CN103113471A - 抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体及其制法 - Google Patents

Abstract

抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体及其制法，属于生物技术领域。该双特异性单克隆抗体对盐酸克伦特罗和喹乙醇同时具有特异性。本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，为盐酸克伦特罗和喹乙醇的快速检测提供技术基础。

Description

抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体及其制法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体及其制法。

背景技术

免疫分析方法(Immunoassay，IA)是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的一门技术，是基于抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应，具有特异性强、灵敏度高、方便快速、高通量、检测成本低、安全可靠等特点。该方法一般不需要贵重仪器，使用人员技术要求不高，容易普及和推广，尤其适合现场筛选和大量样品的快速分析。以该技术为基础开发的一系列检测产品，如ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、免疫传感器等已广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。

免疫分析法起始于20世纪5O年代，首先应用于体液大分子物质的分析，1960年，美国学者Yalow和Berson等将放射性同位素示踪技术和免疫反应结合起来测定糖尿病人血浆中的胰岛素浓度，创立了放射免疫分析技术。1968年，Oliver将地高辛同牛血清白蛋白结合，使之成为人工抗原，免疫动物后成功获得了抗地高辛抗体，从而开辟了用免疫分析法测定小分子药物的新领域。在RIA的基础上，随着新的标记物质的发现及新的标记方法的使用，以及电子计算机、自动控制技术的广泛应用，派生出许多新的检测技术，使免疫分析法逐渐发展成为一门新型的独立学科。

由于免疫分析试剂在免疫反应中所体现出的独特的选择性和极低的检测限，使这种分析手段在临床、生物制药和环境化学等领域得到广泛应用。各种标记技术(放射性标记、酶标记、荧光标记、金标记、化学发光等)的发展，使免疫分析的选择性更加突出。标记免疫分析一般是将酶、荧光素、放射性核素等标记物对抗体或抗原进行标记，这种标记物既保持了抗体或抗原的活性，也不影响标记物的活性，当它与相应抗体或抗原反应后，可以直接测定复合物中的标记物，从而直接对目标物质进行定量分析。通过标记物的信号放大作用，可以提高免疫分析技术的敏感性。免疫学检测技术以其特异性强、灵敏度高、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点，已成为21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。

目前采用免疫分析方法进行多残留检测常有两种方法，一种是采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原，获得对同类农药具有特异性识别反应的广谱抗体，如Alococer等用有机磷的通用结构膦酸作为半抗原，成功制备了广谱性的多克隆抗体，且对10种以上的有机磷农药有特异性识别；骆爱兰等用拟除虫菊酯类农药的共有结构间苯氧基苯甲酸（PBA）为半抗原，也成功制备了广谱性的多克隆抗体，并对5种菊酯有特异性识别。另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上制备成人工抗原，经过动物免疫获得对目标农药有特异性识别的“宽谱特异性抗体（broad specificity antibody）”，如王姝婷等通过对人工抗原的设计，将克百威、三唑磷、毒死蜱和甲基对硫磷半抗原偶联到一个载体蛋白分子上制备出了多抗原决定簇的人工抗原并获得了能同时识别上述四种农药的“宽谱特异性”多克隆抗体，达到多残留检测的目的。

抗体在多残留免疫分析中的作用非常关键，抗体质量的好坏直接影响免疫分析的准确性和灵敏度，因此获得好的抗体是多残留免疫分析技术的首要工作，已报道的药物多残留免疫检测的抗体均为多克隆抗体，由于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化，生产数量上也会受到一定的限制，制备的抗体可重复性差，在应用中会受到一定的限制，随着单克隆抗体技术的出现，解决了抗体制备过程中抗体性状不稳定的问题，并且单克隆抗体技术获得的杂交瘤细胞在体外能无限量分泌性状稳定的抗体，因此，在小分子药物免疫分析中单克隆抗体已逐渐取代多克隆抗体。

