KR100449892B1 - 신규한 발현벡터, 형질전환 효모 및 이를 이용한 재조합인간혈청 알부민의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 발현벡터, 형질전환 효모 및 이를 이용한 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 구성성 발현을 유도하는 프로모터를 이용하여 재조합 인간 혈장 알부민을 고효율로 대량 생산하기 위하여 알부민 발현벡터를 함유한 형질전환 균주를 개발하고 이를 고농도로 배양하면서 알부민을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파 유래의GAP프로모터에 연결된 알부민 cDNA를 지닌 신규한 발현벡터 및 상기 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파 염색체로 삽입된 형질전환된 효모를 제공하며, 상기 형질전환 한세눌라 폴리모르파를 고농도의 글리세롤을 단발적으로 주입하는 유가배양법을 통하여 고농도 배양에 의한 발효공정을 매우 단순화시키면서GAP프로모터로 부터 고효율로 알부민 발현을 유도함으로써 산업적 공정화가 용이하도록 개발된 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법을 제공한다.

Description

신규한 발현벡터, 형질전환 효모 및 이를 이용한 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법{Novel expressing vector, recombinant Hansenula polymorpha and a production process for human serum albumin using recombinant Hansenula polymorpha}

본 발명은 신규한 발현벡터, 형질전환 효모 및 이를 이용한 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 구성성 발현을 유도하는 프로모터를 이용하여 재조합 인간 혈장 알부민을 고효율로 대량 생산하기 위하여 알부민 발현벡터를 함유한 형질전환 균주를 개발하고 이를 고농도로 배양하면서 알부민을 고효율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 인체 지놈(genome)의 완독을 위시하여 여러 생명체에서의 유전체 정보가 밝혀지고 이에 따른 다양한 단백질의 유용한 기능과 역할이 속속 규명됨에 따라 생산량이 한정된 유용단백질을 다양한 숙주세포에서 대량 발현시키는 "재조합 단백질 발현기술"이 핵심 기반기술로 인식되고 있다. 대량 발현을 위한 숙주시스템으로는 박테리아, 효모, 곰팡이, 식물 및 동물을 포함한 여러 다양한 시스템이 개발되고 있는데, 적은 비용으로 고농도 균체 배양이 용이한 미생물 숙주 시스템이 일차적인 발현 시스템으로 활용되고 있다.

여러 유용한 미생물 숙주시스템들 중에서도 특히 미생물이면서도 진핵생물의 단백질 발현 및 분비 특징을 갖는 효모는 고등 진핵생물 유래의 재조합 단백질을 대량 생산하기 위한 미생물 숙주로 유용하게 사용되고 있다.

최근에는 산업적 생산 숙주로서 전통 효모 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae)가 갖는 단점들, 예로써 장기간 발효시 발현 벡터의 불안정성, 당단백질의 과당화(hyperglycosylation), 또한 박테리아 발현시스템에 비해 낮은 생산성 등의 문제점들을 보완하기 위하여 여러 다른 효모 시스템이 대체숙주로서 개발되고 있다(Romanos et al.,Yeast8, 423-488 (1992)). 비전통 효모를 이용한 외래유전자 발현 시스템들 중 특히 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)는 피키아 패스토리스(Pichia pastoris)와 더불어 여러 독특한 특징으로 인해 재조합 단백질 대량생산을 위한 이상적인 숙주시스템으로 각광을 받고 있다(Faber et al.,Yeast11, 1331-1344 (1995); Hollenberg and GellissenCurr.Opin.Biotechnol. 8, 554-560 (1997)).

한세눌라 폴리모르파와 피키아 패스토리스는 값싼 원료물질인 메탄올을 에너지원과 탄소원으로 이용할 수 있고 메탄올 대사에 관련되는 유전자들에서 유래된 발현 조절이 용이하면서도 매우 강력한 프로모터들을 갖고 있어 산업적 응용 측면에서 사카로마이세스 세레비시애보다 그 유용성이 매우 높다. 또한 간단한 합성배지에서도 고농도 배양(100-130g DCW/L)이 용이하고, 형질 전환시 발현 목표유전자가 숙주의 염색체상으로 삽입되어 비선택 배지를 사용한 장기간의 배양에서도 도입된 발현벡터의 안정성이 뛰어난 장점이 있다(Gellissen et al., Gene expression in recombinant microorganisms (Smith A. ed.), p. 195 (1995)). 더 나아가 이들 효모에서 발현된 당단백질들은 사카로마이세스 세레비시애에서 발현된 당단백질들에 비해 훨씬 과당화되는 정도가 낮은 것으로 보고되었다(Bretthauer and Castellino,Biotechnol. Appl. Biochem. 30, 193-200 (1999); Kang et al.,Yeast14, 371-381 (1998)).

특히, 이들 메탄올자화 효모가 전통효모 사카로마이세스 세레비시애에 비해 산업균주로서 내세울 만한 장점 중의 하나는 발효(fermentation) 활성이 매우 낮다는 점이다. 즉, 높은 농도의 탄소원을 사용하는 고농도 배양시, 사카로마이세스 세레비시애의 경우는 많은 양의 에탄올이 부산물로 축적됨에 따라 숙주 성장과 더불어 재조합 단백질의 생산성도 심각하게 저하되는 문제점이 있다. 특히 균주 성장에 가장 좋은 탄소원인 포도당 농도가 높은 경우 크랩트리 효과(Crabtree effect)가 작동되어 산소가 풍부하게 존재하는 조건에서도 숙주의 호흡(respiration) 활성이 급격히 감소되고 발효 활성이 현저하게 증가되는 현상이 일어나게 된다.

그러나, 이와 같은 크랩트리 효과(Crabtree effect)를 받지않는 한세눌라 폴리모르파와 피키아 패스토리스의 경우는 호흡 활성이 발효 활성보다 훨씬 강해서 에탄올 저해현상이 거의 없어 매우 높은 균체 생산율(cell yield: Y_x/s)를 보이므로 고농도 배양이 매우 용이하게 된다(Chiruvolu et al.,Appl. Biochem. Biotechnol. 75, 163-173 (1998)). 따라서 이들 메탄올 자화효모 발현 시스템의 내세울 만한 특징은 플라스크로부터 고농도 배양조로의 스케일-업이 매우 쉽다는 것이며, 피키아 패스토리스의 경우는 유가 배양 및 연속 배양에 대한 프로토콜이 이미 잘 확립되어 널리 보급되어 있다(Stratton et al.,Methods Mol. Biol.103, 107-120 (1998)).

