CN112540172A - 一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，包括：EB病毒衣壳抗原包被的磁微粒试剂、化学发光标记物标记的抗人IgG抗体试剂和中间相试剂。本发明的试剂盒基于化学发光免疫分析法，能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，完成对血清中EB病毒衣壳抗原IgG抗体的检测。试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度，缩短了临床检测所需的时间，具有灵敏度高、准确定量、操作简单、检测时间短等优点。此外，本发明的试剂中添加的胆碱和酶抑制剂大大提高了试剂的抗干扰性及稳定性，特别是有自身免疫疾病或其他并发症患者的检测。

Description

一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

EB病毒(Epstein—Barr virus，EBV)为疱疹病毒科，称人类疱疹病毒IV型，人类是其唯一宿主。EBV是双链DNA病毒，基因组长172kb，在病毒颗粒中呈线性分子。EBV主要通过唾液传播，也可以通过输血或器官移植途径传播。EBV有两种感染形式：裂解感染和潜伏感染。感染细胞后，其DNA发生环化并能自我复制。EBV原发感染后会建立终身潜伏感染。超过90％的个体在20岁之前感染过EBV，多数人表现为无症状的感染或自限性的传染性单核细胞增多症(IM)，但少数人可引起慢性活动性EBV感染(CAEBV)和EBV相关噬血淋巴组织细胞增生症(EBV.HLH)等非肿瘤性重症EBV相关疾病。EBV还与许多恶性肿瘤的发生相关，如霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、鼻咽癌(NPC)、胃癌、移植后淋巴细胞增殖症(PTLD)等。

EBV感染的血清学反应复杂，不同EBV抗原的抗体反应谱显示了原发性或持续性潜伏性EBV感染以及EBV相关疾病的特征模式。目前的原发性EBV感染在血清学上是由循环VCA-IgM的早期出现及其随后下降到不可检测的水平，与此同时VCA-IgG出现，其水平逐步升高来定义的。大多数(>80％)有症状的传染性单核细胞增多症患者在首次检查时显示VCA-IgG和IgM抗体水平接近峰值。VCA-IgM抗体通常在发病后2-3个月内消失，而IgG抗体则终身存在。大多数患者会暂时产生抗EA(D)的抗体，但抗EBNA-1的IgG抗体出现在发病数周或数月后的血液循环中，并持续数年甚至终身。在有症状的传染性单核细胞增多症患者中，同时检测到VCA-IgM、VCA-IgG抗体和EBNA-1的IgG抗体时，有助于区分传染性单核细胞增多症的早期恢复期和急性期。感染性单核细胞增多症患者的EBNA-1IgG水平升高可能预示着从早期到后期的康复过程。VCA-IgG水平的升高表明感染的急性期，而VCA-IgM水平的升高可能表明感染的早期进展到急性期。类似地，VCA-IgM水平的下降可能预示着感染从急性期发展到衰退期。VCA-IgA的急剧升高可以预测鼻咽癌风险，健康个体中EBNA-IgG抗体的存在表明既往感染EBV；VCA-IgG抗体的存在表明注射过疫苗、或无症状感染和既往感染。因此，跟踪EBV抗体谱有助于EBV感染的诊断，是临床诊断中不可缺少的依据。

目前测定EB病毒衣壳抗原IgG抗体的方法有金标法和酶联免疫吸附法等方法。金标方法灵敏度较低，只能定性，不能定量；酶联免疫吸附法定量准确性差、抗干扰能力差、操作时间长、自动化程度低，结果受人为因素影响结果较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，基于化学发光免疫分析法，实现EB病毒衣壳抗原IgG抗体定量检测，提高了整个系统的灵敏度与准确度，同时操作简单，实现自动化，检测降低了人为操作的误差。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，包括：

试剂R1：EB病毒衣壳抗原包被的磁微粒试剂；

试剂R2：化学发光标记物标记的抗人IgG抗体试剂；

和试剂R3：中间相试剂；其中，

试剂R1包被用磁珠为环氧树脂磁颗粒，EB病毒衣壳抗原包被质量比为0.2～3.0％，试剂质量比为0.01～1％，磁颗粒的粒径是2.0～3.0μm；

试剂R2中抗人IgG抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～1:10，抗体的终浓度为0.1～1.0μg/mL；

