WO2012057396A1 - 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

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WO2012057396A1
WO2012057396A1 PCT/KR2010/008339 KR2010008339W WO2012057396A1 WO 2012057396 A1 WO2012057396 A1 WO 2012057396A1 KR 2010008339 W KR2010008339 W KR 2010008339W WO 2012057396 A1 WO2012057396 A1 WO 2012057396A1
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spp
yeast
promoter
ura3
vector
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PCT/KR2010/008339
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English (en)
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Inventor
최원자
김완기
Original Assignee
이화여자대학교 산학협력단
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts

Definitions

  • the present invention relates to yeast expression vectors and their use for chromosomal integration.
  • Gene integration includes rRNA genes (Lopes et al., 1969; Fujii et al., 1990) and sigma (Kudla et al., 1992) or delta sequences (Sakai et al., 1990; Lee et al., 1997; Ekino et. al., 2002; Oliviera et al., 2007). Since the sequences are present in many places throughout the yeast genome, strains containing multiple copies of the inserted gene can occur. Even if cell-cell heterogeneity has been avoided, this strategy can cause similar problems in controlling expression levels from the beginning by controlling the copy number of the inserted gene, e.g. Additional selection of clones expressing the inserted genes is required.
  • the OR open reading frame of the modified gene As described above, the OR open reading frame of the modified gene; Or with other promoters of different strength).
  • the choice of integrated clones depends on the ability of the cell to grow in the absence of certain nutrients provided by the integration vector.
  • many gene integrations can be obtained in strains with multiple nutritional mutations.
  • it can be obtained by introducing nutritional mutations into industrial microorganisms, as these mutations can affect cell physiology in addition to the increased culture costs required to replenish the nutrients needed.
  • a reproducible integrated vector is a powerful means for achieving the above-mentioned objectives in industrial microorganisms with single nutritional mutations.
  • Ura-blaster cassette or the URA3-dl200 cassette. Ura-blasters were originally developed for the destruction of genes that have been successfully targeted in adiploid microorganisms, such as Candida albicans / 7 ' ⁇ albicans (Alani and leckner, 1987; Fonzi and Irwin, 1993; Pla et al. ., 1996).
  • the cassette is C. albicans URA3 Direct repeats of the Salmonella hisG gene isolated by copy (hisG-URA3-hisG).
  • URA3-dpl200 cassette was developed by Wilson et al. (2000) to overcome the limitations of the Ura-blaster with too large cassettes for efficient PCR amplification of the entire cassette.
  • the cassette has a 200 bp full tanking repeat, which replaces hisG of Ura-blaster to allow efficient PCR amplification for transformation as well as homologous cleavage of the URA3 marker. As long as a C. albicans URA3 copy replaces a copy of URA3 in S.
  • the cassette can be used for continuous targeted gene disruption in ura3 / ura3 strains to S. cerevisiae.
  • many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated.
  • the disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained. [Detailed Description of the Invention]
  • the present inventors have tried to develop a high efficiency expression system capable of continuously delivering the desired genes in yeast.
  • the inventors made novel dual module plasmids consisting of expression modules and URA3 cleaved hairs capable of continuously transforming a gene of interest into yeast, thereby producing a target gene in the Ura yeast strain.
  • the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a yeast expression vector. Still another object of the present invention is to provide a method for continuous transformation of one or more target nucleotide sequences in yeast using the vector described above. Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
  • the present invention provides an antibody comprising: (a) a sequence homologous to the flanking sequence of a gene of interest; (b) (i) a multiple cloning site (MCS), (ii) a promoter of ScTDH3 (Saccharomyces cerevisiae glycer aldehyde— 3—phosphate dehydrogenase 3) and (iii) a terminator of ScADHKalcohol dehydrogenase 1) An expression module; And (c) (i) a promoter of ScURA3, (ii) an open reading frame (RFF) of ScURA3 operably linked to said promoter, and (iii) a terminator of ScURA3 coupled to both ends of said promoter and 0RF ( A yeast expression vector comprising a URA3 excision module comprising a terminator is provided.
  • MCS multiple cloning site
  • ScTDH3 Sacharomyces cerevisiae glycer aldehyde— 3—phosphat
  • the present invention provides a method for the continuous transformation of one or more target nucleotide sequences in yeast comprising the following steps: (a) The target nucleotide at the multiple cloning site (MCS) of the vector described above; Cloning the sequence; (b) transforming the vector into yeast; (c) inducing URA3 cleavage in the transformed yeast; And (d) subjecting steps (a) and (b) to a different target nucleotide sequence.
  • MCS multiple cloning site
  • the present inventors have constructed novel dual module plasmids consisting of expression modules and URA3 cleaved hairs capable of continuously transforming a target gene into yeast, thereby producing target genes in the Ura yeast strain. It was confirmed that it can continuously deliver with high efficiency.
  • Yeast has been widely used for the production of foreign proteins and other products of economic interest. Saccharomyces cerevisiae (5accAa / "i3 ⁇ 47yces cerevisiae) has been used industrially for a long time and has other advantages that other yeasts may be more suitable for the production of desired products.
  • Genus Kluyveromyces yeast species have beneficial properties for: K.
  • lactis (jf / i / yi / erQw ces 1 1 act is) and K. Maximilian G573 ⁇ 4 e / O C & s marxianus Generally Recognized As Save) and can be used with the same stability as Saccharomyces.
  • Vectors of the invention include sequences homologous to the flanking sequence of the gene of interest, an expression module and a URA3 cleavage module.
  • the vector of the present invention is selected by homologous recombinat ion homologous recombinat ion in the Ura yeast strain, homologous recombinat ions are integrated into the target site chromosome, and then through URA3 cleavage
  • homologous recombinat ions are integrated into the target site chromosome, and then through URA3 cleavage
  • sequences homologous to the flanking sequences of the genes of interest described above are determined by the yeast species to be applied.
  • the yeast with a vector of the present invention can be applied is a Saccharomyces species My process ⁇ Saccharomyces spp.), To progenitor saccharide My process (Schizosaccharomyces spp.), Picky 0 ⁇ ⁇ Pichia spp. ), Papy ⁇
  • the term "homologous sequence homologous to the target gene” is a sequence capable of homologous recombinat ion with the target gene on the chromosome. Performs the function of integrating the expression module and URA3 cleaved hairs into the target gene position in the chromosome.
  • the vector of the present invention can determine the position to be specifically integrated into the chromosome according to the flanking sequences ('UP' and 'DOWN' sequences) of the gene of interest.
  • the expression module of the present invention comprises (i) multiple cloning site (MCS), (ii) ScTDH3 (Saccharomyces cerevisiae 1 ycer a 1 dehyde-3-phosphat e) promoter of dehydrogenase 3) and (iii) terminator of ScADHl (alcohol dehydrogenase 1).
  • MCS multiple cloning site
  • ScTDH3 Sacharomyces cerevisiae 1 ycer a 1 dehyde-3-phosphat e
  • ScADHl alcohol dehydrogenase
  • the vector of the present invention comprises (i) a nucleotide sequence encoding an expression subject; (ii) a promoter operably linked to the nucleotide sequence of (i) and acting on animal cells, preferably yeast cells, to form RNA molecules, more preferably (i) encoding an expression target Nucleotide sequence; (ii) operably linked to the nucleotide sequence of (i) and acting on animal cells, preferably yeast cells, to form RNA molecules
  • the multicloning position serves as a position for cloning the nucleotide sequence encoding the expression material, and preferably includes four restriction enzyme positions (5a / I, Clal, EcRl and BanRl).
  • promoter refers to a DNA sequence that regulates the expression of a coding sequence or functional RNA.
  • the expression-coding nucleotide sequence is operably linked to the promoter.
  • operatively linked means a functional between nucleic acid expression control sequences (eg, promoter sequences, signal sequences, or arrays of transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences. Binding, whereby the regulatory sequence modulates transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • the URA3 cleaved hairs of the present invention include a URA3 0RF (open reading frame) that functions as a yeast selection marker.
  • Ura yeast train is used to use the vector of the present invention for transformation.
  • yeast strains transformed with the vectors of the invention can be grown in uracil-deficient media. That is, as the vector of the present invention is integrated into the yeast chromosome, the transformed yeast train is selected from uracil-deficient medium.
