CN117821460A - 新型内含子、环状rna及其体外制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种环状RNA的体外制备方法,包括下列步骤:质粒构建:将T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2,第一外显子E1,5’内含子,3’同源臂,和酶切位点EcoRI的基因片段连接到表达载体上;所述3’内含子和5’内含子的组成来自于SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2序列;质粒线性化和纯化;体外转录;第一步环化,第二步环化,或者一步法经过纯化得到环状RNA。本发明通过将TwortⅠ型内含子进行改造,将剪切的内含子序列插入目的片段5’末端及3’末端之间,将线性的mRNA高效环化,并具有较少的外源性碱基残留,由所述制备方法得到的环状RNA可适用于mRNA疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及到利用I类新型内含子自剪接活性在体外条件下环状RNA的制备方法、以及获得的环状RNA。
背景技术
与传统技术相比,mRNA疫苗具有更高的免疫原性、安全性及低成本规模级制备的显著优势,在基因编辑、细胞治疗与肿瘤新抗原疫苗等领域也具有广阔蓝海。然而,mRNA本身的种种固有缺点也不容忽视。由于mRNA易降解、难储藏的特性,Moderna与BioNTech公司生产的mRNA疫苗需要在-20℃或-70℃条件下进行储藏运输。除此以外,线性mRNA会引发较强的免疫原性,往往需要对核酸进行修饰,例如使用假尿嘧啶取代尿嘧啶,才能够将其引发的免疫反应控制在合理范围内。这些严苛条件极大的限制了mRNA技术的发展和应用。如何进行升级改造,实现mRNA的常温储藏、免疫可控就成为了技术开发的当务之急。
Circular RNA(circRNA)是一种首尾以共价键连接的闭合的环状RNA,在真核细胞中广泛存在。因不具有线性mRNA的Poly A尾及5’末端和3’末端,circRNA对RNA酶消化和水解具有更强的抵抗力。在近年的研究中,越来越多的内源性circRNA已经被发现具有翻译和蛋白表达的功能,为circRNA的实际应用奠定了理论基础,Chuyun Chen等人更是证明在室温条件下储藏15天对circRNA的翻译活性几乎没有影响,此外有研究者证明人工制备的circRNA比线性mRNA在真核细胞内具有更持久的蛋白表达及更低的非特异性免疫刺激。因此,circRNA既继承了线性mRNA的特点,同时拥有稳定、持久、易储藏运输的天然优势。
当前的circRNA体外制备方法主要包括酶连法以及利用具有自剪接功能的I型或Ⅱ型内含子进行环化的PIE技术(Permuted Intron-exon)。酶连法主要是指利用T4 DNA或RNA连接酶在ATP的辅助下将线性mRNA进行首尾连接,其主要优势在于较少的外源性碱基残留,然而这种方法对核酸链的长度有着严格要求,不适用于长链RNA的环化,且无法保证RNA的环化效率,不适用于circRNA的规模级制备。PIE技术最早可追溯到上世纪九十年代,由M.Puttaraju和Michael D.Been共同提出,首次将剪切后的Tetrahymena及Anabaena的I型内含子连接在外显子两端,并在Mg2+与GTP的催化下成功将线性mRNA环化。由于当时年代技术的限制,这种环化效率并不理想且无法获得高纯度的circRNA,难以实际应用于疫苗或药物开发等领域。直到2018年,R.Alexander Wesselhoeft等人对PIE法进一步优化实现了以Anabaena内含子为基础的高效率体外环化,然而这一方法会使circRNA残留较多的外源性核酸序列,部分观点认为circRNA的免疫原性与其残留的外源性核酸序列长度相关,可能会引起非特异性免疫。
除了利用I型内含子的PIE系统外,Ⅱ型内含子也可被改造用于circRNA的制备,Chuyun Chen等人证明Clostridium tetani的Ⅱ型内含子的不同切割方式对circRNA的环化效率有较大的影响,传统观点认为Ⅱ型内含子的体内外剪接原理可能存在差异,其体外剪接机制仍需明确,对Ⅱ型内含子的改造依然困难,是否具备普适性应用也仍不可知。
发明内容
基于此,本发明的目的是提供了基于PIE系统的高效体外制备circRNA的方法,将IVT(In vitro transcription,体外转录)制备的mRNA高效环化成circRNA,并具有较少的外源性碱基残留。
本发明通过部分I型内含子的改造,实现mRNA的高效环化,提出了一种全新的PIE制备circRNA的方法。
本发明的第一方面,提供了用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子,其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二方面,提供了任一核酸分子SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2在体外制备环状RNA中的应用。
本发明的第三方面,提供了用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子,其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列,且无重叠区域。
在其中的一些实施例中,所述3’内含子和5’内含子的组成构成SEQ ID NO.1或SEQID NO.2完整的序列。
在其中的一些实施例中,所述3’内含子与5’内含子来自于SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2中的任意片段,所述3’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp,5’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp来自与SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2中不重合的序列,且3’内含子与5’内含子组合成完整的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2。
在其中的一些实施例中,其组成选自以下中的至少一组:
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
SEQ ID NO.11和AAACA;
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20;
