CN110499315B - 巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子及其应用 - Google Patents

巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种巴氏杜氏藻甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶启动子及其应用，涉及分子克隆领域。本发明采用了来自特氏杜氏藻的同属的巴氏杜氏藻的Gapdh启动子来驱动RNA干扰片段，使得该片段能够在特氏杜氏藻细胞中稳定高效的表达。该载体中采用了博来霉素抗性进行筛选，使得我们能够筛选到单克隆突变株。相对荧光定量PCR结果：可以看出RNA干扰后的特氏杜氏藻株系中，特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的表达量显著下调。因此，本发明使用了新的启动子以及验证了启动子的高效表达，并首次在特氏杜氏藻中实现对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。

Description

巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子及其应用
技术领域
本发明涉及分子克隆领域，涉及一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(DbGapdh promoter)及其应用，特别涉及藻类干扰载体的构建克隆系统，具体涉及一种杜氏藻属结构基因(如甜菜碱合成相关基因)的RNA干扰载体的构建及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指一种生物体内由双链RNA诱发的基因沉默现象。当细胞中导入与内源性mRNA同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi最早是在研究线虫中被发现的，随后陆续发现于真菌、拟南芥、果蝇、锥虫、水螅、涡虫及斑马鱼等多种真核生物中，并逐渐证实植物中的转录后基因沉默、共抑制介导的病毒抗性等现象均属于RNAi在不同物种的表现形式。甜菜碱是公认的在细胞中起着无毒渗透保护作用的细胞相溶性物质，广泛存在于植物、动物、细菌等多种生物体中。植物中甜菜碱因其结构不同，其生物合成途径和催化合成所需要的酶也各不相同。
建立稳定高效的盐藻生物反应器至关重要的一步是寻找合适的内源性启动子驱动表达外源基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(缩写为Gapdh)催化糖酵解的第六步。Gapdh基因的表达是由高活性的启动子调控的，Gapdh基因的5'端调控序列已作为一个较优启动子元件广泛用于真菌，植物和细菌中启动外源基因的高效表达。Gapdh基因还涉及几种非代谢过程，包括转录激活，细胞凋亡的启动等。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。
本发明的另一目的在于提供上述巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的应用。
本发明的另一目的在于提供一种杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体。
本发明的另一目的在于提供上述杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体的应用。
本发明为了在特氏杜氏藻特定基因表达下调，验证基因功能，本发明构建了一种在特氏杜氏藻中进行RNA干扰的载体。该让该载体在特氏杜氏藻细胞内稳定表达，并实现了对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子，是从巴氏杜氏藻的基因组中获得的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供一种巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子在杜氏藻属中启动结构基因中的应用。
优选的，所述的杜氏藻属包括特氏杜氏藻、巴氏杜氏藻、杜氏盐藻等；
优选的，所述的结构基因为甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶CHDH。
本发明还提供一种杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体，是通过酶切连接和同源重组的办法构建得到，以pCR2.1为骨架载体，将Dbzdspro启动子序列、ble-EGFP序列以及Dblycbter终止子序列按转录方向依次连接在一起；接着再将上述所述的巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Dbgapdhpro启动子)、结构基因正向片段、pdk和cat内含子、结构基因反向片段以及Dbpsyter终止子按转录方向依次连接在一起，得到杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体。
优选的，所述的杜氏藻属包括特氏杜氏藻、巴氏杜氏藻、杜氏盐藻等；
优选的，所述的结构基因为甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶CHDH；
优选的，CHDH正向片段如SEQ ID NO：2的第7181-7522位碱基所示，CHDH反向片段如SEQ ID NO：2的第8521-8862位碱基所示。
其中，Dbzdspro启动子序列如SEQ ID NO：2的第58-2966位碱基所示，ble-EGFP序列如SEQ ID NO：2的第2967-4067位碱基所示，Dblycbter终止子序列如SEQ ID NO：2的第4068-4896位碱基所示，pdk和cat内含子如SEQ ID NO：2的第7523-8520位碱基所示，Dbpsyter终止子如SEQ ID NO：2的第8871-9972位碱基所示。
优选的，所述的杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
所述的杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体在干扰杜氏藻属中结构基因表达中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用了来自特氏杜氏藻的同属的巴氏杜氏藻的Gapdh启动子来驱动RNA干扰片段，使得该片段能够在特氏杜氏藻细胞中稳定高效的表达。该载体中采用了博来霉素抗性进行筛选，使得我们能够筛选到单克隆突变株。相对荧光定量PCR结果：可以看出RNA干扰后的特氏杜氏藻株系中，特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的表达量显著下调。
(2)本发明使用了新的启动子以及验证了启动子的高效表达，并首次在特氏杜氏藻中实现对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。
附图说明
图1是特氏杜氏藻RNA干扰载体的质粒图谱；其中，Zdspromoter启动子至lycbter终止子段是保证通过博来霉素抗性筛选后，能够得到单克隆突变株。Gapdh启动子及Dbpsy终止子是在本实验室中经过活性验证的基因调控元件，实现对特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的干扰。
图2是不同盐浓度下特氏杜氏藻和突变株的培养图；其中，(a)特氏杜氏藻对照组的培养图；(b)为突变株的培养图；1-5对应的盐浓度分别为0.25mol/L、0.75mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、3.0mol/L。
图3是不同盐浓度下特氏杜氏藻和突变株的细胞图；其中，1-5对应的盐浓度分别为0.25mol/L、0.75mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、3.0mol/L。
图4是特氏杜氏藻和突变株的荧光定量表达图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中所用的巴氏杜氏藻(Dunaliella bardawil)，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB-847；
特氏杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB-821。