현재 메탄올자화 효모에서 외래 단백질의 대량 생산을 위해 가장 널리 상용되고 있는 프로모터들은 메탄올 대사에 관련된 유전자에서 유래된 프로모터들로서, 이들은 매우 강력하면서도 메탄올 존재 여부에 따라 발현 조절이 가능한 장점이 있다. 한세눌라 폴리모르파의 경우MOX1,DHAS또는FMDH프로모터가 보편적으로 활용되어 있고 피키아 패스토리스의 경우는AOX1프로모터가 주로 사용되고 있다.

그러나 식품으로 개발되는 재조합 단백질을 생산하고자 하는 경우 메탄올은 발현 유도체로 사용하기에 적합하지 않으며, 또한 대규모 발효에 필요한 대량의 메탄올은 화재 위험성을 내포하고 있고, 더욱이 메탄올에 의한 발현 유도 최적화를 위한 발효 공정은 매우 복잡하다는 점들이 메탄올을 필요로 하는 이들 프로모터들의 단점으로 지적되고 있다.

따라서, 최근에는 이들을 대체할 만한 여러 다양한 프로모터 개발에 관한 연구들이 활발하게 진행되고 있다. 특히 피키아 패스토리스의 포름알데히드 디하이드로지나제(formaldehyde dehydrogenase:FLD1) 프로모터는 메탄올뿐만 아니라 메틸아민을 사용하여 발현을 조절할 수 있으면서도AOX1프로모터만큼 매우 강력하다는 장점이 있다(Shen et al.,Gene216, 93-102(1998)). 또한 발현 유도를 위해 특정 발현 조건이나 유도 물질이 필요없는 강력한 구성성 발현 프로모터로 개발된 한세눌라 폴리모르파의 세포막 ATPase (PMA1) 프로모터(Cox et al.,Yeast16, 1191-1203(2000)), 피키아 패스토리스의GAP프로모터(Waterham et al.,Gene186, 37-44(1997))들도 지금까지 재조합 단백질 대량생산을 위해 가장 널리 사용되어오던MOX1나AOX1프로모터에 필적할 만한 발현 수준을 보이고 있다.

인간 혈장 알부민 (Human serum albumin; HSA)은 585 개의 아미노산으로 이루어진 분자량 66.6 kDa 크기의 단백질이다. 혈장 단백질 함량의 약 60%를 차지하는 알부민은 혈장의 삼투압을 유지하는 역할과 더불어 지방산, 담즙 색소, 아미노산, 스테로이드 호르몬, 금속 이온들을 운반하는 역할을 한다(Peters, T.The plasma proteins,ed. F.W. Putnam, p. 133(1975), Academic Press Inc).

알부민은 혈장 확장액의 대체용액으로 또는 출혈시 혈액 보충액으로 사용되고 있어 의료학적으로 그 수요량이 크게 증가하고 있다. 현재까지 인간 혈장 알부민은 혈액으로부터 분리 정제한 것을 주로 사용하고 있으나, 병원균 또는 바이러스의 오염에 의한 안전성 문제가 최근에 크게 대두되고 있어서 재조합 알부민의 대량생산이 절실히 필요한데, 본 발명자 들은 메타놀 자화효모인 한세눌라 폴리모르파의MOX프로모터를 이용하여 HSA를 한세눌라 폴리모르파에서 발현시키는 데에 적합한 벡터를 제작하고 이 벡터가 염색체상으로 도입된 형질 전환체를 선별한 후 이로부터 알부민을 고효율로 생산하는 균주를 선별하여 재조합 HSA를 분비 생산하는 발현시스템을 개발하였다(한국특허 등록번호 제288889호).

그러나, 재조합 알부민이 의약용으로 사용되기 위해서는 배지내에 높은 농도로 존재하는 메탄올 성분의 완전한 제거가 요구되고, 대량 배양시 발현 유발 조건의 최적화가 까다롭고, 특히 발현 유발을 위해 장기간의 배양이 요구되는 등 여러 개선해야 할 점들이 제기되었다. 또한 한세눌라 형질전환체 고농도 배양시 발효말기에 균주의 자가 분해(autolysis)가 일어나서 배양액으로 세포질내의 많은 단백질들이 방출되어 배양액에서 알부민을 분리정제하기에 어려운 문제점이 있다.

본 발명자들은 보다 쉽게 최적 발현조건을 구비할 수 있는 다른 강력한 프로모터를 이용하여 알부민 발현 시스템의 개발을 도모하고자 구성성 발현 프로모터인 한세눌라 폴리모르파GAP프로모터(한국특허 등록번호 제237979호)를 사용하여 고효율 알부민 발현벡터를 제작하고 이를 함유한 형질전환체의 생리분석 및 균체 자가분해 요인 규명을 통해 구성성 발현 프로모터로부터 알부민을 고효율로 발현하면서도 균체 자가분해가 일어나지 않는 배양조건을 확립하여 기존의 고농도 균체 배양공정을 매우 단순화시키는 대량 배양방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 메탄올자화 효모 한세눌라 폴리모르파 유래의GAP프로모터에 연결된 알부민 cDNA를 지닌 신규한 발현벡터 및 상기 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파 염색체로 삽입된 형질전환된 효모를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 한세눌라 폴리모르파를 고농도의 글리세롤을 단발적으로 주입하는 유가배양법을 통하여 고농도 배양에 의한 발효공정을 매우 단순화시키면서GAP프로모터(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter)로 부터 고효율로 알부민 발현을 유도함으로써 산업적 공정화가 용이하도록 개발된 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법을 제공함에 있다.