试剂R3为中间相试剂为包含0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和0.01～0.5％抑肽酶pH7.0～8.0的缓冲液。

其中，试剂R2所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌中的一种。优选为吖啶酯。

试剂R2所述的抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体。

试剂R3为100～400mM PB、Bistris丙烷或HEPES缓冲液。

试剂R3优选为含有0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、0.01～0.5％抑肽酶、0.5％BGG、50～200ug/ml阻断剂pH7.0～8.0的100～400mMPB、Bistris丙烷或HEPES缓冲液。

所述阻断剂为非特异性小鼠IgG抗体。

本发明还提供了上述试剂盒的制备方法，具体地，试剂R1的制备方法为：取环氧树脂磁颗粒，按所述质量比加入EB病毒衣壳抗原，加入缓冲液，37℃下混悬16-24小时，磁分离，去上清，用缓冲液清洗后，加入封闭液进行封闭并储存；使用前，磁分离，清洗后，用25MmTris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％～1％的固相试剂R1。

试剂R2的制备方法为：用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置2-4小时后，纯化标记抗人IgG抗体；使用时，将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用100～400mM PB、Bistris丙烷或柠檬酸，0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.5％BGG、pH6.0～7.0的缓冲液稀释抗体终浓度为0.1～1.0μg/mL，即为R2试剂。

试剂R3的制备方法为：制备含有0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、0.01～0.5％抑肽酶、0.5％BGG、50～200ug/ml阻断剂、PH7.0～8.0的100～400mM PB、Bistris丙烷或HEPES的缓冲液。

磁珠包被的抗原、化学发光标记物标记的抗人IgG抗体和中间相试剂分别灌封于不同的试剂瓶中组成试剂盒。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，基于化学发光免疫分析法，能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，完成对血清中EB病毒衣壳抗原IgG抗体的检测。试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度，缩短了临床检测所需的时间，具有灵敏度高、准确定量、操作简单、检测时间短等优点。此外，本发明的试剂中添加的胆碱和酶抑制剂大大提高了试剂的抗干扰性及稳定性，特别是有自身免疫疾病或其他并发症患者的检测。

附图说明

图1为实施例1中用到的吖啶酯的化学结构式。

图2为实施例1得到的EB病毒衣壳抗原IgG抗体标准曲线图，横坐标为校准品浓度，纵坐标为试剂反应的光量子数，其拟合度分别为0.9991。

图3为实施例2得到的EB病毒衣壳抗原IgG抗体标准曲线图，横坐标为校准品浓度，纵坐标为试剂反应的光量子数，其拟合度分别为0.9988。

具体实施方式

本发明的。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。

本发明提供的EB病毒衣壳抗原IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒包括：EB病毒抗原包被的环氧树脂磁颗粒(本相也可用生物素标记的抗原与链霉亲和素磁珠通过生物素-链霉亲和素体系的结合来完成，本发明重点以包被体系展开论述)、化学发光标记物标记的抗人IgG抗体和中间相试剂。

优选的，EB病毒抗原包被的环氧树脂磁颗粒的抗原包被质量比为0.2～3.0％，试剂质量比为0.01～1％，磁颗粒的粒径是2.0～3.0μm。

优选的，化学发光标记物标记的抗体中，抗人IgG抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～1:10。试剂缓冲液为pH6.0的100mM PB，0.05％吐温、0.05％Proclin300和0.02％的迭氮钠、0.05％吐温-20，1％的BSA，5％氯化钠，0.5％BGG的缓冲液。

优选的中间相试剂为pH7.4的100mM PB，0.05％吐温、0.05％Proclin300和0.02％的迭氮钠、0.05％吐温-20，1％的BSA，5％氯化钠，0.05％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，0.05％抑肽酶，0.5％BGG，50ug/ml的阻断剂(非特异性小鼠IgG抗体)的缓冲液。