传统的免疫快速诊断技术中使用的抗体不论是多克隆抗体还是普通单克隆抗体，一个抗体分子均只识别一种或者一类抗原，使检测范围受到很大的限制，随着单克隆杂交瘤技术的发展和不断完善， Milstein等首次报道了一株能分泌双特异性单克隆抗体（Bispecific Monoclonal Antibodies, BisMcAb）的杂交-杂交瘤（Hybrid Hybridomas）细胞，标志着双特异性单克隆抗体技术的创立。双特异性单克隆抗体是结构上双价，功能上单价的免疫球蛋白分子。其基本结构中两个Fab端的结构和功能不相同，能分别结合两种不同抗原。由于双特异性单克隆抗体在结构上的特殊性，具有两个不同的抗原识别位点，如果能把该抗体技术引入到药物残留快速诊断技术中来，特别是在面临多残留快速检测技术需求的背景下，在一定程度上能满足多残留检测所面临的新的要求，该技术从抗体的结构和特性上入手，区别于传统的多残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行一系列的改造，通过杂交-杂交瘤技术获得能特异性识别两种同类药物甚至是结构差异大得两类药物的双特异性单克隆抗体，与传统的抗体快速检测相比具有质的飞跃，为探索药物多残留快速检测技术新的研究领域和发展方向方面具有重要意义。

盐酸克伦特罗(Clenbuterol hydrochloride)，又名瘦肉精，具有改变养分代谢途径、提高瘦肉率等作用，被广泛用于饲料添加剂，然而研究表明瘦肉精的毒性危害很大，为此农业部于2002年发布第176号公告将盐酸克仑特罗列为禁用药品，但盐酸克伦特罗的违规使用和滥用现象还时有发生，因此加强对盐酸克伦特罗的快速、高通量、现场监测的技术研究非常重要。

目前，盐酸克伦特罗的分析技术主要以仪器分析为主，仪器分析法虽然结果准确，但检测设备昂贵，需专业人员操作，样品前处理方法烦琐，不适于批量样品的筛选检测任务，因此，开发一种简单、快速，适于现场监控的痕量分析法-免疫分析方法具有重要的现实意义。 

喹乙醇（Olaquindox），又名喹酰胺醇、倍育诺、快育灵、奥拉金，是氧化喹恶啉类药物，为一种化学合成抗菌促生长剂。1965 年由西德拜尔（Bayer）公司K-Ley 等人首先合成，我国于1981年由北京营养源研究所研制成功，并发现它对动物有促生长作用，在20 世纪80 年代后期开始将其用于水产养殖，以后逐步成为我国鱼虾配合饲料中较为常用的促生长剂之一，有“水产瘦肉精”之称。水产养殖中，喹乙醇除了用于促生长外，还常用于防治多种水产动物细菌性疾病，如细菌性肠炎、细菌性败血病等。由于喹乙醇促生长效果好，价格便宜，故在实际生产中，人们往往盲目加大用量。但随着研究的不断深入及生产中出现的问题，人们经逐渐认识该添加剂带来的负面效应。喹乙醇作为饲料添加剂,使用过量时会造成动物急性中毒，据研究报道，已中毒或在体内蓄积大量喹乙醇但未表现中毒症状的动物如被人食用,则可造成喹乙醇在人体内的蓄积,从而危害人体健康。因此,目前喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂，我国也将喹乙醇列入无公害食品禁用渔药名称表,并且在无公害食品水产品中渔药残留限量表中明确标明不得检出。《中华人民共和国兽药典》（2005版）也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。虽然现在我国已明令禁止在水产饲料中添加喹乙醇，但是由于多方面原因，导致短期内还不能完全杜绝，因此加强水产品中喹乙醇的检测是保障水产品质量安全的重要手段之一。

 目前喹乙醇的检测分析技术主要包括电化学分析法、光谱法和气相色谱、液相色谱和质谱等方法，同样，由于上述方法需要昂贵的仪器，检测过程复杂,对检测技术的要求也较高,不适用于基层的快速普查。为此开发能适用于基层、具有快速、灵敏、高通量、操作简便和低成本的分析技术，实现从源头上把好质量关。

