CN112500479A

CN112500479A - 一种犬ⅱ型腺病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

Info

Publication number: CN112500479A
Application number: CN202011507484.0A
Authority: CN
Inventors: 洪淑凡; 曹丹琴; 余卫; 余铭恩; 吴琼杉
Original assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: HANGZHOU XIANZHI BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2020-12-18
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2040-12-18
Also published as: CN112500479B

Abstract

本发明属于生物工程技术领域。本发明涉及一种重组蛋白，该重组蛋白包含犬Ⅱ型腺病毒蛋白的两个优势抗原表位，为提高该重组蛋白在原核表达系统中的产量，采用大肠杆菌偏爱密码子将该重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，化学合成该核苷酸序列并构建重组表达载体。本发明还涉及用该重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，经淘选筛选得到对应犬Ⅱ型腺病毒蛋白单链抗体scfv序列，将得到的scfv序列构建成完整鼠IgG1抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体并分别标记铕离子（Eu³⁺），通过正交实验确定最佳单抗配对组合，可用于犬传染性喉气管炎和肺炎的早期诊断。

Description

一种犬Ⅱ型腺病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。具体来说，本发明涉及一种新的重组蛋白，涉及使用上述重组蛋白免疫小鼠建立噬菌体库，筛选得到特异性单链抗体scfv序列，还涉及将得到的scfv序列构建成真核表达载体表达犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆抗体，并应用于犬传染性喉气管炎和肺炎症状的早期诊断。

背景技术

犬腺状病毒(Canineadenovirus CAV)是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒。有两个血清型。Ⅰ型既可引起犬传染性肝炎，(以肝小叶中心坏死，肝实质细胞和皮质细胞核内出现包涵体和出血时间长为特征的急性败血性传染病。)还可引起狐狸脑炎，故又称狐狸脑炎与犬传染性肝炎病。犬Ⅱ型腺病毒Ⅱ型可引起犬的传染性喉气管炎及肺炎症状。临床特征表现持续性高热、咳嗽、浆液性至粘液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎。本病主要通过消化道感染,也可通过胎盘传染。犬Ⅱ型腺病毒的感染潜伏期为5-6天。持续性发热(体温在39.5℃左右。鼻部流浆液性鼻液，随呼吸向外喷水样鼻液。表现6-7天阵发性干咳，后表现湿咳并有痰液，呼吸喘促，人工压迫气管即可出现咳嗽。听诊有气管啰音，口腔咽部检查可见扁桃体肿大，咽部红肿。病状继续发展可引起坏死性肺炎。病犬可表现精神沉郁、不食。并有呕吐和腹泻症状出现。该病往往易和犬瘟热、犬副流感病毒及支气管败血波氏杆菌混合感染。

在最初的发热期,可用大剂量抗腺病毒传染的高免血清,或犬用抗多病免疫球蛋白注射液,干扰素,尖端抗毒注射液,病毒灵注射液,病毒唑注射液等抗病毒药物,进行特异性治疗来抑制病毒的扩散。应用抗生素类药物控制继发感染,并结合应用输血、输液、补糖、保肝的药物。因此,控制本病的根本措施,在于免疫预防和检疫。目前检测犬Ⅱ型腺病毒主要是病毒中和试验，但病毒中和试验需要临时培养细胞，调节要求高，难以高通量检测，而且操作人为因素影响大，仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，不能运用于养殖场和宠物医院。

因此制备犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆抗体用于犬Ⅱ型腺病毒特异性识别检测成为早期诊断的主要方式。常规犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆抗体制备是将犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆细胞株制备Balb/c小鼠腹水，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体。但由于单只小鼠腹水产量不确定性且个体差异大，得到的抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆抗体批间差异大，使得检测准确性较差。

发明内容

设计目的：为解决传统小鼠腹水制备单克隆抗体周期长、纯度低、批间差异大的不足，通过设计、合成犬Ⅱ型腺病毒蛋白并通过建立噬菌体库和真核细胞表达来制备其单克隆抗体，不仅节省时间，而且能降低批间差异，提高检测准确性。