도 1은 한세눌라 폴리모르파GAP프로모터에 인간 혈장 알부민을 코딩하는 cDNA가 연결된 발현 카세트 P_GAP-HSAI과 P_GAP-HSAII,

도 2는 P_GAP-HSA 발현 카세트를 지닌 한세눌라 폴리모르파용 삽입용 벡터로서, 도 2(a)는 P_GAP-HSAI을 지닌 카피-수 조절용 벡터 pYHSA161, 도 2(b)는 P_GAP-HSAII을 지닌 카피-수 조절용 벡터 pYHSA171, 도 2(c)는GAP프로모터 부위로의 삽입을 위한 벡터 pYHSA173, 도 2(d)는LEU2유전자 부위로의 삽입을 위한 벡터 pYHSA175,

도 3은 한세눌라 폴리모르파 형질전환체들에서의 알부민 mRNA 발현양상 분석을 위한 노던블럿 결과로서, 도 3(A)는 pYHSA161가 삽입된 형질전환체의 분석 결과, 도 3(B)는 pYHSA171가 삽입된 형질전환체의 분석결과,

도 4는 탄소원이GAP프로모터를 이용한 알부민 발현에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 4(a)는 알부민 mRNA 발현양상 분석을 위한 노던블럿 결과, 도 4 (b)는 알부민 단백질 발현양상을 분석하기 위한 웨스턴블럿 결과,

도 5는 플라스크 배양에서 한세눌라 폴리모르파 형질전환체의 균체성장 및 알부민 발현에 관한 분석결과로서, 도 5(a)는 배양동안의 균체성장, 배지 pH, 알부민 mRNA 및 단백질 발현양상 변화에 대한 분석그래프, 도 5(b)는 배양 배지 pH가 한세눌라 폴리모르파 자가분해 현상에 미치는 영향을 분석하기 위해 배양액을 실버 염색한 결과,

도 6은 글리세롤 농도가 한세눌라 폴리모르파 형질전환체의 성장 및 GAP 프로모터로부터의 알부민 발현에 미치는 영향을 분석한 결과로서, 도 6(a)는 성장 곡선, 도 6(b)는 배양액을 실버 염색한 결과,

도 7은 발효조를 이용하여 글리세롤의 농도에 따른 단발 유가배양에서의 세포성장과 알부민 생산에 대한 결과로서, 도 7(a)는 글리세롤의 농도가 3%, 도 7(b)는 글리세롤의 농도가 6%, 도 7(c)는 글리세롤의 농도가 12%인 경우의 결과,

도 8은 발효조를 이용하여 단발 유가배양시 글리세롤의 농도에 따른 세포 성장에 대한 알부민의 상대적 생산수율, 탄소원의 소비에 대한 세포의 상대적 성장률 및 알부민의 생산량에 대한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 구성성 발현(constitutive expression)을 유도하는 메탄올 자화효모 한세눌라 폴리모르파 유래의GAP프로모터를 이용하여 인체 혈장 알부민을 발현시키는 데 적합한 발현벡터들을 제조하는 과정, 상기 발현벡터가 숙주 염색체로 삽입된 효모 형질전환체 선별, 이로부터 고효율 발현주를 선별하는 과정, 최종 형질전환체의 자가분해를 방지하는 배양조건 선정, 고농도 균체배양 공정개발 과정으로 구성되는데, 알부민 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파GAP유전자 부위로 특정하게삽입되도록 제조된 발현벡터 pYHSA173와 상기 발현벡터가GAP유전자 부위로 삽입된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 알부민 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파GAP유전자 부위로 특정하게 삽입되도록 제조된 발현벡터 pYHSA173을 이용하여 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고, 상기 과정에 의하여 형질전환된 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 를 배양하여 생산하는 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법임을 특징으로 한다.

즉, 본 발명은 알부민 cDNA 유래의 5' 비해독 영역(5' untranslated region ; 5' UTR)를 지닌 채로 한세눌라 폴리모르파GAP프로모터에 연결된 발현카세트를 숙주의GAP유전자 부위로 특정 삽입시킬 수 있는 발현벡터 pYHSA173를 제조하고, 숙주의 염색체로 상기 발현벡터 pYHSA173이 삽입된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1L/G12를 고농도의 글리세롤을 탄소원으로 사용한 배지에서 배양하여 알부민을 고효율로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 사용된 알부민 발현을 위한 효모 숙주로는 한세눌라 폴리모르파 DL-1(ATCC 26012)에서 유래된 루이신 영양요구성 변이주인 DL1-L(leu2)를 사용하고,GAP프로모터는 한세눌라 폴리모르파GAP유전자가 포함된 4.5 kb DNA 절편이 클로닝된, 공지된 벡터 pGAP7123(Sohn et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 51, 800(1999))에서 확보한다.

MOX터미네이터와 연결된 HSA cDNA는 공지된 벡터들인 pBHSA11과 pYIP-HSA (Kang et al., Biotechnol. Bioeng. 76, 175-185(2001))로부터 확보하고, 한세눌라폴리모르파용 자가복제 서열인 TEL135와 G418 내성 유전자는 공지된 벡터 pGLG61-135(Kang et al., Biotechnol. Bioeng. 76, 175-185(2001))에서 확보하고 결손된dHpLEU2유전자는 공지된 벡터 pCTEL188(Sohn et al., J. Bacteriol. 181, 1005-1013 (1999))에서 확보한다.

본 발명에 의한 형질전환된 효모 세포주는 한세눌라 폴리모르파 DL1-L 균주에 힐 등의 방법(Hill et al.,Nucl. Acids Res. 19, 5791(1991))에 의해 알부민 발현벡터들을 도입하여 LUE2⁺로 전환된 형질전환체를 선별하여 얻어지는데,LEU2외에도 대장균 유래의 G418에 대한 내성을 갖게하는APH유전자를 선별표지로 지닌 벡터의 경우 1차적으로 LUE2⁺형질전환체를 얻은뒤 YPD 배지에서 약 50 세대 정도 계대배양하여 안정화시킨 후 G418 농도를 달리한 배지에 도말하여 2차 선별을 하여 얻을 수 있다.

본 발명에 의한 형질전환된 효모는 6%(w/v) 이상의 고농도의 글리세롤이 함유된 배지를 단발적으로 주입시키는 유가배양법으로 배양하여 재조합 인간혈청 알부민을 제조하는데, 배양시 배지 pH를 5.5-6.0으로 유지하여 균주의 자가분해와 배양액으로 분비발현된 재조합 알부민의 분해를 방지한다.

