KR19990033548A

KR19990033548A - 한세눌라 폴리모르파용 다중병렬도입형 발현벡터

Info

Publication number: KR19990033548A
Application number: KR1019970054926A
Authority: KR
Inventors: 최의성; 강현아; 이상기; 손정훈
Original assignee: 박원훈; 한국과학기술연구원
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1997-10-24
Publication date: 1999-05-15
Also published as: KR100256023B1

Abstract

본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 염색체에 외래 유전자를 다중으로 도입하는 다중병렬도입형 발현벡터에 관한 것으로, 구체적으로는 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터에 관한 것이다.

Description

한세눌라 폴리모르파용 다중병렬도입형 발현벡터

본 발명은 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)의 염색체에 외래 유전자를 다중으로 도입하는 다중병렬도입형 발현 벡터에 관한 것으로, 구체적으로는 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터에 관한 것이다.

한세눌라 폴리모르파는 메탄올자화 효모 균주로, 강력한 프로모터 시스템을 가지고 있으면서 외래 유전자를 염색체에 다중으로 도입할 수 있어 재조합 단백질의 대량생산에 유용한 미생물이다(Glesson et al., Yeast, 4, 1(1988); Janowicz et al. Yeast, 7, 431(1991); Romanos et al., Yeast, 8, 423(1992); Faber et al., Yeast, 11, 1331(1995)).

외래 유전자를 사용한 한세눌라 폴리모르파의 형질전환시, 외래 유전자가 염색체내에 다중병렬로 도입되는 현상(multiple tandom integration)은 다수 보고되어 있으나(Roggenkamp et al., Mol., Gen. Genet., 202, 302(1986); Janowicz et al., 상기문헌; Gellissen et al., TIBTECH., 10, 413(1992); Faber et al., 상기 문헌 참조), 이 경우 다중병렬도입의 빈도가 매우 낮아 형질전환체의 선별에 많은 시간과 노력이 요구되는 단점이 있었다.

한편, 한세눌라 폴리모르파에서는 자기복제서열을 포함하는 플라스미드가 형질전환을 통하여 도입되었을 때, 일시적으로 플라스미드 상태로 염색체 DNA와 별개로 복제되어 유지되나, 이러한 플라스미드를 포함하는 형질전환체는 안정성이 매우 낮다. 그렇지만, 형질전환체를 선택 배지에서 비선택적 배지로 옮겨 수세대 동안 계대배양하는 안정화 과정을 거치면 자기 복제중인 플라스미드가 염색체내로 도입되어 매우 안정하게 된다(Roggenkamp et al., Mol., Gen. Genet., 202, 302(1986)). 이러한 안정화 과정동안, 어떤 세포들은 그들의 염색체 DNA내로 병렬형으로 다중 도입된 다수 카피의 이중 유전자를 획득하게 된다.

도입된 다중병렬형 유전자를 갖는 세포를 얻을 확률은 형질전환 플라스미드의 자기복제서열의 자기 복제 능력이 증가할 수록 커지지만 (Roggenkamp et al., EP 0374282), 일반적으로 매우 낮다. 따라서, 도입된 다중병렬형 유전자를 갖는 세포를 선별하기 위해서는 시간이 많이 소요되는 지루한 선별과정이 요구되며, 이 때문에 도입된 유전자의 카피수에 따라 세포에 다양한 정도의 내성을 부여하는 지배적 선별 마커(dominant selection marker)가 사용되어 왔다.

지배적 선별 마커의 예로는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)로부터 유래된 구리-내성 CUPI 유전자(Fogel and Welch, Proc. Nat1. Acad. Sci. U.S.A., 79, 5342(1982)), 마우스 cDNA로부터 유래된 메토트랙세이트-내성 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(Zhu et al., Bio/Technol., 3, 451(1985)), Tn903으로부터 유래된 G418-내성 아미노글리코시드-3-포스포트랜스퍼레이즈(APH) 유전자(Jamenez and Davies, Nature, 287, 869(1980)), 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터 유래된 하이그로마이신 B-내성 hph 유전자(Gritz and Davies, Gene, 25, 178(1983)) 및 사카로마이세스 세레비지에로부터 유래된 설포메투론 메틸-내성 SMRI 유전자(Casey et al., J. Ind. Brew., 94, 93 (1988))가 있다. 상술한 지배적 선별 마커들중 APH 유전자가 다양한 효모 숙주에서 가장 빈번하게 사용되고 있다. 그렇지만, 대장균으로부터 유래된 프로모터는 효모에서 적절하게 기능하지 못하므로, 대장균 유래의 APH 유전자의 선택효율을 영양요구성 마커로 얻을 수 있는 선택효율의 약 10%에 불과하였다(Jimenes and Davies, 상기 문헌 참조; Webster and Dickson, Gene, 26, 243(1983)). 대장균 유래의 프로모터 대신에 사카로마이세스 세레비지에 유래의 PGK 프로모터를 사용하면 APH 발현 효율을 영향요구성 마커와 동등한 수준으로 올릴 수 있다(Hadfield et al., Curr. Genet., 18, 303(1990)). APH 유전자 마커가 MOX 프로모터에 연결되어 한세눌라 폴리모르파에서 사용될 때, 형질전환된 세포는 20㎎/㎖의 G418 농도에서도 생존한다고 보고되었다(Glesson and Sudbery, Yeast, 4, 1(1988)). 또한, APH 유전자 마커가 사카로마이세스 세레비지에의 알코올 탈수소효소 I(ADHI)의 프로모터에 연결되어 다중 카피의 이종 유전자를 포함하는 세포를 선택하는 공정에 사용된 것으로 보고되었다(Janowicz et al., Yeast, 7, 431(1991)). 그러나, 항생제 내성 유전자를 선별 유전자로 이용하여 형질전환한 직후 형질전환체를 고농도의 항생제 배지에서 선별하면 도입된 플라스미드가 카피수가 낮고 불안정한 상태이어서 형질전환체는 항생제에 대하여 내성을 가지기 어려우며 결국 형질전환체의 콜로니를 얻기 어렵다는 문제점이 있다.