  • the URA3 cleaved hairs of the present invention function as hairs for the continuous transformation of the gene of interest. More specifically, for continuous transformation of the gene of interest, URA3 cleavage is performed on the transformed yeast strain.
  • the transformed yeast strain is grown in medium supplemented with 5-F0A to induce URA3 cleavage through homologous recombination that occurs between the promoter and the terminator of URA3 bound to both ends of the 0RF.
  • the transformed yeast strain is a Ura yeast strain in which the gene of interest is integrated at the target site of the chromosome and cannot grow in uracil-deficient media.
  • the vector of the present invention including a target gene other than the target gene can be used to perform transformation to target a target gene at another position on the chromosome of the transformed yeast strain.
  • a transformed yeast strain obtained by continuously modifying two different target genes can be produced.
  • a transformed yeast train modified with one or more target genes can be prepared.
  • the yeast selection marker gene of the present invention may utilize various selection marker genes known in the art and include, for example, auxotrophic selection marker genes such as UAR3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE2 and LYS2. Or not limited thereto. Most preferably, the yeast selection marker gene is UAR3. Alternatively, the present invention may utilize genes encoding proteins that impart drug resistance on host cells that can be used as yeast selection markers, including, for example, CAN1 and CYH2, but are not limited thereto. It is not.
  • a promoter that can be used is a promoter derived from a yeast cell that can regulate the transcription of the expression target material of the present invention, a mammal Promoters derived from viruses and promoters derived from genomes of mammalian cells, for example, promoters of 5. cerevisiae TDH3 (glycer aldehyde 3 phosphate dehydrogenase 3), yeast (5. cerevisiae) GAPDH (G 1 y cer a 1 dehyde 3 phosphate dehydrogenase promoter, yeast (5.
  • the expression cassette used in the present invention comprises a poly annealing sequence (e.g., ADH1 terminator, plastic field hormone terminator and SV40 derived poly adenylation sequence).
  • the method of transporting the vector of the present invention into a host cell may use various methods known in the art, for example, when the host cell is a prokaryotic cell, the CaC method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D. , J. Mo J. B / o J., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • the CaC method Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)
  • one method Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac
  • yeast globular / cell fusion used in transduction, electroporation, lipofection, microinjection, part icle bombardment, YAC And Agrobacterium-mediated transformation used in plant cells.
  • the bacterial replication initiation point may be selected from those well known in the art which are useful for stable bacterial replication of long DNA inserts.
  • bacterial selection marker of the present invention may use bacterial selection marker genes known in the art.
  • bacterial selection marker genes include, but are not limited to, genes that confer resistance to antibiotics such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, zeosin, neomycin, hygromycin and chloramphenicol.
  • the production of transformed yeast cells using the vector of the invention can be carried out by gene transfer methods commonly known in the art. For example, electroporation, lithium acetate / DMS0 method (Hill, J., et al., (1991), DMSO—enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791), liposome-mediated Transfer method (Wong, et al., 1980), retrovirus—mediated transfer method (Chen, HY, et al., (1990), J. Reprod. Fert.
  • the above-described transformation is Saccharomyces ⁇ ⁇ Saccharomyces spp.), Shichizozosaccharomyces sp., Pichia ⁇ ⁇ Pichia spp. ), Papia species G3 ⁇ 4 /// a spp.), Kluyberomyces species UUuyveromyces spp.), Candida ⁇ Candida spp.), Talaromyces species Talaromyces spp.), Brettanomyces spp.), Pachysolene ⁇ ⁇ Pachysolen spp. Or Debaryomyces sp.
  • the present invention relates to a novel dual module expression vector for yeast and a method for transforming a target nucleotide sequence using the same.
  • Expression modes of the present invention include expression modules and URA3 excision modules, including multiple cloning sites (MCS), suitable promoters and terminators.
  • MCS multiple cloning sites
  • the vector of the present invention can efficiently integrate a target gene at a specific position in the chromosome in yeast, preferably Saccharomyces cerevisiae, & ccAa // ziFces cere / s / ae).
  • Transformation method using the vector of the present invention is to produce a transformed yeast strain stably integrating the target gene into the chromosome and then continuous transformation to induce modification of another target gene in the yeast strain Where possible, it can be very usefully applied to the industrial production of desired products (biomass).
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of pScDAL.
  • Plasmid pScDAL was constructed on the backbone of pBluescript SKII (Stratagene) and contains expression modules (green) and URA3 cleavage modules (yellow) that are functionally and structurally similar to URA3-dpl200.
  • the top panel is the overall structure of pScDAL.
  • the components of each parent are as follows: middle panel, expression mothers; And bottom panel , URA3 cutting modules.
  • Primers for PCR amplification used in pScDAL construction are listed in Table 1. Distances between components or distances between restriction sites are not shown in proportions. CS, 0RF cloning position.
  • FIG. 2 schematically shows a schematic of the events of 0RF replacement and URA3 truncation, as a 0RF replacement and URA3 truncation strategy.
  • Homologous recombination between the 'UP' and 'DOWN' sequences isolated and cloned into the plasmid pScDAL results in 0RF replacement during integration of the linearized pScDAL into the recipient cell chromosome.
  • Primers for PCR amplification used for the cloning and determination of the genome structure are indicated.
  • 3 shows the results of investigating genome structure and gene expression after ORF replacement and URA3 cleavage.
  • FIG. 3A shows PCR amplification results using several primer sets to determine the genome structure of iBY4741-SPT15m6 in which 0RF of wild-type SPT15 was replaced with SPT15m6 ORF.
  • Primers used are shown in Figure 2 and Table 1: Lane 1, S9 and AS1; Lanes 2, S9 and AS2; Lanes 3, S3 and AS9; And lane 4, S4 and AS9.
  • FIG. 3B shows expression levels by Western blotting with anti-SPT15 and anti-actin antibodies prepared from total strains of strains directed to test the function of expression modules: lane 1, BY4741; And lane 2, iBY4741-SPT15m6.
  • 3C shows the results of PCR amplification using several primer sets to determine the genome structure of iBY4741_SPT15m6-ura3A with URA3 removed from iBY4741-SPT15m6 under F0A selection: lanes 1, S9 and AS1; Lanes 2, S9 and AS2; Lanes 3, S4 and AS4; Lanes 4, S2 and AS9; Lanes 5, S4 and AS9; And lane 6, S3 and AS9 (see FIG. 2 and Table 1).
  • S. cerevisiae used in this study includes NCYC3233 (wild type) or BY4741 (a a; his3A 1; leu2A 0; met 15 ⁇ 0; w aJ li?) (Nat ional Collection of Yeast Cultures, UK), a novel strain They were prepared via lithium acetate transformation (Burns et al., 1994).
  • the oligonucleotide sequences used for PCR are listed in Table 1.
  • Yeast cells were treated with YPD medium (20 g dextrose (Difco, USA), 20 g bacto-peptone (Difco, USA) and 10 g yeast extract (Difco) for non-selective propagat ion).
  • E. coli DH5a strain (Stratagene, USA) was used to supplement LB medium (10 gbacto trypton per litre) with ampicillin (50 // g / ml). , USA), 5 g yeast extract and 10 g NaCl (Difco, USA), or additionally 15 g bacto-agar for solid plates).
  • LB medium 10 gbacto trypton per litre
  • ampicillin 50 // g / ml
  • yeast extract and 10 g NaCl (Difco, USA)
  • 15 g bacto-agar for solid plates 15 g bacto-agar for solid plates.
  • PCR primers used in this study are listed in Table 1. PCR conditions were as follows: 95 ° C., 1 min; 60 ° C., 1 minute; And 72 ° C., extension time appropriate to the length of DNA to be amplified. Experiment result
  • Plasmid pScDAL containing expression parents and URA3-dpl200-like cassette under the control of the TDH3 promoter on the pBluescript backbone was prepared as follows.
  • the TDH3 promoter (682 bp; SEQ ID NO: 1 sequence) and the ADH1 terminator (213 bp; SEQ ID NO: 2 sequence) were amplified from the genome DNA of NCYC3233 using the S1 / AS1 and S2 / AS2 primer sets, respectively. And then cloned into the Xho lSal ⁇ and Bai MXba locations of pBluescript SKlKStratagene, La Jolla, CA, USA).
  • the construction of the URA3-dpl200-like cassette was basically carried out by adopting the method described by Wilson et al. (2000).
