KR20120042444A

KR20120042444A - 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120042444A
Application number: KR1020100104139A
Authority: KR
Inventors: 최원자; 김완기
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-25
Filing date: 2010-10-25
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR101213179B1; WO2012057396A1

Abstract

본 발명은 (a) 목적 유전자 단편의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) (ⅰ) 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), (ⅱ) ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (ⅲ) ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 모듈(expression module); 및 (c) (ⅰ) ScURA3의 프로모터, (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) ScURA3의 ORF(open reading frame) 및 (ⅲ) 상기 프로모터 및 ORF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3의 터미네이터(terminator)를 포함하는 절단 모듈(URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현벡터(yeast expression vector) 및 이를 이용한 형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환 방법은 안정적으로 목적 유전자를 안정적으로 염색체로 통합시킨 형질전환 효모 스트레인을 제작한 후 상기 효모 스트레인에 또 다른 목적 유전자의 변형을 유발시키는 연속적인 형질전환이 가능함에 따라, 소망하는 산물들(바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도{Yeast Expression Vectors for Integration of Chromosome and Uses Thereof}

본 발명은 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도에 대한 것이다.

유전자 기능을 연구하기 위한 추가적인 대사공학(metabolic engineering)으로서, 사카로마이세스 세레비지에(Saccahromyces cerevisiae)에서 이종 또는 자가 유전자 발현이 대량으로 경제적 가치를 가지는 물질의 생산하거나 또는 숙주세포의 물리화학적 특성을 증진시킬 수 있다(Nevoigt, 2008). 이것은 다른 영양요구 돌연변이체(auxotrophic mutants) 및 목적 유전자가 다양한 프로모터의 조절 하에 위치하여 자가적으로 복제하는 적합한 선택마커를 가진 플라스미드가 유용하기 때문에 실험실 스트레인들에서 용이한 일이다. 잘-알려진 프로모터를 포함하는 플라스미드의 이용과 관련된 문제들 중 하나는 산업적 적용에서 효모 배양을 위해 임의대로 선택할 수 없는 선택 압력(selection pressures)의 지속적인 존재에도 불구하고 카피 수를 조절할 수 없음으로 인해 야기되는 발현 상에 세포-세포 이질성(cell-cell heterogeneity)이다. 따라서, 선택 압력의 부재(즉, 상동 재조합에 의한 염색체로의 통합) 하에서 유전자의 안정적인 발현 및 유지가 매우 바람직하다.

유전자 통합은 rRNA 유전자(Lopes et al., 1969; Fujii et al., 1990) 및 시그마(Kudla et al., 1992) 또는 델타 서열(Sakai et al., 1990; Lee et al., 1997; Ekino et al., 2002; Oliviera et al., 2007) 같은 지놈 상의 특정 위치로 타겟팅된다. 상기 서열들이 효모 지놈 전반에 걸쳐서 많은 곳에서 존재하기 때문에, 여러 카피의 삽입된 유전자를 포함하는 스트레인이 발생할 수 있다. 세포-세포 이질성을 회피했을 지라도, 이 전략은 삽입된 유전자의 카피 수를 조절하여 시작부터 발현 레벨을 조절하는 데 유사한 문제를 일으킬 수 있는데, 예를 들어 적정 레벨로 삽입된 유전자를 발현시키는 클론의 추가적인 선택이 필요하다. 더욱이, 발현된 단백질 레벨이 항상 유전자 카피 수와 상관관계를 가지지 않는다(Moriya et al., 2006). 이런 점으로 인해, 삽입된 유전자의 단백질 산물이 양적 또는 기능적으로 상응하는 야생형 유전자의 단백질보다 크게 우세하지 않는다면 변형된 유전자들(예컨대, 돌연변이)에 대한 기능 분석이 어려운 것이다. 이런 측면에서 유전자 대체(replacement)는 간결한 방식으로 원하는 위치로의 정밀한 통합 타겟팅(integrative targeting)하기 위한 선택수단일 수 있다. 최근에, 특정 유전자의 고유의 프로모터가 다른 유전자의 다른 강도를 가지는 유전적으로 변형되거나 또는 천연의 프로모터로 대체되어 졌다(Verstrepen et al., 2004; Nevoigt et al., 2006).

상술한 바와 같이, 변형된 유전자의 ORF(open reading frame; 또는 다른 강도의 프로모터와 함께)를 대체함으로써 변형된 형태만의 효과를 조사하는 것이 바람직하다. 대부분의 경우, 통합된 클론들의 선택은 통합 벡터에 의해 제공되는 특정 영양성분(nutrients)의 부재 하에서 성장하는 세포의 능력에 의존한다. 이론적으로, 많은 유전자 통합은 여러 영양요구 돌연변이를 가진 스트레인에서 획득될 수 있다. 하지만, 특별한 경우 산업적 미생물에 영양요구 돌연변이를 도입함으로써 얻어질 수 있는데, 이러한 돌연변이가 필요한 영양성분을 보충하는 필요한 증가된 배양 비용 이외에도 세포 생리상태(physiology)에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 재생산할 수 있는 통합 벡터는 단일 영양요구 돌연변이를 가진 산업적 미생물에서 상술한 목적을 달성하기 위한 강력한 수단이다.