한세눌라 폴리모르파의 MOX 및 FMDH 프로모터는 메탄올리 탄소원으로 사용될 때에만 발현이 유도되는 조절 프로모터이다(Gellisen et al., Trends Biotechnol., 10 , 413(1992)). 따라서, 이 프로모터들이 외래 유전자와 함께 사용되면, 재조합 단백질의 발현 단계와 별도로 세포 배양 단계를 조절할 수 있다. 이러한 특징은 발현된 재조합 단백질이 세포성장을 억제할 때에는 유용하나, 임의의 탄소원에 의해서도 유도될 수 있는 강한 구성적 프로모터를 사용하는 것이 더욱 편리하다. 그러한 프로모터로서는 사카로마이세스 세레비지에, 피키아 패스토리스 등의 효모에서 이종 단백질의 발현을 위해 널리 사용되어 온 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH) 유전자가 있다(Kniskern et al., Gene, 46, 135(1986); Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384 (1985); Hallewell et al., Bio/Technol., 5, 363 (1987); Rosenberg et al., Methods in Enzymol., 185, 341 (1990); Waterham et al., Gene, 186, 37 (1997)).

상술한 바와 같이, 한세눌라 폴리모르파에서 외래 유전자의 다중병렬도입의 빈도가 높고 형질전환체의 선별이 용이한 다중병렬도입용 발현 벡터 및 이를 이용하여 형질전환된 세포들을 용이하게 선별할 수 있는 방법이 절실히 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열 HARS36, TEL188, TEL135 및 TEL61, 및 GAPDH 프로모터의 서열을 밝혀내어 본 출원과 동일자로 특허출원하였으며, 이 다중병렬도입형 자기복제서열 및 GAPDH 프로모터를 사용하여 다중병렬도입의 빈도가 높고 형질전환체의 선별이 용이한 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입용 발현 벡터 및 이 벡터를 포함하는 형질전환체를 용이하게 선별하는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 외래 유전자의 다중병렬도입의 빈도가 높고 형질전환체의 선별이 용이한 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입용 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 형질전환체를 용이하게 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pGAP7121, pGAP7123 및 pGAP7131의 제한효소 지도이다.

도 2는 플라스미드 pUC-4K, pBLT188 및 pGL418의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 3은 플라스미드 pBLT188 및 pGLG578의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 4a, 4b 및 4c는 플라스미드 pGL418, pGLG578 및 pGLG61을 각각 함유하는 G418-내성 형질전환체에서의 도입 유전자 카피수를 비교하는 서던 블럿팅 분석의 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 플라스미드 pGLG578, pGLG356, pGLG292, pGLG251, pGLG146 및 pGLG61의 구조를 도식적으로 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치한, 목적 외래 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오디트의 하류에 위치한 터미네이터를 포함하는 단백질 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있으며, 이 경우, 목적 단백질을 발현하는 세포는 상기 선별 카세트의 발현 단백질에 의해 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 벡터에 사용할 수 있는 한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열은, 바람직하게는, 하기 서열 1, 2, 3 및 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 HARS36, TEL188, TEL135 및 TEL61이다.

[서열 1]

[서열 2]

[서열 3]

[서열 4]

다중병렬도입형 자기복제서열은 외래 유전자를 포함하는 벡터를 한세눌라 폴리모르파 염색체내로 복수카피로 삽입되게 하여, 본 발명의 벡터의 형질전환체를 안정하게 한다.

본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 영양요구성 선별 유전자는, 예를 들면, 효모(예. 한세눌라 폴리모르파 및 사카로마이세스 세레비지에)의 루이신 합성 유전자(LUE2) 및 우라실 합성 유전자(URA3)와 같은 영양소 합성 관련 유전자, 바람직하게는 LEU2일 수 있다. 지배적 선별 유전자는 항생제 내성을 부여하는 유전자로서, 예를 들면, 대장균 트랜스포손(transposon) Tn903 또는 Tn5로부터 유래된 아미노글리코시드-3-포스포트랜스퍼레이즈(aminoglycoside-3-phospho transferase, APH)이다.

