En este caso, el reactivo* puede ser un anticuerpo detectable
analíticamente dirigido contra un epítopo específico de la especie,
clase de Ig o subclase de Ig y con el reactivo I (protocolo A) o el
reactivo II (protocolo B) como el alergeno/antígeno/hapteno. Como
alternativa, puede seleccionarse el opuesto, es decir, el reactivo*
es el alergeno/antígeno/hapteno, y el reactivo I y el reactivo II
son, respectivamente, el anticuerpo dirigido contra el analito. En
el protocolo A, cuando el analito es un antígeno en general, el
reactivo I y el reactivo* pueden ser anticuerpos dirigidos contra
el antígeno. En el protocolo B son el reactivo II y el reactivo* los
que son anticuerpos dirigidos contra el antígeno.
Las variantes competitivas son las más
interesantes para los analitos de bajo peso molecular. Son ejemplos
ilustrativos antígenos y haptenos. En el protocolo C, el reactivo I
puede ser el antígeno o el hapteno firmemente anclado a la matriz,
el reactivo III puede ser un anticuerpo dirigido contra el
antígeno, y el reactivo* puede ser un anticuerpo dirigido contra el
reactivo III. En el protocolo D, el reactivo I puede se un
anticuerpo dirigido contra el analito y el reactivo* puede ser el
analito marcado con un grupo detectable analíticamente.
El método de la invención puede realizarse como
parte del diagnóstico de alergias o de enfermedades
autoinmunes.
Para los inventores, ha tenido un interés
especial la medición de anticuerpos anti-alergeno
de clase IgE o IgG, centrándose preferiblemente para esto último en
cualquiera de las subclases mencionadas. La medición de anticuerpos
específicos de alergeno puede utilizarse cuando se diagnostica
alergia mediada por IgE.
Las muestras pertinentes pueden ser de origen
biológico, por ejemplo, de diferentes fluidos corporales (sangre
entera, suero, plasma, orina, saliva, fluido lacrimal, líquido
cefalorraquídeo, etc.), de medios de cultivo celular, procedimientos
de procesamiento biotecnológicos, de extractos de tejidos, de
productos alimentarios, del medio ambiente (muestras de análisis
medioambiental), etc. Las muestras pueden pretratarse para
ajustarse, por ejemplo, a la matriz, al protocolo de ensayo
implicado, etc.
Los métodos de determinación del tipo al que se
refiere la invención implican que se mida la señal detectable del
reactivo detectable analíticamente (reactivo*), y que la señal
medida (valor de la muestra) se considere una medida de la cantidad
de analito presente en la muestra. Para transformar la señal medida
en cantidades reales de analito, la señal normalmente se compara con
la correspondiente señal (valor calibrador) de cantidades estándar
conocidas del analito (calibradores). En relación con la presente
invención se ha desarrollado un nuevo sistema calibrador que,
aplicado a la presente invención, constituye la mejor
realización.
Esta invención separada significa que el
calibrador usado se ha anclado con anterioridad a una matriz
(calibrador de matriz), preferiblemente del mismo tipo que la
utilizada para en ensayo de la muestra. Cuando se miden los valores
del calibrador, se deja que el calibrador de la matriz se una al
reactivo*, y después se mide la señal del reactivo* de una forma
conocida per se. Utilizando distintas cantidades de
calibrador de matriz, se puede obtener una serie de valores de
calibrador que corresponden a diferentes cantidades predeterminadas
del analito en la muestra (cantidades estándar, curva
dosis-respuesta, curva de calibración).
Como alternativa, en su lugar se ancla a la
matriz un enlazador para el calibrador, y el calibrador se añade en
la determinación del valor del calibrador, opcionalmente
predepositándose en la matriz corriente arriba de la(s)
zona(s) del calibrador para disolverse por la solución de la
muestra o el tampón en la determinación. Cuando se une a la matriz
un enlazador del calibrador, el calibrador puede predepositarse con
movilidad (con posibilidad de difusión) en la matriz en una zona
separada de la zona de detección, o puede añadirse junto o por
separado de la muestra. El enlazador del calibrador normalmente es
un miembro de un par de unión específica (par de reactivos), estando
el otro miembro del par de unión acoplado o conjugado con la
substancia calibradora. Como ejemplos de tales pares de unión
específica pueden mencionarse pares de unión inmunológica tales
como antígeno-anticuerpo y
hapteno-anticuerpo, biotina-avidina
o -estreptavidina; lectina-azúcar,
hormona-receptor de hormona, y dúplex de ácido
nucleico.