Nevoigt 등(2006)은 S. 세레비지에용 재생산용 프로모터 대체 카세트(reusable promoter replacement cassette)를 보고하였다. 상기 컨스트럭트에서 선택마커는 박테리아 loxP 서열 쌍 간에 위치한다. 이후, 선택마커가 Cre 단백질에 의해 매개되는 상동재조합을 통해 제거될 수 있다. 또 다른 선택적인 수단은 Ura-블라스터 카세트(Ura-blaster cassette) 또는 URA3-dpl200 카세트이다. Ura-블라스터는 원래 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 같은 무성생식 배수체(diploid) 미생물에서 성공적으로 타겟팅된 유전자의 파괴를 위해 개발되었다(Alani and Kleckner, 1987; Fonzi and Irwin, 1993; Pla et al., 1996). 상기 카세트는 C. 알비칸스 URA3 카피(hisG-URA3-hisG)에 의해 분리된 살모넬라 hisG 유전자의 반복서열(direct repeats)를 포함한다.

URA3의 절단은 FOA(5-fluoroorotic acid)가 보충된 배지에서 성장하는 경우에 hisG 반복부위 간의 빈번한 상동재조합을 통해 일어난다. 따라서, URA3 선택마커는 다른 목적 유전자의 연속적인 파괴에 이용될 수 있다. URA3-dp1200 카세트는 전체 카세트의 효율적인 PCR 증폭하기 위해 너무 큰 카세트를 가지는 Ura-블라스터의 한계점을 극복하기 위해 Wilson 등(2000)에 의해 개발되었다. 상기 카세트는 200 bp의 플랭킹 반복부위를 가지는 데, 이 부위는 Ura-블라스터의 hisG를 대체하여 URA3 마커의 상동 절단 뿐 아니라 형질전환을 위한 효율적인 PCR 증폭을 가능하게 한다. C. 알비칸스 URA3 카피가 S. 세레비지에 URA3의 카피를 대체하는 한, 상기 카세트는 S. 세레비지에의 ura3/ura3 스트레인들에서 연속적인 타겟팅된 유전자 파괴에 이용될 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 효모에서 목적 유전자들을 연속적으로 전달할 수 있는 고효율 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 효모에 연속적으로 목적 유전자를 형질전환시킬 수 있는 발현 모듈(expression module) 및 URA3 절단 모듈로 이루어진 신규한 이중 모듈 플라스미드(dual module plasmids)를 제작하여 Ura ^- 효모 스트레인에서 목적 유전자들을 연속적으로 고효율로 전달할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 효모 발현벡터(yeast expression vector)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상술한 벡터를 이용한 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 목적 유전자의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) (ⅰ) 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), (ⅱ) ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (ⅲ) ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 모듈(expression module); 및 (c) (ⅰ) ScURA3의 프로모터, (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) ScURA3의 ORF(open reading frame) 및 (ⅲ) 상기 프로모터 및 ORF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3의 터미네이터(terminator)를 포함하는 절단 모듈(URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현벡터(yeast expression vector)를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법을 제공한다: (a) 상술한 벡터의 MCS(multiple cloning site)에 목적 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; (b) 상기 벡터를 효모에 형질전환시키는 단계; (c) 상기 형질전환된 효모에서 URA3 절단을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a) 및 (b)를 다른 목적 뉴클레오타이드 서열로 실시하는 단계.

본 발명자들은 효모에서 목적 유전자들을 연속적으로 전달할 수 있는 고효율 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 효모에 연속적으로 목적 유전자를 형질전환시킬 수 있는 발현 모듈(expression module) 및 URA3 절단 모듈로 이루어진 신규한 이중 모듈 플라스미드(dual module plasmids)를 제작하여 Ura ^- 효모 스트레인에서 목적 유전자들을 연속적으로 고효율로 전달할 수 있다는 것을 확인하였다.

효모는 경제적으로 관심을 끄는 외래 단백질 및 다른 산물들의 생산에 폭넓게 이용되어 왔다. 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)는 오랜 기간 동안 산업적으로 이용되어져 왔으며, 이 외에도 다른 효모들이 소망하는 산물들의 생산에 보다 더 적합할 수 있는 장점들을 가진다. 또한, 생명공학적 방법을 위해 유익한 특징들을 가지고 있는 속이 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 효모종이다. K. 락티스(Kluyveromyces lactis) 및 K. 막시아누스(Kluyveromyces marxianus) 효모는 GRAS(Generally Recognized As Save)로서 분류되어 사카로마이세스와 동일한 안정성을 가지고 이용될 수 있다.