한편, 프로모터는 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자의 프로모터 또는 이의 단편, 예를 들어, 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)로부터 유래된 하기서열 5를 갖는 GAPDH 프로모터 또는 하기 서열 5의 219번-796번(GAP578), 441번-796번(GAP356), 505번-796번(GAP292), 546번-796번(GAP251), 651번-796번(GAP146) 및 736번-796번(GAP61) 뉴클레오티드로 이루어진 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터의 단편을 사용할 수 있다.

[서열 5]

본 발명의 벡터의 발현 카세트에 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 GAPDH 프로모터 또는 그의 단편이 사용될 때, 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드는 상기 프로모터의 3'-말단 후에 단독으로 삽입되거나, 목적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)으로부터 유래된 GAPDH 유전자 또는 그의 단편과 융합된 융합 폴리뉴클레오티드의 형태로 벡터에 삽입될 수 있다.

본 발명의 가장 바람직한 벡터는 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)으로부터 유래된 다중병렬도입형 자기복제서열, 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)으로부터 유래된 GAPDH 프로모터와 APH 유전자의 융합유전자, 및 LEU2 유전자로 구성된 선별 카세트를 포함한다. GAPDH 프로모터의 크기에 따라, 형질전환된 유전자의 카피수가 달라질 수 있고, 유전자의 카피수는 GAP61이 사용될 경우 50 카피까지 증가된다. 또한, 배지중 항생제 G418의 농도를 0.5 내지 20㎎/㎖의 범위로 조절함으로써 형질전환된 유전자의 카피수를 1내지 수백의 범위내로 조정할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터를 사용하여 생산할 수 있는 목적 단백질의 예로서는, 히루딘, 인간 표피 성장인자(hEGF), 인간 혈청 알부민(HSA), 프로유로키나제, 유로키나제, 인간 α₁-안티트립신, B형 간염 표면항원(HBsAg), 리포코틴, 인터페론, 이소자임, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 조직 플라스미노겐 활성소자, 인슐린, 인자 VIII, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 칼시토닌, 인슐린-유사 성장인자, 성장 호르몬 등이 포함될 수 있다.

본 발명의 벡터는 강한 자기복제서열의 높은 형질전환 효율로 인해 다수의 외래 유전자 카피가 숙주 세포의 염색체 내로 도입될 수 있다는 점 및 항생제의 용량에 의존적인 지배적 선별 유전자가 존재하므로 외래 유전자가 다중으로 도입된 형질전환체가 용이하게 선별될 수 있다는 점에서 유리하다.

본 발명의 벡터는 외래 유전자의 발현 또는 형질전환체의 선별을 위해 사용될 수 있으며, 세균, 효모, 진균 및 동물 세포와 같은 다른 공지의 벡터들과 연결하여 사용할 수 있다.

한세눌라 폴리모르파 세포는 통상적인 방법, 예를 들어, 염화 리튬-DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991))에 따라 본 발명의 발현 벡터에 의해 형질전환될 수 있다. 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 세포는 균주 및 사용된 벡터를 고려하여 선택된 조건하에 적당한 배지에서 배양되고, 목적 단백질은 효모 세포를 수집하고 그로부터 목적 단백질을 정제하거나 벡터에 분비 시그날 서열이 사용된 경우에는 배양 배지로부터 분비된 단백질을 정제함으로써 얻을 수 있다.

또한, 본 발명은 (가) 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고, (나) 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 최소 배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하고, (다) 선별된 형질전환체를 복합 배지에서 반복 배양하여 형질전환체내의 벡터를 안정화시키는 단계, 및 (라) 안정화된 형질전환체를 항생제를 포함하는 선택 배지에서 배양하여 항생제에 내성을 갖는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는, 다수 카피의 도입된 외래 유전자를 갖는 한세눌라 폴리모르파 형질전환체의 선별 방법을 제공한다.

상기 단계 (나)에서, 최소 배지는 통상적인 최소 배지중의 하나일 수 있으며, 바람직하게는 0.67% 아미노산 결핍 효모 질소 기질, 2% 글루코즈 및 2% 박토아가를 포함한다.

단계 (다)에서 벡터의 안정화를 위해서는, 형질전환체를 10 내지 100 세대, 바람직하게는, 50 세대까지 계대배양시킬 수 있다. 복합배지는 증류수 1ℓ당 1 내지 50g, 바람직하게는 10g의 효모 추출물, 1 내지 60g, 바람직하게는, 20g의 박토-펩톤 및 1 내지 50g, 바람직하게는, 20g의 글루코즈 또는 글리세롤을 포함할 수 있다.