实施例1
1、特氏杜氏藻培养液配制
配制不含氯化钠的盐藻培养液：NaNO3 0.420g/L，NaH2PO4·2H2O 0.156g/L，NaHCO30.840g/L，KCl 0.074g/L，MgSO4·7H2O 1.230g/L，CaCl2·2H2O 0.044g/L，0.1％Fe-EDTA液0.5mL/L。向培养液中加入A5微量元素溶液1mL/L，调pH至7.5。Fe-EDTA液成分如下：Na2EDTA0.189g/L，FeCl3·6H2O 0.244g/L。A5微量元素溶液成分如下：H3BO3 2.86g/L，MnCl2·4H2O1.81g/L，ZnSO4·7H2O 0.22g/L，CuSO4·5H2O 0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.04g/L。
不含氯化钠的盐藻培养液按100mL每瓶分装至250mL的三角瓶中，分别加入1.463克(即0.25mol/L)、4.388克(即0.75mol/L)、8.775克(即1.5mol/L)、11.7克(即2.0mol/L)、17.55克(即3.0mol/L)氯化钠，摇匀，四层纱布封口，在102.9kPa大气压下121℃高温灭菌20min。室温冷却后使用。
2、特氏杜氏藻RNA干扰载体的构建
巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子(Dbgapdh promoter)，是从巴氏杜氏藻的基因组中获得的，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
将pCR2.1载体序列、Dbzdspro启动子(即Dbzds promoter)序列、ble-EGFP序列(博来霉素和绿色荧光蛋白基因)以及Dblycbter终止子(即Dblycb terminator)序列这四个序列按转录方向依次连接在一起。再将Dbgapdhpro启动子(即Dbgapdh promoter)、Dtchdh正向片段、pdk和cat内含子(pdk-cat intron)、Dtchdh反向片段以及Dbpsyter终止子(即Dbpsy terminator)按转录方向依次连接在一起，构建方式如图1，构建得到的特氏杜氏藻RNA干扰载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
Dbzdspro启动子(即Dbzds promoter)和ble-EGFP来自质粒pZBET(在文献“doi:10.1104/pp.114.235390”中公开)；Dblycbter终止子(即Dblycb terminator)来自质粒pLBET(在文献“doi:10.1111/1462-2920.13539”中公开)；pCR2.1载体骨架购自invitrogen公司；其他序列由本实验克隆得到。克隆和构建的引物如下表：
Figure BDA0002174420740000041
Figure BDA0002174420740000051
构建方案为：
①PCR2.1+zdspro-ble-EGFP(来自pZBET)；
②PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter(XbaI酶切)；
③PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter+DbGapdh promoter(XbaI酶切)；
④PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter+DbGapdh promoter+ChDh正向片段(XbaI酶切)；
⑤PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter+DbGapdh promoter+ChDh正向片段+PDK-CAT intron(XbaI酶切)；
⑥PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter+DbGapdh promoter+ChDh正向片段+PDK-CAT intron+CHDH反向片段(XbaI酶切)；
⑦PCR2.1+zdspro-ble-EGFP+Lycbter+DbGapdh promoter+ChDh正向片段+PDK-CAT intron+CHDH反向片段+Dbpsy terminator；
(1)制备线性化载体。
用所采用的限制性核酸内切酶(购自Thermo Fisher Scientific)。37℃水浴3h。酶切反应体系如下：
10×Buffer 5μL
两种酶 各1μL
质粒 10μL
Add dH<sub>2</sub>O To 50μL
Total 50μL
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。
(3)酶切之后，采用PCR纯化试剂盒纯化线性化载体。
3、PCR扩增目的片段
(1)使用Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase(高保真酶，购自Takara)，进行两轮PCR反应。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
(3)用OMEGA公司的胶回收试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit回收目的片段，纯化PCR产物。
4、In-Fusion克隆
(1)建立In-Fusion(购自Takara)克隆反应体系：
5X In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL
线性化载体 1μL
纯化的PCR片段 2μL
dH<sub>2</sub>O 5μL
Total 10μL
(2)50℃孵育15min，然后置于冰上。
(3)连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有卡那酶素的平板上。在37℃生化培养箱中倒置培养12～16h。注意培养时间不宜过长，否则抗性失效，生长出卫星菌落，给筛选阳性克隆造成困难
5、质粒的提取
参照OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit试剂盒的说明书，提取质粒pSDS-DbCRTISO。
(1)10000g，1min离心，收集菌体。
(2)加入250μL SolutionⅠ，涡旋十几秒，混匀。
(3)加入250μL SolutionⅡ，上下颠倒4～6次，室温放置2min。
(4)加入350μL SolutionⅢ，轻轻摇匀，10000g，10min离心。
(5)转上清至Hibind柱，10000g，1min离心。
(6)弃掉滤液，加入500μL Buffer HB，10000g，1min离心。
(7)弃掉滤液，加入700μL DNA Wash Buffer，10000g，1min离心。
(8)重复洗一次(步骤7)。
(9)10000g，空管离心2min。
(10)弃掉收集管将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管，加入50～100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA，静置1～2min后，10000g，1min离心。
6、电击转化特氏藻RNA干扰质粒
前期准备：
(1)对数期藻细胞：重新接种特氏杜氏藻细胞，培养7天左右，特氏杜氏藻生长至对数期，此时转化率最高。
(2)重组质粒：提前一天接种含重组质粒(构建方案⑦对应的重组质粒)的大肠杆菌，提取质粒，并测质粒浓度，备用。
(3)干净的电极杯。
电转化：
(1)收集处于对数生长期的特氏杜氏藻细胞培养液，室温，离心2000rpm，5min，收集细胞，用新鲜培养基清洗2次。
(2)用2×HEPES缓冲液(NaCl 1mol/L，KCl 0.01mol/L，CaCl2 0.01mol/L，HEPES0.04mol/L，甘露醇0.4mol/L，山梨醇0.4mol/L)调整特氏杜氏藻细胞浓度达到大约为1.2～2×106个/mL；
(3)取400μL 2×HEPES缓冲液悬浮细胞，加入0.4cm电击杯内；
(4)加入1μg的质粒混匀后冰浴静置10～15min；
(5)采用电容25μF，电阻400Ω，电压0.8KV的电击条件转化特氏杜氏藻。
(6)将电击杯置于冰浴中静置5min；
(7)将悬浮液转移至1.5mL离心管中，1000rpm离心10min；
(8)去除电击缓存液(用移液器吸取上清)，加入1mL 1.5M盐度的特氏杜氏藻培养液中；