본 발명의 벡터는 목적 유전자의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열, 발현 모듈(expression module) 및 URA3 절단 모듈을 포함한다.

본 발명의 벡터는 Ura ^- 효모 스트레인에서 목적 유전자의 플랭킹 서열과 상동적인 서열이 상동재조합(homologous recombination)을 통해 발현 모듈 및 절단 모듈이 타겟 위치의 염색체로 통합되어 선택되고, 이후 URA3 절단을 통해 목적 유전자가 염색체에 통합된 형질전환된 Ura ^- 효모 스트레인이 얻어짐으로써, 연속적인 유전자 전달이 가능하다. 상술한 목적 유전자의 플랭킹 서열과 상동적인 서열은 적용될 효모 종에 따라 결정된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터가 적용될 수 있는 효모는 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.)을 포함하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 종을 포함하고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에를 포함한다.

본 명세서의 용어 “목적 유전자의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열”은 염색체 상의 목적 유전자의 플랭킹 서열과 상동재조합(homologous recombination)이 가능한 서열로, 본 발명의 벡터 내 발현 모듈(expression module) 및 URA3 절단 모듈을 염색체 내 목적 유전자 위치로 통합시키는 기능을 수행한다. 따라서, 본 발명의 벡터는 목적 유전자의 플랭킹 서열(‘UP’및 ‘DOWN’서열)에 따라 특이적으로 염색체에 통합될 위치를 결정할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 모듈(expression module)은 (ⅰ) 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), (ⅱ) ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (ⅲ) ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함한다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 벡터는 (ⅰ) 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포, 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하며, 보다 바람직하게는 (ⅰ) 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ⅱ) 상기 (ⅰ)의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포, 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터; 및 (ⅲ) 상기 동물세포, 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위, 바람직하게는 ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현벡터를 포함한다.

본 발명의 벡터에서, 상기 멀티 클로닝 위치는 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 위치로 기능하며, 바람직하게는 4개의 제한효소 위치(SalI, ClaI, EcoRI 및 BamHI)를 포함한다.

본 명세서에서 용어 “프로모터”는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 제조합 발현벡터에서 발현대상물질-코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 조절하게 된다.

본 발명의 URA3 절단 모듈은 효모 선택마커로서 기능하는 URA3 ORF(open reading frame)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 벡터를 형질전환에 이용하기 위해서 Ura ^- 효모 스트레인을 이용한다. 따라서, 본 발명의 벡터로 형질전환된 효모 스트레인은 우라실-결핍 배지에서 성장할 수 있다. 즉, 본 발명의 벡터가 효모 염색체 내로 통합됨에 따라 형질전환된 효모 스트레인이 우라실-결핍 배지에서 선택된다.

또한, 본 발명의 URA3 절단 모듈은 목적 유전자의 연속적인 형질전환을 위한 모듈로서 기능한다. 보다 상세하게는, 목적 유전자의 연속적인 형질전환을 위해, 상기 형질전환된 효모 스트레인에서 URA3 절단을 실시한다. 상기 형질전환된 효모 스트레인이 5-FOA가 보충된 배지에서 성장시킴으로써, 상기 프로모터 및 ORF 양쪽 말단에 결합된 URA3의 터미네이터 간에 발생하는 상동재조합을 통해 URA3 절단을 유도시킨다. URA3 절단 후, 상기 형질전환된 효모 스트레인은 상기 목적 유전자가 염색체의 타겟 위치에 통합되고, 우라실-결핍 배지에서 성장할 수 없는 Ura ^- 효모 스트레인이다. 따라서, 상기 목적 유전자가 아닌 다른 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 벡터를 이용하여 상기 형질전환된 효모 스트레인의 염색체 상에 다른 위치의 목적 유전자를 타겟팅하는 형질전환을 실시할 수 있다. 그 결과, 서로 다른 2개의 목적 유전자를 연속적으로 변형시킨 형질전환 효모 스트레인을 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이, URA3 절단 과정을 반복적으로 실시함으로써, 하나 이상의 목적 유전자를 변형시킨 형질전환 효모 스트레인을 제조할 수 있다.