단계 (라)에서, 선택 배지는 최소 배지 또는 복합 배지에 항생제를 포함하는 것일 수 있다. 예시적인 선택 배지는 0.5-20㎎/㎖, 바람직하게는, 4㎎/㎖의 항생제를 포함할 수 있다. 항생제는 벡터에 사용된 지배적 선별 마커의 종류에 따라 선택되며, 예를 들어, APH 유전자가 지배적 선별 마커로 사용된 경우에는 G418을 함유하는 선택 배지가 사용된다. 또한, 항생제의 농도가 증가함에 따라 선별된 형질전환체 내에 포함된 플라스미드의 카피수도 증가하지만, 선택 배지에서 생존한 형질전환체의 수는 감소한다.

본 발명의 선별 방법은 단시간에 적은 노력으로 다수 카피의 도입된 외래 전자를 갖는 한세눌라 폴리모르파 형질전환체를 선별할 수 있다는 장점을 가지고 있다.

이하 본 발명을 참조예 및 실시예에 의해 상세히 설명하나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참조예:

(1) 미생물의 형질전환

한세눌라 폴리모르파의 형질전환은 초산 리튬-DMSO 법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)에 따라 실시하였다.

(2) 서던 블럿팅 분석(Southern blotting analysis)

서던 블럿팅 분석은 42℃ 하이브리디제이션 오븐(hybridization oven, Hybaid, 영국)에서 하이브리디제이션 용액(5×SSC, 0.1% N-라우로일 사코신(lauroyl sarcosine), 0.02% SDS, 5% 블록킹 시약, 50% 포름아미드)을 이용하여 서던 방법(Southern, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503(1975)에 따라 실시하였다. 프로브는 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트(Non-radioactive DNA Labeling and Detection Kit, Boehringer Mannheim, 독일)를 사용하여 제조하였다.

(3) 도입된 유전자의 카피수 결정

도입된 유전자의 카피수는 서던 덴시토그램(Southern densitogram)을 이미지분석 시스템(Image analysis sysem, Bio-Rad, Model GS-700)을 이용하여 측정하였다.

(4) 뉴클레오티드 서열 결정

유전자의 뉴클레오티드 서열은 ABI 서열분석 키트(ABI Prism Dye Terminatior Cycle Sequencing Ready Reaction Kit, Perkin-Elmer Cetus, 미국)와 DNA 서열분석기(DNA Sequencer, Model 373A, Applied Biosystems, 미국)를 이용하여 결정하였다.

[실시예 1]

한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자

시카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)의 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)의 염기서열(Holland et al., J. Biol. Chem., 254, 9839(1979)에 근거하여, 하기 서열 6 및 7을 갖는 합성 프라이머 1 및 2를 제조하였다.

[서열 6]

5'-AAGCTTACCA GTTCTCACAC GG-3'

[서열 7]

5'-AAGCTTACAA TCAATGAATC GA-3'

상기 합성 프라이머 1 및 2를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 의해, 사카로마이세스 세레비지에 2805(R. B. Wickner, NIH, 미국)의 염색체 DNA로부터 사카로마이세스 세레비지에의 GAPDH 유전자(Sc-GAPDH 유전자)를 분리하였다.

분리한 Sc-GAPDH 유전자를 플라스미드 pT7-블루(Blue) T-벡터(Novagen 사)에 삽입하여, Sc-GAPDH 유전자를 포함하는 플라스미드 pT7-SGAP2를 제조하였다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 영양요구성 변이균주인 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(NPO Biotechnologia, 모스크바, 러시아)의 염색체 DNA를 분리한 후 제한효소 BamHI으로 절단하였다. 상기에서 제조된 플라스미드 pT7-SGAP2를 제한효소 XbaI로 절단하였다. 절단된 염색체 DNA를 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 플라스미드 pT7-SGAP2를 프로브로하여 서던 블럿팅을 실시한 결과, 약 14kb 크기의 밴드를 얻었다.

한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)의 염색체 DNA를 제한효소 BamHI로 절단한 후; 12-16 kb의 DNA 절편들을 분리하고, 이 DNA 절편들을 제한효소 BamHI로 절단한 플라스미드 p블루스크립트(pBluescript) KS+(Stratagen Co.)에 삽입하여 게놈 라이브러리를 제조하였다.

이 게놈 라이브러리로 대장균을 형질전환시켜 1×10⁴개의 형질전환체를 얻었다. 형질전환체로부터 DNA를 분리한 후, DIG로 표지된 Sc-GAPDH 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하여, 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 유전자(Hp-GAPDH 유전자)를 포함하는 플라스미드 pGAP7121을 선별하였다. 플라스미드 pGAP7121의 제한효소 지도는 도 1에 나타나 있다.

플라스미드 pGAP7121을 제한요소 StuI으로 절단하여 Hp-GAPDH 유전자를 포함하는 DNA 절편을 얻고, 이 DNA 절편을 제한효소 EcoRV로 절단된 플라스미드 p블루스크립트 KS+에 삽입하여 플라스미드 pGAP7123을 얻었다.

한편, 플라스미드 pGAP7121을 제한효소 XbaI으로 절단하여 Hp-GAPDH 유전자를 포함하는 다른 DNA 절편을 얻고, 이 DNA 절편을 제한효소 XbaI로 절단된 플라스미드 p블루스크립트 KS+ 삽입하여 플라스미드 pGAP7131을 얻었다.