본 발명에 의한 형질전환된 효모배양시의 배지조성은 회분식 진탕배양을 위해서 종균배지로는 복합배지인 YPG(효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 글리세롤 2%)를 사용하여 효모 균주를 16∼20 시간, 37℃에서 배양한 다음, 30 ml의 YPG, YPD (효모 추출물 1%, 박토 펩톤 2%, 포도당 2%), 또는 YPM(효모 추출물 1%, 박토 펩톤2%, 메탄올 2%)을 넣은 250 ml의 방해판이 부착된 삼각 플라스크(baffled flask)에 종균의 농도를 1%로 접종하여 37℃에서 본배양을 수행한다. 배양시 pH 조절에 따른 생성물 자가분해를 검토하기 위하여, 칼륨인산염 완충액을 0.1 M 농도로 첨가하여 배양액의 pH를 5.5-6.0 부근으로 유지한다.

발효조를 이용한 유가배양은 YPG 배지에서 지수성장기(exponential phase)에 동결 보관된 글리세롤 동결보존액 0.3 ml을 50 ml의 YPG가 들어있는 500 ml 삼각 플라스크에 접종하여 37℃에서 18∼20시간동안 종균배양을 행하고, 본배양은 종균배양액의 농도가 5%가 되도록 접종하여 발효를 시작한다. 배지는 YPG (효모 추출물 4%, 박토 펩톤 2%, 글리세롤 12%)를 사용하고, 배양액의 pH는 2 N-염산 수용액과 30%-암모니아수용액으로 pH 6.0을 유지하고 37℃에서 배양한다.

산소의 공급은 탄소원인 글리세롤의 소비량에 따라서 일반 공기와 순산소를 임의로 혼합하여 DO가 20% 범위에서 유지되도록 공급하고, 도입량은 1∼2.5 vvm 내에서 조절하고, 발효에 따라서 생성되는 거품은 네오닌을 첨가하여 제거한다.

유가배양액의 도입은 초기에 공급된 글리세롤이 거의 소모되었을 때, 글리세롤의 도입후 최종농도가 12%가 되도록 행하며, 탄소원인 글리세롤의 공급과 함께 질소원의 고갈을 막기위하여 탄소원과 질소원의 비율이 3:2가 되도록 효모 추출물을 함께 공급하여 준다.

세포성장은 자외선(UV) 흡광광도기(Kontron, USA)를 이용하여 O.D. 600에서 탁도를 측정하여 결정하고, 건조세포 중량은 예비실험에 의하여 얻은 검량선의 방정식 [건조세포중량(g/l) = OD₆₀₀에서의 탁도 ×0.3194]으로부터 결정한다. 글리세롤의 농도는 HPLC를 이용하여 분석하고, 발효로부터 생성되는 에탄올의 농도는 GC(Hurett Packerd, USA)를 이용하여 측정한다.

HPLC 분석을 위해 양이온교환 컬럼(Aminex HPX-87H, USA, 300 ×7.8mm)을 사용하고, 유량은 0.6 ml/min로 유지하며 이동상은 8 mN의 황산이 첨가된 초순수 (Merck, USA)를 사용한다. 컬럼에서 용리된 시료는 굴절률 검출기를 이용하여 측정하며, 윈크로 프로그램(Winchro program, 영인, Korea)을 이용하여 농도를 결정한다. 배양액의 에탄올 및 글리세롤 농도는 가스 크로마토그래피(5890, Hewlett Packard)를 사용하여 온도 기울기법에 의하여 분석하고 D520B integrator(영인, Korea)를 이용하여 결정한다.

세포배양액으로부터 분비된 알부민은 웨스턴 블롯팅이나 실버 염색으로 분석하는데(Kang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 575 (2000)), 발현된 알부민의 양은 미국 시그마사로부터 구입한 혈장 알부민을 표준으로 나타나는 밴드의 감도를 덴시토미터(Image analysis system, Bio-Rad, Model GS-700)로 읽어 정량한다.

알부민 발현벡터가 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L의 염색체상으로 삽입된 양상과 카피수(copy number)를 분석하기 위해 복합배지 YPD에서 24 시간 동안 배양한 형질전환체에서 DNA를 추출하여 제한효소로 절단한 후 샘브룩(Sambrook) 등(Molecular cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 의해서던블롯을 수행한다. 프로브(probe)는 비방사성 DNA 표지 및 감지 키트(Non-radioactive DNA labelling and detection kit)를 사용하여 0.42 Kb 크기의GAP프로모터 절편과 1.2 kb의HpLEU2유전자 절편을 디그옥시제닌(digoxigenin)으로 표지하여 사용하고, 알부민 발현벡터의 다중 도입수를 결정하기 위해 DNA 밴드의 감도를 덴시토미터로 읽어서 결정한다.

또한, 알부민 mRNA 발현양상을 분석하기 위해 핫페놀 방법(Elion and Warner, Cell 39, 663 (1984))에 의해 RNA를 추출하여 Sambrook 등(Molecular Cloning Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)의 방법에 의해 노던블롯을 수행한다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 다음의 실시예는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.

<실시예 1> (GAP프로모터를 이용한 인간 혈청 알부민 발현 벡터 제작)

한세눌라 폴리모르파GAP프로모터로부터 고효율로 인체 혈청 알부민을 발현하는 발현 벡터를 제작하기 위해 알부민 발현효율에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인들, 즉, 알부민 mRNA의 5′UTR의 구조, 알부민 발현벡터의 카피수 및 도입 부위 등을 고려하여 여러 발현 벡터들을 제작하였다.

(1)GAP프로모터를 이용한 P_GAP-알부민 발현 카세트 제작

mRNA의 5′UTR을 구성하는 뉴크레오타이드 조성과 길이는 mRNA의 안정성이나 단백질 번역(translation) 효율에 영향을 줌으로써 최종 단백질 발현양에 크게 영향을 미친다고 알려져 있다(Donahue와 Cigan, Meth. Enzymol. 185, 366 (1990)). HSA cDNA 유래의 5' UTR 존재여부가 한세눌라 폴리모르파GAP프로모터를 이용한 HSA 발현에 미치는 효과를 분석하기 위해, 3 단계의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용한 융합방법을 통해 5′UTR이 제거된 HSA cDNA를 제한효소를 사용하지 않고GAP프로모터에 직접 연결된 HSA 발현 카세트 I을 제조하였다.