设计方案：为了实现上述设计目的。本申请：(1)以犬Ⅱ型腺病毒蛋白为靶抗原，分析并选择该抗原的两个特异性优势抗原表位，序列比对结果显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为了促进所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，增强免疫效果，将所选择的两个优势抗原表位序列通过柔性片段串联形成重组蛋白氨基酸序列。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的高效表达。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入原核表达载体PET-32a，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，加氨苄青霉素抗性筛选培养基筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，取溶液上清通过镍琼脂糖亲和层析柱亲和层析，洗脱得到纯化重组蛋白。(7)纯化的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏分离淋巴细胞用来建立单链抗体scfv噬菌体展示库，使用抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白进行多轮淘选筛选最终得到能与重组犬2型腺病毒结合的单链抗体scfv序列。(8)将scfv序列构建成完整鼠IgG1表达载体并使用HEK293细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析纯化单克隆抗体，并分别标记铕离子(Eu³⁺)。(9)正交实验筛选显示2B5单抗包被与7D5-Eu标记单抗配对检测犬Ⅱ型腺病毒蛋白为最佳组合。

具体实施方案：以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。

实施例1：犬Ⅱ型腺病毒蛋白优势抗原表位选择

以犬Ⅱ型腺病毒蛋白为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择A优势抗原表位和B优势抗原表位。同时，序列比较结果表明所选择的A、B两个优势抗原表位序列特异性高，与其它蛋白序列无明显同源性。

实施例2：犬Ⅱ型腺病毒蛋白优势抗原表位串联

为增强所选择抗原表位对小鼠免疫系统的刺激以利于后续实验的进行，将犬Ⅱ型腺病毒蛋白的A、B两个优势抗原表位序列分别重复再通过柔性片段(连续4个甘氨酸)连接，得到重组蛋白氨基酸序列。

实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列

为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白的氨基酸序列转化为对应的核苷酸序列，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。

实施例4：构建重组蛋白表达载体

用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和PET-32a载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和PET-32a载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均购自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和PET-32a载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均购自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。

实施例5：构建抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白表达菌株

将构建好的重组表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，于37℃过夜培养。次日挑取平板上单克隆菌株至含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，取1mL保存，剩余加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4小时后制备蛋白电泳样品。11％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白表达菌株。

实施例6：纯化抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白

接种重组蛋白表达菌株至LB液体培养基，加氨苄青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养8小时后，用含50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.8，加诱导剂IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，4度低温超声破菌，低温离心后取上清通过镍琼脂糖亲和层析柱，经洗涤、洗脱最终得到纯化抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白。

实施例7：单链抗体scfv噬菌体库构建

取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg重组犬2型腺病蛋白，共400μl/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80μg重组犬2型腺病蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg重组犬2型腺病抗原腹腔加强注射，于72小时后，眼眶取血，并处死小鼠，取其脾脏用鼠脾脏淋巴细胞分离试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离鼠脾脏淋巴细胞。用RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)从分离的淋巴细胞中提取总RNA，用反转录试剂盒(Takara)反转录合成cDNA，用鼠源单链抗体scfv通用简并引物扩增重链可变区以及轻链可变区基因，PCR产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因，回收的目的基因通过overlap PCR链接成scfv，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，并切胶回收目的基因经NotI和SfiI酶切后使用T4连接酶和pCANTAB5e(北京宝科维食安生物技术有限公司)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物经胶回收试剂盒回收以去除里面的酶及缓冲物质，回收产物用细菌电转化仪(biorad)分多次电转入大肠杆菌TG1电转感受态，并涂布于含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及2％葡萄糖的2×YT-AG平板，于30℃恒温培养12小时之后，取适量的2×YT培养基用无菌玻璃棒将平板上的菌落全部刮取下来并收集菌体悬液，此为构建好的噬菌体抗体库。