目前虽然有盐酸克伦特罗和喹乙醇的免疫分析技术报道，但均局限于单一的分析技术和手段，在面临多残留分析需求的背景下，建立能同时检测两种或者两类目标化合物的免疫分析技术就显得尤为迫切，而制备优质的双特异性单克隆抗体是建立免疫多残留分析技术的新的手段和方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体及其制法的技术方案。

所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对盐酸克伦特罗和喹乙醇同时具有特异性。

所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成盐酸克伦特罗和喹乙醇的半抗原和人工抗原；

2）利用盐酸克伦特罗人工抗原制备分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行HGPRT酶或TK酶缺陷筛选；

3）利用喹乙醇人工抗原制备分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行TK酶或HGPRT酶缺陷筛选；

4）抗盐酸克伦特罗的杂交瘤细胞株和抗喹乙醇的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体。

所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：克伦特罗活化后为半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后杂交瘤细胞经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗盐酸克伦特罗的杂交瘤细胞株。

所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：采用琥珀酸酐法合成喹乙醇衍生物喹乙醇-半琥珀酸酯为半抗原，活化酯法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后杂交瘤细胞经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，使其TK酶或者HGPRT酶缺陷后得到分泌抗喹乙醇的杂交瘤细胞株。

本发明制备得到的双特异性单克隆抗体性状稳定、检测灵敏度高、能大量生产，为盐酸克伦特罗和喹乙醇的快速检测提供技术基础。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

1.  免疫原的制备

1.1  盐酸克伦特罗人工抗原的制备

1.1.1 盐酸克伦特罗的活化成  

取3 mg CL，加入1 mL 1mol/L HCL和500 μL蒸馏水于反应烧杯中，同时调节pH至0.5，然后在4 ℃下往其中连续缓慢加入60 μL 0.2 mol/L NaNO₂，4℃低速搅拌1-3 h。

1.1.2人工抗原的合成与纯化

准确称取牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA），溶于pH值7.0-8.0磷酸盐缓冲液（PBS）中。将偶氮后的盐酸克伦特罗慢慢滴入牛血清白蛋白溶液中（盐酸克伦特罗和蛋白载体分子比在20-30之间），用1 mol/L氢氧化钠调节pH在7.0-8.0之间，滴加结束后在暗处继续搅拌2-5 h。反应结束后，反应液置于处理过的透析袋内，4 ℃搅拌透析72 h后，- 20 ℃保存备用。

1.2 喹乙醇半抗原和人工抗原的制备

1.2.1 喹乙醇半抗原的制备

称取26.30 g OLA和13.00 g琥珀酸酐置于500 mL反应瓶中，加入100 mL二甲基亚砜(DMSO)作为溶剂，75-95℃反应1h-3 h；将反应液冷却至室温，缓慢加入400 mL蒸馏水中，边滴加边搅拌，溶液中析出大量淡黄色沉淀；抽滤沉淀，用冰蒸馏水洗涤后抽干，40 ℃-60℃烘干，用蒸馏水进行重结晶，重复3次，干燥得淡黄色针状结晶，即为喹乙醇半抗原（OLA-HS）。

1.2.2 喹乙醇人工抗原的制备与纯化

称取10.96 mg OLA-HS溶于500 μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入9.34 mg N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，用200 μL DMF溶解4.17 mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，将其滴加到上述溶液中，室温搅拌反应6 h-10 h，此为反应液A；另称取20.00 mg BSA或OVA 溶于2.00 mL 0.01 mol/L，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，此为反应液B。将反应液B置于磁力搅拌器上，4℃下将反应液A缓慢滴加到反应液B中，搅拌反应过夜。次日将反应液置于处理过的透析袋内，4 ℃搅拌透析72 h后，- 20 ℃保存备用。