(9)转移至试管内，暗培养12h后，转至光照培养箱中正常培养48h。
(10)博莱霉素(Zeocin)抗性培养基：在100mL含有11.7g(2.0mol/L)NaCl的盐藻培养基中加入0.75g的琼脂粉，在微波炉中4min，待冷却至60℃左右的时候加入10μL 100mg/mL的Zeocin，混匀，倒平板，培养基的Zeocin最终浓度为0.01mg/mL。
(11)在暗处恢复培养24h后的转化藻培养液，分别吸取500μL涂布于巴氏藻固体博莱霉素抗性培养基平板中，然后放置光照培养箱，给予14：10(光照：暗夜)的光照周期进行培养，经过约14d的光照培养，将平板上长出的单克隆藻落接种于巴氏藻液体博莱霉素抗性培养基中，按照常规培养至对数生长期，用于后续检测、验证。
7、挑选单克隆突变株，采用荧光定量检测突变株(记为：RNAi-mut)和特氏杜氏藻对照株(Control)的RNA表达情况。结果如图4所示，可以看出RNAi干扰后的特氏杜氏藻株系中，特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的表达量显著下调。
8、将已鉴定的单克隆突变株分别转移至0.25mol/L、0.75mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、3.0mol/L盐含量的培养基中培养20天，并观察培养形态和细胞形态。
培养形态结果如图2所示，从图2可以看出各种盐浓度下藻液颜色有明显差别。特氏杜氏藻藻液颜色明显比突变株藻液颜色绿。说明干扰特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的基因对藻细胞体内色素含量有影响。
细胞形态结果如图3所示，从图3可以看出各种盐浓度下特氏杜氏藻细胞和突变株对比形态变化不大。说明干扰特氏杜氏藻甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶DtCHDH的基因对藻细胞形态影响不大。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子及其应用
<160> 24
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子
<400> 1
ccttgccaat gtttcccttc tgacgaacac ctaaggtaaa ctgcatcctt ggtgttacac 60
ccatacaggg ctctcgaaac tacaccatgt gttgcagacc acactgtcct cacaagttgc 120
tggttggcat ggaacgtagg catggaaagt aagacatgcc caagagggag aaaacaatca 180
ggagctcaag catgttagct ctgtaggcca tccttgcact aagagtggag cccctccccc 240
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taacttttta cacacgcatc acctctcaca gaagcttgct tgcatgcaag cgcacacaac 720
acacacatac atgcacgcac acccacacac ccacacaccc acacgcacaa acttgaccga 780
gagaacacag gagttactgt tggcacatgc acctggcact caacagatgg gcaatacttg 840
gactttgtta ctgctgtcgt gcttgagtat tcatgaaaca cagtagcaag aatgcaacgg 900
gacgggcact attccgtgta ctccagtgcg tagtagagtc atccacgcag tagggtttac 960
tttgcaatta tttctcacag actcttcaca aaggaaaggc atgcctattg agacaagatg 1020
gcgtgcccac ctaaaatgtt ggatgccagg gtcaacaaaa tggccagcgc tgtgcttcca 1080
cccacagctg cggtcatgct tataccagag gatagggtgg ttggcataca gcagaagaca 1140
gctgcgccca gtgcgatggg gagagagtgg tccggcagtg gcagcctcag caacacataa 1200
gcgagcaggg gcgtgagcag caaaatggag accagcccga aggtcacgca gcctgcaggc 1260
tcaagaaaaa tgagcagtgt cagaacgtgc tcctgccatc tgtatgcaga tggcacggac 1320
cagctggtgt gcattcatat gcactcatga gcacagatct ggggctgcca tcagcaagaa 1380
gtgcatgtaa gtcctacgtt gaagattggt tagctgccaa gagtttggtt tagccccccg 1440
gtttgaattg gagcttcacc tgttgacttt gccgcagcta gcgcatcgcc acgcttcagt 1500
ggcagcccac tgatgacgaa gatggcaatt gtgatcaagt ttgaaaggcc cagctcataa 1560
gctcttaggc cctcttgggg gcggatcaca cccagcagga tgaaagaaat caaagcgaaa 1620
gggaggatct gcttgtcaat ggctctcagc acagacagca ctgcttttgc tggcgactgc 1680
atgtttgttg gacccccagc atggtcgtga tgctgccctt gtgagagcac gtgggtccgc 1740
tgcttggttt ctttccctgt gcagttcctc ctggagagaa tgccccattg cgcggataac 1800
cggtgttggt ggaaactgtg cacagagcat gccctgctca acggcacagt ttgccgtatc 1860
tgaagcatcc cagtctatat tcccaactgc tccttcaatt ttgcacttat tgacctcatg 1920
cttgcatgcc gctcaagctt cacaggaagc agcagctcgg ggtagcacag aggattttcc 1980
aacaaatgag aaatgcaaac agtgaagcgc tgtagcactt gcttgcaggg gcttgcttct 2040
ctcatgaaag ttcatgacaa gagcgaagtg actcccattg agcacaatac gatggaaaat 2100
ggatcataag aagaaatcct ctttgagtaa gtttgagtgc agacacttcg gagcggttgg 2160
aacggacaaa ctcaaggagt tttgatccta ctcacgccgc tcataaattt ttacgttgtt 2220
tcaattgtga ggtgtatttg aacagtcttg gcagcagaac agtgag 2266
<210> 2
<211> 13558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体
<220>
<222> (58)..(2966)
<223> Dbzdspro启动子
<220>
<222> (2967)..(4067)
<223> ble-EGFP序列
<220>
<222> (4068)..(4896)
<223> Dblycbter终止子
<220>
<222> (7181)..(7522)
<223> CHDH正向片段
<220>
<222> (7523)..(8520)
<223> pdk和cat内含子
<220>
<222> (8521)..(8862)
<223> CHDH反向片段
<220>
<222> (8871)..(9972)
<223> Dbpsyter终止子
<400> 2
gcttggtacg agctcggatc cactagtaac ggccgccagt gtgctggaat tcggcttaat 60
gtgcctcctg ttccaataat ggtgcaggga gagttttctt ttccctacgt agtttttctt 120
ctttcttttc taggctagca atttctgcaa gttgcttcag caaagctgcc ctgtaggcat 180