본 발명의 효모 선택마커 유전자는 당업계에 공지된 다양한 선택마커 유전자를 이용할 수 있으며, 예를 들어, UAR3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE2 및 LYS2 같은 영양요구성(auxotrophic) 선택마커 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 효모 선택마커 유전자는 UAR3이다. 선택적으로, 본 발명은 효모 선택마커로서 이용될 수 있는 숙주세포 상에 약물 저항성(drug resistance)를 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 이용할 수 있고, 예를 들어 CAN1 및 CYH2를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터가 진핵세포, 바람직하게는 효모 세포에 적용되는 경우, 이용될 수 있는 프로모터는, 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 효모 세포에서 유래된 프로모터, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, 효모(S. cerevisiae) TDH3(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터, 효모(S. cerevisiae) GAPDH(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, 효모(S. cerevisiae) GAL1 내지 GAL10 프로모터, 효모(Pichia pastoris) AOX1 또는 AOX2 프로모터, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 효모 TDH3의 프로모터이다.

바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 카세트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: ADH1 터미네이터, 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 트랜스덕션(transduction), 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이때, 박테리아 복제 개시점은 긴 DNA 삽입물(inserts)의 안정적인 박테리아 복제에 유용한 당업계에 잘 알려진 복제 개시점들로부터 선택될 수 있으며, ColE1, F-인자(F-factor) 및 P1 레플리콘(replicon)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리아 선택마커는 당업계에 알려진 박테리아 선택마커 유전자를 이용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 선택마커 유전자는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 제오신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 클로람페니콜 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 리튬 아세테이트/DMSO 방법(Hill, J., et al., (1991), DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791), 리포좀-매개 전이방법(Wong, et al., 1980), 레트로바이러스-매개 전이방법(Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110) 등을 이용하여 실시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상술한 형질전환은 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.) 효모 스트레인에서 실시하며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 종에서 실시하고, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에에서 실시한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 효모용 신규한 이중 모듈 발현 벡터(dual module expression vector) 및 이를 이용한 목적 뉴클레오타이드 서열의 형질전환 방법에 관한 것이다.

(b) 본 발명의 발현 모듈은 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), 적합한 프로모터 및 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 모듈(expression module) 및 URA3 절단 모듈(excision module)을 포함한다.

(c) 본 발명의 벡터는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 염색체 내 특정 위치로 목적 유전자를 고효율로 통합시킬 수 있다.

(d) 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환 방법은 안정적으로 목적 유전자를 안정적으로 염색체로 통합시킨 형질전환 효모 스트레인을 제작한 후 상기 효모 스트레인에 또 다른 목적 유전자의 변형을 유발시키는 연속적인 형질전환이 가능함에 따라, 소망하는 산물들(바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

도 1은 pScDAL의 구조를 도식적으로 나타내는 도면이다. 플라스미드 pScDAL이 pBluescript SKII(Stratagene)의 백본에서 구축되었으며, URA3-dpl200와 기능적 및 구조적으로 유사한 발현 모듈(녹색) 및 URA3 절단 모듈(노란색)을 포함한다. 위쪽 패널은 pScDAL의 전체 구조이다. 각 모듈의 구성성분은 다음과 같다: 중간 패널, 발현 모듈; 및 아래쪽 패널, URA3 절단 모듈. pScDAL 구축에 이용된 PCR 증폭용 프라이머들은 표 1에 기재되어 있다. 구성성분들 간의 거리 또는 제한효소 위치들 간의 거리는 비율에 따라 표시되어 있지 않다. CS, ORF 클로닝 위치.
도 2는 ORF 대체 및 URA3 절단 전략으로서, ORF 대체 및 URA3 절단의 이벤트들에 대한 도식을 개략적으로 나타낸다. 플라스미드 pScDAL에 분리되어 클로닝된 ‘UP’와 ‘DOWN’ 서열 간의 상동재조합은 선형화된 pScDAL의 수용세포 염색체로의 통합 과정 동안 ORF 대체를 초래한다. 클로닝 및 지놈 구조(참조: 도 1)의 결정을 위해 이용된 PCR 증폭용 프라이머들이 표시되어 있다.
도 3은 ORF 대체 및 URA3 절단 후 지놈 구조 및 유전자 발현을 조사한 결과이다. 도 3A는 야생형 SPT15의 ORF를 SPT15m6 ORF로 대체한 iBY4741-SPT15m6의 지놈 구조를 결정하기 위해 여러 프라이머 세트를 이용하여 실시한 PCR 증폭 결과이다. 이용된 프라이머들은 도 2 및 표 1에 기재되어 있다: 레인 1, S9 및 AS1; 레인 2, S9 및 AS2; 레인 3, S3 및 AS9; 및 레인 4, S4 및 AS9. 도 3B는 발현 모듈의 기능을 테스트하기 위해 지시된 스트레인들로부터 총 세포 추출물을 제조하여 항-SPT15 및 항-액틴 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 발현 레벨을 조사하였다: 레인 1, BY4741; 및 레인 2, iBY4741-SPT15m6. 도 3C는 URA3가 FOA 선택 하에서 iBY4741-SPT15m6로부터 제거된 iBY4741-SPT15m6-ura3의 지놈 구조를 결정하기 위해 여러 프라이머 세트를 이용하여 실시한 PCR 증폭 결과이다: 레인 1, S9 및 AS1; 레인 2, S9 및 AS2; 레인 3, S4 및 AS4; 레인 4, S2 및 AS9; 레인 5, S4 및 AS9; 및 레인 6, S3 및 AS9(참고: 도 2 및 표 1).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