2.免疫动物

实验选用6-10周龄的BALB/C小鼠，20-22 g，免疫5-10只小鼠。取6－10周龄体重20-22 g BALB/C 雌性小鼠，将制备的CL-BSA交联物和OLA-HS-BSA交联物分别与等体积弗氏完全佐剂混合，充分乳化后，经腹部皮下多点注射，剂量为50-100 μg/只，以后每隔2-4周，取抗原（与一免等剂量）和等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后腹腔和皮下注射加强免疫，加强免疫共4次，末免以加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3 d后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-12：1的比例，在无血清的RPMI-1640培养基中混匀，1500 rpm离心5 min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma）作为融合剂，在37 ℃下水浴下加入0.5-0.7 ml，使其融合2 min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500 rpm离心5 min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37 ℃，5 % CO2的细胞培养器皿中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞在细胞培养板中培养5 d后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10%-50%时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔。盐酸克伦特罗筛选共获50多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中20个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选8个较理想的阳性孔，这8个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌抗盐酸克伦特罗的特异性抗体的杂交瘤细胞7C7，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。喹乙醇筛选共获40多个对上述抗原有反应的阳性孔，选择其中18个呈强阳性反应的细胞孔进行间接ELISA，最后筛选4个较理想的阳性孔，这4个阳性孔进行有限稀释法克隆，最终获得1株能分泌抗喹乙醇的特异性抗体的杂交瘤细胞8G10，经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5.单克隆抗体的阳性检测

阳性孔的特异性检测采用间接ELISA方法，用包被液稀释成1－10 ug/mL的包被抗原(OLA-HS-OVA、CL-OVA)100 uL/孔包被ELISA板，37 ℃ 2 h，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min；加入阳性孔培养上清100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h；PBST洗涤三次后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。

6. 四体杂交瘤细胞的制备

对7C7细胞株用含8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)浓度为100-300 μg/mL的RPMI1640培养基培养3-6周，使7C7细胞HGPRT酶缺失；对8G10细胞株采用含5-溴-2-脱氧尿苷(5-BrdU)浓度为50-300 μg/mL的RPMI1640培养基中培养4-8周，使8G10细胞胸苷激酶(TK)缺失；将上述两种酶缺陷型细胞进行再融合制备杂交-杂交瘤细胞，以盐酸克伦特罗包被抗原和喹乙醇包被抗原进行阳性和灵敏度筛选，以对盐酸克伦特罗和喹乙醇具有较好的特异性和灵敏度为筛选依据，最终筛选获得1株四体杂交瘤细胞4B10，经3个月以上体外传代和多次冻存复苏后，该株细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

7. 双特异性单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5 ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁶个6D6杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000 rpm离心3 min，收集上清液，即为双特异性单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加4倍体积0.06 M pH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30 μl/mL腹水），室温下边加边搅拌，4 ℃澄清 1 h，12000 rpm离心20 min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4 ℃放置2 h，3000 rpm离心20 min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4 ℃流动透析24 h后即获纯化的腹水抗体，-70 ℃保存。

8.双特异性单克隆抗体ELISA分析方法的建立

8.1盐酸克伦特罗ELISA分析方法的建立

采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下：

采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为0.125-8 μg/mL于ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min，加入浓度梯度为0.5-16ng/mL酶标半抗原CL-HRP，100 uL/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，OD值在1.0左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min；加入梯度稀释的盐酸克伦特罗标准溶液50 μl，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μl，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与克伦特罗浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：抑制率（%）＝                                                ×100%

式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为克伦特罗x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。由上述公式计算得盐酸克伦特罗各浓度的抑制率，作图。以抑制浓度最低的组合为最佳工作浓度，从数据分析可知，盐酸克伦特罗最佳工作浓度(Ab:CL-HRP)为2 ug/mL和8 ng/mL，在此优化反应体系的基础上，得出盐酸克伦特罗的抑制中浓度（IC₅₀）为22.8 ng/mL，检测灵敏度（IC₂₀）为4.62 ng/mL，抑制率与盐酸克伦特罗浓度的对数值呈显著的线性关系，线性相关系数达到0.99以上，与沙丁胺醇、莱克多巴胺、肾上腺素、氯霉素、青霉素和链霉素等的交叉反应率均低于1%。