gtacggcttt gcagcccttt ccttgcttat tctttcctat aggtattatg atgcacagcc 240
agataactct tttctatcat tcaattgcat tgcttttgct atcacaatgc tttctgttgg 300
tttgttcaat ttcgtcgcgc attcaatcca gctcatgtga aactcgaatg tcagctctct 360
gcctttgcag tggtcaagcc ccaccttgct acatggagtg ttggcatgga ggttttttac 420
tgtgctcatg gacccccaaa aaatatagcg caaagccgca ttcctgcacc tcacttgcct 480
caagaaagac atatgttcta agctgctata ttgacagaaa ttgttggtaa cgtacaatag 540
gtgcccatgt caagcgcatc acagtttaca ggactcagcc cagcatgaca acaaagaggg 600
gcaaggggtc atcagcgcca aaaaattgtt gccaggcaca ttgtccattc atatttgcaa 660
ttgtgagtct atatgtcatc atgaacatac gtttggttta aatgttgatg ctgaatagca 720
ccaattccat catggaatgg catcccactc attcaacatg gatcacacag tgtgtggaag 780
gattagaaaa aatttgaagg taccatagaa atgaacaagc gatcctttaa ccaactgggg 840
agggtgggag gggggtccac ttgtcaagtt ttatgcaagt cacgccatat ttacatgtgc 900
atgatgcatg cacaacaagg tggatgtaag ttacataatg tacagcgttt ctaccgtggc 960
tggctaaaca accacgactt gatcttttta ctggagggcc cttgcctggc cgatggcgcc 1020
gctcgttgct gcttgctgct ttttgctggt gcttccgctg ctggtgtgct aggcgtcgag 1080
gctggtgctg gcttggaagc atcaatgcgc aactgacgtt caggcaaagc ttggaacagg 1140
gggagcgcga ctgagcttgc tgtcttcaga aacacgccct gtacaagaat caaagcgagc 1200
ggcataatta agaggcgcag aggaagccga ggcagcagtt caatcacggg agtcttatcc 1260
agttctaatc ctacatccct ggacttttag gaattaatca agaagcacga aaaagtccca 1320
ggccaagaaa actgaaaaca tagccttatc ctatgcagca tggatattcc atgaagaagg 1380
gccaaacggt gggtgcacta ggtgctggca tgtgaaagtg aagcacaggt aaaaagctgt 1440
tttcagaact ggtcaccgaa aaaccccaat gacaacatac gcgtgcaaaa atcttcggac 1500
acaaagccct ctcgcacctg tatgttggcc cacttcttgg gtatatgctc cactgcttga 1560
cataagatcg catggatgtt ctccactatc tgctgctgag tctgcccgct ccgagctgct 1620
cggatattca cgcatgtccc actgttcttg aacatgtgcg tggctgcgca tgccttcttg 1680
acctacaagg caggaaatta gagttaaggg aggtggtgaa acatgtggca tccagacagg 1740
agcaggccag gtacagttgg gatgcacaca atggcggaca taattctcct ttacaagaat 1800
gaaacggaac tggacatcga gtacaaacta aaagacatcg aggcctcaat gtatacatgt 1860
cagctctttg cactcattga aaacgtttga atacaaagca ttgtgcaaca aatgtaccgc 1920
acaatcatca cgcttggaaa ttgaacagaa tttgaactcc ctgcaggagt acatgggcat 1980
gagtaaaata aatgtgcaca cacacagagg catgcatgct cacacacatg cacacacaca 2040
cacttgcata cttacacatt gggaacccaa gacctcttaa tcctttccat acctgcgctg 2100
gaaagtcctt gacagtgatg tccacaggga tgggctgctt cttcttcttg aaaaagctct 2160
tgccaatgag cttgggcaaa gacggcagga tgcgctcatc ggctagaaac aagtcataca 2220
gcttgcacag ctccctcttg gcctcatggg acttgtactt cgtgcgcagc ttggacaggc 2280
ccaccacctt ggtcacgccg cccttgcgct cgaacttgtt caccatggct ttggcctgct 2340
tgtggccctt ctcccttgtg gtctttcacg aaaaggcaaa gcttctgcgc cctccgggct 2400
gagaaggggg tgaggcaagg gaaggggaac aggcttgtcc ttgcgtgcct gcaggggcat 2460
tttcttcagc gccagctgca ggaagaacac ctgtggcgtg gaatgcacac agagaggtgg 2520
tttatgagcc agtctgtgtc agcatgccgg gttgagcaga ggaaaaggcg gctttgggaa 2580
acacacaggt gcctaaggga aagagtctgc cggctgcaca cacctgcatg tcaacatgca 2640
ttacaagtac gtgcccctcg ttccccacct cgtcgtccgc atccgccagc agatcatggc 2700
tctcggaggc agccttgttg gtgaactttt gcagcgaggc gaccgcttgc tctacctgct 2760
tcgcgttcca ccctgccagc ttgacatctg cgcctgtaaa tttgcccatt ctatttgcta 2820
aatgcaattt atcttatcgt tttacccttg tcttttcaac aagcactcaa gctaggttct 2880
ttgcttgtct accggtagtt agcaggcgta cattgccggc cacttacatt tcccaaatat 2940
tacttacagc atacagaagg cgcgccatgg ccaagttgac cagtgccgtt ccggtgctca 3000
ccgcgcgcga cgtcgccgga gcggtcgagt tctggaccga ccggctcggg ttctcccggg 3060
acttcgtgga ggacgacttc gccggtgtgg tccgggacga cgtgaccctg ttcatcagcg 3120
cggtccagga ccaggtggtg ccggacaaca ccctggcctg ggtgtgggtg cgcggcctgg 3180
acgagctgta cgccgagtgg tcggaggtcg tgtccacgaa cttccgggac gcctccgggc 3240
cggccatgac cgagatcggc gagcagccgt gggggcggga gttcgccctg cgcgacccgg 3300
ccggcaactg cgtgcacttc gtggccgagg agcaggacgg acgcgccatg gtgagcaagg 3360
gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg 3420
gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc 3480
tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc 3540
tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct 3600
tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg 3660
gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg 3720
agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca 3780
actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga 3840
acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc 3900
agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc 3960
agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg 4020
tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaaccg cggttggatc 4080
ttacatgtaa ctgttgcaat gggcgttgta gtctgtgcgc atgctgtttt cagcttgagc 4140
tggggaggaa agggtatgaa actgccacat gtctggatgt ggctaacgtt taattgctta 4200
tccatgggct ctgatgcaaa tgcgcatgaa tacttgatgt gagatacgcc cgcatggaag 4260
tgcatggatt tttccctttt ggctctcatt gcatgaaata tgtgcgatgc ccagcagctc 4320
attcagtgtg ccgacgctct tcagcatgaa ttgcctgttt tgaatggcct tgcctctctc 4380
accaaaactt ttttggaact ggaacaacac attttcttta actgttgaat tgtctatcta 4440
tctgaaatcc tggatgcacc ttatcaaagg gaattgatgt cttctgtgag gctgaggcta 4500
tggcgctgta tggtgtatgg ctgaggaaat gtggccggaa tatacttttt gtgcatcgta 4560
gaccattacg gtgcttaagc tcatgcagac atggcattcc atcattctga gcacaactgc 4620
tgcatgatga ccaccctcgc aaatttgtgc aagtatacct ttttcaagct gataagtgct 4680
tggaactgtt gaaacaaaac aggctaacct catggcaatt ccttcaataa gaaaaagaaa 4740
gattgtggag gcaaagagaa cttcatgcta catttattag gggaaaggag acgcaatggc 4800
tcaaagaagc cttcatgcat gctacagaaa gctgacagtc taataaaaaa acatagattc 4860
ctggttttgt tttgtgcggg ttcttctcac tcggccccgc ggctcgagcc ttgccaatgt 4920
ttcccttctg acgaacacct aaggtaaact gcatccttgg tgttacaccc atacagggct 4980
ctcgaaacta caccatgtgt tgcagaccac actgtcctca caagttgctg gttggcatgg 5040
aacgtaggca tggaaagtaa gacatgccca agagggagaa aacaatcagg agctcaagca 5100
tgttagctct gtaggccatc cttgcactaa gagtggagcc cctcccccca aaaggagcac 5160
ccctgaaggg tactttttca ccaagcggag aacccaaagt ggagcaccag agacgcaaca 5220
aagcagcagt gacctttacc tggaacatgt ttcagggtac agaagcaaaa ggcctttggt 5280
caggaacatg gccgtgagcc tgttcataaa agagaggggg ttttgcaaca aagcagcagt 5340
ggctacctgg aacaaaggct ctggcagcag cgcccaggag agtgggcagc agcaccacct 5400
tggtgagctg ggcgagcagg gggcctggct gcaggccgct gctgctgctg ccccctacag 5460
cgctgcccag caacactggc agtaccaggg gcatggtgaa gacgcctgca agatgcagag 5520
atggcaaata aggagtgccc ctccatgcga gcaacggaca attttgacta actttttaca 5580
cacgcatcac ctctcacaga agcttgcttg catgcaagcg cacacaacac acacatacat 5640
gcacgcacac ccacacaccc acacacccac acgcacaaac ttgaccgaga gaacacagga 5700
gttactgttg gcacatgcac ctggcactca acagatgggc aatacttgga ctttgttact 5760
gctgtcgtgc ttgagtattc atgaaacaca gtagcaagaa tgcaacggga cgggcactat 5820
tccgtgtact ccagtgcgta gtagagtcat ccacgcagta gggtttactt tgcaattatt 5880
tctcacagac tcttcacaaa ggaaaggcat gcctattgag acaagatggc gtgcccacct 5940
aaaatgttgg atgccagggt caacaaaatg gccagcgctg tgcttccacc cacagctgcg 6000
gtcatgctta taccagagga tagggtggtt ggcatacagc agaagacagc tgcgcccagt 6060
gcgatgggga gagagtggtc cggcagtggc agcctcagca acacataagc gagcaggggc 6120
gtgagcagca aaatggagac cagcccgaag gtcacgcagc ctgcaggctc aagaaaaatg 6180
agcagtgtca gaacgtgctc ctgccatctg tatgcagatg gcacggacca gctggtgtgc 6240
attcatatgc actcatgagc acagatctgg ggctgccatc agcaagaagt gcatgtaagt 6300
cctacgttga agattggtta gctgccaaga gtttggttta gccccccggt ttgaattgga 6360
gcttcacctg ttgactttgc cgcagctagc gcatcgccac gcttcagtgg cagcccactg 6420
atgacgaaga tggcaattgt gatcaagttt gaaaggccca gctcataagc tcttaggccc 6480
tcttgggggc ggatcacacc cagcaggatg aaagaaatca aagcgaaagg gaggatctgc 6540
ttgtcaatgg ctctcagcac agacagcact gcttttgctg gcgactgcat gtttgttgga 6600
cccccagcat ggtcgtgatg ctgcccttgt gagagcacgt gggtccgctg cttggtttct 6660
