KR0141312B1 - 변형된 프로모터와 leu2-d 유전자를 포함하는 신규 효모 발현 벡터 - Google Patents

변형된 프로모터와 leu2-d 유전자를 포함하는 신규 효모 발현 벡터

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KR0141312B1 KR1019940029992A KR19940029992A KR0141312B1 KR 0141312 B1 KR0141312 B1 KR 0141312B1 KR 1019940029992 A KR1019940029992 A KR 1019940029992A KR 19940029992 A KR19940029992 A KR 19940029992A KR 0141312 B1 KR0141312 B1 KR 0141312B1
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Abstract

본 발명은 프로모터에 연결된 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 세 번째 앞의 염기가 아데닌으로 치환된 변형된 프로모터와 효모의 루이신 합성에 관여하는 LEU2 유전자의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자를 포함하는, 외래 유전자의 효모에서 발현율을 높일 수 있는 신규 발현 백터에 관한 것이다.

Description

변형된 프로모터와 leu2-d 유전자를 포함하는 신규 호모 발현 백터
제1도의 a는 PGK 프로모터에 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV-I)의 표면단백질 유전자 P17을 연결하여 플라스미드 pYH-10을 제작하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,
제1도의 b는 PGK 프로모터의 조절하에 P-17베타갈락토시다제(LacZ) 융합 단백질을 생산할 수 있는 플라스미드 pYH-10Z의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,
제2도는 하이드록실아민 처리에 의해 변형된 PGK 프로모터의 변형된 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸 것이고,
제3도는 변형된 PGK 프로모터, LacZ 유전자 및 leu2-d 유전자를 갖는 플라스미드 pYH10-Zd의 제작 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,
제4도는 변형전의 PGK 프로모터, 변형된 PGK 프로모터 또는 변형된 PGK 프로모터와 Leu2-d 유전자를 포함하는 플라스미드에 P17 유전자 또는 싸이토카인 인터루킨-6(IL6) 유전자를 삽입하여 제작된 플라스미드로 각각 형질전환된 효모에서의 P17-LacZ 또는 IL-6-LacZ 융합단백질의 발현량을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 믈롯팅 분석에 의해 확인한 결과를 나타낸 것이고,
제5도는 변형전의 킬라틴 프로모터, 변형된 킬라틴 프로모터 또는 변형된 킬라틴 프로모터와 Leu2-d 유전자를 포함하는 플라스미드에 P17 유전자 도는 IL-6 유전자를 삽입하여 제작된 플라스미드로 각각 형질전환된 효모에서의 P17-LacZ 또는 IL-6-LacZ 융합 단백질의 발현량을 SDS-폴리아크릴리아미드 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯팅 분석에 의해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 효모로부터 생리활성이 있는 외래 단백질을 대량 생산하기 위하여 사용할 수 있는, 효모 세포내에서 호율적 발현이 가능한 신규 발현 벡터에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 프로모터에 연결된 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 세 번째 앞의 염기가 아데닌으로 치환된 변형된 프로모터와 효모의 루이신 합성에 관여하는 LEU2 유전자의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자를 포함하는, 외래 유전자의 효모에서의 발현율을 높일 수 있는 신규 발현 백터에 관한 것이다.
지금까지 효모에서 진핵세표 유전자를 발현시키기 위해서는 유전자의 전사(transcription)를 담당하는 프로모터로서 포스포글리세레이트 키나아제(phosphoglycerate kinase, PGK) 프로모터(Hitzeman et al., Science 219, 620-625(1983))와 구리 이온에 의해 발현이 유도되는 킬라틴(chelatin) 프로로모(Etchevery, Methods in Enzymology, 185, 319,329(1990)) 등을 사용하여 왔다. 그러나, 상기 프로모터를 이용하여 생산되는 단백질의 양은 단백질의 성질에 따라 차이가 있고, 상기 프로모터들은 일반적으로 진핵유전자 단백질의 생산 목적으로 쓰기에는 일반적으로 발현효율이 낮은 단점이 있으므로, 효모에서 외래 진핵 단백질을 발현시킬 때 발현율을 증가시킬 수 있는 백터의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 상기 단점을 해결하고 효모에서 외래 단백질의 발현 효울을 증가시킬 수 있는 백터를 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 프로모터에 연결된 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째의 염기가 아데닌으로 치환된 변형된 프로모터와 효모의 루이신 합성에 관여하는 LEU2 유전자의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자를 포함하는 벡터가 외래 유전자의 효모에서의 발현율을높일 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 효모에서 외래 단백질의 발현율을 높일 수 있는 신규 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 발현 벡터로 형질전환된 효모 및 이를 배양하여 외래 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명에서는 프로모터에 연결된 진행 유전자의 발현 효율을 증가시키도록 변형된 프로모터 및 상기 변형된 프로모터를 갖는 벡터에 효모의 루이신 합성 유전인자중 하나인 LUE2 유전자의 프로모터 일부가 제거된 leu2-d 유전자를 삽입함으로써 루이신이 없는 배지에서 효모 세포내의 변형된 프로모터를 가진 벡터 수가 증가하여 외래 단백질의 발현량을 크게 증가시킬 수 있는 개량된 벡터가 제공된다.