8.2喹乙醇ELISA分析方法的建立

采用包被抗体-酶标半抗原的反应模式，建立ELISA分析方法。具体步骤如下：

采用正交实验法梯度包被双特异性单克隆抗体浓度为0.125-8 ug/mL于ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-6 0min，加入浓度梯度为0.125-4 ng/mL 酶标半抗原OLA-HS-HRP，100 ul/孔，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2 mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，OD值在1.0左右的抗体-酶标半抗原的浓度组合为初选工作浓度，然后将初选的双特异性单克隆抗体包被ELISA板，37 ℃ 2 h，PBST洗涤三次后用1－10％的脱脂奶粉或1－3％ BSA或3－6％牛血清封闭30-60 min;加入梯度稀释的盐酸克伦特罗标准溶液50 μl，再加入经缓冲液稀释的2倍浓度的酶标半抗原50 μl，37 ℃ 1－2 h，PBST洗涤四次后，用OPD-H₂O₂底物显色，2mol/L H₂SO₄终止反应后，用酶标仪读取OD₄₉₀的值，根据抑制与农药浓度之间的半对数关系作图即得到标准曲线。

ELISA方法的标准曲线以抑制率与农药浓度的半对数曲线表示，抑制率以下式计算：抑制率（%）＝

×100%

式中：ODmax为不加药时的吸光值，ODx为喹乙醇x时的吸光值，ODmin为空白对照孔的吸光值。由上述公式计算得喹乙醇各浓度的抑制率，作图。以抑制浓度最低的组合为最佳工作浓度，从数据分析可知，喹乙醇最佳工作浓度(Ab:OLA-HS-HRP)为2.0 ug/mL和1.0 ng/ mL,并在此优化反应体系的基础上，得出喹乙醇的抑制中浓度（IC₅₀）为20.4 ng/mL，检测灵敏度（IC₂₀）为4.56 ng/mL，抑制率与盐酸克伦特罗浓度的对数值呈显著的线性关系，线性相关系数达到0.99以上，与卡巴氧、乙酰甲喹和磺胺间甲氧嘧啶等的交叉反应率均低于1%。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体，其特征在于所述的双特异性单克隆抗体对盐酸克伦特罗和喹乙醇同时具有特异性。

2.一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）合成盐酸克伦特罗和喹乙醇的半抗原和人工抗原；

2）利用盐酸克伦特罗人工抗原制备分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行HGPRT酶或者TK酶缺陷筛选；

3）利用喹乙醇人工抗原制备分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并进行TK酶或者HGPRT酶缺陷筛选；

4）分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株和分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行细胞融合后筛选得到四体杂交瘤细胞，所述的四体杂交瘤细胞分泌抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体。

3.如权利要求2所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤2）中分泌抗盐酸克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：克伦特罗活化后为半抗原，重氮化法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗克伦特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后杂交瘤细胞经过含8-杂氮鸟嘌呤或5-溴-2-脱氧尿苷筛选，使其HGPRT酶或者TK酶缺陷后得到分泌抗盐酸克伦特罗的杂交瘤细胞株。

4.如权利要求2所述的一种抗盐酸克伦特罗和喹乙醇的双特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述的步骤3）中分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞株通过以下方法制备得到：采用琥珀酸酐法合成喹乙醇-半琥珀酸酯为半抗原，活化酯法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原后免疫小鼠，再取脾细胞与SP2/0细胞进行融合、筛选，获得分泌抗喹乙醇单克隆抗体的杂交瘤细胞，然后杂交瘤细胞经过含5-溴-2-脱氧尿苷或8-杂氮鸟嘌呤筛选，使其TK酶或者HGPRT酶缺陷后得到分泌抗喹乙醇的杂交瘤细胞株。