Aplicado a la presente invención, nuestro nuevo
sistema calibrador implica principalmente que el flujo de
transporte pasa por una o más zonas con un calibrador, firmemente
anclado a la matriz en la zona del calibrador (CZ) respectiva.
El anclaje de un calibrador a la matriz en la
zona del calibrador puede realizarse de acuerdo con los mismos
principios usados para el anclaje del reactivo I a la zona de
detección.
Las zonas del calibrador deben estar localizadas
corriente abajo de una zona de aplicación de líquido, destinada al
transporte del reactivo*. En relación con la zona de detección
(DZ), la zona del calibrador preferiblemente se localiza corriente
arriba.
Nuestra invención referida a los calibradores se
describe en detalle en Pharmacia Diagnostics AB, documento WO
99/36777.
\newpage
De acuerdo con lo anterior, la matriz de flujo
que contiene dos o más zonas de aplicación de líquido,
opcionalmente en forma de un kit donde la matriz de flujo está
comprendida junto con el reactivo indicable analíticamente,
constituye un segundo aspecto principal de la invención.
La invención se ilustra en la siguiente parte
experimental no limitante.
Adsorción de fenildextrano en partículas de
poliestireno: Se adsorbió fenildextrano (grado de substitución:
1 grupo fenilo en cada quinta unidad de monosacárido = 20%, Pm del
dextrano 40.000, Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Suecia) en
partículas de poliestireno (0,49 \mum Bangs Laboratories, USA)
por incubaciones con agitación con fenildextrano disuelto en agua
desionizada a 1) 5 mg/ml, suspensión de partículas al 10%,
temperatura ambiente 30-60 minutos; 2) 5 mg/ml,
suspensión de partículas al 5%, temperatura ambiente 1h; 3) 20
mg/ml, suspensión de partículas al 1-2%,
temperatura ambiente 3 h o durante una noche. Las partículas se
lavaron posteriormente dos veces con agua desionizada. Las
suspensiones de partículas se centrifugaron entre cada incubación y
lavado (12.100 x g, 25 min, Beckman, J-21, 10.000
rpm). La suspensión de partículas finalmente se sonicó (Baño de
ultrasonidos, Branson 5210, 5 min).
Acoplamiento del anticuerpo
anti-IgE humana (anti-hIgE) a
partículas de poliestireno: El Anti-hIgE se
acopló a partículas de poliestireno recubiertas con fenildextrano
con CDAP (bromuro de
1-ciano-4-dimetilamino-piridinio
(Kohn J y Wilchek M., FEBS Letters 154(1) (1983)
209-210).
La desalificación y el cambio de tampón del
anti-hIgE se realizaron por filtración en gel
(PD-10, Pharmacia Biotech AB) en NaHCO_{3}, 0,1 M,
pH 8,5. Se activaron 2,3 g de partículas de poliestireno
(recubiertas con fenil dextrano de acuerdo con lo anterior) en una
solución al 2% de acetona al 30% (en volumen) con 17 ml de CDAP
(0,44 M) y 14 ml de TEA (trietilamina, 0,2 M, RiedeldeHaän,
Alemania). Se añadió CDAP con agitación durante 150 segundos y TEA
durante 150 segundos. Las partículas se lavaron con acetona al 30%
(en volumen) y se centrifugaron a 12.100 xg (25 min, Beckman,
J-21, JA-20, 10.000 rpm). Se
acoplaron 17 de anti-hIgE a las partículas activadas
(2%, 0,15 g en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5) incubando con agitación
durante toda la noche a +4ºC. Las partículas se centrifugaron y se
decantaron antes de la desactivación con ácido glutámico 0,05 M y
ácido aspártico 0,05 M en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5, cuando se
incubaron con agitación durante toda la noche a +4ºC. Las partículas
acopladas se lavaron una vez con NaHCO_{3} 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH
8,5, una vez con HAc 0,1 M, NaCl 0,3 M, pH 5, una vez con
NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5 y una vez con tampón borato 20 mM, pH
8,5.
La concentración de partículas se determinó
espectrofotométricamente a A_{600} nm con partículas no tratadas
como referencia. La concentración de proteína acoplada se determinó
teniendo presente anti-hIgE durante el acoplamiento
y midiendo las cpm.