플라스미드 pGAP7131에 포함된 Hp-GAPDH 유전자의 뉴클레오티드 서열은 참조예에 기재된 방법에 따라 결정하였으며, 상세한 서열은 상기 서열 5에 나타나 있다.

또한, Hp-GAPDH 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유추되는 아미노산 서열은 Sc-GAPDH와 비교할 때 72%의 높은 서열 상동성을 가진 것으로 확인되었다.

[실시예 2]

Hp-GAPDH 프로모터의 획득

실시예 1에서 제조한 플라스미드 pGAP7123을 주형으로 하고 하기 서열 8 및 9의 합성 프라이머 3 및 4를 이용한 중합효소 연쇄 반응을 실시하여, Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 798 bp 크기의 DNA 절편을 얻었다.

[서열 8]

5'-GAATTCGAAT ATTGTTTCTA TATTATC-3'

[서열 9]

5'-GTAAAACGAC GGCCAGT-3'

[실시예 3]

플라스미드 pGLG578의 제작

루이신 영양요구성 및 항생제 G418에 대한 내성을 선별표지로 하고 한세눌라 폴리모르파 다중병렬도입형 자기복제서열 TEL188을 포함하는 플라스미드 pGLG578을 다음과 같이 제작하였다.

(단계 1) 플라스미드 pBLT188의 제작

LEU2 유전자를 포함하는 플라스미드 pCE36(본 출원인의 동일자 출원 제 97-_______ 호 참조, 기탁번호 : KCTC 0352BP, 기탁일 : 1997년 7월 24일)을 BamHI 및 XbaI으로 절단하여 LEU2 유전자를 포함하는 DNA 절편을 얻었다. 상기 LEU2 유전자를 포함하는 DNA 절편을 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 자기복제서열 TEL188을 포함하는 플라스미드 pBKS-TEL188(본 출원인의 동일자 출원 제 97-______ 호 참조, 기탁번호 : KCTC 0355BP, 기탁일 : 1997년 7월 24일)을 BamHI - XbaI 위치에 삽입하여, 자기복제서열 TEL188 및 LEU2 유전자를 포함하는 플라스미드 pBLT188을 제작하였다(도 2).

(단계 2) 플라스미드 pGL418의 제작

대장균 유래의 프로모터하에 위치하는 대장균 트랜스포손 Tn903 (E. colitransposon Tn903) 유래의 APH 유전자를 한세눌라 폴리모르파에서 선별표지로 사용할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 이 유전자를 한세눌라 폴리모르파에 도입하고 APH 유전자의 발현여부를 다음과 같이 실험하였다.

APH 유전자를 포함하는 플라스미드 pUC-4K(Pharmacia, 스웨덴)를 PstI으로 처리하여 얻은 DNA 절편을 PstI으로 절단한 플라스미드 pBLT188에 삽입하여, 자기복제서열 TEL188, LEU2 유전자 및 APH 유전자를 포함하는 플라스미드 pGL418을 제조하였다(도 2).

(단계 3) 플라스미드 pGLG578의 제작

실시예 2에서 얻은 Hp-GAPDH 프로모터 DNA를 EocRV로 절단한 플라스미드 pT7-Blue T-벡터(Novagen사)에 삽입하여, 한세눌라 폴리모르파 GAPDH 유전자의 프로모터를 포함하는 플라스미드 pT7-HGAP를 제조하였다.

또한, 대장균 트랜스포손 Tn903 유래의 APH 유전자와 한세눌라 폴리모르파 GAPDH 프로모터의 연결을 용이하게 하기 위하여, 플라스미드 pUC-4K(Pharmacia사)를 주형으로 하고 하기 서열 9 및 10의 합성 프라이머 4 및 5를 이용한 중합효소 연쇄 반응에 의해 APH 유전자의 cDNA를 얻고, 이를 EcoRV로 절단한 플라스미드 pT7-Blue T- 벡터(Novagen사)에 삽입하여 플라스미드 pT7-G418을 제작하였다.

[서열 9]

5'-GTAAAACGAC GGCCAGT-3'

[서열 10]

5'-GAATTCGTTA TGAGCCATAT TCAA-3'

다음으로 플라스미드 pT7-G418을 EcoRI 및 PstI으로 절단하여 APH 유전자인 약 1kb의 DNA 절편을 얻고, 상기에서 제작된 플라스미드 pT7-HGAP를 XbaI 및 EcoRI으로 절단하여 Hp-GAPDH 프로모터인 578bp의 DNA 절편을 얻었다. 이 두 DNA 절편을 XbaI 및 PstI으로 절단된 플라스미드 pBLT188에 동시에 삽입하여, Hp-GAPDH 프로모터와 APH 유전자의 융합 유전자를 포함하는 플라스미드 pGLG578을 제조하였다(도 3).