상기 개량된 벡터에 삽입된 목적 단백질을 코드하는 유전자의 효모내 발현량은 대장균의 베타갈락토시다제(LacZ) 유전자를 상기 목적 단백질을 유전자의 3'-말단에 연결하여 목적 단백질과 베타갈락토시다제의 융합 단백질이 생산되도록 한 후 베타갈락토시다제의 활성을 측정함으로써 쉽게 측정할 수 있다.
본 발명의 변형된 프로모터는 그에 연결된 외래 목적 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째의 염기가 아데닌으로 치환된 것으로, 효모에서 진핵 유전자의 발현을 위해 사용되는 프로모터라면 어느 것이라도 변형시켜 사용 할 수 있다. 사용가능한 프로모터로서는 PGK 프로모터, 킬라틴 프로모터, GAL 프로모터 및 ADH 프로모터 등을 예로 들 수 있다. PGK 프로모터의 경우에는 하이드록 실아민을 이용하여 변형시킨 결과 번역 개시 코돈 직전의 서열이 5'-GATCCCAATAGG-3'인 것으로 확인되었다.
본 발명의 변형된 프로모터를 포함하는 효모 발현 벡터는 외래 유전자로서 어느 진핵 유전자도 상기 프로모터의 조절을 받도록 벡터에 삽입하여 그의 단백질을 발현시킬 수 있느며, 예를 들면, 후천성면역결핍 바이러스(HIV-I)의 표면 단백질 P17 또는 인터루킨-6 은 그의 유전자를 본 발명의 벡터에 삽입하여 효모내에서 발현시킴으로써 생산 할 수 있다. 또한, 외래 유전자를 포함한 상기 벡터에 효모의 루이신 합성에 관여하는 유전자인 LEU2의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자를 십입한 벡터를 사용한 경우에는 변형시키지 않은 프로모터만을 단독으로 사용한 경우보다 발현효율이 훨씬 더 증가한다.
예를 들면, 변형된 PGK 프로모터를 포함하는 효모 발현 벡터에 HIV-I의 표면 유전자 P17을 삽입하여 제조된 플라스미드인 pYH10ZM 으로 효모를 형질전환시킨 후 이를 배양하고, 플라스미드의 발현 효율을 생산된 단백질의 양 또는 3'-쪽에 결합된 대장균 베타갈락토시다제의 활성을 측정하여 비교하면 원래의 PGK 프로모터를 이용했을 때보다 발현 효율이 4∼6배 이상 증가함을 알 수 있다. 또한, 상기 벡터에 효모의 루이신 합성에 관여하는 유전자인 LEU2 의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자를 삽입한 벡터인 pYH10Zd를 사용한 경우에는 발현 효율이 2∼4배 더증가되어 변형시키지 않은 PGK 프로모터만을 단독으로 사용한 경우보다 발현효율이 10∼15배 증가한다.
구리 이온에 의해 발현이 유도되는 킬라틴 프로모터가 그에 연결된 외래 목적 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째의 염기가 아데닌인 상기 서열을 포함하도록 변형시킨 후 이를 포함하는 벡터에 외래 유전자로서 상기 유전자 P17을 삽입하여 제조된 벡터인 플라스미드 pYH-FZM을 이용하여 효모에서 상기 유전자 P17을 발현시키면 원래의 킬라틴 프로모터를 포함하는 벡터로 형질저환시킨 경우에 비해 발현 효울이 3∼5배 증가하며, 변형된 칼라틴 플로모터를 포함하는 벡터에 leu2-d 유전자를 삽입하여 제조된 벡터인 pYH-FZd 의 경우에는 발현효율이 2∼4배 더 증가한다.