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24;
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26;
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30;
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32;
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48。
在其中的一些优选实施例中,其组成选自以下中的至少一组:SEQ ID NO.3和SEQID NO.4;SEQ ID NO.11和AAACA;SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18;SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24。这些3’内含子和5’内含子体外制备环状RNA时具有更高的环化效率,总体效果更好。
本发明的第四方面,提供了任一上述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状RNA中的应用。
本发明的第五方面,提供了一种环状RNA的体外制备方法。
一种环状RNA的体外制备方法,包括下列步骤:
s1质粒构建:将T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2,第一外显子E1,5’内含子,3’同源臂,和酶切位点EcoR I的基因片段连接到表达载体上;所述3’内含子和5’内含子的组成来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2序列中其一的同一序列;
s2质粒线性化和纯化;
s3体外转录和环化,纯化后得到环状RNA。
在其中一些实施例中,所述3’内含子与5’内含子来自于SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2中的任意片段,所述3’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp,5’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp来自与SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2中不重合的序列,且3’内含子与5’内含子组合成完整的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2。
在其中一些实施例中,s3体外转录和环化,纯化包括:
s3.1体外转录:纯化后的线性化质粒DNA为模板,在转录酶的催化下进行体外转录;然后去除多余未反应的线性化模板;
s3.2进行第一步环化,并对环化的RNA进行柱纯化;
s3.3进行第二步环化,并对环化的RNA进行柱纯化,得到环状RNA。
在其中一些实施例中,s3体外转录和环化,纯化包括:
s3.1’:配制一步法反应体系,将所述一步法反应体系的各成分混合均匀后,保持恒温使其发生环化;其中所述一步法反应体系中包括RNA聚合酶、RNase抑制剂、焦磷酸酶、环化反应缓冲液和碱基,无酶无菌水、线性化质粒;所述外源性RNA的环化反应缓冲液,包括Tris-HCL缓冲液,亚精胺、TCEP或DTT、Mg2+,pH为6.5~8.5,所述Mg2+的浓度为190mM~400mM,所述亚精胺的浓度为5mM~80mM;所述TCEP的浓度为5mM~35mM,所述DTT的浓度为180~220mM;
s3.2’:线性化模板去除;
s3.3’:RNA纯化和去除线性RNA;纯化后即得环状RNA。
在其中一些实施例中,体外转录步骤中,所述的线性化质粒DNA浓度为350ng/μL-650ng/μL。
在其中一些实施例中,表达载体为pSP64-Poly(A)载体。
在其中一些实施例中,所述第一步环化包括:添加GTP至最终浓度为2±0.2mM,然后将反应体系在55±2℃加热15±2min。
在其中一些实施例中,所述第二步环化包括:RNA变性后在含有GTP的反应体系中,55±2℃反应8±1min。
本发明的第六方面,是提供由上述制备方法得到的环状RNA。
本发明的第七方面,是提供上述环状RNA在制备mRNA疫苗中的应用。
本发明通过将Twort I型内含子进行改造,得到两条序列SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示,其分别为Twort nrdE intron1和Twort nrdE intron2,通过任意剪切,获得环化效率较高的所述3’内含子与5’内含子,将剪切的内含子序列插入目的片段5’末端及3’末端之间,在体外制备环状RNA时,能将线性的mRNA高效环化,并具有较少的外源性碱基残留。
附图说明
图1为IVT产物及环化产物的凝胶电泳检测结果示意图。
图2为RNase R消化产物的凝胶电泳检测结果示意图。
图3为Sanger法测序circRNA接头序列结果示意图。
图4为circRNA的体外一步法IVT及环化结果示意图。
图5为一步法制备circRNA的RNase R消化耐受实验结果示意图。
图6为nrdE intron1不同置换位点的内含子一步法制备环状circRNA的结果示意图。
图7为nrdE intron2不同置换位点的内含子一步法制备环状circRNA的结果示意图。
图8为实施例4中RNase R处理后的circRNA-GFP凝胶电泳图。
图9为实施例4中circRNA-GFP转染后的293T荧光图。
图10为实施例4中circRNA-GFP表达持久性验证结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
序列1(Twort nrdE intron1,321nt)Complete intron:
序列2(Twort nrdE intron2,331nt)Complete intron:
*序列1和序列2是高度同源的(参考文献:Landthaler M,Begley U,Lau NC,ShubDA.Two self-splicing group I introns in the ribonucleotide reductase largesubunit gene of Staphylococcus aureus phage Twort.Nucleic Acids Res.2002 May1;30(9):1935-43.doi:10.1093/nar/30.9.1935.PMID:11972330;PMCID:PMC113830.)