实施例8：单链抗体scfv的淘选及筛选

从噬菌体抗体库中去取一定量的菌液接种到2×YT-AG培养液中使OD600为0.3。37℃，250rpm振荡1h左右，使OD600达0.5后加入辅助噬菌体M13K07超感染，感染比例为M13K07/TG1＝20:1。37℃，250rpm振荡1h后3300g，4℃离心10min沉淀细菌，小心移弃上清。重悬细菌到含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的2×YT-AK培养基中，30℃，250rpm振荡培养过夜。次日，10800g，4℃离心20min沉淀细菌。上清移入干净离心管中，加入1/5体积的PEG/NaCl，混合后冰浴2h。10800g，4℃离心20min沉淀细胞，小心移弃上清，扣干，将沉淀重悬于PBS中，用0.45μm膜过滤去除细菌碎片用于淘选步骤。将纯化的重组犬2型腺病抗原用包被液稀释至8μg/ml包被免疫管(Thermo)，每个免疫管4ml，4℃过夜包被。次日，弃去包被液和未吸附的抗原，无菌PBST洗涤3次，每个免疫管加入封闭液5ml，37℃孵育2h。弃去封闭液，无菌PBST洗涤3次后将经PEG沉淀获得的噬菌体加入到免疫管中，每个免疫管加入4ml，37℃孵育1h。弃去免疫管中的液体，用无菌PBST洗涤10次再用无菌PBS洗涤10次后加入1ml 100mM三乙胺将结合的噬菌体洗脱下来，再立即加入500μl 1M Tris-HCl，pH 7.4进行中和。将中和后的噬菌体加入到一定量处于对数生长期的TG1大肠杆菌中进行超感染，此为第一轮淘选富集过程。经过3轮淘选，犬2型腺病特异性scfv得以富集。将最后一轮洗脱中和后的噬菌体侵染TG1大肠杆菌后涂布于2×YT-AG平板上，于30℃恒温培养12小时之后随机挑取400-600个单克隆菌落于96孔深孔板中，用2×YT-AG培养基37℃，250rpm振荡2h后加入一定量M13K07辅助噬菌体进行超感染，37℃，250rpm振荡1h后离心去掉上清加入含氨苄青霉素抗性(50μg/mL)及氨苄青霉素抗性(50μg/mL)的2×YT-AK培养基30℃，250rpm过夜培养。第二天进行单克隆ELISA筛选，筛选步骤如下：

包被：用包被液稀释犬2型腺病重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；

封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；

加样：加过夜诱导表达的细菌培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；

加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释兔抗M13噬菌体HRP酶标二抗(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；

加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；

终止反应：以50μL/孔加入2M H₂SO₄；

结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示有14个阳性克隆OD值较高，经测序得到5株scfv序列，分别为2B5,5A1,9H6,7D5,4E9。相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，加ddH₂O定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄·12H₂O 2.68g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH₂O定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄·12H₂O 2.68g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加ddH₂O定容至1000mL(pH7.4)。

显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH₂O定容至1000mL。

显色液B：柠檬酸2.1g，Na₂HPO₄·12H₂O 71g，加ddH₂O定容至1000mL。

使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H₂O₂

终止液：2M H₂SO₄，21.7mL浓H₂SO₄加ddH₂O定容至1000mL。

实施例9：真核表达载体构建及HEK293F细胞瞬转表达和纯化

将5株犬2型腺病单链抗体scfv序列分别构建成完整鼠IgG1抗体序列，即将scfv中重链可变区与轻链可变区通过PCR分别与鼠IgG1重链恒定区和轻链恒定区桥接，再分别插入到pcDNA3.1(德国Novagen公司)质粒中。分别通过PEI将构建好的重链质粒与轻链质粒共转染HEK293F细胞，37℃，5％二氧化碳，120rpm细胞摇床表达7天后离心沉淀，收集上清过0.45μm滤器。用50mL平衡缓冲液PBS(pH7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein A层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度为0。上清上样后加PBS洗涤至吸光度为0，然后用0.1M甘氨酸(pH3.0)洗脱，收集流出液并加入500mM Tris-HCl(pH8.5)缓冲液中和至pH 7.0左右，得到纯化的单克隆抗体2B5,5A1,9H6,7D5,4E9。

实施例10：Eu³⁺标记单抗的制备

取1mg纯化后的单克隆抗体于0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH9.6)中4℃透析3次，加入1mg DTPA(二乙基三胺五乙酸)立即混匀，室温反应1h，加入200μL Eucl₃(33mmol/L)，室温反应1h后用10m mol/L PBS(pH7.4)于4℃过夜透析。以上述方法分别对单抗2B5,5A1,9H6,7D5,4E9进行Eu³⁺标记。相关溶液配方如下：

碳酸盐缓冲液(pH9.6)：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃ 2.9g，加双蒸水定容至1000mL。PBS缓冲液(pH7.4)：KH₂PO₄ 0.29g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，NaCl 8.2g，加双蒸水定容到1000mL。