Conjugado de partículas de carbono
(reactivo*): Éste se preparó adsorbiendo
anti-hIgE en partículas de carbono (sp100, <1
\mum, Degussa, Alemania) de acuerdo con el documento WO 96/22532
(Pharmacia AB). La solución final que se usó en la matriz de flujo
contenía 400 \mug de partículas de carbono por ml.
Deposición de partículas acopladas con
anti-hIgE en la membrana: Se depositaron
partículas de anti-hIgE (preparadas de acuerdo con
lo anterior) en láminas de nitrocelulosa (Whatman, 8 \mum, 5 cm
de longitud y 25 cm de anchura con soporte de poliéster) en una zona
de la anchura de la lámina (futura zona de detección) con Linear
Striper (IVEK Corporation). El flujo fue de 1 \mul/seg y 1
\mul/cm. Las partículas se diluyeron en tampón borato (20 mM, pH
8,5, Dextrano T5000 al 4,2% p/p, sorbitol al 5,8% p/p). La cantidad
de anticuerpo anti-IgE depositado fue de
aproximadamente 1000 ng/cm. Las láminas se secaron durante 1 h a
30ºC.
Zonas de aplicación del tampón, muestra y
partículas de carbono conjugados: Bien separados de la zona que
contenía el material depositado, se situaron 4 tiras de una anchura
de 1 mm de Inplastor (Mylar con pegamento en un lado, Gelman) en
paralelo con la zona y en paralelo entre sí a una distancia de 5 mm
entre ellas (espaciadores de zona). De esta manera, las tiras de
Inplastor definían cuatro zonas con una anchura de 5 mm. Las
láminas se cortaron perpendicularmente a la zona que contenía el
material depositado, en tiras con una anchura de 0,5 cm (la longitud
de la tira pasó a ser entonces de 5 cm) (Singulator: cortadora de
membrana Matrix 1201, automatización Kinematic). Las tiras finales
mostraban cuatro zonas paralelas (zonas de aplicación) separadas
por las tiras de Inplastor como espaciadores de zonas y una zona
separada con el anticuerpo anti-hIgE depositado
(zona de detección). Con fines comparativos, se produjeron tiras
sin espaciadores de zonas, es decir, sin zonas de aplicación
separadas.
\newpage
Metodología de ensayo: Las tiras con zonas
de aplicación separadas se montaron en un soporte plano. En la
parte superior (0,5 cm) de la tira (y con la zona de detección como
la zona más próxima) se colocó una membrana de succión (Whatman, 17
Chr, 3 cm de anchura). El soporte también proporcionaba una presión
constante sobre las membranas de succión. Para la aplicación
simultánea de los reactivos a las cuatro subzonas, se usó una
multipipeta de 4 canales (Labsystems). La multipipeta se cargó de
tal manera que se aplicó una muestra de suero (30 \mul) en la zona
de aplicación más próxima a la zona de detección en el orden:
tampón (30 \mul), partículas de carbono conjugadas (30 \mul) y
tampón (30 + 30 \mul) en la zona de aplicación corriente arriba
respectiva. Para la aplicación secuencial en las tiras sin
espaciadores de zona, se aplicaron primero 30 \mul de muestra en
el extremo inferior de la tira. Tras la succión del volumen de la
muestra, se añadieron sucesivamente: tampón (30 \mul), partículas
de carbono conjugadas (30 \mul) y tampón (30 + 30 \mul). Las
partículas de carbono conjugadas se prepararon de acuerdo con lo
anterior y se suspendieron en tampón. El tampón era NaPO_{4} 0,1
M, BSA al 3%, NaN_{3} al 0,05%, sacarosa al 3%, cloruro sódico al
0,2%, fenildextrano al 0,05%, gammaglobulina bovina al 0,05%, pH
7,5. La unión de las partículas de carbono conjugadas a la zona de
detección se cuantificó midiendo la absorbancia (Ultroscan XL,
Enhanced Laser Densitometer, LKB). Como muestras, se usaron IgE con
concentraciones estándar en plasma (0; 0,5; 2; 10; 50 y 200
KU/L).