ttccctgtgc agttcctcct ggagagaatg ccccattgcg cggataaccg gtgttggtgg 6720
aaactgtgca cagagcatgc cctgctcaac ggcacagttt gccgtatctg aagcatccca 6780
gtctatattc ccaactgctc cttcaatttt gcacttattg acctcatgct tgcatgccgc 6840
tcaagcttca caggaagcag cagctcgggg tagcacagag gattttccaa caaatgagaa 6900
atgcaaacag tgaagcgctg tagcacttgc ttgcaggggc ttgcttctct catgaaagtt 6960
catgacaaga gcgaagtgac tcccattgag cacaatacga tggaaaatgg atcataagaa 7020
gaaatcctct ttgagtaagt ttgagtgcag acacttcgga gcggttggaa cggacaaact 7080
caaggagttt tgatcctact cacgccgctc ataaattttt acgttgtttc aattgtgagg 7140
tgtatttgaa cagtcttggc agcagaacag tgaggtcgac accggcgcac gcaccacccg 7200
cctcctgttc gagcgtgtgc ctggtgcacc acccaaggct gtgggcgtgg agttctcgca 7260
gggcagcaac agtgcaagcg ggcgcgagag cgcgcaactg gcagagggtg gcgaggtgct 7320
gctgtgctct ggtgcagtgc acagccccca tgtgctgcag ctgtcgggca tcgggcctgc 7380
gcaggagctg cagcggcacg gcatcgaagt gattgcggac gtgccgggcg tgggcaagaa 7440
cctgcaggac caccctgcag ctctgattgg ctgcctgaca gacgcacagt atgaccagct 7500
agctgtgacg agccagatat accttggtaa ggaaataatt attttctttt ttccttttag 7560
tataaaatag ttaagtgatg ttaattagta tgattataat aatatagttg ttataattgt 7620
gaaaaaataa tttataaata tattgtttac ataaacaaca tagtaatgta aaaaaatatg 7680
acaagtgatg tgtaagacga agaagataaa agttgagagt aagtatatta tttttaatga 7740
atttgatcga acatgtaaga tgatatacta gcattaatat ttgttttaat cataatagta 7800
attctagctg gtttgatgaa ttaaatatca atgataaaat actatagtaa aaataagaat 7860
aaataaatta aaataatatt tttttatgat taatagttta ttatataatt aaatatctat 7920
accattacta aatattttag tttaaaagtt aataaatatt ttgttagaaa ttccaatctg 7980
cttgtaattt atcaataaac aaaatattaa ataacaagct aaagtaacaa ataatatcaa 8040
actaatagaa acagtaatct aatgtaacaa aacataatct aatgctaata taacaaagcg 8100
caagatctat caattttata tagtattatt tttcaatcaa cattcttatt aatttctaaa 8160
taatacttgt agttttatta acttctaaat ggattgacta ttaattaaat gaattagtcg 8220
aacatgaata aacaaggtaa catgatagat catgtcattg tgttatcatt gatcttacat 8280
ttggattgat tacagttggg aagctgggtt cgaaatcgat aagcttgcgc tgcagttatc 8340
atcatcatca tagacacacg aaataaagta atcagattat cagttaaagc tatgtaatat 8400
ttacaccata accaatcaat taaaaaatag atcagtttaa agaaagatca aagctcaaaa 8460
aaataaaaag agaaaagggt cctaaccaag aaaatgaagg agaaaaacta gaaatttacc 8520
gtatatctgg ctcgtcacag ctagctggtc atactgtgcg tctgtcaggc agccaatcag 8580
agctgcaggg tggtcctgca ggttcttgcc cacgcccggc acgtccgcaa tcacttcgat 8640
gccgtgccgc tgcagctcct gcgcaggccc gatgcccgac agctgcagca catgggggct 8700
gtgcactgca ccagagcaca gcagcacctc gccaccctct gccagttgcg cgctctcgcg 8760
cccgcttgca ctgttgctgc cctgcgagaa ctccacgccc acagccttgg gtggtgcacc 8820
aggcacacgc tcgaacagga ggcgggtggt gcgtgcgccg gtgcggccgc gcacagcctc 8880
tgtatggttg cagccgctgg ttgtgctgta gcccgtgcgc ccacatgggt gctgggcgag 8940
cagggtttca gtgttgctgg ctgactgaca tgcaagtgct caggaactga gtgcaggctg 9000
tgggcgcccg cgaccaagct atgtaacact agattactgg tttgcaagac tgccaagtag 9060
aactgcatgc tcagaaatat gtcgcaaggg gtggtgtgtg tgctggacac gccacgcgca 9120
cctccagtgc agctctctgc cctgatgttt tttggtaagt ggtatatctt gaccttttgg 9180
ctccttgccg cttgcattgc ccatcccaca tgcattctgc atacagtcca gcagacatgc 9240
atggcgggct cctgttgggg tgccaagcac accatgtgat ttgtgagtga gagagctttc 9300
aaatccggca ctcatgggaa tgttgagtgt gtgaatgcga tgcccctgct tgaggtgtcc 9360
ttgcttaccg tacttctccc ttctttctcg gactcccgag gagtgcttag cccaacgttg 9420
gcagcgtatt ccttgtcgca tcttcttcac gcctgaatgt atttgcgctg tggtttgtat 9480
gcatatatag gacagggtca tctgatatga tctgctcttt gagcggcttc tgtgcggggg 9540
catgaaggac aagagtgctg agggactctg gctggtgctc tgtttgcgtc ccccttagag 9600
tcgctcacct cctcaatacc ttattttgct gtcttcaagc cacttcgact tgaaacccca 9660
ctatgacgag caatcccttg tatagtgcct tgcaaggctt caactcatag ctttttgttt 9720
attcatttaa gcaggcttga atttttttgt cataattgtt ttgcatgccc gatttctttc 9780
cgtggcatgc ttgttttttc ctctcaaggc tttgcgctta gcttgcactt gatgtaagac 9840
ttgctttcgt gcatctgtca tgggatggca cttccccgca ttgtacggca cataaaatgc 9900