实施例11：配对单抗筛选

5株单克隆抗体(2B5,5A1,9H6,7D5,4E9)分别经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤2次；加入封闭液，150μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加犬Ⅱ型腺病毒感染血清及正常犬血清标本，100μL/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；加实施例10制备得到的Eu³⁺标记单抗，100μL/孔，室温震荡孵育30分钟后，洗涤液洗涤5次；增强液100μL/孔，室温震荡5分钟，置于时间分辨检测仪(上海新波生物技术有限公司)读值。相关溶液配方如下：

包被液：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃ 2.9g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。

封闭液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g，NaH₂PO4.2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

洗涤液：Na₂HPO₄.12H₂O 2.68g，NaH₂PO₄.2H₂O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。

增强液：冰醋酸6mL，Triton X-100 1mL，TOPO(Tri-Octyl Phosphine Oxide正三辛基氧膦)50μmol，β-NTA(N(CH₂COOH)₃氨三乙酸)15μmol，用0.1mol/L的邻苯二钾酸氢钾调pH至3.2，加双蒸水定容至1000mL。

以上述方法正交检测各包被单抗与铕标单抗配对，求P/N值(阳性标本检测均值与阴性标本检测均值比值)，见表1。

通过上表可知，2B5单抗包被与7D5-Eu配对检测犬Ⅱ型腺病毒蛋白为最佳组合。

SEQ ID NO1：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO2：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO3：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-7D5轻链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO4：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-7D5重链可变区氨基酸序列；

SEQ ID NO5：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO6：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5重链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO7：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-7D5轻链可变区核苷酸序列；

SEQ ID NO8：抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-7D5重链可变区核苷酸序列；

序列表

<110> 杭州贤至生物科技有限公司

<120> 一种犬Ⅱ型腺病毒重组蛋白单克隆抗体的制备

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 2

<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Arg Pro Gly Val

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Lys Gln Ser His Ala Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Gly Thr Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Val Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Arg

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Pro Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Arg Tyr Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr

115 120

<210> 5

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gacattgtgc tcacccaatc tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60

gtcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actaatgtag cctggtatca acagaaacca 120

gggcaatctc ctaaagcact gatttactcg gcatcctacc ggtacagtgg agtccctgat 180

cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240

gaagacttgg cagaatattt ctgtcagcaa tataacagct atcctctcac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataaa acgt 324

<210> 6

<211> 354

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggtccaac tgcaacagtc tgggcctgag ctggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60

tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatgcta tgcactgggt gaagcagagt 120

catgcaaaga gtctagagtg gattggagtt attggtactt actctggtca tacaaactac 180

aaccagaagt ttaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240

atggaacttg tcagattgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagagggggt 300

tacccgtact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcg 354

<210> 7

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaaatgtgc tcacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga aaaggtcacc 60

atgacctgca gggccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120

tcaggtgcct cccccaaact caggatttat agcacatcca acttggcttc tggagtccct 180

gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagtgtggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgccag cagtacagtg gttacccact cacgttcggc 300

tcggggacaa agttggaaat aaaacgg 327

<210> 8

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgac ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcaat ggatactaca tgcactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggacgt attaatccta acaatggtgg tattacctac 180

aaccagaagt tcaaggacaa ggccatatta actgtagaca agtcatccag tacagcctac 240

atggagcccc gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagagggggg 300

aggtacgact actttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa 360

acgaca 366

Claims

1.抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5，包括轻链和重链，其特征在于：

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-7D5，包括轻链和重链，其特征在于：

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种编码权利要求1所述的抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scfv-2B5的基因，其特征在于：

编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.一种编码权利要求2所述的抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白特异性单链抗体scFv-7D5的基因，其特征在于：

编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的轻链可变区核苷酸序列。

6.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求3所述的重链可变区核苷酸序列。

7.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求4所述的轻链可变区核苷酸序列。

8.一种质粒载体，其特征在于该质粒载体含有权利要求4所述的重链可变区核苷酸序列。

9.权利要求5、6、7、8所述的质粒载体用于真核表达犬2型腺病毒单克隆抗体，包括:

(a)通过PCR将权利要求3、4中所述轻链和重链核苷酸序列分别与鼠IgG1轻链恒定区和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；

(b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗犬Ⅱ型腺病毒蛋白单克隆抗体；

(c)纯化单抗并分别标记铕离子(Eu³⁺)，通过正交实验确定最佳单抗配对组合。