  • DNA fragments containing the promoter, 0RF and terminator of the URA3 gene (1276 bp, named PURA3T; promoter and 0RF, SEQ ID NO: 3 sequence) were amplified from the genome DNA of NCYC3233 using S3 and AS3 primer sets.
  • the URA3 terminator (243 bp; named URA3T; SEQ ID NO: 4 sequence) was amplified using the S4 and AS4 primer sets.
  • the S4 primer was designed to include the 5'-end 24 bp of the URA3 promoter and 22 bp of the 3'-end of the URA3 terminator.
  • Purified PURA3T and URA3T were mixed and annealed at the same molar ratio, and then PCR was performed using the S5 and AS5 primer sets to ligate both fragments.
  • short fragments including terminators only
  • long fragments named TPURA3T; SEQ ID NO: 5 sequences
  • the TPURA3T strand consists of the URA3's terminator, promoter, 0RF and terminator (5 '-> 3' direction).
  • Long fragments (1474 bp) were purified and digested with Not ⁇ and S cII and cloned into plasmids containing the expression parents described above (pScDAL; top panel of FIG. 1).
  • Plasmid pScDAL has expression modules and URA3 cleavage module.
  • the expression module of plasmid pScDAL includes the TDH3 promoter, the cloning position (CS) of the gene of interest, and the ADH1 terminator (middle panel of FIG. 1).
  • TDH3 promoter was PCR amplified using a sense primer containing a 5'-terminal JOiol position and an antisense primer containing a 3'-terminal Sail position, and By cutting with Sail it can be replaced by another promoter.
  • the cloning position of the gene of interest includes four restriction enzyme positions (5a / I, Cla ⁇ , EccRl and BanRi.
  • the URA3 cleavage moieties are similar to the URA3-dpl200 cassette, and the terminator, promoter, 0RF and terminator of URA3 (5 '— > 3 'direction (lower panels in Figures 1 and 2.)
  • the direct repeats of the terminator sequences present at both ends promote cleavage of URA3 in the F0A-supplemented medium. Testing
  • SPT15wt wild-type SPT15 gene
  • SPT15m6 clone comprising two mutations (Leu76Val and Leul35Ser).
  • AS6 SPT15-AS primer sets and cloned into £ ccRI and BaiMl of pScDAL (pScDAL-SPT15m6).
  • the size of the site containing the two modules was 2653 bp.
  • the inventors then have two options as DNA preparation methods that can be used for targeted integration into the SPT15 gene locus on the genome.
  • the first is about 2.8 kb by amplifying a site containing two mothers with recombination-competent primers containing sequences deduced to a targeted location similar to URA3-blasters (typically> 65 bp). It is to prepare a fragment of.
  • the second is to prepare plasmids whose upstream and downstream target DNA fragments (typically> 200 bp) are cloned into the 0 0 wl and between the URA3 cleavage moieties (between 5adl and 5acl), respectively, (see: 1A).
  • the plasmid is amplified in bacteria and then linearized with Kpn ⁇ and 5acl for integration.
  • an upstream target DNA fragment ('UP') was prepared using the SPT15UP-S (S7) and SPT15UP-AS (AS7) primer sets for the upstream 419-179 bp sequence of the start codon of SPT15 0RF. After amplification, the cells were cleaved with Kpn ⁇ and? ⁇ , and cloned into pScDAL-SPT15m6 ( P ScDAL-SPT15m6U).
  • SPT15m6UD SPT15m6UD
  • pScDAL-SPT15m6UD and pScDAL-SPT15m6 as a control were linearized to Kpnl and & d.
  • the combination of insert and pBluescript backbone was cleared by phenol / chloroform extraction and then used for yeast transformation.
  • S. cerevisiae strain BY4741 was used as a transformant receptor (recipient).
  • Transformed cells were selected in SD medium (SD-ura) supplemented with nutrients lacking the required uracil. Transformation efficiency (yield) was about 20 cfu /// g in pScDAL-SPT15m6UD and 2-3 cf u / g in pScDAL—SPT15m6.
  • SPT15UP AS AS7 CTCGAGCACGTCCOTGITTACTCTTACC
  • SPT15DN AS AS8 GAGCTCGTTCACCnCCTCTGTAGGAAGC
  • PCR products containing S9 / AS1, S9 / AS2, S3 / AS9 and S4 / AS9 primer sets will be generated.
  • fragments of expected size were amplified in seven clones. Prototypical patterns of PCR amplification are shown in FIG. 3A. These data show the integration of pScDAL-SPT15m6UD linearized around the SPT15 gene with an efficiency of about 70). The remaining three clones show false consolidation, a rate consistent with the consolidation frequency of pScDAL-SPT15m6.
  • the inventors have shown that the integrated URA3 cleaved hairs eliminate the uracil nutritional composition of the recipient cells.
  • the URA3 gene is cleaved under the F0A selection pressure of removing a single copy of the terminator through homologous interactions between terminator repeats.
  • rBY4741-SPT15m6 in SD-ura medium containing uridine and F0A to obtain a F0A-resistant strain named iBY4741-SPT15m6-ura3A.
  • the strain exhibited uracil nutrition (not shown results).
  • PCR was performed using a designated primer set to examine the genome structure after URA3 cleavage (FIG.

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Abstract

본 발명은 (a) 목적 유전자 단편의 플랭킹 서열(flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) (ⅰ) 멀티 클로닝 위치(multiple cloning site, MCS), (ⅱ) ScTDH3(Saccharomyces cerevisiae glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (ⅲ) ScADH1(alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터(terminator)를 포함하는 발현 모듈(expression module); 및 (c) (ⅰ) ScURA3의 프로모터, (ⅱ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된(operably linked) ScURA3의 ORF(open reading frame) 및 (ⅲ) 상기 프로모터 및 ORF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3의 터미네이터(terminator)를 포함하는 절단 모듈(URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현벡터(yeast expression vector) 및 이를 이용한 형질전환 방법에 관한 것이다. 본 발명의 벡터를 이용한 형질전환 방법은 안정적으로 목적 유전자를 안정적으로 염색체로 통합시킨 형질전환 효모 스트레인을 제작한 후 상기 효모 스트레인에 또 다른 목적 유전자의 변형을 유발시키는 연속적인 형질전환이 가능함에 따라, 소망하는 산물들(바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
염색체 통합용 효모 발현 백터 및 이의 용도 【기술 분야】
본 발명은 염색체 통합용 효모 발현 백터 및 이의 용도에 대한 것이다.
【배경 기술】
유전자 기능을 연구하기 위한 추가적인 대사공학 (metabolic engineer ing)으로서， 사카로마이세스 세레비지에 ( Saccahromyces cer /s/ae)에서 이종 또는 자가 유전자 발현이 대량으로 경제적 가치를 가지는 물질의 생산하거나 또는 숙주세포의 물리화학적 특성을 증진시킬 수 있다 (Nevoigt, 2008). 이것은 다른 영양요구 돌연변이체 (auxotrophic mutants) 및 목적 유전자가 다양한 프로모터의 조절 하에 위치하여 자가적으로 복제하는 적합한 선택마커를 가진 플라스미드가 유용하가 때문에 실험실 스트레인들에서 용이한 일이다. 잘-알려진 프로모터를 포함하는 플라스미드의 이용과 관련된 문제들 중 하나는 산업적 적용에서 효모 배양을 위해 임의대로 선택할 수 없는 선택 압력 (selection pressures)의 지속적인 존재에도 불구하고 카피 수를 조절할 수 없음으로 인해 야기되는 발현 상에 세포 -세포 이질성 (cell-cell heterogeneity)이다. 따라서， 선택 압력의 부재 (즉, 상동 재조합에 의한 염색체로의 통합) 하에서 유전자의 안정적인 발현 및 유지가 매우 바람직하다.