스트레인 및 배지

본 연구에서 이용된 S. 세레비지에는 NCYC3233(야생형) 또는 BY4741(Mat a; his3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0)(National Collection of Yeast Cultures, UK), 신규한 스트레인들은 리튬 아세테이트 형질전환(Burns et al., 1994)을 통해 제조하였다. PCR에 이용된 올리고뉴클레오타이드 서열은 표 1에 기재되어 있다.

효모 세포는 비-선택적 증식(non-selective propagation)을 위해서 YPD 배지(1리터 당 20 g 덱스트로오스(Difco, USA), 20 g 박토-펩톤(Difco, USA) 및 10 g 효모 추출물(Difco, USA), 그리고 고형 플레이트를 위해서 15% 박토-아가(Difco, USA)를 추가적으로 포함)에서 배양하거나 또는 선택적 증식을 위해서 합성 배지(SD medium; 1리터 당 20 g 덱스트로오스 및 아미노산이 없는 6.7 g 효모 질소 베이스(Difco, USA), 그리고 필요하다면 영양요구 보충 혼합물(Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하거나 또는 2% 덱스트로오스, 그리고 고형 플레이트를 위해서 15 g 노블 아가(Difco, USA)를 추가적으로 포함; MP, OH)에서 배양하였다. 우리딘(1리터 당 80 mg; Sigma-Aldrich, USA) 및 FOA(0.1%; Sigma-Aldrich, USA)가 URA3 절단용 배지에 첨가되었다.

플라스미드의 유지(고형 플레이트) 또는 증폭(액체 배지)을 위해, 대장균 DH5α 스트레인(Stratagene, USA)은 암피실린(50 ㎍/ml)이 보충된 LB 배지(1리터 당 10 g 박토 트립톤(Difco, USA), 5 g 효모 추출물 및 10 g NaCl(Difco, USA), 또는 고형 플레이트를 위해서 15 g 박토-아가를 추가적으로 포함)에서 배양시켰다.

분자생물학적 방법

클로닝, 플라스미드 제조, 시퀀싱 및 웨스턴 블롯 분석은 이전에 기재된 바와 같이 실시하였다(Sambrook and Russell, 2001). 모든 증폭된 DNA 단편들의 뉴클레오타이드 서열은 pGEM-T easy 벡터(Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 시퀀싱하여 확인하였다.

지놈 DNA 및 세포 추출물의 제조

이전에 기술된 바와 같이, 지놈 DNA(Hoffman and Winston, 1987) 및 세포 추출물(Choi et al., 2003)을 중간-로그 세포로부터 제조하였다.

PCR

본 연구에서 이용된 PCR 프라이머들은 표 1에 기재되어 있다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃, 1분; 60℃, 1분; 및 72℃, 증폭될 DNA 길이에 따라 적합한 연장 시간.

실험결과

이중 모듈 플라스미드(pScDAL)의 구축

pBluescript 백본 상에 TDH3 프로모터의 조절 하에 발현 모듈 및 URA3-dpl200-유사 카세트를 포함하는 플라스미드 pScDAL를 다음과 같이 제조하였다. 발현 모듈의 경우, TDH3 프로모터(682 bp; 서열목록 제1서열) 및 ADH1 터미네이터(213 bp; 서열목록 제2서열)가 NCYC3233의 지놈 DNA로부터 각각 S1/AS1 및 S2/AS2 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후, pBluescript SKII(Stratagene, La Jolla, CA, USA)의 XhoI/SalI 및 BamHI/XbaI 위치로 차례대로 클로닝되었다.