根据以上序列,可以根据其组成,任意截取不同长短的5'内含子和3'内含子序列,以下为任意的举例,可参照此,按照以下方式进行选取相应的5'内含子和3'内含子进行mRNA进行环化。
表1 Twort nrdE intron1的置换位点3'内含子片段序列和5'内含子片段序列
表2:Twort nrdE intron2的置换位点3'内含子片段序列和5'内含子片段序列
以上表格中,在完成环化后,内含子序列被剪切掉,外显子残留碱基(相互连接,形成封闭接头。
Circ2.4 exon-truncated的序列在环化的过程中两端各自只保留了8个碱基,即认为能够实现较短的外源碱基残留。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1:基于不同I型内含子的PIE法构建的RNA体外环化验证
1.1实验方法与步骤(1)质粒构建
为探究基于新型内含子的PIE法能否促进mRNA的体外环化,首先构建了含有不同内含子的质粒,此处所使用的构建环状RNA的DNA载体,包含T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2(Exon2),第一外显子E1(Exon1),5’内含子,3’同源臂,以及可用于质粒线性化的酶切位点EcoR I。所得基因片段连接到pSP64-Poly(A)载体。载体可委托金唯智进行合成。
构建环状RNA的DNA载体元件可参考如下文献:
Wesselhoeft RA,Kowalski PS,Anderson DG.Engineering circular RNA forpotent and stable translation in eukaryotic cells.Nat Commun.2018Jul 6;9(1):2629.
doi:10.1038/s41467-018-05096-6.PMID:29980667;PMCID:PMC6035260.
其中,nrdE intronl
Exonl:CAACCAGGGT(SEQ ID NO.51)
Exon2:GGGAAAACGT(SEQ ID NO.52)
nrdE intron2
Exon1:CAACCAGGGT(SEQ ID NO.53)
Exon2:ACACAATCCA(SEQ ID NO.54)。
在本实施例中,所使用的内含子序列除上述表1和表2所示之外,还包括如下表3所示:
/>
阳性对照Circ1.0的Exon外显子序列如下:
(2)质粒线性化
将10x Reaction buffer(cut smart)室温解冻并混匀,EcoRI-HF混匀后放于冰盒上。配置酶切体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应1小时。质粒线性化酶切体系:
名称 | 量 |
构建的质粒 | 20μg |
EcoRI-HF | 5μL |
10x Reaction buffer | 10μL |
RNase-free water | to 100μL |
线性化质粒纯化
在100μL上述酶切体系中加入100μL混匀的AMPureXP磁珠,Vortex混匀,室温静置孵育10分钟。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。加入1mL 70%乙醇清洗磁珠,旋涡重悬磁珠,静置20秒。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。重复一次以上两步清洗步骤。将70%乙醇吸干,磁珠室温干燥10分钟。加入40ul RNase-free水洗脱,孵育5分钟,重复洗脱一次。Nanodrop测浓度后,琼脂糖凝胶电泳进行线性化效率测定。
(3)体外转录
将NTPs和10x Reaction buffer室温解冻并混匀,IVT Enzyme mix(Thermoscientific)放于冰盒上。按照下表配制转录体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应3小时,得RNA solution。
体外转录体系:
名称 | 量 |
10x Reaction Buffer | 6μL |
100mM ATP | 6μL |
100mM CTP | 6μL |
100mM GTP | 6μL |
100mM UTP/100mM pseudo-UTP | 6μL |
IVT Enzyme mix | 6μL |
DNA template(DNA模板,线性化质粒) | 3μg |
RNase-free water | to 60μL |
线性化模板去除:
将DNase I放于冰盒上。按照下表配制去除质粒模板体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应0.5小时。
去除质粒模板体系:
名称 | 量 |
RNA solution | 60μL |
DNase I,RNase-free | 3μL |
(4)第一步环化
将100mM GTP放于冰盒上。
向完成体外转录的且去除线性化模板的样品中添加额外的GTP至最终浓度为2mM,然后将混合液在55℃加热15min。
留样:1μL
circRNA纯化:使用RNA Cleanup Kit(500μg)试剂盒(NEB)对第一步环化的RNA进行柱纯化。添加2倍反应体系的RNA Cleanup Binding Buffer(RNA纯化结合缓冲液)至RNA反应体系。添加3倍反应体系的无水乙醇到混合液中,用移液枪混匀,勿旋涡。将混合液转移至吸附柱中,吸附柱插入到收集管中,于4℃,16000g离心1min。将吸附柱插入到另一个新的收集管中,添加500RNACleanup Wash Buffer(使用前确认Cleanup Wash Buffer已加入无水乙醇);于4℃,16000g离心1min。弃去收集管中液体,再用RNA Cleanup WashBuffer清洗一次。将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中,加入100μL RNase-free水洗脱RNA,静置2min,于4℃,16000g离心1min,收集洗脱液。并用洗脱液重复洗脱RNA一次。