첫번째 단계에서는 유니버스 프라이머(5'-GTAAAACGAGGCCAGT-3')와 GAP-20mer (5'-CATATTGTTTCTATATTATC-3'; 이때 단백질 개시코돈은 밑줄친 것)을 사용하여 pGAP7123로부터 단백질 개시코돈을 지닌 0.8 kb 크기의GAP프로모터 DNA 절편을 합성하였다. 두번째 단계에서는 두 올리고뉴크레오타이드 GAP/HSA-32mer (5'-GATAATATAGAAACAATATGAAGTGGGTAACC-3'; HSA cDNA의 개시코돈은 밑줄친 것)과 HSA-AflIII 19mer (5'-GCTGACTCATCAGCAACAC-3')를 사용하여 HSA cDNA의 N-말단 부분에 해당되는 247 bp 크기의 DNA 절편을 합성하였다.

상기 첫번째와 두번째 단계에서 합성된 DNA 절편들을 함께 섞은 후 이로부터 GAP/HSA-32mer와 유니버스 프라이머를 사용한 PCR을 통해GAP프로모터에 HSA cDNA N-말단부위가 연결된 1.1 kb 크기의 DNA 단편을 합성한 후, 이를 pT7Blue(Novagen)에 삽입하여 pT7Blue/PgapHSA247를 조립하였다. 상기 PCR은pfu중합효소(Stratagene, USA)를 사용하여 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 2분 30초의 조건으로 PCR을 수행하여 확보하였고, PCR 과정 중 발생할 수 있는 염기배열의 변화여부는 염기배열 분석으로 확인하였다.

pT7Blue/PgapHSA247를BstEII와KpnI로 절단하여GAP프로모터와 HSA cDNA N-말단부분을 포함하고 있는 0.8 kb 크기의 DNA 절편을 얻어서 벡터 pBHSA11의MOX프로모터와 HSA cDNA H-말단부분을 지닌 1.6 kbBstEII/KpnI DNA 절편과 바꾸어서 P_GAP-HSA 발현 카세트 I 을 지닌 벡터 pBHSA16을 제조하였다(도 1(A)).

HSA cDNA 유래의 5′UTR를 지닌 P_GAP-HSA 발현 카세트 II는 벡터 YIP-HSA에서MOX프로모터에 해당되는 1.5 kbSalI/EcoRI DNA 절편을 p23P2/pT7에서 유래된GAP프로모터에 해당되는 0.8 kbSmaI/SspI 절편으로 바꿈으로 제작하였다(도 1(B)).

(2) P_GAP-알부민 발현 카세트를 지닌 삽입용 벡터 제작

3.3 kb 크기의 P_GAP-HSA 발현 카세트 I 또는 P_GAP-HSA 발현 카세트 II를NotI으로 절단한 pGLG61-135와 연결하여 삽입 수 조절이 가능한 발현 벡터 pYHSA161과 pYHSA171를 각각 제작하였다(도 2(a)와 도 2(b)).

pYHSA173은 TEL135와APH유전자가 포함된 1.5 kbEcoRI/SalI DNA 절편을 제거함으로 제작되었다(도 2(c)). pYHSA175는 pYHSA173에서HpLEU2유전자를 포함한 1.2 kbKpnI/ClaI DNA 절편을 제거하고 대신 pCTEL188에서 확보된 결손된HpLEU2유전자와 TEL188을 지닌 1.6 kbKpnI/ClaI DNA 절편으로 대체함으로써 제작하였다(도 2(d)).

상기의 방법으로 제조된 발현벡터 pYHSA173은 2001년 7월 5일 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10006BP로 기탁하였다.

<실시예 2> (알부민 발현 형질전환주 선별 및 발현 분석)

(1) 5′UTR과 벡터 삽입 카피수가 알부민 발현에 미치는 영향 분석

우선 5'UTR가GAP프로모터를 이용한 알부민 발현에 미치는 영향을 분석하기 위해 P_GAP-HSA 발현카세트 I을 지닌 벡터 pYHSA161와 P_GAP-HSA 발현카세트 II를 지닌 벡터 pYHSA171를 각각 한세눌라 폴리모르파 DL1-L (leu2^-) 균주에 도입하여 일차적인 Leu2⁺형질전환체를 얻은 후 G418 농도별로 이차적 선별을 수행하여 알부민 발현 벡터가 숙주내에 다양한 카피 수로 도입된 형질전환체들을 얻었다.

확보된 한세눌라 폴리모르파 형질 전환체들의 알부민 발현효율을 분석하기 위해 플라스크 배양을 실시하여 배지내의 알부민 양을 웨스턴으로 정량하였고, 알부민 발현 카세트의 삽입 카피수는 서던 블롯으로 분석하여 그 결과를 종합적으로 표 1에 나타내었다.

서던 블롯을 실시한 결과 pYHSA161 형질전환체의 경우 G418 농도가 높을수록 알부민 발현 벡터 카피수가 1 카피에서 27 카피까지 증가되었음을 확인하였다. 그러나 확보된 한세눌라 폴리모르파 형질 전환체들은 발현벡터의 높은 카피수에도 불구하고 알부민 발현이 1-2 mg/L정도로 매우 낮았다.

이에 반해 발현벡터 pYHSA171를 지닌 형질전환체의 경우, G418 농도가 높을수록 카피수가 증가되었지만 최대 6 카피까지만 삽입되었다. 그러나 대체로 발현벡터의 카피수에 크게 상관없이 배양 24 시간만에 모두 약 60-70 mg/L 정도의 높은 발현양을 보였다.

<표 1>. 5′UTR과 벡터 카피 수가 알부민 발현에 미치는 영향

벡터	HSA5'UTR	카피수	삽입부위	알부민 생산량*
pYHSA161	-	1	LEU2	-
		2	tel	-
		3	tel	< 1
		9	tel	1-2
		18	tel	1-2
		27	tel	1-2
pYHSA171	+	1	tel	30-40
		2	tel	60-70
		6	tel	60-70

*배양액으로 분비된 알부민 농도는 플라스크에서 20 hr 배양한 후 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

노던 블럿을 통해 형질 전환체들의 HSA mRNA 발현양을 측정한 결과 pYHSA161을 지닌 형질전환체들의 경우 HSA mRNA 발현양이 매우 낮으며 카피수가 9 이상으로 증가되면 HSA mRNA의 발현양은 더 이상 증가되지 않음이 관찰되었다(도 3(A)).

이에 반해 pYHSA171을 지닌 형질전환체들의 경우는 같은 카피수의 pYHSA161를 지닌 형질전환체(예를 들면 2 카피를 지닌 형질전환체의 경우)에 비해 HSA mRNA발현양이 훨씬 높아 HSA cDNA 유래의 5′UTR 존재가GAP프로모터로부터 발현되는 HSA mRNA의 안정성에 필요함을 시사하였다(도 3(B)).