Al tener cuatro zonas de aplicación de líquido y
adición simultánea, los líquidos migraron en el orden de las zonas
de aplicación, es decir, la muestra que estaba en la zona más
próxima a la zona de detección migró primero, sin mezclarse con la
solución de lavado de la siguiente zona de aplicación, solución que
empezó a migrar a su vez cuando la muestra había salido de la zona
de aplicación de muestras. De forma correspondiente, los líquidos
de la zonas restantes migraron de forma secuencial sin
mezclarse.
| Resultados del análisis de procesos con adición secuencial en una zona y con adición simultánea | ||
| en cuatro subzonas (tampón, reactivo detectable analíticamente, tampón, muestra). | ||
| Adición secuencial en una zona | Adición simultánea en 4 subzonas | |
| IgE KU/L | (Abs x1000) | (Abs x1000) |
| 0,5 | 0 | 12 |
| 2 | 312 | 207 |
| 10 | 1241 | 831 |
| 50 | 1921 | 1560 |
| 200 | 2115 | 2044 |
En la tabla 1 se demuestra que la captación
desciende ligeramente en las tiras con zonas de aplicación
discretas en comparación con cuando la adición se lleva a cabo en
una misma zona. Sin embargo, el descenso es marginal. Por lo tanto,
el experimento demuestra que generalmente puede conseguirse el
mismo resultado si la adición simultánea se realiza según la
secuencia de zonas LZ_{4}B, LZ_{3}R*, LZ_{2}B, LZ_{1}S o si
la muestra, reactivo* y tampón se añaden secuencialmente a una zona
de aplicación común.
Si el anticuerpo anti-IgE
firmemente anclado (reactivo I) se reemplaza por un alergeno, se
obtiene un método de determinación para anticuerpos IgE dirigidos
contra el alergeno. De forma análoga, pueden determinarse sistemas
de ensayo relacionados con anticuerpos de otra clase/subclase y con
otra especificidad. Pueden omitirse las zonas de aplicación sólo
para el tampón. En relación con los protocolos de ensayo
adicionales alternativos y los analitos, véase el texto bajo los
encabezamientos "Protocolos de ensayo" y "Analitos"
presentados anteriormente.
Acoplamiento del anticuerpo
anti-IgE humana (anti-hIgE) a una
partícula de poliestireno: El anti-hIgE se
acopló a partículas de poliestireno recubiertas con fenildextrano
(preparadas de acuerdo con el ejemplo 1) con CDAP (bromuro de
1-ciano-4-dimetilaminopiridinio)
(Kohn J y Wilchek M, FEBS Letters 154(1) (1983)
209-210). La desalificación y el cambio de tampón de
anti-hIgE se realizaron por filtración en gel
(PD-10, Amersham Pharmacia Biotech AB) en
NaHCO_{3}, 0,1 M, pH 8,5.
Se activaron 0,35 g de partículas de poliestireno
(solución al 2%) con 5,2 ml de CDAP (0,44 M) y 4,2 ml de TEA
(trietilamina 0,2 M, Riedel-deHaän, Alemania). El
CDAP se añadió con agitación durante 60 segundos y el TEA durante
120 segundos. Se añadió un exceso de 5 veces de agua desionizada
enfriada con hielo. Las partículas se centrifugaron a 12.100xg (25
min, Beckman, J-21, JA-20, 10.1000
rpm). El sedimento resultante se disolvió en agua desionizada
enfriada con hielo, se lavó una vez con agua desionizada enfriada
con hielo y después se centrifugó a 12.000 x g. Se acoplaron 50 mg
de anti-hIgE a las partículas activadas (2%, 0,35 g
en NaHCO_{3}, 0,1 M, pH 8,5). Se realizó una incubación con
agitación durante 1 hora a +4ºC. Después de la centrifugación, las
partículas se desactivaron con ácido glutámico, 0,05 M, y ácido
aspártico, 0,05 M, en NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5. Después se
realizaron la incubación y la agitación a +4ºC. Las partículas
acopladas se lavaron dos veces con tampón borato 20 mM, pH 8,5,
después de lo cual se determinó la concentración de partículas
espectrofotométricamente a A_{600nm}, con partículas no tratadas
como referencia. La concentración de proteína acoplada se determinó
teniendo presente anti-hIgE radiactivo durante la
conjugación.