유전자 통합은 rRNA 유전자 (Lopes et al., 1969； Fujii et al. , 1990) 및 시그마 (Kudla et al. , 1992) 또는 델타 서열 (Sakai et al., 1990； Lee et al. , 1997； Ekino et al. , 2002； Oliviera et al. , 2007) 같은 지놈 상의 특정 위치로 타겟팅된다. 상기 서열들이 효모 지놈 전반에 걸쳐서 많은 곳에서 존재하기 때문에， 여러 카피의 삽입된 유전자를 포함하는 스트레인이 발생할 수 있다. 세포 -세포 이질성을 회피했을 지라도, 이 전략은 삽입된 유전자의 카피 수를 조절하여 시작부터 발현 레벨을 조절하는 데 유사한 문제를 일으킬 수 있는데， 예를 들어 적정 레벨로 삽입된 유전자를 발현시키는 클론의 추가적인 선택이 필요하다. 더욱이， 발현된 단백질 레벨이 항상 유전자 카피 수와 상관관계를 가지지 않는다 (Moriya et al .， 2006). 이런 점으로 인해， 삽입된 유전자의 단백질 산물이 양적 또는 기능적으로 상웅하는 야생형 유전자의 단백질보다 크게 우세하지 않는다면 변형된 유전자들 (예컨대， 돌연변이)에 대한 기능 분석이 어려운 것이다. 이런 측면에서 유전자 대체 (replacement)는 간결한 방식으로 원하는 위치로의 정밀한 통합 타겟팅 (integrative targeting)하기 위한 선택수단일 수 있다. 최근에， 특정 유전자의 고유의 프로모터가 다른 유전자의 다른 강도를 가지는 유전적으로 변형되거나 또는 천연의 프로모터로 대체되어 졌다 (Verstrepen et al . , 2004； Nevoigt et al. , 2006).
상술한 바와 같이, 변형된 유전자의 OR open reading frame; 또는 다른 강도의 프로모터와 함께)를 대체함으로써 변형된 형태만의 효과를 조사하는 것이 바람직하다. 대부분의 경우， 통합된 클론들의 선택은 통합 백터에 의해 제공되는 특정 영양성분 (nutrients)의 부재 하에서 성장하는 세포의 능력에 의존한다. 이론적으로， 많은 유전자 통합은 여러 영양요구 돌연변이를 가진 스트레인에서 획득될 수 있다. 하지만, 특별한 경우 산업적 미생물에 영양요구 돌연변이를 도입함으로써 얻어질 수 있는데， 이러한 돌연변이가 필요한 영양성분을 보충하는 필요한 증가된 배양 비용 이외에도 세포 생리상태 (physiology)에 영향을 미칠 수 있기 때문이다. 따라서, 재생산할 수 있는 통합 백터는 단일 영양요구 돌연변이를 가진 산업적 미생물에서 상술한목적을 달성하기 위한 강력한 수단이다.
Nevoigt 등 (2006)은 S. 세레비지에용 재생산용 프로모터 대체 카세트 (reusable promoter replacement cassette)를 보고하였다. 상기 컨스트럭트에서 선택마커는 박테리아 /αχ·5서열 쌍 간에 위치한다. 이후, 선택마커가 Cre 단백질에 의해 매개되는 상동재조합을 통해 제거될 수 있다. 또 다른 선택적인 수단은 Ura—블라스터 카세트 (Ura-blaster cassette) 또는 URA3-d l200 카세트이다. Ura-블라스터는 원래 칸디다 알비칸스 /7 'ώ albicans) 같은 무성생식 배수체 (diploid) 미생물에서 성공적으로 타겟팅된 유전자의 파괴를 위해 개발되었다 (Alani and leckner, 1987； Fonzi and Irwin, 1993； Pla et al., 1996). 상기 카세트는 C. 알비칸스 URA3 카피 (hisG-URA3-hisG)에 의해 분리된 살모넬라 hisG 유전자의 반복서열 (direct repeats)를 포함한다.
URA3 의 절단은 F0A(5-fluoroorotic acid)가 보충된 배지에서 성장하는 경우에 hisG 반복부위 간의 빈번한 상동재조합을 통해 일어난다. 따라서， URA3 선택마커는 다른 목적 유전자의 연속적인 파괴에 이용될 수 있다. URA3-dpl200 카세트는 전체 카세트의 효율적인 PCR 증폭하기 위해 너무 큰 카세트를 가지는 Ura-블라스터의 한계점을 극복하기 위해 Wilson 등 (2000)에 의해 개발되었다. 상기 카세트는 200 bp의 플탱킹 반복부위를 가지는 데， 이 부위는 Ura-블라스터의 hisG 를 대체하여 URA3 마커의 상동 절단 뿐 아니라 형질전환을 위한 효율적인 PCR 증폭을 가능하게 한다. C. 알비칸스 URA3 카피가 S. 세레비지에 URA3 의 카피를 대체하는 한, 상기 카세트는 S. 세레비지에의 ura3/ura3 스트레인들에서 연속적인 타겟팅된 유전자 파괴에 이용될 수 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. 【발명의 상세한 설명】
본 발명자들은 효모에서 목적 유전자들을 연속적으로 전달할 수 있는 고효율 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 효모에 연속적으로 목적 유전자를 형질전환시킬 수 있는 발현 모들 (expression module) 및 URA3 절단 모들로 이루어진 신규한 이중 모들 플라스미드 (dual module plasmids)를 제작하여 Ura_효모 스트레인에서 목적 유전자들을 연속적으로 고효율로 전달할 수 있다는 것을 확인함으로써， 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 효모 발현백터 (yeast expression vector)를 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상술한 백터를 이용한 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. 본 발명의 양태에 따르면， 본 발명은 (a) 목적 유전자의 플탱킹 서열 (flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) ( i ) 멀티 클로닝 위치 (multiple cloning site, MCS) , ( ii ) ScTDH3 ( Saccharomyces cerevisiae glycer aldehyde— 3— phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (iii) ScADHKalcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터 (terminator)를 포함하는 발현 모듈 (expression module); 및 (c) ( i ) ScURA3의 프로모터， ( ii ) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 (operably linked) ScURA3 의 0RF(open reading frame) 및 (iii) 상기 프로모터 및 0RF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3 의 터미네이터 (terminator)를 포함하는 절단 모들 (URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현백터 (yeast expression vector)를 제공한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법을 제공한다: (a) 상술한 백터의 MCS(multiple cloning site)에 목적 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계; (b) 상기 백터를 효모에 형질전환시키는 단계; (c) 상기 형질전환된 효모에서 URA3 절단을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a) 및 (b)를 다른 목적 뉴클레오타이드 서열로 실시하는 단계 . 본 발명자들은 효모에서 목적 유전자들을 연속적으로 전달할 수 있는 고효율 발현 시스템을 개발하고자 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 효모에 연속적으로 목적 유전자를 형질전환시킬 수 있는 발현 모들 (expression module) 및 URA3 절단 모들로 이루어진 신규한 이중 모들 플라스미드 (dual module plasmids)를 제작하여 Ura 효모 스트레인에서 목적 유전자들을 연속적으로 고효율로 전달할 수 있다는 것을 확인하였다. 효모는 경제적으로 관심을 끄는 외래 단백질 및 다른 산물들의 생산에 폭넓게 이용되어 왔다. 사카로마이세스 세레비지에 (5accAa/"i¾7yces cerevisiae)는 오랜 기간 동안 산업적으로 이용되어져 왔으며， 이 외에도 다른 효모들이 소망하는 산물들의 생산에 보다 더 적합할 수 있는 장점들을 가진다. 또한， 생명공학적 방법을 위해 유익한 특징들을 가지고 있는 속이 클루이베로미세스 효모종이다. K. 락티스 (jf/i/yi/erQw ces1 1 act is) 및 K. 막시아누스 G57¾ e/O C&s marxianus) 효모는 GRAS(Generally Recognized As Save)로서 분류되어 사카로마이세스와 동일한 안정성을 가지고 이용될 수 있다.
본 발명의 백터는 목적 유전자의 플랭킹 서열 (flanking sequence)과 상동적인 서열， 발현 모들 (expression module) 및 URA3 절단 모듈을 포함한다.
본 발명의 백터는 Ura 효모 스트레인에서 목적 유전자의 플탱킹 서열과 상동적인 서열이 상동재조합 (homologous recombinat ion)을 통해 발현 모들 및 절단 모들이 타겟 위치의 염색체로 통합되어 선택되고， 이후 URA3 절단을 통해 목적 유전자가 염색체에 통합된 형질전환된 Ura 효모 스트레인이 얻어짐으로써, 연속적인 유전자 전달이 가능하다. 상술한 목적 유전자의 플탱킹 서열과 상동적인 서열은 적용될 효모 종에 따라 결정된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 본 발명의 백터가 적용될 수 있는 효모는 사카로마이세스 종 {Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 ( Schizosaccharomyces spp.), 피키 0 ^{Pichia spp . ) , 파피 ο|· ^{Paffia spp.), 클루이베로미세스 종 (Khiyveromyces spp.), 칸디다 ^ Candida spp.), 탈라로미세스 종 ( alaromyces spp.), 브레타노미세스 ( Bret tanomyces spp.), 파기솔렌 ^-{Pachysolen spp. ) 또는 데바리오미세스 종 Debaryomyces spp.)을 포함하며， 보다 바람직하게는 사카로마이세스 종을 포함하고， 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에를 포함한다.