其中所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌。其中，化学发光标记物优选为吖啶酯，结构式如图1。

其中还包括化学发光底物液包括A液和B液。A液为硝酸和过氧化氢溶液，B液为氢氧化钠溶液。

其中还包括EB病毒衣壳抗原IgG抗体校准品。EB病毒衣壳抗原IgG抗体的校准品浓度为0U/mL、5U/mL、25U/mL、125U/mL、250U/mL、500U/mL和1000U/mL的EB病毒衣壳抗原IgG抗体蛋白溶液。

这种EB病毒衣壳抗原IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒用于检测EB病毒衣壳抗原IgG抗体时，利用全自动化学发光免疫分析仪(迪瑞CM180)对EB病毒衣壳抗原IgG抗体校准品进行检测，绘制标准曲线，内置于电脑软件；然后根据需求测试临床样本，根据样本的光量子数计算EB病毒衣壳抗原IgG抗体的浓度；最后对EB病毒衣壳抗原IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒进行性能(线性、灵敏度、分析特异性等)的评价。

试剂盒的检测方法为：以全自动化学发光免疫分析仪(CM180)为检测工具，方法学模式为间接法，样本量10μL，抗原包被的磁珠试剂量40μL，中间相试剂量50μL，吖啶酯标记的抗人IgG抗体试剂量50μL。即仪器依次加入10μL的样本，磁珠包被的抗原R1溶液和中间相试剂R3共同孵育18min，洗涤，再加入吖啶酯标记抗体R2试剂孵育5min，形成磁微球-EB病毒衣壳抗原-EB衣壳抗原IgG抗体-抗人IgG抗体-吖啶酯复合物，通过磁分离器分离免疫复合物，洗掉游离的成分。仪器将反应物送入暗室，一次加入发光底物液A液(HNO3+H2O2溶液)和B液(NaOH溶液)进行反应，记录相对光单位(RLU)，在线性范围内，样本中EB病毒衣壳抗原IgG抗体的含量与相对光单位成正比。

实施例1EB病毒衣壳抗原IgG抗体化学发光免疫检测试剂盒的制备

(1)磁颗粒工艺：

取浓度是5mg(以该浓度为例，扩大质量提高相应抗原和缓冲液相同倍比体积)的环氧树脂磁颗粒(本品为商购)，加入100ug EB病毒衣壳抗原1mg/mL，加入2种等体积的环氧树脂磁颗粒自带缓冲液，37℃下混悬16小时，磁分离，去上清，用自带PH7.4的PBS缓冲液清洗后，加入环氧树脂磁颗粒自带的封闭液进行封闭并储存于该溶液。使用前，磁分离，清洗后，用25Mm Tris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.02％的固相试剂R1，2～8℃保存。

(2)化学发光标记物标记的抗人IgG抗体标记工艺：

用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，抗体量为500μg，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置2小时后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗人IgG抗体。将收集到的吖啶酯标记的抗人IgG抗体放置于2～8℃保存，使用时将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用pH6.0的100mM PB，0.05％Proclin300和0.02％的迭氮钠、0.05％吐温-20，1％的BSA，5％氯化钠，0.5％BGG的缓冲液稀释抗体终浓度为0.3μg/mL，即为R2试剂。

(3)中间相试剂

pH7.4的100mM PB，0.05％吐温、0.05％Proclin300和0.02％的迭氮钠、0.05％吐温-20，1％的BSA，5％氯化钠，0.05％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，0.05％抑肽酶，0.5％BGG，50ug/ml的阻断剂(非特异性小鼠IgG抗体)的缓冲液。

实施例2

(1)磁颗粒工艺：

取浓度是5mg的环氧树脂磁颗粒，加入100ug EB病毒衣壳抗原1mg/mL，加入2种等体积的环氧树脂磁颗粒自带缓冲液，37℃下混悬20小时，磁分离，去上清，用自带PH7.4的PBS缓冲液清洗后，加入环氧树脂磁颗粒自带的封闭液进行封闭并储存于该溶液。使用前，磁分离，清洗后，用25Mm Tris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.02％的固相试剂R1，2～8℃保存。