Acoplamiento de anticuerpos
anti-hIgE a partículas de detección: Se
acoplaron anticuerpos contra hIgE escindidos con pepsina a
fragmentos fab'2 a partículas de poliestireno fluorescentes con
grupos aldehído en su superficie (Molecular Probes
C-17177 TransFluoSphere, microesferas de
aldehído-sulfato, 0,1 \mum, 633/720, sólidos al
2%). Después se acoplaron 23 mg de anticuerpo a 66 mg de partículas
en NaPO_{4} 50 mM, pH 6,5, durante toda la noche a temperatura
ambiente, después de lo cual se añadieron 205 \mul de
NaCNBH_{4}(5 M) para reducir el acoplamiento, durante 3
horas a temperatura ambiente. La centrifugación se realizó a 20.800
x g durante 50 minutos (50 minutos en Eppendorf 5417R, 14.000 rpm),
y después se realizó la desactivación en ácido glutámico, 0,05 M, y
ácido aspártico, 0,05 M, en agua desionizada a pH 6,5 durante toda
la noche con agitación a temperatura ambiente. Después de
centrifugar otra vez a 20.800 x g, se realizó un bloqueo con BSA al
0,2% en NaPO_{4} 50 mM, pH 7,4, con NaN_{3} al 0,05% y se
realizó una incubación durante toda la noche a +4ºC. Después se
realizó otra centrifugación de nuevo a 20.800 x g y se realizó un
lavado dos veces con tampón de bloqueo, que entonces también se usó
para almacenamiento. La concentración de partículas se determinó en
un fluorímetro (Perkin-Elmer LS50B) con una curva
patrón preparada con la partícula original. La concentración de
proteína acoplada se determinó teniendo presente hIgE radiactivo
durante el acoplamiento.
Deposición de partículas acopladas con
anti-hIgE en membranas y en zonas de
aplicación: Se llevó a cabo de acuerdo con el ejemplo 1, con la
excepción de que las tiras de Inplastor se reemplazaron por tiras
de cinta adhesiva (poliéster transparente de 2 milésimas de pulgada
(0,05 mm) Arcare con pegamento en uno de sus lados).
Metodología de ensayo: Se montaron tiras
con zonas de aplicación espaciadas en un plano inclinado,
aproximadamente 16º, en un soporte. En la parte superior (0,5 cm) de
la tira (y con la zona de detección como la zona más próxima), se
situaron dos membranas de succión (Whatman, 17 Chr, 3,4 cm de
anchura) una encima de otra. El soporte también ejercía una presión
constante sobre las membranas de succión. Para la aplicación
simultánea de los reactivos en las cuatro subzonas, se usó una
pipeta multicanal Finn (Labsystems). La multipipeta se cargó de
forma que la muestra de suero (30 \mul) se aplicó en la zona de
aplicación más próxima a la zona de detección en el siguiente orden:
tampón (15 \mul), partículas conjugadas fluorescentes (30 \mul)
y tampón (30 + 30 \mul) en la zona de aplicación respectiva
localizada corriente arriba. Para la aplicación secuencial en las
tiras sin espaciador de zona, primero se aplicaron 30 \mul de
muestra en el extremo inferior de la tira. Después de aspirar el
volumen de la muestra, se aplicaron sucesivamente el tampón (15
\mul), partículas conjugadas de detección (30 \mul) y tampón
(30 + 30 \mul). Las partículas conjugadas se suspendieron en
tampón de ensayo que constaba de NaPO_{4} 0,1 M, BSA al 3%,
NaN_{3} al 0,05%, sacarosa al 10%, NaCl 0,15 M, gammaglobulina
bovina al 0,05%, pH 7,5. La medición del tiempo empezó con la
aplicación de la muestra, y se anotó el tiempo hasta que se aspiró
el último tampón de la membrana. La unión de las partículas
conjugadas fluorescentes a la zona de detección se cuantificó por
exploración con un diodo láser rojo (635 \pm 5nm). Como muestras
se usaron concentraciones estándar de IgE en plasma (0, 0,5, 2,
10, 50 y 200 KU/L).