tcaggaaagg ttacaggtta catgtgttgt gtttggatat acagtgtgta gtgatacaag 9960
aagaaaggca ggtctagagg gcccaattcg ccctatagtg agtcgtatta caattcactg 10020
gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 10080
gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 10140
tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 10200
cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 10260
ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 10320
taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 10380
aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 10440
ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 10500
tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 10560
ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa attcagggcg 10620
caagggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc 10680
ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa 10740
gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc 10800
aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 10860
aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca 10920
agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 10980
ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 11040
tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 11100
cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 11160
gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 11220
gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatcc caccttgctc ctgccgagaa 11280
agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 11340
attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 11400
tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 11460
caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 11520
cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 11580
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 11640
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 11700
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga attgaaaaag gaagagtatg 11760
agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg ccttcctgtt 11820
tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt gggtgcacga 11880
gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt tcgccccgaa 11940
gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt attatcccgt 12000
attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa tgacttggtt 12060
gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag agaattatgc 12120
agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac aacgatcgga 12180
ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg atcatgtaac tcgccttgat 12240
cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg agcgtgacac cacgatgcct 12300
gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg aactacttac tctagcttcc 12360
cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg caggaccact tctgcgctcg 12420
gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag ccggtgagcg tgggtctcgc 12480
ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc gtatcgtagt tatctacacg 12540
acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga tcgctgagat aggtgcctca 12600
ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat atatacttta gattgattta 12660
aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc tttttgataa tctcatgacc 12720
aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 12780
ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 12840
ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 12900
actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 12960
caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 13020
gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 13080
ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 13140
cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 13200
cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 13260
acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 13320
ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 13380
gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 13440
tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 13500
accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaag 13558
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dbgapdhpro-F
<400> 3
ccttgccaat gtttcccttc 20
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dbgapdhpro-R
<400> 4
ctcactgttc tgctgccaag ac 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dbpsyter-F
<400> 5
gcacagcctc tgtatggttg 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dbpsyter-R
<400> 6
cctgcctttc ttcttgtatc act 23
<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dtchdh正-F
<400> 7
accggcgcac gcacca 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dtchdh正-R
<400> 8
gtatatctgg ctcgtcac 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dtchdh反-F
<400> 9
gtatatctgg ctcgtcacag 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Dtchdh反-R
<400> 10
accggcgcac gcaccacc 18
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Zdspro-be-F
<400> 11
ccagtgtgct ggaattcggc ttaatgtgcc tcctgttcca ataa 44
<210> 12
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Zdspro-be-R
<400> 12
ggcgaattgg gccctctaga ttacttgtac agctcgtcca 40
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Be-lycbt-F
<400> 13
atggacgagc tgtacaagta accgcggttg gatcttacat 40
<210> 14
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Be-lycbt-R
<400> 14
gcgaattggg ccctctagac ggccgagtga gaagaaccc 39
<210> 15
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lycbt-gapdhpro-F
<400> 15
gttcttctca ctcggccccg cggctcgagc cttgccaatg ttt 43
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Lycbt-gapdhpro-R
<400> 16
agggcgaatt gggccctcta gacctcactg ttctgctgcc aag 43
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Gapdhpro-chdhf-f
<400> 17
tcttggcagc agaacagtga ggtcgacacc ggcgcacgca c 41
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Gapdhpro-chdhf-r
<400> 18
ggcgaattgg gccctctaga ccgcggccgc accggcgcac gca 43
<210> 19
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> chdhf-intron-F
<400> 19
tgacgagcca gatatacctt ggtaaggaaa taatta 36
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> chdhf-intron-R
<400> 20
cgaattgggc cctctagagg taaatttcta gtttttct 38
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Intron-chdhr-f
<400> 21
agaaaaacta gaaatttacc gtatatctgg ctcgtca 37
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Intron-chdhr-R
<400> 22
cgaattgggc cctctagaac cggcgcacgc acca 34
<210> 23
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Chdhr-psyter-f
<400> 23
gcgtgcgccg gtgcggccgc gcacagcctc tgtatg 36
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Chdhr-psyter-r
<400> 24
aattgggccc tctagacctg cctttcttct tg 32

Claims (4)

1.一种杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体在干扰杜氏藻属中结构基因表达中的应用，其特征在于：
所述的杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体，以pCR2.1为骨架载体，将Dbzdspro启动子序列、ble-EGFP序列以及Dblycbter终止子序列按转录方向依次连接在一起；接着再将巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子、结构基因正向片段、pdk和cat内含子、结构基因反向片段以及Dbpsyter终止子按转录方向依次连接在一起，得到杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体；
所述的巴氏杜氏藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述的杜氏藻属为特氏杜氏藻。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的结构基因为甜菜碱合成基因胆碱脱氢酶CHDH。
3.根据权利要求1～2任一项所述的应用，其特征在于：
其中，Dbzdspro启动子序列如SEQ ID NO：2的第58-2966位碱基所示，ble-EGFP序列如SEQ ID NO：2的第2967-4067位碱基所示，Dblycbter终止子序列如SEQ ID NO：2的第4068-4896位碱基所示，pdk和cat内含子如SEQ ID NO：2的第7523-8520位碱基所示，Dbpsyter终止子如SEQ ID NO：2的第8871-9972位碱基所示。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的杜氏藻属结构基因的RNA干扰载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
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