(2)化学发光标记物标记的抗人IgG抗体标记工艺：

用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，抗体量为500μg，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置3小时后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗人IgG抗体。将收集到的吖啶酯标记的抗人IgG抗体放置于2～8℃保存，使用时将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用pH7.0的400mM Bistris丙烷，0.1％Proclin300、0.1％吐温-20，3％的BSA，3％氯化钠，0.5％BGG的缓冲液稀释抗体终浓度为0.1μg/mL，即为R2试剂。

(3)中间相试剂

pH8.0的400mM Bistris丙烷，0.1％Proclin300、0.1％吐温-20，3％的BSA，3％氯化钠，0.01％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，0.5％抑肽酶，0.5％BGG，200ug/ml的阻断剂(非特异性小鼠IgG抗体)的缓冲液。

实施例3

(1)磁颗粒工艺：

取浓度是5mg的环氧树脂磁颗粒，加入100ug EB病毒衣壳抗原1mg/mL，加入2种等体积的环氧树脂磁颗粒自带缓冲液，37℃下混悬24小时，磁分离，去上清，用自带PH7.4的PBS缓冲液清洗后，加入环氧树脂磁颗粒自带的封闭液进行封闭并储存于该溶液。使用前，磁分离，清洗后，用25Mm Tris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.02％的固相试剂R1，2～8℃保存。

(2)化学发光标记物标记的抗人IgG抗体标记工艺：

用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，抗体量为500μg，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置4小时后，AKTA蛋白纯化仪纯化标记抗人IgG抗体。将收集到的吖啶酯标记的抗人IgG抗体放置于2～8℃保存，使用时将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用pH6.5的200mM柠檬酸，0.01％的迭氮钠、0.05％吐温-20，1％的BSA，5％氯化钠，0.5％BGG的缓冲液稀释抗体终浓度为1.0μg/mL，即为R2试剂。

(3)中间相试剂

pH7.0的200mM柠檬酸，0.1％Proclin300、0.1％吐温-20，3％的BSA，3％氯化钠，0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，0.01％抑肽酶，0.5％BGG，100ug/ml的阻断剂(非特异性小鼠IgG抗体)的缓冲液。

对比例1

R1和R2试剂制备与实施例1相同，R3未添加胆碱和酶抑制剂。

试验例试剂盒性能评价

1)线性的检测：采用实施例1和对比例制备的试剂盒，对校准品浓度为0U/mL、5U/mL、25U/mL、125U/mL、250U/mL、500U/mL和1000U/mL与光量子数作标准曲线，如图2和图3所示，得到线性相关系数r＝0.9991和0.9988，线性范围均为5～1000U/mL。具体结果如表1所示。

表1实施例1和对比例的校准结果

浓度(U/mL)	实施例1光量子数(RLU)	对比例光量子数(RLU)
			0	115	292
5	8632	7891
			25	53487	47293
125	353796	324726
			250	796344	645823
500	1536742	1453214
			1000	3362471	3142658

2)灵敏度检测：灵敏度的定义为对零值校准品进行20次测定光量子数，取其平均值加两倍标准差，带入零值校准品及相邻的校准所成直线所得即为灵敏度；计算实施例1和对比例制备的试剂盒的灵敏度分别为0.0277U/mL、0.0379U/mL，具体结果如表2所示。

表1实施例1和对比例的灵敏度检测结果

3)分析特异性

分析特异性为在样品基质中存在潜在干扰因素(例如抗凝剂、溶血等)或交叉反应抗体的情况下，分析特定干扰或交叉反应物存在时的准确性。潜在干扰物质和交叉反应抗体的存在检测结果表明，抗凝剂(柠檬酸钠、EDTA、肝素)、溶血(1000mg/dL血红蛋白)、血脂(3000mg/dL甘油三酯)、胆红素(20mg/dL胆红素)、hCMV IgG、MP IgG、HSV-1IgG、HSV-2IgG、VZV IgG、Toxo IgG、类风湿因子(RF)的存在对实施例1和对比例试剂准确性均没有显著影响，但添加了胆碱和抑肽酶的实施例1抗干扰特异性明显优于对比例，具体结果见表3。