Precisamente como en el ejemplo 1, los líquidos
migraron de la zona de aplicación en el orden establecido. El
tiempo para un ensayo completo con aplicación simultánea fue de
aproximadamente 20 minutos, y el tiempo para un ensayo con
aplicación secuencial fue de aproximadamente 25 minutos.
| Resultados de los análisis de los procesos con aplicación secuencial en una zona y con aplicación | ||
| simultánea en cuatro subzonas (tampón, reactivo detectable analíticamente, tampón, muestra). | ||
| KU/L | Adición simultánea en cuatro subzonas | Adición secuencias en una zona |
| 0 | 0,048* | 0,038* |
| 0,5 | 0,053 | 0,047 |
| 2 | 0,085 | 0,074 |
| 10 | 0,286 | 0,256 |
| 50 | 1,334 | 1,291 |
| 200 | 2,507 | 2,487 |
| * = señal de exploración (Vmm) |
La tabla 2 demuestra que la captación para las
tiras con zonas de aplicación discreta es comparable con la de la
adición en una sola zona. Por lo tanto, el experimento demuestra
que se puede obtener el mismo resultado si la adición se realiza de
forma simultánea en la secuencia de zonas LZ_{4}B, LZ_{3}R*,
LZ_{2}B, LZ_{1}S, o si la muestra, reactivo* y tampón se añaden
de forma secuencial a una zona de aplicación común.
Extracción de alergeno t3 del polen de abedul,
Betula verucosa: Se extrajo una parte (en peso) de polen de
abedul (Allergon, Suecia) con 10 partes (en volumen) de tampón
fosfato 0,1 M, pH 7,4. La extracción se continuó durante 2 horas en
una mesa de agitación a +4ºC. El extracto se centrifugó a 4000 rpm
durante 1,75 horas. Tras la filtración, la solución se aplicó en una
columna PD-10 (Pharmacia Biotech AB) y se eluyó con
NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5. El eluato de t3 (designado extracto de
t3 1/14) se sometió a un análisis de aminoácidos para determinar el
contenido total de proteína.
Acoplamiento del alergeno de polen de abedul a
partículas de poliestireno: el extracto de t3 se acopló a
partículas de poliestireno recubiertas con fenildextrano (preparadas
de acuerdo con el ejemplo 1) con CDAP. El acoplamiento se efectuó
de forma análoga al acoplamiento de hIgE.
Las partículas de poliestireno (2128 mg)
recubiertas con fenildextrano en acetona al 30% (en volumen), en
suspensión de partículas al 2%, se activaron con 954 mg de CDAP
(100 mg/ml en acetona al 30%) y 7,63 ml de trietilamina 0,2 M (TEA,
Riedel-de Haen, Alemania). El CDAP se añadió con
agitación y el TEA se añadió gota a gota durante 90 segundos y con
agitación durante un total de 120 segundos. La reacción se detuvo
por la adición de acetona al 30% (4 veces el volumen) y por
centrifugación a 12.400 g durante 35 minutos. Las partículas se
lavaron una vez con agua desionizada.
Se añadieron 640 ml de extracto t3 1/14 en
NaHCO_{3} 0,1 M, pH 8,5, a las partículas activadas, y el
acoplamiento se continuó durante 1 hora en una mesa de agitación.
Después de la centrifugación, las partículas se desactivaron con
ácido aspártico 0,05 M y con ácido glutámico 0,05 M en NaHCO_{3}
0,1 M, pH 8,5. Después, la incubación se realizó en una mesa de
agitación durante toda la noche a +4ºC. Posteriormente, las
partículas se lavaron dos veces con NaPO_{4} 50 mM, NaN_{3} al
0,05%, pH 7,4. La concentración de partículas se determinó
espectrofotométricamente a 600 nm con partículas de poliestireno no
recubiertas como referencia. Las partículas de poliestireno con t13
acoplado se sometieron a un análisis de aminoácidos para determinar
el contenido total de proteína.
Deposición de partículas de poliestireno
acopladas con t3 en una membrana: En láminas de nitrocelulosa
con un soporte de poliéster (Whatman, 8 \mum, 5 cm de anchura) se
aplicaron zonas de partículas con t13 acoplado diluidas hasta un
contenido de partículas del 4% en NaPO_{4} 50 mM, sacarosa al
10%, NaN_{3}al 0,05%, pH 7,4. Los depósitos se secaron durante 1
hora a 30ºC.
Zonas de aplicación de tampón, muestra y
partículas conjugadas de detección: Se situaron cinco tiras de
cinta adhesiva de 1 mm de anchura (poliéster transparente de 2
milésimas de pulgada (0,05 mm) Arcare con pegamento en un lado)
bien separadas de la zona que contenía el material depositado y en
paralelo con dicha zona a una distancia de 5 mm entre sí. De esta
manera, las tiras de cinta definían cinco zonas diferentes de 5 mm
de anchura. Las láminas se cortaron perpendicularmente a la zona que
contenía el material depositado en las tiras, teniendo una anchura
de 0,5 cm (la longitud de las tiras entonces pasó a ser de 5 cm)
(Singulator: cortadora de membrana Matrix 1201; automatización
Kinematic). Las tiras finales mostraron cinco zonas (zonas de
aplicación) separadas por tiras de cinta adhesiva como espaciadores
de zona y una zona separada con polen de abedul depositado (zona de
detección). Con fines comparativos, se prepararon tiras sin
espaciadores de zona, es decir, sin zonas de aplicación
separadas.