[실시예 4]

한세눌라 폴리모르파에서 대장균 APH 프로모터의 작동 여부 확인

플라스미드 pGL418 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 영양요구성 변이균주인 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)(NPO Biotechnologia, 모스크바, 러시아)에 형질전환한 후 형질전환체를 최소 배지에서 배양하여 1차 선별하였다. 플라스미드 pGL418의 형질전환 효율은 2×10³형질전환체 / ㎍ DNA이었다. 1차 선별된 형질전환체를 합한 후 YPD 배지 50㎖에 접종한 후 50 세대이상까지 계대배양하여 안정화하였다. 배양중인 형질전환체를 최소 배지에 도말하여 세포간의 성장속도가 일정한 것을 안정화된 형질전환체로 판정하였다. 안정화된 형질전환체 1×10⁵세포를 YPD 배지 및 최소 배지에 도말한 후 1주일간 배양하여 성장한 세포군락의 수를 측정하여 50 세대후의 안정화율을 결정하였다. 한편, 안정화된 형질전환체 1×10⁵세포를 0, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0 또는 4.0 ㎎/㎖ 농도의 항생제 G418을 포함하는 최소배지에 각각 도말한 후 1주일간 배양하여 G418 내성균주의 수를 측정하였다. 또한, 상기 실시예 3의 (단계 1)에서 제작된 플라스미드 pBLT188을 대조구로 사용하여 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과는 하기의 표 1과 같다.

[표 1]

대조구 플라스미드 pBLT188을 포함하는 형질전환체는 항생제 G418 0.5㎎/㎖의 농도에서는 생존하지 못하였으나, 플라스미드 pGL418을 포함하는 형질전환체는 항생제 G418 4㎎/㎖의 농도에서도 생존하였고, 1.0㎎/㎖의 농도에서는 성장속도가 매우 느려 1주일후에 군락을 형성하였다.

플라스미드 pGL418을 포함하는 항생제 G418 내성 형질전환체로부터 DNA를 분리하여 제한효소 SmaI으로 절단하고, 디곡시게닌(DIG)으로 표지된 LEU2 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿을 실시하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 염색체상에 단일 카피로 존재하는 숙주 자체의 LEU2 유전자는 약 30.0kb 위치에서 밴드로 나타났고, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 LEU2 유전자는 약 1.0kb 위치에서 밴드로 나타나, 숙주 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)가 플라스미드 pGL418로 형질전환되었음을 확인하였다.

또한, G418에 내성을 나타낸 형질전환체중 무작위로 선별한 일부의 형질전환체는 항생제 G418 없이 루이신 선별 표지로만 선별한 대조구에 비하여 LEU2 유전자의 카피수가 증가하였으나, 증가 양상은 항생제 G418 농도와는 무관한 것으로 나타났으며, 그 외의 형질전환체들은 대조구보다 적거나 동일한 카피수로 나타나 자발적인 변이에 의하여 G418 내성을 보였음을 알 수 있었다.

이는 대장균 유래의 프로모터는 한세눌라 폴리모르파에서 제대로 작동하지 못함을 나타내며, 따라서 대장균 유래의 포로모터하에 위치하는 대장균 트랜스포손 Tn903 유래의 APH 유전자 그 자체로는 한세눌라 폴리모르파에서 선별표지로 사용될 수 없음을 나타낸다.

[실시예 5]

Hp-GAPDH와 APH의 융합 유전자에 의한 G418 내성 발현

실시예 3의 (단계 3)에서 제도된 플라스미드 pGLG578을 이용하여 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)를 형질전환시킨 후, 안정화된 형질전환체를 YPD 배지 및 G418을 포함하는 최소배지에서 48시간 동안 배양하는 것을 제외하고는 실시예 4와 동일한 절차를 반복하여, 50 세대 후 안정화율과 G418 내성 균주수를 측정하였다. 이때, 상기 실시예 3의 단계 1 및 2에서 제조된 플라스미드 pBLT188 및 pGL418을 대조구로 사용하여 동일한 실험을 반복하였다.

그 결과는 하기의 표 2와 같다.

[표 2]

대조구 플라스미드 pBLT188 및 pGL418의 형질전환체는 항생제 G418 1.0㎎/㎖의 농도에서는 48 시간동안 성장하지 못하였으나, 플라스미드 pGLG578의 형질전환체는 항생제 G418 4㎎/㎖의 농도에서도 빠르게 성장하였으며 항생제 G418의 농도에 따라 내성의 정도에 차이가 있었다.

즉, Hp-GAPDH 프로모터 대장균 APH 유전자의 융합 유전자는 효율적인 선별표지로 사용할 수 있는 것으로 확인되었다.

플라스미드 pGLG578을 포함하는 형질전환체에서 항생제 G418에 대한 내성과 도입된 유전자의 카피수와의 관계를 확인하기 위하여, 항생제 G418의 농도별로 내성을 가지는 형질전환체를 무작위로 6개씩 선별하여 게놈 DNA를 분리하고 제한효소 XhoI으로 절단한 후, DIG로 표지된 GAPDH 프로모터를 프로브로 사용하여 서던 블럿팅을 실시하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 염색체상에 단일 카피로 존재하는 숙주자체의 GAPDH 프로모터는 약 5.5kb 위치에서 밴드로 나타났고, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 GAPDH 프로모터는 약 0.7kb 위치에서 밴드로 나타났다.