表3实施例1和对比例抗干扰结果

通过上述结果可以看出本发明研制的检测EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、检测范围广、稳定性好等优点，特别是添加胆碱和酶抑制剂后，干扰特异性明显得到改善，可广泛用于临床检测。实施例2和3的试验结果与实施例1相似。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：

试剂R1：EB病毒衣壳抗原包被的磁微粒试剂；

试剂R2：化学发光标记物标记的抗人IgG抗体试剂；

和试剂R3：中间相试剂；其中，

试剂R1包被用磁珠为环氧树脂磁颗粒，EB病毒衣壳抗原包被质量比为0.2～3.0％，试剂质量比为0.01～1％，磁颗粒的粒径是2.0～3.0μm；

试剂R2中抗人IgG抗体与化学发光标记物的标记摩尔比例是1:3～1:10，抗体的终浓度为0.1～1.0μg/mL；

试剂R3为中间相试剂为包含0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱和0.01～0.5％抑肽酶pH7.0～8.0的缓冲液。

2.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R2所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺和三联吡啶钌中的一种。

3.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R2所述的抗人IgG抗体为鼠抗人IgG抗体。

4.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R3为100～400mM PB、Bistris丙烷或HEPES缓冲液。

5.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R3为含有0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、0.01～0.5％抑肽酶、0.5％BGG、50～200ug/ml阻断剂pH7.0～8.0的100～400mM PB、Bistris丙烷或HEPES缓冲液。

6.根据权利要求4所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，所述阻断剂为非特异性小鼠IgG抗体。

7.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R1的制备方法为：取环氧树脂磁颗粒，按所述质量比加入EB病毒衣壳抗原，加入缓冲液，37℃下混悬16-24小时，磁分离，去上清，用缓冲液清洗后，加入封闭液进行封闭并储存；使用前，磁分离，清洗后，用25Mm Tris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％～1％的固相试剂R1。

8.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，试剂R2的制备方法为：用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置2-4小时后，纯化标记抗人IgG抗体；使用时，将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用100～400mM PB、Bistris丙烷或柠檬酸，0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.5％BGG、pH6.0～7.0的缓冲液稀释抗体终浓度为0.1～1.0μg/mL，即为R2试剂。

9.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒，其特征在于，还包括7个浓度的校准品，分别为0U/mL、5U/mL、25U/mL、125U/mL、250U/mL、500U/mL和1000U/mL的EB病毒衣壳抗原IgG抗体蛋白溶液。

10.根据权利要求1所述的EB病毒衣壳抗原IgG抗体检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

试剂R1的制备方法为：取环氧树脂磁颗粒，按所述质量比加入EB病毒衣壳抗原，加入缓冲液，37℃下混悬16-24小时，磁分离，去上清，用缓冲液清洗后，加入封闭液进行封闭并储存；使用前，磁分离，清洗后，用25Mm Tris、0.05％吐温-20、0.05％Proclin300和0.02％迭氮钠，pH7.2的缓冲液中配成磁珠浓度为0.01％～1％的固相试剂R1；

试剂R2的制备方法为：用超滤离心管将抗人IgG抗体缓冲液置换为PBS，加入吖啶酯DMF溶液，充分混匀，室温放置2-4小时后，纯化标记抗人IgG抗体；使用时，将纯化后的抗人IgG抗体浓溶液用100～400mM PB、Bistris丙烷或柠檬酸，0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.5％BGG、pH6.0～7.0的缓冲液稀释抗体终浓度为0.1～1.0μg/mL，即为R2试剂；

试剂R3的制备方法为：制备含有0.05％～0.1％PC300或0.01％～0.03％的迭氮钠、0.05％～0.1％吐温-20、1％～3％的BSA、3％～5％氯化钠、0.01～0.5％的2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、0.01～0.5％抑肽酶、0.5％BGG、50～200ug/ml阻断剂、PH7.0～8.0的100～400mM PB、Bistris丙烷或HEPES的缓冲液。

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