본 명세서의 용어 "목적 유전자의 플탱킹 서열 (flanking sequence)과 상동적인 서열" 은 염색체 상의 목적 유전자의 플탱킹 서열과 상동재조합 (homologous recombinat ion)이 가능한 서열로， 본 발명의 백터 내 발현 모듈 (expression module) 및 URA3 절단 모들을 염색체 내 목적 유전자 위치로 통합시키는 기능을 수행한다. 따라서, 본 발명의 백터는 목적 유전자의 플랭킹 서열 ( 'UP' 및 'DOWN' 서열)에 따라 특이적으로 염색체에 통합될 위치를 결정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 발현 모들 (expression module)은 ( i ) 멀티 클로닝 위치 (multiple cloning site, MCS) , ( ii ) ScTDH3( Saccharomyces cerevisiae 1 ycer a 1 dehyde-3-phosphat e dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (iii) ScADHl (alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터 (terminator)를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 백터는 ( i ) 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ii) 상기 ( i )의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포, 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는 프로모터를 포함하며， 보다 바람직하게는 ( i ) 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; (ii) 상기 ( i )의 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결되며 동물세포, 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 RNA 분자를 형성시키는
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cerevisiae g 1 ycer a 1 dehyde-3-phosphat e dehydrogenase 3)의 프로모터； 및 (iii) 상기 동물세포， 바람직하게는 효모세포에서 작용하여 상기 RNA 분자의 3'-말단의 폴리아데닐화를 야기시키는 3'-비-해독화 부위， 바람직하게는 ScADHK alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터 (terminator)를 포함하는 발현백터를 포함한다.
본 발명의 백터에서， 상기 멀티 클로닝 위치는 발현대상물질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 위치로 기능하며， 바람직하게는 4 개의 제한효소 위치 (5a/I, Clal, EcRl 및 BanRl)를 포함한다.
본 명세서에서 용어 "프로모터" 는 코딩 서열 또는 기능적 RNA 의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 제조합 발현백터에서 발현대상물질 -코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 용어 "작동적으로 결합된 (operatively linked)" 은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터 서열， 시그널 서열， 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며， 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및 /또는 번역을조절하게 된다.
본 발명의 URA3 절단 모들은 효모 선택마커로서 기능하는 URA3 0RF(open reading frame)을 포함한다. 본 발명에 따르면， 본 발명의 백터를 형질전환에 이용하기 위해서 Ura 효모스트레인을 이용한다. 따라서, 본 발명의 백터로 형질전환된 효모 스트레인은 우라실 -결핍 배지에서 성장할 수 있다. 즉， 본 발명의 백터가 효모 염색체 내로 통합됨에 따라 형질전환된 효모스트레인이 우라실 -결핍 배지에서 선택된다.
또한， 본 발명의 URA3 절단 모들은 목적 유전자의 연속적인 형질전환을 위한 모들로서 기능한다. 보다 상세하게는， 목적 유전자의 연속적인 형질전환을 위해, 상기 형질전환된 효모 스트레인에서 URA3 절단을 실시한다. 상기 형질전환된 효모 스트레인이 5-F0A 가 보층된 배지에서 성장시킴으로써， 상기 프로모터 및 0RF 양쪽 말단에 결합된 URA3 의 터미네이터 간에 발생하는 상동재조합을 통해 URA3 절단을 유도시킨다. URA3 절단 후， 상기 형질전환된 효모 스트레인은 상기 목적 유전자가 염색체의 타겟 위치에 통합되고， 우라실 -결핍 배지에서 성장할 수 없는 Ura 효모 스트레인이다. 따라서， 상기 목적 유전자가 아닌 다른 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 백터를 이용하여 상기 형질전환된 효모 스트레인의 염색체 상에 다른 위치의 목적 유전자를 타겟팅하는 형질전환을 실시할 수 있다. 그 결과， 서로 다른 2 개의 목적 유전자를 연속적으로 변형시킨 형질전환 효모 스트레인을 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이， URA3 절단 과정을 반복적으로 실시함으로써， 하나 이상의 목적 유전자를 변형시킨 형질전환효모스트레인을 제조할 수 있다.
본 발명의 효모 선택마커 유전자는 당업계에 공지된 다양한 선택마커 유전자를 이용할 수 있으며， 예를 들어, UAR3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE2 및 LYS2 같은 영양요구성 (auxotrophic) 선택마커 유전자를 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 효모 선택마커 유전자는 UAR3 이다. 선택적으로， 본 발명은 효모 선택마커로서 이용될 수 있는 숙주세포 상에 약물 저항성 (drug resistance)를 부여하는 단백질을 인코딩하는 유전자를 이용할 수 있고, 예를 들어 CAN1 및 CYH2 를 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 재조합 백터가 진핵세포， 바람직하게는 효모 세포에 적용되는 경우， 이용될 수 있는 프로모터는， 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서， 효모 세포에서 유래된 프로모터， 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며， 예컨대， 효모 (5. cerevisiae) TDH3(glycer aldehydeᅳ 3ᅳ phosphate dehydrogenase 3)의 프로모터， 효모 (5. cerevisiae) GAPDH (G 1 y cer a 1 dehyde 3一 phosphate dehydrogenase) 프로모터， 효모 (5. cerevisiae) GAL1 내지 GAL10 프로모터 , ^모 Pichia pastoris) A0X1 또는 A0X2 프로모터， CMV(cyt omega lo virus) 프로모터， 아데노바이러스 후기 프로모터， 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터， SV40 프로모터 , HSV 의 tk 프로모터 , RSV 프로모터， EF1 알파 프로모터 , 메탈로티오닌 프로모터， 베타 -액틴 프로모터， 인간 IL-2 유전자의 프로모터 인간 IFN 유전자의 프로모터， 인간 IL-4 유전자의 프로모터， 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는， 효모 TDH3의 프로모터이다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 발현 카세트는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다 (예: ADH1 터미네이터， 소성장 호르몬 터미네이터 및 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 백터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며， 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaC 방법 (Cohen, S.N. et al. , Proc. Natl. Acac. Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al . , Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)； 및 Hanahan, D. , J. Mo J. B/o J., 166:557- 580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al . , Nucleic. Acids Res. , 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우， 트랜스덕션 (transduction), 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 (lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총 (part icle bombardment ) , YAC 에서 이용되는 효모 구형질체 /세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다. 이때， 박테리아 복제 개시점은 긴 DNA 삽입물 (inserts)의 안정적인 박테리아 복제에 유용한 당업계에 잘 알려진 복제 개시점들로부터 선택될 수 있으며，
？ ColEl, F-인자 (F-factor) 및 PI 레플리콘 (replicon)을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리아 선택마커는 당업계에 알려진 박테리아 선택마커 유전자를 이용할 수 있다. 예를 들어， 박테리아 선택마커 유전자는 암피실린， 카나마이신， 테트라사이클린， 제오신， 네오마이신， 하이그로마이신 및 클로람페니콜 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자들을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 백터를 이용하여 형질전환된 효모 세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어， 전기천공법 (electroporation), 리튬 아세테이트 /DMS0 방법 (Hill, J. , et al . , (1991) , DMSO— enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Res. 19, 5791)， 리포좀 -매개 전이방법 (Wong, et al., 1980), 레트로바이러스—매개 전이방법 (Chen, H.Y. , et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182； Kopchick, J.J. et al. , (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos . In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; But t erwor t h-He i nemann； Lee, M.-R. and Shuman , R. (1990) Proc. 4th World Congr . Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110) 등을 이용하여 실시할 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면， 상술한 형질전환은 사카로마이세스 ^{Saccharomyces spp.), 시조사카로마이세스 ( Schi zosaccharomyces sp . )， 피키아 ^{Pichia spp . )， 파피아 종 G¾///a spp.), 클루이베로미세스 종 UUuyveromyces spp.), 칸디다 ^ Candida spp.), 탈라로미세스 종 Talaromyces spp.), 브레타노미세스 ( Brettanomyces spp.), 파키솔렌 ^{Pachysolen spp. ) 또는 데바리오미세스 ^ Debaryomyces spp.) 효모 스트레인에서 실시하며， 보다 바람직하게는 사카로마이세스 종에서 실시하고， 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에에서 실시한다. 본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: (a) 본 발명은 효모용 신규한 이중 모들 발현 백터 (dual module expression vector) 및 이를 이용한 목적 뉴클레오타이드 서열의 형질전환 방법에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 발현 모들은 멀티 클로닝 위치 (multiple cloning site, MCS), 적합한 프로모터 및 터미네이터 (terminator)를 포함하는 발현 모들 (expression module) 및 URA3 절단 모들 (excision module)을 포함한다.