변형된 킬라틴 플로모터를 포함하는 벡터로 형질전환된 효모를 배양할 때 목적 단백질의 발현을 유도하기 위해서는 구리 이온을 배양액에 첨가해야 하며 이때 첨가되는 구리 이온의 농도는 10∼30μM, 바람직하게는 20μM 이다.
따라서, 프로모터에 연결된 외래 목적 단백질 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째의 염기가 아데닌으로 치환된 것으로, 번역 개시 코돈 직전의 서열이 5'-CAATAGG-3'인 변형된 프로모터 및 leu2-d 유전자를 함유하는 본 발명의 효모벡터는 외부 유전자의 효모내에서의 발현 효율을 15배 이상 증가시킨다.
본 발명의 상기 발현 벡터들은 목적 단백질을 생산할 수 있는 효모 형질전환체를 제조하는데 사용될 수 있으며, 효모 숙주세포로서는 20B-12, L3262 등을 사용할 수 있고, L3262가 바람직하다. 형질전환된 효모는 30℃에서 배양함으로써 목적 단백질을 높은 효율로 발현시킬 수 있다.
효모에서 발현된 목적 단백질은 여러 가지 통상적인 방법으로 정제할 수 있으며, 특히 베타갈락토시다제와 융합된 형태로 발현되는 경우에는 베타갈각토시다제 항체를 이용한 친화 크로마토그라피(affinity chromatography)를 이용하여 순수정제할 수 있는 장점이 있다.
이하 실시예로써 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하지만, 하기 실시예들은 단지 예시적 목적으로 주어진 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.
[실시예1]
변형된 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제작
(단계1)
PGK 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제작
PGK 프로모터를 가진 플라스미드 YEpIPT(R.A. Hitzeman, et al., Science 219, 620-625(1983)))의 PGK 프로모터의 3'-말단 쪽에 있는 BamHI 인식부위를 제한효소 BamHI 로 절단한 후, 외래 유전자로서 플라스미드 pYYM-gagl(유향숙 등, 한국미생물학회지 29, 1-7(1991))로부터 BamHI을 이용하여 절단해낸 에이즈 바이러즈의 표면 단백질 유전자 p17을 연결하여 플라스미드 pYH-10을 제조하였다(제1도의 A 참조).
계속해서, P17 단백질과 LacZ 단백질의 융합 단백질을 생산할 수 있는 발현 벡터를 제조하기 위해 다음과 같이 실시하였다. 플라스미드 pYH-10의 PGK 플로모터를 GAL10 프로모터로 바꾸어 제조한 플라스미드 pYHG 에 대장균의 LacZ유전자를 삽입하여 플라스미드 pYHG-Z를 제작하고, 이를 제한효소 SacI 및 BamHI으로 절단하여 얻은 LacZ 단편을 SacI 및 BamHI 으로 절단될 플라스미드 pYH-10의 PGK 프로모터의 하류에 삽입하여 플라스미드 pCK-1을 제작하였다. 플라스미드 pCK-1을 다시 BamHI 으로 절단한 후, 플라스미드 pYH-10을 BamHI으로 절단하여 얻은 P17 유전자 단편과 결합시켜 PGK 프로모터 다음에 P17 유전자 및 LacZ 유전자를 포함하는 플라스미드 pYH-10Z를 제작하였다(제1도의 B참조).