(5)第二步环化
将100mM GTP放于冰盒;配制2X Re-circular Buffer,使体系中含有终浓度100mMTris-HCL、20mM MgCl2、2mM DTT;取50μL上述步骤(4)中的实验产物,置于70℃加热5min后,置于冰上3min,以便其充分变性;按照下表配制RNA第二步环化体系,充分混匀后,于金属浴中55℃反应8min。
名称 | 量 |
第一步环化及纯化产物 | 50μL |
2X Re-circular Buffer | 75μL |
100mM GTP | 3μL |
RNase-free water | to 150μL |
留样:1μL,以便后续凝胶电泳检测。circRNA纯化:同步骤(4)中的描述。
(6)线性mRNA去除
将第二步环化并经过纯化的10μg RNA置于65℃加热3min后,置于冰上3min;按照下表配制linear mRNA去除体系,充分混匀后,于金属浴中37℃消化1h,置于冰上。
名称 | 量 |
RNA | 100μg |
RNase R | 2.5μL |
10X RNaseR buffer | 10μL |
RNase-free water | to 100μL |
circRNA纯化:同步骤(4)中的描述。
(7)circRNA的鉴定
A.试剂配制:0.9g琼脂糖粉加入60mL 1xTBE溶液中,加热将琼脂塘融化,将凝胶倒入槽中。B.mRNA检测:将mRNA稀释至50ng/μL,取1μL mRNA溶液,加入3μL体积的4×RNAloading buffer混匀,75℃加热5min,上样进行琼脂糖凝胶检测,凝胶电泳条件为165V,20min。待电泳结束后,在凝胶成像仪中进行成像。
1.2实验结果
(1)DNA转录模板制备
线性化模板浓度:pCirc2.1:598.82ng/μL;pCirc2.2:604.55ng/μL;pCirc2.3:600.97ng/μL;pCirc2.4:602.02ng/Ml;pCirc2.5:654.37ng/μL;pCirc2.6:629.99ng/μL;pCirc2.7:593.03ng/μL。
(2)mRNA体外转录与环化
①mRNA转录纯化后RNA浓度:Circ2.1:7211.9ng/μL;Circ2.2:7044.8ng/μL;
Circ2.3:7623.8ng/μL;Circ2.4:4515.3ng/μL;Circ2.5:8415.1ng/μL;Circ2.6:14079.1ng/μL;
Circ2.7:9754.3ng/μL。
②mRNA环化并纯化后RNA浓度:Circ2.1:2401.4ng/μL;Circ2.2:1745.6ng/μL;
Circ2.3:1777.3ng/μL;Circ2.4:1705.1ng/μL;Circ2.5:2832ng/μL;Circ2.6:2202.4ng/μL;
Circ2.7:2725.8ng/μL。
③RNA变性琼脂糖凝胶电泳。
如图1,本实验采用传统环化方式,即首先对Circ2.1-Circ2.7的线性化模板进行IVT,获得线性mRNA,再在不同缓冲液中进行分步体外环化,以获得环状mRNA。与线性mRNA凝胶电泳结果相比,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6在环化后出现明显条带分布改变,Circ2.4的环化产物在500nt左右出现明亮条带,而Circ2.5、Circ2.6的产物大小也与预期基本相符。由于circRNA的复杂高级结构,在实际实验中可能会出现条带迁移,因此初步认为Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6环化成功。
RNase R消化抵抗测试及Sanger测序验证
①RNase R消化测试:由于circRNA没有裸露的5’及3’末端,相较于线性mRNA具有更强的RNase R消化抗性,因此首先尝试使用RNase R消化前期认为已经环化的Circ2.4-Circ2.6,实验结果如图2所示。circRNA由于缺少裸露的5’及3’末端,具有更强的RNase R消化抗性。在RNase R消化后,Circ2.4主要条带依旧明亮,Circ2.5及Circ2.6的环化产物占比则随RNase R消化时间延长而增加,证明Circ2.4-Circ2.6的目的产物未受到RNase R消化影响,目的条带应为环状RNA。即在相同上样量的情况下,RNase R消化时间越长,则circRNA的条带亮度越是明亮,证明目的条带的确为mRNA环化产物。
②Sanger测序验证:由于I型内含子的固有剪接机制,在环化完成后,本实验所设计的内含子序列会被完全切除,环状RNA接头处分别是E2与E1,并以共价键形式连接,因此本实验以特异性引物扩增含有circRNA接头部分的E2与E1序列,通过测序来验证是否环化成功。如图3所示,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6分别为对应E2-E1的连接序列,由于Circ2.5与Circ2.6设计采用相同I型内含子的不同剪接位点,因此其接头部分序列相同。这说明Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6环化成功。