(c) 본 발명의 백터는 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지에 &ccAa/ /ziFces cere /s/ae)에서 염색체 내 특정 위치로 목적 유전자를 고효율로 통합시킬 수 있다.
(d) 본 발명의 백터를 이용한 형질전환 방법은 안정적으로 목적 유전자를 안정적으로 염색체로 통합시킨 형질전환 효모 스트레인을 제작한 후 상기 효모 스트레인에 또 다른 목적 유전자의 변형을 유발시키는 연속적인 형질전환이 가능함에 따라, 소망하는 산물들 (바이오매스)의 산업적 생산에 매우 유용하게 적용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 은 pScDAL 의 구조를 도식적으로 나타내는 도면이다. 플라스미드 pScDAL 이 pBluescript SKII(Stratagene)의 백본에서 구축되었으며， URA3-dpl200 와 기능적 및 구조적으로 유사한 발현 모들 (녹색) 및 URA3 절단 모듈 (노란색)을 포함한다. 위쪽 패널은 pScDAL 의 전체 구조이다. 각 모들의 구성성분은 다음과 같다: 중간 패널, 발현 모들; 및 아래쪽 패널， URA3 절단 모들. pScDAL 구축에 이용된 PCR 증폭용 프라이머들은 표 1 에 기재되어 있다. 구성성분들 간의 거리 또는 제한효소 위치들 간의 거리는 비율에 따라 표시되어 있지 않다. CS, 0RF 클로닝 위치.
도 2 는 0RF 대체 및 URA3 절단 전략으로서， 0RF 대체 및 URA3 절단의 이벤트들에 대한 도식을 개략적으로 나타낸다. 플라스미드 pScDAL 에 분리되어 클로닝된 'UP' 와 'DOWN' 서열 간의 상동재조합은 선형화된 pScDAL 의 수용세포 염색체로의 통합 과정 동안 0RF 대체를 초래한다. 클로닝 및 지놈 구조 (참조: 도 1)의 결정을 위해 이용된 PCR 증폭용 프라이머들이 표시되어 있다. 도 3 은 ORF 대체 및 URA3 절단 후 지놈 구조 및 유전자 발현을 조사한 결과이다. 도 3A는 야생형 SPT15의 0RF를 SPT15m6 ORF로 대체한 iBY4741-SPT15m6 의 지놈 구조를 결정하기 위해 여러 프라이머 세트를 이용하여 실시한 PCR 증폭 결과이다. 이용된 프라이머들은 도 2 및 표 1 에 기재되어 있다: 레인 1， S9 및 AS1; 레인 2， S9 및 AS2; 레인 3， S3 및 AS9; 및 레인 4， S4 및 AS9. 도 3B 는 발현 모듈의 기능을 테스트하기 위해 지시된 스트레인들로부터 총 세포 추출물을 제조하여 항 -SPT15 및 항- 액틴 항체로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 발현 레벨을 조사하였다: 레인 1， BY4741; 및 레인 2， iBY4741-SPT15m6. 도 3C 는 URA3 가 F0A 선택 하에서 iBY4741-SPT15m6 로부터 제거된 iBY4741_SPT15m6-ura3A의 지놈 구조를 결정하기 위해 여러 프라이머 세트를 이용하여 실시한 PCR 증폭 결과이다: 레인 1， S9 및 AS1; 레인 2， S9 및 AS2; 레인 3， S4 및 AS4; 레인 4， S2 및 AS9; 레인 5， S4 및 AS9; 및 레인 6， S3 및 AS9(참고: 도 2 및 표 1). 【실시예】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 실시예 실험재료 및 실험방법
스트레인 및 배지
본 연구에서 이용된 S. 세레비지에는 NCYC3233(야생형) 또는 BY4741( ai a; his3A 1； leu2A 0； met 15 Δ 0； w aJ l i?)(Nat ional Collection of Yeast Cultures, UK), 신규한 스트레인들은 리튬 아세테이트 형질전환 (Burns et al . , 1994)을 통해 제조하였다. PCR 에 이용된 을리고뉴클레오타이드 서열은 표 1에 기재되어 있다. 효모 세포는 비-선택적 증식 (non-selective propagat ion)을 위해서 YPD배지 (1리터 당 20 g 덱스트로오스 (Difco, USA), 20 g박토 -펩톤 (Difco, USA) 및 10 g 효모 추출물 (Difco, USA), 그리고 고형 플레이트를 위해서 15% 박토 -아가 (Difco, USA)를 추가적으로 포함)에서 배양하거나 또는 선택적 증식을 위해서 합성 배지 (SD medium; 1 리터 당 20 g 텍스트로오스 및 아미노산이 없는 6.7 g 효모 질소 베이스 (Difco, USA), 그리고 필요하다면 영양요구 보층 흔합물 (Sigma-Aldrich, USA)을 첨가하거나 또는 2% 덱스트로오스， 그리고 고형 플레이트를 위해서 15 g 노블 아가 (Difco, USA)를 추가적으로 포함; MP, 0H)에서 배양하였다. 우리딘 (1 리터 당 80 mg; Sigma-Aldrich, USA) 및 FOA(0.1¾; Sigma-Aldrich, USA)가 飄3 절단용 배지에 첨가되었다.
플라스미드의 유지 (고형 플레이트) 또는 증폭 (액체 배지)을 위해， 대장균 DH5a 스트레인 (Stratagene, USA)은 암피실린 (50 //g/ml)이 보층된 LB배지 (1리터 당 10 g박토 트립톤 (Difco, USA), 5 g효모 추출물 및 10 g NaCl (Difco, USA), 또는 고형 플레이트를 위해서 15 g 박토-아가를 추가적으로 포함)에서 배양시켰다. 분자생물학적 방법
클로닝, 플라스미드 제조， 시퀀싱 및 웨스턴 블롯 분석은 이전에 기재된 바와 같이 실시하였다 (Sambrook and Russell, 2001). 모든 증폭된 DNA 단편들의 뉴클레오타이드 서열은 pGEM-T easy 백터 (Promega, Madison, WI, USA)에 클로닝한 후 시뭔싱하여 확인하였다. 지놈 DNA및 세포 추출물의 제조
이전에 기술된 바와 같이， 지놈 DNA toffman and Winston, 1987) 및 세포 추출물 (Choi et al., 2003)을 중간 -로그 세포로부터 제조하였다.
PCR
본 연구에서 이용된 PCR 프라이머들은 표 1 에 기재되어 있다. PCR 조건은 다음과 같다: 95°C, 1 분; 60°C, 1 분 ; 및 72°C， 증폭될 DNA 길이에 따라 적합한 연장 시간. 실험결과
이중모들플라스미드 (pScDAL)의 구축
pBluescript 백본 상에 TDH3 프로모터의 조절 하에 발현 모들 및 URA3-dpl200-유사 카세트를 포함하는 플라스미드 pScDAL 를 다음과 같이 제조하였다. 발현 모들의 경우, TDH3 프로모터 (682 bp; 서열목록 제 1 서열) 및 ADH1 터미네이터 (213 bp; 서열목록 제 2 서열)가 NCYC3233 의 지놈 DNA 로부터 각각 S1/AS1 및 S2/AS2 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후， pBluescript SKlKStratagene, La Jolla, CA, USA)의 Xho lSal\ 및 Bai MXba 위치로 차례대로 클로닝되었다.