(단계2) 변형된 PGK 프로모터를 포함하는 발현 벡터의 제작
플라스미드 pYH-10Z DNA 5㎍을 하이드록실아민 용액(0.99% NaOH, 0.35g 하이드록실아민, HC1/5㎖ 의 찬물)에 녹이고 10∼12 시간 동안 반응시켜 DNA에 변성이 일어나게 한 후 10㎍의 5M NaC1 과 50㎍ 의 0.1% 우형 혈청 알부민(BSA)을 넣어 반응을 중지시켰다. 생성된 용액에 1㎖의 에탄올을 섞어 DNA가 침전되도록 하고, 침전된 DNA를 원심분리에 의해 분리한 후 증류수에 녹여 보관하였다. 상기 DNA 용액을 이용하여 리튬 아세테이트 방법(lithium acetate method; Ito, H., et al., J. Bacteriol. 153, 163(1983))에 의해 효모 균주 20B-12(a trp1, pep4-3, cuplR, KTCC 1557)를 형질전환시켰다. 형질전환된 효모세포를 트립토판이 없는 YNB 배지(0.67% 아미노산 결핍 효모 질소 기질, 2% 글루코즈, 1.5% 한천)에 접종하고 30℃에서 이틀간 배양한 후 생성된 콜로니를 X-gal 이 들어있는 클리프톤(Clifton) 배지 (0.1M KH2PO4, 0.015M (NH4)2SO4, 0.075M KOH, 0.8mM MgSO4·7H2O2μM Fe2(SO)4·9H2O, 40㎍/ℓ 티아민 40㎍/ℓ 피리독신 40㎍/ℓ 판토텐산, 200㎍/ℓ 이노시톨, 2㎍/ℓ 비오틴, 0.004% X-gal, 2% 글루코즈, pH 7.0에 복제하여 30℃에서 다시 배양하였다. 청색을 띤 콜로니를 선별하여 밀러(Miller)의 방법(Experiments in Molecular Genetics, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory)에 의해 베타갈락토시 다제 활성을 측정하고 플라스미드 pYH-10Z fh 형질전환된 효모세포에서의 베타갈락토시다제 활성과 비교하여 높은 활성도를 나타내는 콜로니만을 선택하였다. 선택된 콜로니로부터 플라스미드를 분리하고 이를 이용하여 하나한(Hanahan)의 방법(DNA Cloning Practical Approach, 1, 109(1985))으로 대장균 DH5α(Promega, U.S.A)를 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균을 100㎍/㎖의 앰피실린을 함유하는 LB 배지(1% 트립토느 0.5% 효모 추출물, 1% 한천)에서 배양하여 앰피시린에 대한 저항성을 나타내는 대장균으로부터 플라스미드를 분리하였다.
(단계3)
변형된 프로모터의 염기서열 확인
상기 (단계2)에서 분리한 플라스미드들의 DNA를 생거(Sanger)의 염기서열 결정법(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 74, 5463-5468(1977))을 이용하여 분석한 결과, P17 유전자의 ATG 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째 위치에 있는 구아닌(G) 염기가 아데닌(A) 염기로 치환된 하기 서열을 포함하는 프로모터를 가진 플라스미드를 함유하는 콜로니가 가장 높은 베타갈락토시다제 활성을 보였으며 변형되지 않은 플라스미드보다 5-6배 이상 높은 프로모터 활성을 나타냈다:
상기의 변형된 프로모터를 가진 플라스미드를 pYH-10ZM이라 명명하였다(제3도 참조).
[실시예2]
: 변형된 프로모터와 leu2-d 유전자를 갖는 벡터의 제조
효모의 루이신 합성에 관여하는 LEU2 유전자의 프로모터가 일부 제거된 leu2-d 유전자(Rose et al., Methods in Enzymology 185, 234-279(1990))를 가진 벡터는 leu2 돌연변이가 있는 효모 균주에 넣었을 때 효모가 루이신이 없는 배지에서 살아남기 위해서 leu2-d의 수를 많이 증폭시키므로 세포내 플라스미드의 수가 증가하며, 따라서, 상기 leu2-d 유전자를 가진 벡터에 외래 유전자를 넣으면 외래 유전자의수도 증가하게 된다. 변형된 PGK 프로모터를 가진 플라스미드 pYH-10ZM에 leu2-d 유전자를 가진 DNA 절편을 삽입하기 위하여 다음과 같이 실시하였다. leu2-d 유전자를 포함하는 플라스미드 pSI4(Dr. James Broach, Princeton University)를 HindIII 및 PvuII 로 절단 하여 leu2-d와 호모 복제시점인 2μm ori를 가진 307kb DNA 절편을 분리하고 클레나우(Klenow) 효소로 양끝을 메운 후, 플라스미드 pBR322(Promega, U.S.A)의 앰피실린 저항을 나타내는 유전자 Amp와 E. coli 복제 시점을 가지는 2.2 kb의 HindIII/PvuII 절편과 연결시켜 6.2 kb의 플라스미드 pCK-3 을제작하였다. 플라스미드 pCK-3을 PvuII 와 KpnI 으로 절단한 후, 플라스미드 pYH-10ZM을 DraI 및 KpnI으로 절단하여 얻은 PGK 프로모터-p17-lacZ 유전자를 함유하는 4.8kb 의 DNA 절편을 삽입하여 변형된 PGK 프로모터와 leu2-d 유전자를 함께 포함하는 플라스미드 pYH-10Zd를 제작하였다(제3도 참조). 상기 플라스미드 pYH-10Zd를 포함하는 대장균 DH5 @ (Escherichia coli DH5 @ /pYH-10Zd)는 1994년 11월 3일자로 한국과학기술연구원 부설 유전공학센터내의 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 8629P로 기탁하였다.