한편, G418 농도에 따른 도입 유전자의 카피수를 측정하기 위해, 도 4b에서 pGLG578을 함유하는 형질전환체의 게놈 DNA를 TE 완충액(10mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5)으로 10배 희석하고, 상기에서와 동일한 프로브를 사용하여 서던 블럿팅 분석을 실시하였다. 도입카피수는 서던 덴시토그램(Southern densitogram)의 시그날 강도를 이미지 분석기(image analyzer)로 분석하여 결정하였다. 그 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다.

[표 3]

즉, 도입된 유전자는 항생제 G418 2㎎/㎖의 농도에서 최대 약 15카피정도로 나타났다. 그러나 항생제 G418 2㎎/㎖이상의 농도에서는 카피수가 증가하지 않았는데, 이는 프로모터가 강력하여 동일한 카피수에서도 항생제 G418 2㎎/㎖ 이상의 농도에서 내성을 보이기 때문인 것으로 사료되었다.

[실시예 6]

결실된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드의 제조

Hp-GAPDH 프로모터를 약화시켜 도입되는 형질전환 플라스미드의 카피수를 증가시키기 위하여, Hp-GAPDH 프로모터를 다음과 같이 결실시켰다.

즉, 실시예 1에서 제조된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드 pGAP7123 20㎍을 NotI으로 절단한 후 클레나우 중합효소를 이용하여 α-티오 dNTP(α-thio dNTP)를 가함으로써 평활말단을 만들었다. 생성된 DNA를 다시 BamHI으로 절단하였다. 이렇게하여 얻는 DNA 절편을 ExoIII/멍빈 뉴클레아제 결실 키트(ExoIII/Mung bean nuclease deletion kit(Stratagen사))를 이용하여 5'-말단을 점차적으로 결실하였다. 이 결실된 프로모터의 염기서열을 분석하여 결실된 GAPDH 프로모터의 크기를 결정한 결과, 서열 5를 갖는 Hp-GAPDH 프로모터의 441번-796번(GAP356), 505번-796번(GAP292), 546번-796번(GAP251), 651번-796번(GAP146) 및 736번-796번(GAP61) 뉴클레오티드로 이루어진 결실된 Hp-GAPDH 프로모터가 얻어졌다.

이들 결실된 Hp-GAPDH 프로모터와 APH의 융합유전자를 포함하는 플라스미드 pGLG356, pGLG292, pGLG251, pGLG146 및 pGLG61을 실시예 3의 (단계 3)에서와 같은 방법으로 제작하였다(도 5). 각각의 플라스미드를 실시예 4에서와 동일한 방법으로 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2)에 형질전환하고 안정화한 후, YPD 배지 및 G418을 포함하는 최소배지에서 48시간 동안 배양하여 안정화율 및 항생제 G418에 대한 내성을 조사하였다.

그 결과는 하기의 표 4에 나타낸 바와 같다.

[표 4]

표 4에서 보는 바와 같이, 서열 5를 갖는 Hp-GAPDH 프로모터의 1번 내지 650번 뉴클레오티드가 결실되어도 항생제 G418에 대한 내성이 감소하지 않았으나, 1번 내지 735번 뉴클레오티드가 결실된 경우에는 항생제 G418에 대한 내성이 상당히 감소하였다.

따라서, APH 유전자를 이용하여 플라스미드가 다수 도입된 세포를 선별하기 위하여는 GAP61의 결실 Hp-GAPDH 프로모터가 적합한 것으로 확인되었다.

[실시예 7]

결실된 Hp-GAPDH 프로모터를 포함하는 플라스미드의 특성

실시예 6에서 얻은 플라스미드의 형질전환시 항생제 G418에 대한 내성 및 도입된 유전자의 카피수와의 관계를 확인하기 위하여, 항생제 G418의 농도별로 내성을 가지는 각각의 플라스미드의 형질전환체를 무작위로 선별하여 게놈 DNA를 분리하고 제한효소 SmaI으로 절단한 후, DIG로 표지된 LEU2 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블럿을 실시하였다.

그 결과는 도 4c에 나타낸 바와 같다. 즉, 염색체상에 단일 카피로 존재하는 숙주자체의 LEU2 유전자는 약 30.0kb 위치에서 밴드로 나타나며, 다중 카피로 존재하는 플라스미드 유래의 LEU2 유전자는 약 1.0kb 위치에서 밴드로 나타난다. 또한, 플라스미드 pGLG61의 형질전환체는 G418 4㎎/㎖에서 성장한 다른 플라스미드의 형질전환체보다 시그날 강도가 강하였다. 특히, pGLG61로 형질전환한 경우 G418 농도 증가에 따라 시그날의 강도가 강해졌다.