URA3-dpl200-유사 카세트의 구축은 기본적으로 Wilson 등 (2000)에 의해 기재된 방법을 채택하여 실시하였다. URA3 유전자의 프로모터， 0RF 및 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 (1276 bp, PURA3T 로 명명됨; 프로모터 및 0RF, 서열목록 제 3 서열)이 NCYC3233 의 지놈 DNA 로부터 S3 및 AS3 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. 다음으로， URA3 터미네이터 (243 bp; URA3T 로 명명됨; 서열목록 제 4 서열)가 S4 및 AS4 프라이머 세트를 이용하여 증폭되었다. PURA3T 및 URA3T 의 PCR-매개된 라이게이션을 촉진시키기 위해， S4 프라이머는 URA3 프로모터의 5' -말단의 24 bp 및 URA3 터미네이터의 3' -말단의 22 bp 를 포함하도록 고안되었다. 정제된 PURA3T 및 URA3T 를 동일 몰비로 흔합하여 어닐링한 후， PCR 을 S5 및 AS5 프라이머 세트를 이용하여 실시하여 두 단편들을 라이게이션시켰다. 그 결과， 짧은 단편 (터미네이터만 포함) 및 긴 단편 (TPURA3T 로 명명됨; 서열목록 제 5 서열)이 제조되었다. TPURA3T 가닥은 URA3 의 터미네이터， 프로모터， 0RF 및 터미네이터 (5' -> 3' 방향)로 구성된다. 긴 단편 (1474 bp)이 정제되고 Not\ 및 S cII 로 절단되어 상술한 발현 모들을 포함하는 플라스미드에 클로닝되었다 (pScDAL; 도 1의 위쪽 패널).
플라스미드 pScDAL 은 발현 모들 및 URA3 절단 모듈을 가진다. 플라스미드 pScDAL 의 발현 모듈은 TDH3 프로모터， 목적 유전자의 클로닝 위치 (CS), 및 ADH1 터미네이터를 포함한다 (도 1 의 중간 패널). TDH3 프로모터는 5' -말단의 JOiol 위치를 포함하는 센스 프라이머 및 3' -말단의 Sail 위치를 포함하는 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고 및 Sail 으로 절단함으로써 다른 프로모터로 대체될 수 있다. 목적 유전자의 클로닝 위치는 4 개의 제한효소 위치 (5a/I, Cla\, EccRl 및 BanRi 포함한다. URA3 절단 모들은 URA3-dpl200 카세트와 유사하며 , URA3 의 터미네이터， 프로모터， 0RF 및 터미네이터 (5' — > 3' 방향)로 구성되어 있다 (도 1 및 도 2 의 아래쪽 패널). 양 말단에 존재하는 터미네이터 서열의 반복부위 (direct repeats)는 F0A-보층된 배지에서 URA3 의 절단을 촉진시킨다. 발현 모들의 테스팅
NCYC3233 으로부터 Taq 폴리머라제를 이용하여 TATA-결합 단백질을 인코딩하는 야생형 SPT15 유전자 (SPT15wt)를 증폭하면서， 본 발명자들은 2개의 돌연변이 (Leu76Val 및 Leul35Ser)를 포함하는 SPT15m6 클론을 얻었다. 본 발명자들은 발현 모듈이 기능하는 지 여부를 테스트하기 위해 상기 돌연변이체를 이용하였다. SPT15m6(723 bp)의 0RF 를 SPT15_S(S6) 및 SPT15-AS(AS6) 프라이머 세트를 이용하여 증폭하여 pScDAL 의 £ccRI 및 BaiMl 로 클로닝하였다 (pScDAL-SPT15m6). 두 개의 모듈을 포함하는 부위의 크기는 2653 bp였다.
이후， 본 발명자들은 지놈 상의 SPT15 유전자 위치에 타겟팅된 통합을 위해 이용될 수 있는 DNA 제조방법으로 2 가지 선택사항을 가진다. 첫 번째는 URA3-블라스터와 유사하게 타겟팅된 위치로 추론된 서열 (일반적으로 >65 bp)을 포함하는 재조합-가능한 (recombination- competent) 프라이머들로 2 개의 모들을 포함하는 부위를 증폭하여 약 2.8 kb 의 단편을 제조하는 것이다. 두 번째는 업스트림 및 다운스트림 타겟 DNA 단편 (일반적으로 >200 bp)이 각각 발현 모들의 앞 0 wl 과 사이) 및 URA3 절단 모들 (5adl 와 5acl 의 사이)에 클로닝된 플라스미드를 제조하는 것이다 (참조: 도 1A). 상기 플라스미드를 박테리아에서 증폭한 후， 통합을 위해 Kpn\과 5acl으로 선형화시킨다.
예상된 약 2.8 kb 의 단편을 증폭시키는 것이 어려웠기 때문에， 첫 번째 선택사항은 배제되었다. 두 번째 방법을 테스트하기 위해， 업스트림 타겟 DNA 단편 ( 'UP' )이 SPT15 0RF 의 개시 코돈의 업스트림 419-179 bp 서열을 위해 SPT15UP-S(S7) 및 SPT15UP-AS(AS7) 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후, Kpn\ 과 ?σΙ 으로 절단하여 pScDAL-SPT15m6 로 클로닝하였다 (PScDAL-SPT15m6U). 다운스트림 타겟 DNA 단편 ( 'DOWN' )이 SPT15 0RF 의 종결 코돈의 다운스트림 183-415 bp 서열을 위해 고안된 SPT15D0丽 -S(S8) 및 SPT15D0WN-AS(AS8) 프라이머 세트를 이용하여 증폭된 후， 와 으로 절단하여 pScDAL— SPT15m6U로 클로닝하였다 (pScDAL-
SPT15m6UD) . pScDAL-SPT15m6UD 및 대조군으로서 pScDAL-SPT15m6 를 Kpnl 과 &d 으로 선형화시켰다. 삽입체 (insert) 및 pBluescript 백본의 흔합물을 페놀 /클로로포름 추출로 깨끗하게 한 후， 효모 형질전환에 이용하였다.
S. 세레비지에 스트레인인 BY4741 을 형질전환 수용세포 (recipient)로 이용하였다. 형질전환된 세포를 필요한 우라실이 결핍된 영양성분으로 보층된 SD 배지 (SD-ura)에서 선택하였다. 형질전환 효율 (yield)는 pScDAL-SPT15m6UD 에서 약 20 cfu///g이었고， pScDAL— SPT15m6에서는 2-3 cf u/ g이었다 .
다음으로， 본 발명자들은 'UP' 단편의 업스트림 및 'DOWN' 단편의 다운스트림 지놈 서열로부터 추론된 프라이머들 (각각， S9 및 AS9 프라이머)을 포함하는 다양한 프라이머들을 이용한 PCR 분석을 통해 통합 후 지놈 구조 (organization)를 결정하였다 (표 1 및 도 2의 아래쪽 패널). 【표 11
본 연구에서 이용된 프라이머들.
Figure imgf000017_0001
STP15-S S6 GAATTCTGAGATGGCCGATGAGGAACGTT
STP15-AS AS6 GGATCCTCACATTTTTCTAAATTCACTTAG
SPT15UP-S S7 GGTACCCTGATTCCCCTCTGATAGCTGAG
SPT15UP— AS AS7 CTCGAGCACGTCCOTGITTACTCTTACC
SPT15DN-S S8 CCGCGGCATAGCATATCTGGTGGATCGTC
SPT15DN— AS AS8 GAGCTCGTTCACCnCCTCTGTAGGAAGC
Conf irml S9 CATGAGGCCATAATACTGCTTCAACCC
Conf i rm2 AS9 CATCACCAGCGAGTTCGCCGGTGAC
재조합이 도 2 에 기 재된 단편들에서만 일어나서 중간의 두 모들 구조가 보존된다면， S9/AS1 , S9/AS2 , S3/AS9 및 S4/AS9 프라이머 세트를 포함하는 PCR 산물이 발생될 것이다 . 열 개의 선택된 클론들의 지놈 구조를 분석하였을 때， 예상된 크기의 단편들이 7 개의 클론들에서 증폭되 었다 . PCR 증폭의 프로토타입 패턴 (prototypical pattern)이 도 3A 에 제시되어 있다. 이들 데이터는 약 70 )의 효율 (probabi l i ty)로 SPT15 유전자 주위에 선형화된 pScDAL-SPT15m6UD 의 통합을 보여준다 . 나머지 3 개의 클론들은 잘못된 통합을 나타내는데， 이는 pScDAL-SPT15m6 의 통합 빈도와 일치하는 비율이다 . 놀랍게도 , S9/AS2 로 증폭된 일곱 개의 적합한 클론들의 발현 모들을 시뭔싱 한 결과， 도 2 의 중간 패널에서 보여지듯이 이들 중 4 개의 클론이 동일한 지놈 구조를 나타낸 반면에 나머지 3 개의 클론에서는 SPT15 터 미네이터가 ADH1 터미네이터로 대체되 었다. 이는 선형화된 pScDAL-SPT15m6UD 의 업스트림 통합이 상기 4 개의 클론에서 'UP' 에서 일어났으며， 상기 3 개의 클론에서는 135 번째 아미노산과 SPT15 의 종결 코돈 간에 일어났다는 것을 의미한다. 따라서， SPT15wt 0RF 의 SPT15m6 0RF 로의 대체 가능성은 4 였다 . 상기 4 개의 클론들 중 하나는 과다발현을 위한 계획 된 구조를 가진 iBY4741-SPT15m6 였다 .