[실시예 3]
본 발명의 벡터의 발현 효율 조사
(단계1) 베타갈락토시다제 활성도
효모 세포 20B-12(a trp1. pep4-3, cup1R, KTCC 1557) 및 L3262(ura3-52, leu2-3, 112, his4-34, Dr. James Broach, Prinston University) 균주를 플라스미드 pYH-10Z, pYH-10ZM 및 pYH-10Zd 로 각각 형질전환시킨 후 트립토판 또는 루이신이 없는 YNB배지에서 자라는 콜로니를 각각 선택하여 X-gal이 들어있는 클리프톤 배지에 옮겨 30℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배지상에서 자란 청색의 콜로니를 선택하여 베타갈락토시다제의 양을 다음과 같이 직접 측정하였다. 형질전환된 효모를 5㎖의 YBN 배지에 접종하고 30℃에서 이틀간 배양하여 포화되게 한 다음 이중 100∼200㎕를 취하여 YBN 배지 50㎖에 접종하고 30℃에서 배양하였다. 배양액의 광학농도가 A600=0.6∼0.8 일 때 3㎖의 Z 완충액(16.1g Na2HPO4·7H2O, 5.5g NaH2PO4, pH 7.0, 0.75g KC1, 0.24g MgSO4·7H2O, 및 2.7㎖ 2-메르캅토에탄올/1ℓH2O)으로 효모세포를 세척한 후 다시 1㎖의 Z 완충액에 현탁시켰다. 이 현탁액에 CHCl3셋방울과 0.1% SDS 두 방울을 넣어 40초간 진탕하고 이중 20∼100㎕제 Z 완충액을 가하여 1㎖로 만든 다음 밀러의 방법(Miller, J.M., Experiments in Molecular Genetics, 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York)에 따라 베타갈락토시다제 활성도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표1에 나타낸 바와 같다.
(단계2) P17-lacZ 융합 단백질의 생산량 측정
P17-lacZ 의 융합단백질이 생산되는 양을 베타갈락토시다제(LacZ)의 활성도 이외의 실제로 효모 세포내에서 생산되는 단백질의양으로서 비고하기 위하여 SDS -플리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 분석하였다. (단계1) 에서와 같은 상태의 효모세포 각 10㎖를 원심분리(5,000xg, 5분)하여 세포침전물을 분리하고 이를 3㎖의 추출용액(200 mM Tris·HC1, pH 8.0, 10 mM MgCl5 mM EDTA)으로 세척하고 다시 원심분리(5,000xg, 5분)하였다. 세로침전물을 3㎖의 추출용액에 현탁한 후 동량의 유리 구슬(glass beads)을 첨가하고 흔들어 세포를 파쇄시켰다. 수득된 세포 추출물에 6배 농도의 시료분석 용액(300mM Tris·HCl pH6.8, 600mM DTT, 12% SDS, 0.6% 브로모페놀 블루, 60% 글리세롤)을 첨가하여 95℃에서 5분 동안 끓인 후 원심분리(10,000xg, 10분)하고 상층액을 10% SDS-폴리아크릴 아미드 겔에서 전기영동하였다. 코마시블루(Coomassie Brilliant Blue R250)로 겔을 염색하여 발현된 단백질량을 확인하였다(제4도의 A 참조). 제4도에서, W는 변형전의 PGK 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를, M는 변형된 PGK 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를 D는 변형된 PGK 프로모터 및 leu2-d 유전자를 동시에 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를 각각 나타낸다.