本实验使用RNase R消化后的纯化产物为模板,首先进行体外反转录获得cDNA,再使用引物进行体外扩增以获得包含circRNA接头序列的PCR产物。最终Sanger法测序结果及序列比对证明,目的条带确为环状RNA,证明所提供的基于新型内含子的PIE法体外制备circRNA的可行性。
由于circRNA的复杂高级结构,在实际实验中可能会出现条带迁移,因此初步认为Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6环化成功。
实施例2:一步法RNA环化验证
2.1实验方法与步骤
在上述实施例1的基础上,采用与上述实施例1相同的内含子与外显子元件,尝试进行IVT同步RNA环化,以达到减少过程性损失的目的。
①circRNA的IVT及体外环化
按照如下表格进行溶液配制:
试剂名称 | 投入量 |
模板 | 2μg |
T7 RNA polymerase | 8.5μL |
RNase Inhibitor | 0.1μL |
Pyrophosphatase | 1μL |
10x Reaction Buffer | 4μL |
100mM ATP | 4μL |
100mM CTP | 4μL |
100mM GTP | 4μL |
100mM UTP | 4μL |
RNase free water | To 40μL |
所述环化反应缓冲溶液(Reaction Buffer)的组成为:400mM Tris-HCL,200mMMgCl2,25mM TCEP,20mM spermidine(pH=7.9)。
将上述溶液混匀后,在PCR仪中以37℃孵育3.5h,孵育结束后取1μL样品稀释后进行凝胶电泳。
②IVT产物去模板
将2μL DNase I分别加入上述IVT产物中,并在PCR仪中继续37℃孵育30分钟,待反应结束后,取1μL样品稀释进行凝胶电泳。
③RNase R消化及circRNA的纯化
在实施例1的基础上,对本实施例的部分实验产物进行RNase R消化及纯化。
在本实施例实验结果中,通过Image J软件分析circRNA凝胶电泳结果的灰度值占比,并根据以下定义分别计算circRNA的环化效率、RNase R酶消化前纯度及RNase R酶消化后纯度。
circRNA的环化效率计算公式:使用经过IVT、DNase I消化及纯化的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算circRNA条带占据circRNA条带灰度及线性核酸前体条带灰度值总和的百分比。
公式为:凝胶电泳circRNA条带灰度值/(凝胶电泳circRNA条带灰度值+凝胶电泳线性RNA条带灰度值)*100%
RNase R酶消化前纯度:使用经过IVT、DNase I消化及纯化的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算所得circRNA条带占据所有核酸条带灰度的百分比。
公式为:circRNA条带灰度值/全核酸条带灰度值总和*100%
RNase R酶消化后纯度:使用RNA酶消化并纯化后的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算所得circRNA条带占据所有核酸条带灰度的百分比。
公式为:circRNA条带灰度值/全核酸条带灰度值总和*100%。
2.2实验结果
(1)circRNA的一步法IVT及环化
circRNA一步法环化及纯化后浓度:Circ2.4:435.6ng/μL;Circ2.5:336.6ng/μL;Circ2.6:324.9ng/μL。
结果参见图4所示。采用一步法制备circRNA,即通过优化IVT相关缓冲液的成分组成,以达到IVT-环化同步进行的目的。在改变实验参数后,Circ2.1-Circ2.3及Circ2.7主要产物大小与线性mRNA条带大小相同,证明未能成功环化或只有少量环化,Circ2.4-Circ2.6则出现明显条带大小改变,且与图1中条带分布基本相同,认为环化成功,同时,Circ2.5及Circ2.6各产物占比出现改变,推测是由于实验条件改变造成的差异。
可见,在完成一步法环化后,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6出现明显条带迁移,初步判断环化成功。
(2)circRNA一步法产物的RNase R消化实验
由于本实施例采用IVT-环化一步法,即省略中间相关操作步骤。因此,核酸的浓度只有最终纯化完成后才能获得。选择相应的IVT及环化产物进行RNase R消化实验。如图5所示,在完成RNase R消化后,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6对应条带中杂带明显减少,且目的条带明亮无降解痕迹,且该方法制备的circRNA与传统环化方法制备的circRNA相比,具有更高的纯度,证明环化成功。
实施例3:基于内含子的不同剪接方式构建的环状RNA
此外,还对表1和表2中的来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2的3’内含子与5’内含子的进行了相关实验。
3.1实验方法与步骤
在上述实施例1和2的基础上,对内含子的剪接位点进行重新设计,采用一步法进行体外环化,以验证其环化的可行性;在本实施例中,内含子序列除了实施例2中相应的Circ2.5和Circ2.6,还包括:Circ2.13、Circ2.14、Circ2.16、Circ2.22、Circ2.23、Circ2.24、Circ2.25、Circ2.26、Circ2.27、Circ2.28、Circ2.29、Circ2.30、Circ2.31、Circ2.34、Circ2.36、Circ2.37、Circ2.58、Circ2.59、Circ2.60、Circ2.61、Circ2.62、Circ2.63、Circ2.64,具体构成表1和表2。