또한 비슷한 HSA mRNA 발현양을 보이는 형질전환체들을 비교해 볼 때, pYHSA171을 지닌 형질전환체가 월등히 높은 HSA 단백질 발현량을 보이고 있어 HSA cDNA 유래의 5′UTR 존재가 HSA mRNA를 번역하여 효율적으로 단백질을 합성하는 과정에도 필수적임을 시사하고 있다.

(2) 발현벡터 삽입위치가 발현효율에 미치는 영향 분석

발현벡터가 숙주 염색체로 삽입되는 경우, 발현 벡터의 삽입위치도 발현효율에 상당한 영향을 미치게 된다. 특히 상기 벡터 pYHSA171의 경우, 염색체 말단 유래의 자가복제 서열인 TEL135를 갖고 있어 거의 대부분 염색체 말단으로 삽입되게 된다. 그러나, 염색체 말단은 그 특유의 구조로 인해 근처에 있는 프로모터의 활성을 저하시킴이 종종 보고되었고(Grunstein M, Cell 93, 325 (1998)), 본 발명자들의 선행연구에서도MOX프로모터를 이용한 알부민 발현벡터 카세트의 경우MOX프로모터 부위로 삽입된 경우가 염색체 말단으로 삽입된 경우 보다 발현효율이 높게 나타났다(Kang et al., Biotechnol. Bioeng. in press (2001)).

따라서, P_GAP-HSA 발현카세트 II를GAP유전자 부위로 특정하게 삽입시키기 위해 TEL135가 제거된 발현벡터 pYHSA173을GAP프로모터에 있는HpaI 제한효소 인지부위에서 절단한 후 한세눌라 폴리모르파 DL-1에 도입하여GAP유전자 부위로 1카피에서 3 카피까지 도입된 형질전환체를 확보하였다. 또한LEU2유전자 부위로의 삽입을 유도하는 결손된dHpLEU2유전자(Agaphonov et al., Yeast 15, 541 (1999))를 지닌 pYHSA175를 한세눌라 폴리모르파 DL-1에 도입하여LEU2유전자 부위로 1 내지 2 카피 도입된 형질전환체를 확보하였다.

이들 형질전환체들의 알부민 발현효율을 비교하면 표 2에서 보는 바와 같이,GAP프로모터로 삽입된 경우 다른 부위로 삽입된 경우에 비해 알부민 발현효율이 다소 (20-50% 정도) 높았고 특히 염색체 말단에 삽입된 경우에 비해서는 장기간 균주 보관시 안정화된 발현 양상을 보였다.

<표 2>. 발현벡터 삽입 부위가 알부민 발현에 미치는 영향

벡터	카피수	삽입부위	알부민 생산량
pYHSA171	1	tel	30-40
pYHSA173	1	GAP	40-50
	2	GAP	80-90
	3	GAP	85-90
pYHSA175	1	LEU2	20-30
	2	LEU2	40-50

*배양액으로 분비된 알부민 농도는 플라스크에서 20 hr 배양한 후 웨스턴 블롯으로 측정하였다.

상기 형질전환 균주중 가장 성능이 우수한 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 균주는 2001년 7월 5일 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 10007BP 호로 기탁하였다.

<실시예 3> (플라스크 배양을 통한GAP프로모터로부터의 알부민 생산최적화)

(1) 탄소원에 따른 알부민의 발현최적화

일반적으로GAP프로모터는 배양조건에는 큰 영향을 받지 않고 항상 발현이 유지된다고 알려졌지만, 피키아 패스토리스GAP프로모터의 경우 탄소원의 영향을 상당히 받음이 보고되었다(Waterham et al., Gene 186, 37(1997)).

따라서 한세눌라 폴리모르파GAP프로모터에 미치는 탄소원의 영향을 살펴보기 위해 알부민 발현벡터가GAP유전자 부위로 한 카피 삽입된 형질전환체를 선택하여 포도당, 글리세롤, 또는 메탄올을 탄소원으로 포함한 배지에서 배양하면서 알부민 mRNA 및 단백질 발현양상을 비교 분석하였다(도 4).

효모세포가 왕성하게 자랄 때 (OD₆₀₀= 5) 전체 RNA를 분리하여 알부민 mRNA 발현정도를 분석한 결과 글리세롤에서 배양된 경우 포도당에서 배양된 경우보다 알부민 mRNA 발현수준이 약간 높았고 메탄올에서 배양된 경우는 매우 저조한 발현수준을 보였다(도 4(a)). 이와 비슷하게 탄소원으로 글리세롤을 이용한 YPG 배지에서 알부민 단백질 발현량도 가장 높게 나타냈다(도 4(b)).

따라서, 한세눌라 폴리모파가 매우 왕성하게 자라며 알부민 발현도 가장 높게 나타나는 글리세롤이 구성적 발현 프로모터인GAP프로모터를 이용한 알부민 생산배지로 가장 적합한 탄소원으로 나타났다.

(2) 세포 자가분해 요인 분석

글리세롤을 탄소원으로 하는 YPG 배지를 포함한 플라스크에서 한세놀라 폴리모르파 형질전환체를 배양하여GAP프로모터에 의한 알부민 발현 양상을 시간별로 분석하기 위해 배양액을 실버 염색하였다. 배양이 진행됨에 따라 균체량이 증가되었고, 이와 비례적으로 배양액에 축적되는 알부민 양도 증가됨이 관측되었다.

그러나 배양이 정체기에 접어들면서 배양액내의 알부민 양이 감소되었다. 알부민 농도 감소요인을 분석하기 위해 알부민 mRNA 발현량을 노던 블롯으로 분석한 결과,GAP프로모터의 활성이 배양 정체기에는 감소하는 경향을 보였다.

또한 매우 흥미로운 것은 배양액의 pH가 초기에는 6.0에서 5.5로 감소되지만, 시간이 지남에 따라 지수성장기 후반부터 갑자기 상승하여 pH 7.5 정도까지 상승되었다. 이와 같은 급속한 pH 증가는 알부민 분해와 항상 동행되었고 효모 균주의 자가분해(autolysis)를 유도하였다(도 5(a)).