URA3-dpl200-유사 카세트의 구축은 기본적으로 Wilson 등(2000)에 의해 기재된 방법을 채택하여 실시하였다. URA3 유전자의 프로모터, ORF 및 터미네이터를 포함하는 DNA 단편(1276 bp, PURA3T로 명명됨; 프로모터 및 ORF, 서열목록 제3서열)이 NCYC3233의 지놈 DNA로부터 S3 및 AS3 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 다음으로, URA3 터미네이터(243 bp; URA3T로 명명됨; 서열목록 제4서열)가 S4 및 AS4 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. PURA3T 및 URA3T의 PCR-매개된 라이게이션을 촉진시키기 위해, S4 프라이머는 URA3 프로모터의 5’-말단의 24 bp 및 URA3 터미네이터의 3’-말단의 22 bp를 포함하도록 고안되었다. 정제된 PURA3T 및 URA3T를 동일 몰비로 혼합하여 어닐링한 후, PCR을 S5 및 AS5 프라이머 세트를 이용하여 실시하여 두 단편들을 라이게이션시켰다. 그 결과, 짧은 단편(터미네이터만 포함) 및 긴 단편(TPURA3T로 명명됨; 서열목록 제5서열)이 제조되었다. TPURA3T 가닥은 URA3의 터미네이터, 프로모터, ORF 및 터미네이터(5’-> 3’ 방향)로 구성된다. 긴 단편(1474 bp)이 정제되고 NotI 및 SacII로 절단되어 상술한 발현 모듈을 포함하는 플라스미드에 클로닝되었다(pScDAL; 도 1의 위쪽 패널).

플라스미드 pScDAL은 발현 모듈 및 URA3 절단 모듈을 가진다. 플라스미드 pScDAL의 발현 모듈은 TDH3 프로모터, 목적 유전자의 클로닝 위치(CS), 및 ADH1 터미네이터를 포함한다(도 1의 중간 패널). TDH3 프로모터는 5’-말단의 XhoI 위치를 포함하는 센스 프라이머 및 3’-말단의 SalI 위치를 포함하는 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고 XhoI 및 SalI으로 절단함으로써 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 목적 유전자의 클로닝 위치는 4개의 제한효소 위치(SalI, ClaI, EcoRI 및 BamHI)를 포함한다. URA3 절단 모듈은 URA3-dpl200 카세트와 유사하며, URA3의 터미네이터, 프로모터, ORF 및 터미네이터(5’-> 3’ 방향)로 구성되어 있다(도 1 및 도 2의 아래쪽 패널). 양 말단에 존재하는 터미네이터 서열의 반복부위(direct repeats)는 FOA-보충된 배지에서 URA3의 절단을 촉진시킨다.

발현 모듈의 테스팅

NCYC3233으로부터 Taq 폴리머라제를 이용하여 TATA-결합 단백질을 인코딩하는 야생형 SPT15 유전자(SPT15wt)를 증폭하면서, 본 발명자들은 2개의 돌연변이(Leu76Val 및 Leu135Ser)를 포함하는 SPT15m6 클론을 얻었다. 본 발명자들은 발현 모듈이 기능하는 지 여부를 테스트하기 위해 상기 돌연변이체를 이용하였다. SPT15m6(723 bp)의 ORF를 SPT15-S(S6) 및 SPT15-AS(AS6) 프라이머 세트를 이용하여 증폭하여 pScDAL의 EcoRI 및 BamHI로 클로닝하였다(pScDAL-SPT15m6). 두 개의 모듈을 포함하는 부위의 크기는 2653 bp였다.

이후, 본 발명자들은 지놈 상의 SPT15 유전자 위치에 타겟팅된 통합을 위해 이용될 수 있는 DNA 제조방법으로 2가지 선택사항을 가진다. 첫 번째는 URA3-블라스터와 유사하게 타겟팅된 위치로 추론된 서열(일반적으로 >65 bp)을 포함하는 재조합-가능한(recombination-competent) 프라이머들로 2개의 모듈을 포함하는 부위를 증폭하여 약 2.8 kb의 단편을 제조하는 것이다. 두 번째는 업스트림 및 다운스트림 타겟 DNA 단편(일반적으로 >200 bp)이 각각 발현 모듈의 앞(KpnI과 XhoI 사이) 및 URA3 절단 모듈(SacII와 SacI의 사이)에 클로닝된 플라스미드를 제조하는 것이다(참조: 도 1A). 상기 플라스미드를 박테리아에서 증폭한 후, 통합을 위해 KpnI과 SacI으로 선형화시킨다.

예상된 약 2.8 kb의 단편을 증폭시키는 것이 어려웠기 때문에, 첫 번째 선택사항은 배제되었다. 두 번째 방법을 테스트하기 위해, 업스트림 타겟 DNA 단편(‘UP’)이 SPT15 ORF의 개시 코돈의 업스트림 419-179 bp 서열을 위해 SPT15UP-S(S7) 및 SPT15UP-AS(AS7) 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후, KpnI과 XhoI으로 절단하여 pScDAL-SPT15m6로 클로닝하였다(pScDAL-SPT15m6U). 다운스트림 타겟 DNA 단편(‘DOWN’)이 SPT15 ORF의 종결 코돈의 다운스트림 183-415 bp 서열을 위해 고안된 SPT15DOWN-S(S8) 및 SPT15DOWN-AS(AS8) 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후, SacII와 SacI으로 절단하여 pScDAL-SPT15m6U로 클로닝하였다(pScDAL-SPT15m6UD). pScDAL-SPT15m6UD 및 대조군으로서 pScDAL-SPT15m6를 KpnI과 SacI으로 선형화시켰다. 삽입체(insert) 및 pBluescript 백본의 혼합물을 페놀/클로로포름 추출로 깨끗하게 한 후, 효모 형질전환에 이용하였다.