①质粒线性化
将10x Reaction buffer(cut smart)室温解冻并混匀,EcoRI-HF混匀后放于冰盒上。配置酶切体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应2小时。
质粒线性化酶切体系:
名称 | 量 |
构建的质粒 | 20μg |
EcoRI-HF | 5μL |
10x Reaction buffer | 10μL |
RNase-free water | to 100μL |
②线性化质粒纯化
在100uL上述酶切体系中加入100uL混匀的AMPureXP磁珠,Vortex混匀,室温静置孵育10分钟。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。加入1mL 70%乙醇清洗磁珠,旋涡重悬磁珠,静置20秒。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。重复一次以上两步清洗步骤。将70%乙醇吸干,磁珠室温干燥10分钟。加入400uL RNase-free水洗脱,孵育5分钟,重复洗脱一次。Nanodrop测浓度后,琼脂糖凝胶电泳进行线性化效率测定。
③circRNA的IVT及体外环化
按照如下表格进行溶液配制:
试剂名称 | 投入量 |
模板 | 2μg |
T7 RNA polymerase | 8.5uL |
RNase Inhibitor | 0.1uL |
Pyrophosphatase | 1uL |
10x Reaction Buffer | 4uL |
100mM ATP | 4uL |
100mM CTP | 4uL |
100mM GTP | 4uL |
100mM UTP | 4uL |
RNase free water | To 40uL |
将上述溶液混匀后,在PCR仪中以37℃孵育3h,孵育结束后取1μL样品稀释后进行凝胶电泳。
3.2实验结果
(1)DNA转录模板制备
线性化模板浓度为:
pCirc2.13:396.92ng/Ml;pCirc2.14:411.43ng/μL;pCirc2.16:402.66ng/μL;pCirc2.22:264.20ng/μL;
pCirc2.23:325.30ng/μL;pCirc2.24:288.90ng/μL;pCirc2.25:313.90ng/μL;
pCirc2.26:320.30ng/μL;pCirc2.27:322.37ng/μL;pCirc2.28:334.48ng/μL;pCirc2.29:349.17ng/μL;
pCirc2.30:300.14ng/μL;pCirc2.31:340.81ng/μL;pCirc2.34:349.53ng/μL;pCirc2.36:340.69ng/μL;
pCirc2.58:303.51ng/μL;pCirc2.59:363.14ng/μL;pCirc2.60:298.46ng/μL;pCirc2.61:394.95ng/μL;
pCirc2.62:280.967ng/μL;pCirc2.63:310.174ng/μL;pCirc2.64:379.01ng/μL。
(2)mRNA体外转录与环化
①circRNA一步法制备及纯化后浓度:
Circ2.13:4275.7g/μL;Circ2.14:3461ng/μL;Circ2.16:5661.1ng/μL;Circ2.22:1810ng/μL;
Circ2.23:1720.5ng/μL;Circ2.24:1463.3ng/μL;Circ2.25:1771.4ng/μL;Circ2.26:1489.7ng/μL;
Circ2.27:4047.4ng/μL;Circ2.28:3978.9ng/μL;Circ2.29:4022.5ng/μL;Circ2.30:3959.7ng/μL;
Circ2.31:3701.2ng/μL;Circ2.34:4020.3ng/μL;Circ2.36:3843.9ng/μL;Circ2.58:4376.8ng/μL;
Circ2.59:4500.9ng/μL;Circ2.60:4572.0ng/μL;Circ2.61:4441.1ng/μL;Circ2.62:4276.7ng/μL;
Circ2.63:4586.16ng/μL;Circ2.64:4573.8ng/μL。
②RNase R消化及纯化后浓度:
Circ2.13:832.6g/μL;Circ2.14:289.7ng/μL;Circ2.16:343.5ng/μL;Circ2.22:158.1ng/μL;
Circ2.23:272.6ng/μL;Circ2.24:452.9ng/μL;Circ2.25:293.3ng/μL;Circ2.26:293.2ng/μL;
Circ2.27:66ng/μL;Circ2.28:110.8ng/μL;Circ2.29:202.6ng/μL;Circ2.30:74.3ng/μL;
Circ2.31:170.1ng/μL;Circ2.34:499.3ng/μL;Circ2.36:64.7ng/μL;Circ2.58:685.4ng/μL;
Circ2.59:874.1ng/μL;Circ2.60:874.6ng/μL;Circ2.61:647.3ng/μL;Circ2.62:349.5ng/μL;
Circ2.63:257.2ng/μL;Circ2.64:392.7ng/μL。
具体结果参见表4和表5,从结果看出可以来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2的3’内含子与5’内含子能够环化成功,其其中的杂带较少,其中,环化效率较好的有Circ 2.4、Circ 2.22、Circ 2.23、Circ 2.25、Circ 2.58、Circ 2.59、Circ 2.62。