한편, 겔상에서 분리된 단백질을 염색하지 않고 전기적으로 니트로셀룰로즈 필터(Millipore, U.S.A)로 옮긴 후 알칼라인 포스파타제(alialine phosphatase) 발색법(Sambrook et al., molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3, Cold Spring harbor Laboratory(1989))을 이용한 웨스턴 블롯팅 분석을 하였다.
오염 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해 필터를 1% 우형 혈청 알부민(bovinw serum albumin, BSA)을 함유하는 TBST 용액1(10 mM Tris·HC1, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% 트윈(Tween) 20)에서 30분 동안 반응시킨 다음, 500배 희석된 제 1차 항체인 항-β-gal 마우스 항체(Promega, U.S.A)가 첨가된 TBST 용액 1로 옮겨 30분 동안 반응시켰다. TBST 용액 2(100mM Tris·HC1, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5mM MgCl)에 기질인 NBT(nitro blue tetrazolium)와 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)를 각각 132㎕ 및 66㎕씩 넣고 발색되는 정도를 관찰하였다(제4도의 B 참조)
그 결과, 제4도에서 보는 바와 같이 변형된 PGK 프로모터를 가진 플라스미드 pYH-10ZM 으로 형질전환된 효모는 변형되지 않은 PGK 프로모터를 가진 플라스미드 pYH-10Z를 함유하는 효모균주보다 5-6배 이상 많은 단백질 생산량을 보였으며 변형된 프로모터와 leu2-d를 함께 가진 플라스미드 pYH-10Zd의 경우에는 더 증가된 단백질의 샌산량을 보였다.
[실시예4]
변형된 PGK 프로모터와 leu2-d를 함유하는 플라스미드를 이용한 싸이토카인 IL-6-LacZ 융합 단백질의 생산.
변형된 PGK 프로모터와 leu2-d를 함유하는 플라스미드가 일반적으로 진핵 유전자의 효모내에서의 발현율을 증가시키는데 사용될 수 있는가 검토하기 위하여, 플라스미드 pYH-10Z, pYH-10ZM 및 pYH-10Zd에서 에이즈 바이러스 표면단백질 P17 유전자를 싸이토카인 IL-6 유전자로 각각 대치한 플라스미드 pYHIL-10Z, pYHIL-10ZM 및 pYHIL-10Zd를 각각 제조하여 IL-6-LacZ 연결단백질의 발현정도를 측정하였다. 베타갈락토시다제 활성도는 하기 표 2에 보이는 바와 같이 변형된 PGK 프로모터 및 leu2-d를 함께 가진 플라스미드로 형질전환된 효모의 경우 변형전의 PGK 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모보다 12배 정도의 활성도를 보였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분석에서 단백질의 양은 10배 이상 증가되어 생산되었고(제4도의 A 참조) , 웨스턴 블롯팅 분석의 결과(제4도의 B참조)에서도 변형된 PGK 프로모터 및leu2-d를 함께 가진 플라스미드로 형질전환된 효모의 경우 변형전의 PGK 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모보다 베타갈락토시다제의 생산량이 훨씬 증가함을 알 수 있었다.
실시예 5: PGK 프로모터를 킬라틴 프로모터로 대치한 벡터의 활성도
PGK 프로모터를 킬라틴 프로모터로 대치한 벡터의 발현 활성도를 조사하기 위하여, 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 세 번째의 아데닌염기를 함유하는 5'-CAATAGG-3' 서열을 그대로 유지하면서 플라스미드 pYH-10Z, pYH-10ZM 및 pYH-10Zd에 PGK 프로모터 대신에 구리 이온에 의해 발현이 유도되는 킬라틴 프로모터를 삽입하여 플라스미드 pYH-FZ, pYH-FZM 및 pYH-FZd를 제조하였다. 상기 플라스미중 pYH-FZd를 포함하는 대장균 DH5 @ (Escherichia coli DH5 @/pYH-FZd)는 1994년 11월 3일자로 한국과학기술연구원 부설 유전공학센터 내의 유전자은행(KCTC)에 기탁번호 KCTC 8628P로 기탁하였다.