본 발명자들은 SPT15m6 의 발현을 단백질 레벨에서 조사함으로써 발현 모들 기능에 대해서 추가적으로 조사하였다 . 부모 스트레인인 BY4741 및 iBY4741-SPT15m6 으로부터 제조된 총 세포 추출물을 항 -SPT15 및 항 -액틴 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz , CA, USA)로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 도 3B 에서 볼 수 있듯이， 통합체 ( integrant )에서의 SPT15ra6 단백질의 레벨이 대조군의 레벨보다 훨씬 더 높았다. URA3 절단모들의 테스팅
상술한 바와 같이， 본 발명자들은 통합된 URA3 절단 모들이 수용세포의 우라실 영양요구성을 없앤다는 것을 보였다. 연속적인 0RF 대체를 위해， 터미네이터 반복부위 간의 상동 상호작용을 통해 단일 카피의 터미네이터의 제거하는 F0A 선택 압력 하에서 상기 URA3 유전자가 절단된다. 본 발명자들은 우리딘 및 F0A 를 포함하는 SD-ura 배지에서 rBY4741- SPT15m6 를 배양시켜 iBY4741-SPT15m6-ura3A로 명명된 F0A-저항성 스트레인을 얻었다. 상기 스트레인은 우라실 영양요구성을 나타냈다 (결과를 보이지 않음). 상기 스트레인으로부터 지놈 DNA 를 제조한 후， URA3 절단 후 지놈 구조를 조사하기 위해 지정된 프라이머 세트를 이용하여 PCR 을 실시하였다 (도 3C). 발현 모들은 변화가 없었다 (레인 1 및 레인 2). 단일 카피의 URA3 터미네이터가 존재하였다 (레인 3). 발현 모들과 URA3 터미네이터 (레인 4)， 및 URA3 터미네이터와 'DOWN' 서열 (레인 5) 간의 연결은 변화되지 않았다. 마지막으로， URA3 유전자의 프로모터 및 0RF 를 포함하는 단편이 증폭되지 않았는데 (레인 6)， 이는 제거되지 않았다면 S3 및 AS9 프라이머 세트로 증폭되었을 것이다 (도 3A 의 레인 3). 상술한 데이터는 URA3 유전자가 터미네이터 반복부위 간의 상호작용을 통해 절단되었음을 나타낸다.
결론적으로， 본 발명자들은 TDH3 프로모터 조절 하의 SPT15 의 돌연변이된 형태가 URA3 마커의 공동 -통합 (co-integration)을 통해 우라실 원시영양성 (prototrophy)을 가지도록 고유의 SPT15 0RF 를 대체한 스트레인을 제조하였다. 본 발명의 스트레인은 URA3 의 연속적인 절단을 통해 또 다른 유전자의 0RF 대체를 가능하게 한다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바， 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서， 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 둥가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Figure imgf000020_0001
w,,,kbl E. X . Choi K; Finer- ¾ws<: · Gaete.iis711ΓM:
ppTO po acwhrt t:oass!trtusos to 1:s U oli>l¾Tlimin fin:1RA3f:.- w Alni Moriya, H. , Shimizu- Yoshida, Y. , and H. Kitano. 2006. In vivo robustness analysis of cell division cycle genes in Saccharomyces cerevisiae. PLoS Genetics 2: 1034-1045.
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Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
(a) 목적 유전자의 플랭킹 서열 (flanking sequence)과 상동적인 서열; (b) ( i ) 멀티 클로닝 위치 (multiple cloning site, MCS), (ii) ScTDH3 ( Saccharomyces cerevisiae g 1 ycer a 1 dehyde-3-phosphat e dehydrogenase 3)의 프로모터 및 (iii) ScADHK alcohol dehydrogenase 1)의 터미네이터 (terminator)를 포함하는 발현 모들 (expression module); 및 (c) ( i ) ScURA3의 프로모터， (ii) 상기 프로모터에 작동적으로 연결된 (operably linked) ScURA3의 0RF(open reading frame) 및 (iii) 상기 프로모터 및 0RF 양쪽 말단에 결합된 ScURA3의 터미네이터 (terminator)를 포함하는 절단 모듈 (URA3 excision module)을 포함하는 효모 발현백터 (yeast expression vector).
【청구항 2]
제 1 항에 있어서， 상기 백터는 Ura 효모 스트레인에 적용되는 것을 특징으로 하는 효모 발현백터.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 백터는 목적 유전자 단편의 플탱킹 서열 (flanking sequence)과 상동적인 서열과 염색체 상의 목적 유전자 단편 간의 상동재조합 (homologous recombinat ion)을 통해 염색체 상으로 통합되는 것을 특징으로 하는 효모 발현백터.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 백터는 상동 재조합 후 URA3 절단을 통해
Ura 효모 스트레인으로 전환시킨 후 신규 목적 유전자 단편을 연속적으로 염색체로 도입할 수 있는 것을 특징으로 하는 효모 발현백터.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 URA3 절단은 5-F0A(5-fluoroorotic acid) 처리에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 효모 발현백터.
【청구항 6]
제 1 항에 있어서， 상기 효모는 사카로마이세스 종 Saccharomyces spp.), 조人 1"^]·로 o]세스 ( Schizosaccharomyces spp.), 피 ^1όΤ" ^ Pichia spp.), 파피아 종 (/¾///a spp.), 클루이베로미세스 종 Kluyveromyces spp.), 칸디다 ^Candida spp.), 탈라로미세스 종 Talaromyces spp.), 브레타노미세스 ^ Brettanomyces spp.), 파키솔렌 종 Pachysolen spp.) 또는 데바리오미세스 ^ Debaryomyces spp.) 인 것을 특징으로 하는 효모 발현백터 .
【청구항 7]
제 6 항에 있어서， 상기 효모는 사카로마이세스 종인 것을 특징으로 하는 효모 발현백터.
【청구항 8】
다음의 단계를 포함하는 효모에서 하나 이상의 목적 뉴클레오타이드 서열들의 연속적 형질전환 방법 :
(a) 제 1 항의 백터의 MCSOnultiple cloning site)에 목적 뉴클레오타이드 서열을 클로닝하는 단계 ;
(b) 상기 백터를 효모에 형질전환시키는 단계;
(c) 상기 형질전환된 효모에서 URA3 절단을 유도하는 단계; 및
(d) 상기 단계 (a) 및 (b)를 다른 목적 뉴클레오타이드 서열로 실시하는 단계 .
【청구항 9】
제 8 항에 있어서， 상기 형질전환은 사카로마이세스 종 ( Saccharomyces spp . ) , 시조入 ]· 7] "로1 ^l" ό1 ^fl스 종 ( Schi zosaccharomyces spp.), 피키아 Pichia spp.), 파피아 종 0 ///a spp.), 클루이베로미세스 종 Khiyveromyces spp.), 칸디다 종 {Candida spp.), 탈라로미세스 ^ Talaromyces spp.), 브레타노미세스 종 Brettanomyces spp.), 파키솔렌 ^ Pachysolen spp.) 및 데바리오미세스 종 Debaryomyces spp.)으로 구성된 군으로부터 선택된 효모 스트레인에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 10]
제 9 항에 있어서， 상기 형질전환은 사카로마이세스 종에서 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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