특히, 효모균주의 자가분해는 모균주에 비해 알부민 뿐만 아니라 재조합 단백질을 분비생산하는 형질전환체에서 더욱 심하게 일어남이 관찰되었다. 따라서 배양배지의 pH 유지를 위해 0.1M 칼륨 인산염 완충용액을 첨가한 경우, 효모 균주의 자가분해와 알부민 분해가 현저하게 방지되어서 세포 배양액에는 알부민에 해당되는 밴드만이 주된 단백질로 축적되었다(도 5(b)).

(3)MOX프로모터를 이용한 알부민 발현시스템과의 비교

메탄올자화 효모에서 현재 가장 널리 사용되고 있는MOX프로모터를 이용한알부민 발현시스템과GAP프로모터를 이용한 발현시스템을 비교 분석하기 위해,MOX프로모터 부위로 한 카피의 P_MOX-HSA 발현카세트가 삽입된 형질전환체와GAP프로모터 부위로 한 카피의 P_GAP-HSA 발현카세트가 삽입된 형질전환체를 0.1M 인산염 완충용액이 첨가된 YPM과 YPG를 사용하여 진탕배양하였다.

표 3에서 보듯이MOX프로모터로부터의 알부민 발현은 배양 72시간에 최대에 도달하는 반면,GAP프로모터로부터의 알부민 발현은 36시간 만에 최대치에 도달하였다. 따라서MOX프로모터를 사용하는 발현시스템에 비해GAP프로모터를 사용한 발현시스템은 약 2배 이상으로 크게 증가된 단위시간당 발현효율을 보이며 별다른 발현유도과정이 필요하지 않으므로 발효조를 이용한 대량생산시 간단한 배양공정과 배양시간을 크게 단축할 수 있음이 큰 장점으로 부각된다.

<표 3>. MOX 프로모터와 GAP 프로모터를 이용한 알부민 발현 양상 비교

Expressioncassette	HSA(μg/mL)	OD600
	12hr	24hr	36hr	48hr	72hr	12hr	24hr	36hr	48hr	72hr
PMOX-HSA(Single copy at the MOX locus)	Glycerol	0	5	15	30	40	45	91	87	86	81
	Methanol	5	40	60	80	95	8	47	53	56	51
PGAP-HSA(Single copy at the GAP locus)	Glycerol	30	70	80	80	80	51	91	86	81	72
	Methanol	5	15	15	15	10	12	58	57	56	55

<실시예 4>. (한세눌라 폴리모르파GAP프로모터의 고발현을 위한 고농도

배양조건 분석)

(1). 플라스크 배양을 통한 예비분석

한세눌라 폴리모르파GAP프로모터에서 발현되는GAPmRNA나 HSA mRNA에 대한 상기 노던블롯(Northern blot) 분석결과(도 5(a))는 이들 mRNA들은 세포의 성장이 활발하게 지속되는 동안 구성적으로 발현되지만 배양 정체기(stationary phase) 후기에는GAP프로모터로부터의 발현율이 감소됨을 보였다.

이는 고농도 배양을 통한 알부민 대량 생산시 구성성 발현 프로모터로 알려진 P _GAP 의 지속적인 활성을 위해서는 적정량의 탄소원 공급이 계속적으로 수행되어야 함을 시사한다. 이와 같이 구성성 프로모터들의 활성이 배양 정체기에는 침체되는 현상이 사카로마이세스 세레비시애의GAP프로모터(Hottiger et al., Yeast 10, 283-296(1994))와ADH1프로모터의 경우(Ruohonen et al., Yeast 7, 337-346(1991))에도 보고되었다.

한편 한세눌라 폴리모르파는 크렙트리 효과를 받지 않는 효모이기에 고농도의 탄소원을 함유한 배지에서도 배양이 가능함을 시사하므로, 한세눌라 폴리모르파를 고농도의 글리세롤을 함유한 배지에서 배양함으로써 균체 성장과 더불어GAP프로모터로부터 지속적으로 활발한 발현을 유도할 수 있는 가능성을 조사하였다.

한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 균주를 3%, 6% 그리고 12% 글리세롤이 첨가된 YP 배지에서 진탕 배양하면서 형질전환체의 성장 및 알부민 생산 분석과 더불어 글리세롤 소모정도와 에탄올 생산량을 분석하였다.

도 6(a)에서 보는 바와 같이 글리세롤 농도가 높아짐에 따라 한세눌라 폴리모르파가 지수성장기에 도입하는 데 시간이 글리세롤 농도가 낮은 경우보다 더 소요되었으나 12% 글리세롤에서도 3% 글리세롤에서와 비견할 만한 속도로 성장하였고 최종적으로 더 많은 균체량이 축적되었다. 배양 72 시간 후의 글리세롤 잔류량은 12% 글리세롤을 사용한 경우도 2% 정도만 남아있었고 에탄올 생성은 거의 무시할 정도여서 글리세롤은 한세눌라 폴리모르파를 고농도로 배양하기에 매우 좋은 탄소원임을 확인할 수 있었다.

또한 알부민 발현량도 글리세롤 농도가 높을수록 균체량 증가와 더불어 함께 증가되어 고농도의 글리세롤를 함유한 배지에서 배양하는 것이GAP프로모터 활성을 지속적으로 유지하는 데에도 훨씬 유리한 것으로 나타났는데(도 6(b)), 상기 결과를 아래 표 4에 정리하였다.

<표 4>. 글리세롤 농도가 알부민, 에탄올 생산 및 균체 성장에 미치는 영향*

초기 글리세롤 농도	3%	6%	12%
OD600pHglycerol(%)EtOH(%)HSA (mg/L)	1146.200.02270	1446.000.039150	1806.42.450.03200

*플라스크 배양 72 시간 후에 측정

(2) 발효조를 이용한 유가배양 조건 분석

알부민 생산공정이 산업적으로 성공하기 위해서는 최적화된 발효조건에 의한높은 수율의 알부민 발현과 함께 이를 산업적으로 쉽게 이식할 수 있는 단순화된 발효공정이 요구된다. 한세눌라 폴리모르파와 같은 메탄올자화 효모는MOX프로모터를 사용하는 경우 메탄올을 탄소원으로 사용하는데, 기질인 메탄올에 의한 저해로 인해 비성장 속도가 다른 탄소원에 비하여 낮으므로 되도록 연속공정에 의해서 낮은 농도의 메탄올을 지속적으로 공급해야 한다.