S. 세레비지에 스트레인인 BY4741을 형질전환 수용세포(recipient)로 이용하였다. 형질전환된 세포를 필요한 우라실이 결핍된 영양성분으로 보충된 SD 배지(SD-ura)에서 선택하였다. 형질전환 효율(yield)는 pScDAL-SPT15m6UD에서 약 20 cfu/㎍이었고, pScDAL-SPT15m6에서는 2-3 cfu/㎍이었다.

다음으로, 본 발명자들은 ‘UP’ 단편의 업스트림 및‘DOWN’ 단편의 다운스트림 지놈 서열로부터 추론된 프라이머들(각각, S9 및 AS9 프라이머)을 포함하는 다양한 프라이머들을 이용한 PCR 분석을 통해 통합 후 지놈 구조(organization)를 결정하였다(표 1 및 도 2의 아래쪽 패널).

본 연구에서 이용된 프라이머들.

프라이머	본 발명에서 이용된 명칭	서열(5’->3’)
TDH3pro-S TDH3pro-AS ADH1ter-S ADH1ter-AS PURA3T-S PURA3T-AS URA3T-S URA3T-AS TPURA3T-S TPURA3T-AS STP15-S STP15-AS SPT15UP-S SPT15UP-AS SPT15DN-S SPT15DN-AS Confirm1 Confirm2	S1 AS1 S2 AS2 S3 AS3 S4 AS4 S5 AS5 S6 AS6 S7 AS7 S8 AS8 S9 AS9	CTCGAGAGTTTATCATTATCAATACTGCC GTCGACTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCG GGATCCGCGAATTTCTTATGATTTATGATGA TCTAGAGCATGCCGGTAGAGGTGTGGTTACGGGGCACAAATCAAGAACGTCCA TAAAGCTTTTCAATTCATC GTTCTTGATTTGTGCCCCGTAA AAAACTGTATTATAAGTAAATGCATG GATGAATTGAAAAGCTTTATGGACGTTCTTGATTTGTGCCCCGTAA GCGGCCGCAAAACTGTATTATAAGTAAATGCATG CCGCGGGTTCTTGATTTGTGCCCCGTAA GAATTCTGAGATGGCCGATGAGGAACGTT GGATCCTCACATTTTTCTAAATTCACTTAG GGTACCCTGATTCCCCTCTGATAGCTGAG CTCGAGCACGTCCCTTGTTTACTCTTACC CCGCGGCATAGCATATCTGGTGGATCGTC GAGCTCGTTCACCTTCCTCTGTAGGAAGC CATGAGGCCATAATACTGCTTCAACCC CATCACCAGCGAGTTCGCCGGTGAC

재조합이 도 2에 기재된 단편들에서만 일어나서 중간의 두 모듈 구조가 보존된다면, S9/AS1, S9/AS2, S3/AS9 및 S4/AS9 프라이머 세트를 포함하는 PCR 산물이 발생될 것이다. 열 개의 선택된 클론들의 지놈 구조를 분석하였을 때, 예상된 크기의 단편들이 7개의 클론들에서 증폭되었다. PCR 증폭의 프로토타입 패턴(prototypical pattern)이 도 3A에 제시되어 있다. 이들 데이터는 약 70%의 효율(probability)로 SPT15 유전자 주위에 선형화된 pScDAL-SPT15m6UD의 통합을 보여준다. 나머지 3개의 클론들은 잘못된 통합을 나타내는데, 이는 pScDAL-SPT15m6의 통합 빈도와 일치하는 비율이다. 놀랍게도, S9/AS2로 증폭된 일곱 개의 적합한 클론들의 발현 모듈을 시퀀싱한 결과, 도 2의 중간 패널에서 보여지듯이 이들 중 4개의 클론이 동일한 지놈 구조를 나타낸 반면에 나머지 3개의 클론에서는 SPT15 터미네이터가 ADH1 터미네이터로 대체되었다. 이는 선형화된 pScDAL-SPT15m6UD의 업스트림 통합이 상기 4개의 클론에서 ‘UP’에서 일어났으며, 상기 3개의 클론에서는 135번째 아미노산과 SPT15의 종결 코돈 간에 일어났다는 것을 의미한다. 따라서, SPT15wt ORF의 SPT15m6 ORF로의 대체 가능성은 40%였다. 상기 4개의 클론들 중 하나는 과다발현을 위한 계획된 구조를 가진 iBY4741-SPT15m6였다.