제조된 플라스미드 pYH-FZ, pYH-FZM 및 pYH-FZd에서 에이즈 바이러스 표면단백질 P17 유전자를 사이토카인 IL-6 유전자로 각각 대치하여 플라스미드 pYHIL-FZ, pYHIL-FZM 및 pYHIL-FZd를 각각 제조하였다. 상기 플라스미드들의 발현 활성도를 실시예 4와 동일한 방법으로 비교한 결과, 하기 표3에 나타난 바와 같이 변형된 킬라틴 프로모터 및 leu2-d를 함께 가진 플라스미드로 형질전환된 효모의 경우 변형전의 킬라틴 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모 보다 15배 정도의 베타갈락토시다제 활성도를 보였다.
P17-LacZ 및 IL6-LacZ의 생산량을 확인한 SDS-폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 분석 및 웨스턴 블롯팅 분석을 결과가 제5도의 A 및 B에 각각 나타나 있다. 제5도에서, W는 변형전의 킬라틴 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를, M은 변형된 킬라틴 플로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를, D는 변형된 킬라틴 프로모터 및 leu2-d 유전자를 동시에 가진 플라스미드로 형질전환된 효모를 각각 나타낸다. 제5도의 결과에서도 변형된 킬라틴 프로모터 및 leu2-d를 함께 가진 플라스미드로 형질전환된 효모의 경우 변형전의 킬라틴 프로모터를 가진 플라스미드로 형질전환된 효모보다 베타갈락토시다제의 생산량이 훨씬 증가함을 알 수 있었다.
그러므로, 본 발명에서 베조한 번역 개시 코돈으로부터 상류 쪽으로 세 번째의 염기가 아데닌(A)인 서열 5' CAATAGG-3'을 갖는 DNA를 번역 개시 코돈과 프로모터 DNA 사이에 가지고 있고 leu2-d 유전자를 함유하는 플라스미드는 기존의 효모 프로모터들, 예를 들어 PGK 또는 킬라틴 만을 함유하는 플라시미드보다 효모내에서의 발현효율이 10-15배 이상 증가되는 벡터이며, 이 벡터를 이용하면 생리활성이 있는 진핵 단백질들을 효모내에서 대량생산할 수 있다.

Claims (8)

  1. 외래 목적 단백질을 코드하는 유전자 및 상기 유전자의 번역 개시 코돈으로부터 상류쪽으로 3번째의 염기가 아데닌이 되도록 변형된 PGK 프로모터 또는 킬라틴 프로모터를 포함하는, 효모내에서 외래 목적 단백질을 대량으로 발현시키기 위한 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 변형된 PGK 프로모터 또는 변형된 킬라틴 프로모터의 3'-말단의 염기 서열이 5'-CAATAGG-3' 인 발현 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 효모세포내에서 플라스미드의 수를 증가시킬 수 있는 leu2-d 유전자를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 목적 단백질이 인간 면역 결핍 바이러스(HIV-I)의 표면단백질 P17 또는 인터루킨-6인 발현 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 플라스미드 pYH-10ZM, pYH-10Zd, pYH-FZM, pYH-FZd, pYHIL-10ZM, pYHIL-10Zd, pYHIL-FZM, 또는 pYHIL-FZd 인 발현 벡터.
  6. 제5항의 플라스미드로 형질전환된 대장균 DH5α/pYH-10ZM, DH5α/pYH-10Zd(KCTC 8629P) DH5α/pYH-FZM, DH5α/pYH-FZd(TCTC 8628P), DH5α/pYHIL-10ZM, DH5α/pYHIL-10Zd, DH5α/pYHIL-FZM 또는 DH5α/pYHIL-FZd.
  7. 제5항의 플라스미드로 형질전환된 효모세포 20B-12 또 L3262.
  8. 제7항의 형질 전환된 효모 세포를 배양하고 배양된 세포 추출물로부터 HIV-I 의 표면단백질 P17 또는 인터루킨-6을 분리함을 포함하는, HIV-I의 표면 단백질 P17 또는 인터루킨-6의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2012057396A1 (ko) * 2010-10-25 2012-05-03 이화여자대학교 산학협력단 염색체 통합용 효모 발현 벡터 및 이의 용도

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