그러나, 실제적인 산업화 공정에서는 연속식 보다는 공정이 단순한 유가식 배양이 현실적으로 선호되고 있으며, 낮은 농도의 메탄올 농도를 유지하기 위한 연속적인 공급은 특히 규모가 큰 산업 생산공정에서는 거의 조절이 불가능하다. 또한 매우 왕성한 메탄올 옥시다제 활성을 지닌 한세눌라 폴리모르파의 경우 메탄올 소모 속도가 매우 빨라서 많은 양의 메탄올이 소모되는 데 휘발성이 높은 메탄올의 대량 사용은 화재 위험상의 문제 때문에도 실제적인 산업화에 적용하기에는 매우 제한적이다. 이와 같은 실용적 관점에서 구성적GAP프로모터를 이용하는 경우 12%의 높은 농도의 글리세롤을 탄소원으로 공급해도 세포 비 성장속도도 높으며 지속적인 알부민 발현이 진행됨을 보여준 상기 플라스크 실험 결과는 고농도 탄소원의 단발공급을 이용하는 산업적으로 실용성이 높은 발효 공정을 개발할 수 있음을 시사하고 있다.

단순화된 효모 유가배양 시스템을 개발하기 위하여 삼각 플라스크 배양의 결과를 토대로 5L 발효조에서 글리세롤의 농도를 증가시키면서 유가 배양을 수행하였다. 그 결과, 도 7(a), 도 7(b) 및 도 7(c)에 나타낸 바와 같이 글리세롤 주입 농도가 3%(w/v)에서 12%(w/v)까지 증가함에 따라서 총 균체량은 다소 증가하였지만알부민 생성량은 5배 이상 증가하였다.

따라서, 도 8에 나타낸 바와 같이 단위 글리세롤 농도당 균체량(Yx/s)과 세포 비성장속도는 0.4431h^-1에서 0.3583h^-1으로 다소 감소하였으나 단위 글리세롤 농도당 알부민 생산량(Yp/x)는 5배 되는 현저한 증가를 보였다. 12% 글리세롤의 경우, 단 한번의 탄소원의 유가 배양으로 세포농도를 OD₆₀₀기준으로 260, 건조세포중량으로 83 g/L의 고농도 세포 배양을 이루었으며, 이때의 알부민 생성량은 500 mg/L 이상이었고, 고농도의 탄소원의 공급에도 불구하고 에탄올 생성량은 5 g/L 미만으로 나타났다.

그러므로 본 발명에서 개발된 고농도 글리세롤의 단발공급에 의한 단순화된 효모 유가배양 공정은GAP프로모터를 이용한 재조합 알부민 생산 한세눌라 폴리모르파 형질전화체의 고농도 균체 배양과 동시에 매우 높은 알부민 생산성을 확보할 수 있는 실제적 산업화에 쉽게 응용 가능한 실용적인 공정이다. 또한 발효 말기까지 알부민 분해와 세포자가분해가 거의 일어나지 않으므로 알부민 정제공정 수율 향상 면에서도 매우 경제적인 발효 공정이다.

본 발명의 효과는GAP프로모터와 같은 구성성 프로모터를 사용한 인간 혈청 알부민 발현벡터로 형질전환된 재조합 한세눌라 폴리모르파 균주를 고농도 글리세롤이 함유된 배지에서 배양함으로써 구성성 프로모터 활성을 지속적으로 유지시키면서도 균체의 자가분해를 방지하여 분리정제가 수월한 알부민을 고효율로 발현하는 형질전환체를 고농도로 대량 배양할 수 있는 매우 간단한 발효공정을 제공함에 있다.

특히, 특정한 발현 유도조건이나 유도물질 첨가 없이도 고효율 발현을 지속적으로 유지하여 발효조를 이용하여 한세눌라 폴리모르파에서 재조합 단백질을 대량생산하고자 할 때 배양시간을 크게 단축하고 발효공정을 크게 단순화함이 큰 장점이다.

따라서, 최근 광우병 확산으로 인해 혈장의 안정성 및 혈장 공급의 감소로 인해 재조합 알부민 제품화 필요성이 급증하고 있는 의약산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (7)

1. 알부민 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파 유래의 글리세르알데하이드3포스페이트 디하이드로게나아제 유전자 부위로 특정하게 삽입되도록 제조된 재조합벡터로서, 도 2(c)에 기재된 개열지도를 갖는 발현벡터 pYHSA173 (KCTC 10006BP).
2. 제 1항에 있어서,

   상기 발현벡터는 알부민 cDNA에서 유래된 5' UTR이 포함된 상태로 알부민을 코딩하는 cDNA가 한세눌라 폴리모르파 유래의 글리세르알데하이드3포스페이트 디하이드로게나아제 프로모터에 연결됨을 특징으로 하는 발현벡터 pYHSA173 (KCTC 10006BP).
3. 알부민 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파 GAP 유전자 부위로 특정하게 삽입되도록 제조된 재조합벡터로서 도 2(c)에 기재된 개열지도를 갖는 발현벡터 pYHSA173 (KCTC 10006BP)이 글리세르알데하이드3포스페이트 디하이드로게나아제 유전자 부위로 삽입된 형질전환 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 (KCTC 10007BP).
4. 알부민 발현벡터가 한세눌라 폴리모르파 유래의 글리세르알데하이드3포스페이트 디하이드로게나아제 유전자 부위로 특정하게 삽입되도록 제조된 발현벡터 pYHSA173 (KCTC 10006BP)를 이용하여 한세눌라 폴리모르파를 형질전환시키고, 상기 과정에 의하여 형질전환된 효모 한세눌라 폴리모르파 DL1-L/G12 (KCTC 10007BP)를 배양하여 생산함을 특징으로 하는 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법.
5. 제 4항에 있어서,

   형질전환된 효모는 고농도의 글리세롤이 함유된 배지를 단발적으로 주입시키는 유가배양법으로 배양함을 특징으로 하는 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법.
6. 제 5항에 있어서,

   글리세롤의 농도는 6%(w/v) 이상 임을 특징으로 하는 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법.
7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,

   형질전환된 효모의 배양시 배지 pH를 5.5-6.0으로 유지하여 균주의 자가분해와 배양액으로 분비발현된 재조합 알부민의 분해를 방지함을 특징으로 하는 재조합 인간혈청 알부민의 제조방법.