본 발명자들은 SPT15m6의 발현을 단백질 레벨에서 조사함으로써 발현 모듈 기능에 대해서 추가적으로 조사하였다. 부모 스트레인인 BY4741 및 iBY4741-SPT15m6으로부터 제조된 총 세포 추출물을 항-SPT15 및 항-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 도 3B에서 볼 수 있듯이, 통합체(integrant)에서의 SPT15m6 단백질의 레벨이 대조군의 레벨보다 훨씬 더 높았다.

URA3 절단 모듈의 테스팅

상술한 바와 같이, 본 발명자들은 통합된 URA3 절단 모듈이 수용세포의 우라실 영양요구성을 없앤다는 것을 보였다. 연속적인 ORF 대체를 위해, 터미네이터 반복부위 간의 상동 상호작용을 통해 단일 카피의 터미네이터의 제거하는 FOA 선택 압력 하에서 상기 URA3 유전자가 절단된다. 본 발명자들은 우리딘 및 FOA를 포함하는 SD-ura 배지에서 rBY4741-SPT15m6를 배양시켜 iBY4741-SPT15m6-ura3로 명명된 FOA-저항성 스트레인을 얻었다. 상기 스트레인은 우라실 영양요구성을 나타냈다(결과를 보이지 않음). 상기 스트레인으로부터 지놈 DNA를 제조한 후, URA3 절단 후 지놈 구조를 조사하기 위해 지정된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 실시하였다(도 3C). 발현 모듈은 변화가 없었다(레인 1 및 레인 2). 단일 카피의 URA3 터미네이터가 존재하였다(레인 3). 발현 모듈과 URA3 터미네이터(레인 4), 및 URA3 터미네이터와 ‘DOWN’서열(레인 5) 간의 연결은 변화되지 않았다. 마지막으로, URA3 유전자의 프로모터 및 ORF를 포함하는 단편이 증폭되지 않았는데(레인 6), 이는 제거되지 않았다면 S3 및 AS9 프라이머 세트로 증폭되었을 것이다(도 3A의 레인 3). 상술한 데이터는 URA3 유전자가 터미네이터 반복부위 간의 상호작용을 통해 절단되었음을 나타낸다.

결론적으로, 본 발명자들은 TDH3 프로모터 조절 하의 SPT15의 돌연변이된 형태가 URA3 마커의 공동-통합(co-integration)을 통해 우라실 원시영양성(prototrophy)을 가지도록 고유의 SPT15 ORF를 대체한 스트레인을 제조하였다. 본 발명의 스트레인은 URA3의 연속적인 절단을 통해 또 다른 유전자의 ORF 대체를 가능하게 한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

(a) 목적 유전자의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) (ⅰ) 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), (ⅱ) ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (ⅲ) ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 모듈(expression module); 및 (c) (ⅰ) ScURA3의 프로모터, (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) ScURA3의 ORF(open reading frame) 및 (ⅲ) 상기 프로모터 및 ORF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3의 터미네이터(terminator)를 포함하는 절단 모듈(URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현벡터(yeast expression vector).
제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 Ura ^- 효모 스트레인에 적용되는 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 목적 유전자 단편의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열과 염색체 상의 목적 유전자 단편 간의 상동재조합(homologous recombination)을 통해 염색체 상으로 통합되는 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 벡터는 상동 재조합 후 URA3 절단을 통해 Ura ^- 효모 스트레인으로 전환시킨 후 신규 목적 유전자 단편을 연속적으로 염색체로 도입할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
제 4 항에 있어서, 상기 URA3 절단은 5-FOA(5-fluoroorotic acid) 처리에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
제 1 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.) 인 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
제 6 항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 종인 것을 특징으로 하는 효모 발현벡터.
다음의 단계를 포함하는 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법:
(a) 제 1 항의 벡터의 MCS(multiple cloning site)에 목적 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계;
(b) 상기 벡터를 효모에 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 형질전환된 효모에서 URA3 절단을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (a) 및 (b)를 다른 목적 뉴클레오타이드 서열로 실시하는 단계.
제 8 항에 있어서, 상기 형질전환은 사카로마이세스 종(Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces spp.), 피키아 종(Pichia spp.), 파피아 종(Paffia spp.), 클루이베로미세스 종(Kluyveromyces spp.), 칸디다 종(Candida spp.), 탈라로미세스 종(Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종(Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종(Pachysolen spp.) 및 데바리오미세스 종(Debaryomyces spp.)으로 구성된 군으로부터 선택된 효모 스트레인에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 형질전환은 사카로마이세스 종에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.