针对Twort nrdE intron1的结果如下表4:
针对Twort nrdE intron2的结果如下表5:
Circ No. | R-纯度 | R+纯度 | R-前环化效率 |
2.27 | 47.17% | 77.73% | 72.8l% |
2.28 | 0% | 0% | 0% |
2.29 | 0% | 0% | 0% |
2.30 | 0% | 0% | 0% |
2.31 | 0% | 0% | 0% |
2.34 | 0% | 0% | 0% |
2.36 | 0% | 0% | 0% |
2.37 | 0% | 0% | 0% |
2.63 | 32.05% | 50.14% | 50.04% |
2.64 | 0% | 0% | 0% |
参见图6-图7,从实验结果可以看出,对Twort nrdE intron1和Twort nrdEintron2通过分割获得的置换位点:
与线性mRNA凝胶电泳结果相比,针对Twort nrdE intron1,其中Circ2.4在环化后出现明显条带分布改变,Circ2.4的环化产物在500nt左右出现明亮条带,而Circ2.13、Circ2.14、Circ2.16、Circ2.22、Circ2.23、Circ2.24、Circ2.25、Circ2.58、Circ2.59、Circ2.60、Circ2.62的产物大小也与预期基本相符,Circ2.61的环化效率稍差。而Circ2.24未见到明显条带,属于PIE在体外RNA环化不理想的情况。
与线性mRNA凝胶电泳结果相比,针对Twort nrdE intron2,请见图2和图4。其中Circ2.27、Circ2.63在环化后出现明显条带分布改变,在500nt左右出现明亮条带,而Circ2.28、Circ2.29、Circ2.30、Circ2.31、Circ2.34、Circ2.36、Circ2.37、Circ2.64未见到明显条带,未能得到合适的环化产物,属于PIE在体外RNA环化不理想的情况。
实施例4:基于新型内含子的circRNA蛋白表达验证
4.1实验方法与步骤
为确保本发明所涉及的内含子序列制备的circRNA能够具有蛋白表达的能力,在上述实施例2-3的基础上,采用与上述实施例2-3相同的内含子切割位点、外显子元件、5’同源臂序列及3’同源臂序列并添加额外的5’间隔区序列和3’间隔区序列,以CVB3IRES为翻译启动元件,构建编码绿色荧光蛋白(EGFP)的环状mRNA,并委托苏州金唯智生物科技有限公司完成进行质粒合成。
一、质粒线性化、线性circRNA前体制备、模板消化及纯化同上述实施例1所述,环状RNA IVT、RNase R消化、纯化及凝胶电泳同上述实施例2-3所述。
1)线性化模板浓度为:Circ2.4-GFP:371.31ng/μL;Circ2.13-GFP:389.52ng/μL;
Circ2.14-GFP:397.55ng/μL;Circ2.16-GFP:354.16ng/μL;Circ2.22:482.47ng/μL;
Circ2.23-GFP:420.31ng/μL;Circ2.25-GFP:373.9ng/μL;Circ2.26-GFP:453.94ng/μL;
Circ2.27-GFP:407.77ng/μL。
2)circRNA一步法制备及纯化后浓度:Circ2.4-GFP:8170.3ng/μL;
Circ2.13-GFP:4726.2ng/μL;Circ2.14-GFP:3808.4ng/μL;Circ2.16-GFP:5494.3ng/μL;
Circ2.22-GFP:4513.1ng/μL;Circ2.23-GFP:6347.4ng/μL;Circ-GFP2.25:5438.9ng/μL;
Circ2.26-GFP:4352.4ng/μL;Circ2.27-GFP:5813.4ng/μL。
3)RNase R消化及纯化后浓度:Circ2.4-GFP:400.4ng/μL;Circ2.13-GFP:556ng/μL;
Circ2.14-GFP:270.5ng/μL;Circ2.16-GFP:522.4ng/μL;Circ2.22-GFP:511.6.1ng/μL;
Circ2.23-GFP:188.4ng/μL;Circ2.25-GFP:399.1ng/μL;Circ2.26-GFP:482.5ng/μL;
Circ2.27-GFP:273.3ng/μL。
二、细胞培养与mRNA转染如下所述:
1)细胞培养
293T细胞于37℃,5% CO2条件下进行培养,培养基为含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基,细胞每2-3天进行传代。
2)细胞转染
①转染前12小时将293T细胞按照5*106个/孔接种于12孔板中,并补足DMEM完全培养基至1mL。
②转染开始时,移除12孔板培养基,并向每个孔加入0.85mL对应的新鲜培养基。
③准备A,B两套各1.5mL离心管,分别标记为对应circRNA编号,向每个离心管中加入75μL OMEM培养基。
④向A套管每管加入1.5μg对应circRNA样品,向B管管分别每管加入3μLLipofectamine MessengerMax(Invitrogen)试剂,随后于室温条件下孵育10min。
⑤将管B液体加入对应管A中,充分混匀后室温静置5min。
⑥将管A内的混合液分别加入12孔板对应的孔中,轻柔混匀后将细胞放回培养箱中。
3)荧光显微镜拍照
在转染结束后2小时和6小时,分别使用荧光显微镜进行拍照。
4)流式细胞检测
在完成转染及荧光拍照后,每3天更换一次新鲜的DMEM完全培养基,并在14天时将293T细胞转移到流式管中准备进行检测。