한편, 플라스미드 pGLG61의 형질전환시 항생제 G418 농도에 따라 도입되는 유전자의 카피수를 결정하기 위하여, 도 4c에서 pGLG61을 함유하는 형질전환체의 게놈 DNA를 TE 완충액으로 25배 희석하여 상기와 동일한 프로브를 사용하여 서던 블럿팅 분석하고 실시예 5의 방법에 따라 도입된 유전자의 카피수를 측정하였다.

그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.

[표 5]

즉, 도입된 유전자는 항생제 G418 4㎎/㎖의 농도에서 최대 약 50카피정도로 나타났으며, 항생제 G418 농도가 증가함에 따라 카피수가 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 항생제 G418 농도를 이용하여 유전자의 카피수를 1부터 50까지 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

[실시예 8]

한세눌라 폴리모르파의 자기복제서열 HARS36, TEL61 및 TEL135를 포함하는 플라스미드의 제작

실시예 7의 플라스미드 pGLG61을 제한효소 PstI 및 SalI으로 절단하여 다중병렬도입형 자기복제서열 TEL188을 제거하고, 그 대신에 HARS36, TEL61 또는 TEL135 를 도입한 플라스미드를 제작하고, 이를 이용하여 실시예 7에서와 같은 방법으로 한세눌라 폴리모르파 DL-1L(Leu2) 세포를 형질전환하고 도입된 유전자의 카피수를 측정하였다.

그 결과는 하기의 표 6에 나타낸 바와 같다.

[표 6]

HARS36, TEL61 및 TEL135를 사용한 플라스미드의 형질전환체도 TEL188의 경우와 동일하게 항생제 G418 농도가 증가함에 따라 외래 유전자의 도입 카피수가 증가하는 것으로 나타났다.

본 발명의 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 벡터는 다중병렬도입의 빈도가 높고, 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체는 용이하게 선별될 수 있다.

Claims

3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,

상기 다중병렬도입형 자기복제서열이 하기 서열 1, 2, 3 또는 4로부터 선택됨을 특징으로 하는 발현 벡터.

[서열 1]

[서열 2]

[서열 3]

[서열 4]
제 1 항에 있어서,

상기 영양요구성 선별 유전자가 효모의 LEU2 유전자 또는 URA3 유전자임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,

상기 지배적 선별 유전자가 대장균 트란스포손(transposon) Tn903으로부터 유래된 아미노글리코시드 3-인산 전이효소(APH)임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,

상기 프로모터가 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터 또는 이의 단편임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 5 항에 있어서,

상기 한세눌라 폴리모르파의 GAPDH 프로모터가 하기 서열 5를 갖는 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.

[서열 5]
제 5 항에 있어서, 상기 단편이 서열 5의 219번-796번(GAP578), 441번-796번(GAP359), 505번-796번(GAP292), 546번-796번(GAP251), 651번-796번(GAP146) 및 736번-796번(GAP61) 뉴클레오티드로 이루어진 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,

프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치한, 목적 외래 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 하류에 위치한 터미네이터를 포함하는 외래 단백질 발현 카세트를 추가로 포함하는 발현 벡터.
제 8 항에 있어서,

상기 목적 외래 단백질이 히루딘, 인간 표피 성장인자(hEGF), 인간 혈청 알부민(HSA), 프로유로키나제, 유로키나제, 인간 α₁-안티트립신, B형 간염 표면항원(HBsAg), 리포코틴, 인터페론, 이소자임, 인터류킨, 콜로니 자극 인자, 조직 플라스미노겐 활성인자, 인슐린, 인자 VIII, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈, 칼시토닌, 인슐린-유사 성장인자, 성장 호르몬으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 발현 벡터.
제 1 항에 있어서,

자기복제서열이 서열 2의 TEL188이고, 영양요구성 선별 유전자가 LEU2 유전자이고, 프로모터가 서열 5의 736번-796번 뉴클레오티드로 이루어진 결실된 GAPDH 프로모터 GAP61이고, 지배적 선별 유전자가 아미노글리코시드-3-인산 탈수소효소(APH)이며, 외래 유전자가 히루딘임을 특징으로 하는 발현 벡터.
(가) 3'-말단에 서열 5'-GGGTGGCG-3'의 반복단위를 포함하는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012) 유래의 다중병렬도입형 자기복제서열, 프로모터, 상기 프로모터의 하류에 위치하는 지배적 선별 유전자 및 영양요구성 선별 유전자를 포함하는 선별 카세트를 포함하는, 한세눌라 폴리모르파의 다중병렬도입형 발현 벡터로 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고,

(나) 형질전환된 한세눌라 폴리모르파를 최소 배지에서 배양하여 형질전환체를 선별하고,

(다) 선별된 형질전환체를 복합 배지에서 반복 배양하여 형질전환체내의 벡터를 안정화시키는 단계, 및

(라) 안정화된 형질전환체를 항생제를 포함하는 선택 배지에서 배양하여 항생제에 내성을 갖는 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는, 다수 카피의 도입된 외래 유전자를 갖는 한세눌라 폴리모르파 형질전환체의 선별 방법.