Metodología de ensayo: Se montaron las
tiras con las zonas de aplicación separadas, y se aplicaron los
reactivos como en el ejemplo 2. Se aplicó tampón (20 \mul) en la
zona más próxima a la zona de aplicación y, luego muestra de suero
(30 \mul), tampón (20 \mul), partículas conjugadas de detección
(20 \mul) y tampón (30 + 30 \mul) en la zona de aplicación
respectiva localizada corriente arriba. Para la aplicación
secuencial, en las tiras sin espaciador de zona primero se aplicaron
20 \mul de tampón en el extremo inferior de la tira, y después de
ser aspirado, se aplicaron 30 \mul de la muestra en la misma
posición y después tampón (20 \mul), partículas conjugadas
fluorescentes (20 \mul) y tampón (30 + 30 \mul). Antes de cada
aplicación en la tira, se había aspirado la aplicación precedente.
La detección de las partículas conjugadas y el tampón se realizaron
de acuerdo con el ejemplo 2.
Con la zona de aplicación consistente en cinco
subzonas y con la adición simultánea a ésta, resultó que los
líquidos, exactamente como en los ejemplos anteriores, migraron
fuera de la zona de aplicación en el orden predeterminado. El
tiempo requerido para un ensayo completo con adición simultánea fue
de aproximadamente 21 minutos, y el tiempo necesario para un ensayo
completo con adición secuencial fue de aproximadamente 27
minutos.
| Resultados del análisis de procesos con adición secuencial en una zona y con adición simultánea en | ||
| cuatro subzonas (tampón, reactivo detectable analíticamente, tampón, muestra). | ||
| Adición simultánea en 5 subzonas | Adición secuencial en 1 zona | |
| neg | 0,067* | 0,058* |
| pos 1 | 1,911 | 2,608 |
| pos 2 | 0,299 | 0,375 |
| * = señal de exploración (Vmm) |
La tabla 3 demuestra que la captación desciende
en alguna medida para las tiras que tienen zonas de aplicación
discretas en comparación con la adición en una sola zona. Sin
embargo, el descenso es marginal y probablemente se debe al hecho de
que en la aplicación simultánea el caudal se retrasaba de alguna
manera. Por lo tanto, el experimento demuestra que se pueden obtener
básicamente los mismos resultados en la aplicación simultánea para
la secuencia de zonas LZ_{5}B, LZ_{4}R*, LZ_{3}B, LZ_{2}S,
LZ_{1}B, o si la muestra, reactivo* y tampón se aplican
secuencialmente en una zona de aplicación común.
Claims (16)
1. Un método de determinación de un analito en
una muestra, en una matriz de flujo por medio del uso de un flujo
de transporte de uno o más reactivos de afinidad bioespecífica, de
los que al menos uno es detectable analíticamente (reactivo*) y el
otro está firmemente anclado a la matriz (reactivo I),
comprendiendo la matriz de flujo:
A) una zona de aplicación del líquido (LZ), que
contiene el tampón y la muestra y, opcionalmente, uno o más de los
reactivos, pero no el reactivo I,
B) una zona de detección (DZ) localizada
corriente abajo de la LZ con el reactivo firmemente anclado
(reactivo I), y
C) opcionalmente, una o más zonas en las que se
ha predepositado cualquiera de los reactivos,
donde (i) el flujo hacia la zona de detección se
inicia por la adición del líquido con la muestra en la zona de
aplicación LZS para el transporte del analito y de los reactivos
hacia la zona de detección (DZ), y (ii) se detecta la cantidad de
reactivo* unido a DZ, estando relacionada la cantidad detectada con
la cantidad de analito en la muestra, caracterizado
porque
I. la matriz de flujo comprende al menos dos
zonas de aplicación de líquido dispuestas substancialmente
adyacentes entre sí
donde
a) LZ_{n} es una zona de aplicación de líquido,
y n es la posición de la zona de aplicación LZ_{n},
b) m es el número total de zonas de aplicación en
las que se inicia el flujo (m \geq 2),
c) una LZ_{n} es una zona de aplicación para la
muestra (LZ_{n'}S) y otra LZ_{n} es para el reactivo*
(LZ_{n''}R*) con n'' \geq n',
d) - - - -> es la dirección del flujo, y
e) DZ es la zona de detección, y
II. el flujo se inicia por la adición de líquido
a cada zona
LZ_{m} .. LZ_{n} .. LZ_{1} (m \neq n) de
tal manera que el líquido_{n+1}, añadido a la zona de aplicación
LZ_{n+1'} contacte con la matriz de flujo de una forma
substancialmente simultánea y se transporte a través de la matriz
inmediatamente después del líquido_{n}, añadido a la zona de
aplicación más próxima corriente arriba LZ_{n}.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque n'' > n' (variantes secuenciales con
respecto al analito y al reactivo*).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
caracterizado porque n'' = n' (variantes simultáneas con
respecto al analito y al reactivo*).
4. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, caracterizado porque
el reactivo* se predeposita en su zona de aplicación
(LZ_{n''}R*).
5. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, caracterizado porque
LZ_{n+1} acaba donde empieza LZ_{n} (m \neq n).
6. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, caracterizado porque
la aplicación del líquido se lleva a cabo de forma substancialmente
simultánea en LZ_{m} .. LZ_{n} .. LZ_{1}.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-6, caracterizado porque m
\leq 6, n' es 1, 2 o 3; n'' > n'; LZ_{n'+1}, LZ_{n'+2},
LZ_{n'+3}, LZ_{n'-1} y
LZ_{n'-2} son zonas de aplicación de líquidos
destinadas al transporte del reactivo* u otro reactivo o tampón sin
reactivo, hasta donde permitan m, n'' y n'.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque
al menos una de las zonas LZ_{m} . . LZ_{n} . . LZ_{1}
comprende una almohadilla o capa de material aplicada en la matriz
de flujo.
\newpage
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, caracterizado porque
las zonas LZ_{m} . LZ_{n} . LZ_{1} tienen espaciadores de zona
entre sí.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1-9, caracterizado
porque la composición de los componentes transportados desde una
zona de aplicación LZ_{n} no es la misma que desde la zona de
aplicación LZ adyacente más próxima, en la que se inicia el flujo,
(LZ_{n+1} y LZ_{n-1}, con la excepción de n = m
y n = 1, donde faltan las zonas LZ_{n+1} y
LZ_{n-1}, respectivamente).
11. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-10, caracterizado porque
al menos un reactivo, diferente al reactivo*, se predeposita en una
zona de aplicación de líquido LZ_{n'''}R destinada al transporte
del reactivo.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-11, caracterizado porque
m \leq 6 y porque n' de la zona de aplicación de muestra
(LZ_{n'}S) es 1, 2 o 3.
13. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, caracterizado porque
el reactivo* tiene afinidad bioespecífica por el analito de forma
que el reactivo* se incorpora en un complejo reactivo'- -
-Analito
reactivo* en la zona de detección en una cantidad relacionada con la cantidad de analito de la muestra, teniendo el reactivo' en dicho complejo afinidad bioespecífica por el analito y siendo:
\hbox{- - -} reactivo* en la zona de detección en una cantidad relacionada con la cantidad de analito de la muestra, teniendo el reactivo' en dicho complejo afinidad bioespecífica por el analito y siendo:
(a) reactivo I, o
(b) un reactivo para el que el reactivo I muestra
afinidad bioespecífica y que se transporta desde LZ_{n'}S o desde
una zona de aplicación corriente abajo de LZ_{n'}S.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-13, caracterizado porque
la matriz comprende al menos una zona de calibrador (CZ), en la que
el calibrador se une o se ha unido con anterioridad a la
matriz.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, caracterizado porque la zona o zonas de calibrador (CZ)
tienen un enlazador para el calibrador firmemente anclado a la
matriz, habiéndose predepositado el calibrador opcionalmente en la
matriz corriente arriba de la zona o zonas de calibrador.
16. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-15, caracterizado
porque
a. el analito se elige generalmente entre
antígenos, y
b, el método se lleva a cabo como parte de un
diagnóstico de alergias o de enfermedades autoinmunes.
Applications Claiming Priority (2)
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