流式细胞仪检测参数如下表所述:
4.2实验结果
RNase R处理后的circRNA-GFP凝胶电泳图如图8和下表6所示,从图中可以看出,其中针对SEQ ID NO.1(Twort nrdE intron1)中的Circ2.14-GFP的纯度最高,达93.8%,Circ2.27-GFP的纯度最低,仅为13.69。
通常认为随着插入序列的变长,最终circRNA的产率和纯度会降低。表6中可以看出,即使将CDS更换为更长的IRES+GFP的序列,也能够保持较高的纯度。
表6:
Sample | Intron | R+纯度 |
Circ2.4-GFP | nrdE1 | 70.08% |
Circ2.23-GFP | nrdE1 | 79.82% |
Circ2.13-GFP | nrdE1 | 80.85% |
Circ2.14-GFP | nrdE1 | 93.8% |
Circ2.16-GFP | nrdE1 | 75.77% |
Circ2.22-GFP | nrdE1 | 86.85% |
Circ2.25-GFP | nrdE1 | 73.44% |
Circ2.26-GFP | nrdE1 | 65.51% |
Circ2.27-GFP | nrdE2 | 13.69% |
circRNA-GFP转染后的293T荧光图如图9所示,图中Circ2.4-GFP,Circ2.13-GFP,Circ2.14-GFP,Circ2.16-GFP,Circ2.22-GFP,Circ2.23-GFP,Circ2.26-GFP转染组均可观测到显著GFP荧光证明本专利所提供新型内含子制备的环状RNA在插入表达驱动元件后能够促使蛋白在细胞内表达,Circ2.27-GFP具备微弱荧光,其自身制备纯度较差,环化效率较低,说明GFP蛋白是由环状RNA而非线性中间产物表达。
如图10所示,从左至右,依次是阴性对照(未转染RNA),阳性对照(转染Circ1.0-GFP),Circ2.4-GFP,Circ2.23-GFP,Circ2.13-GFP,Circ2.14-GFP,Circ2.16-GFP,Circ2.22-GFP,Circ2.25-GFP在circRNA转染14天后,与阴性对照组相比,仍能观测到转染组有显著的阳性率和GFP表达,证明本发明所涉及的新型内含子制备的circRNA在细胞内具有较好的稳定性和蛋白表达能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (14)
1.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子,其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.任一核酸分子SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2在体外制备环状RNA中的应用。
3.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列,且无重叠区域。
4.根据权利要求3所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其特征在于,所述3’内含子和5’内含子的组成构成SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2完整的序列。
5.根据权利要求3或4所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,所述3’内含子大于等于5碱基,5’内含子大于等于5碱基。
6.根据权利要求5所述的的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其组成选自以下中的至少一组:
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
SEQ ID NO.11和AAACA;
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20;
SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24;
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26;
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30;
SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32;
SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48。
7.根据权利要求6所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其组成选自以下中的至少一组:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;SEQ ID NO.11和AAACA;SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22;SEQ ID NO.23和SEQ IDNO.24。
8.权利要求3-7任一所述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状RNA中的应用。
9.一种环状RNA的体外制备方法,其特征在于,包括下列步骤:
s1.质粒构建:将T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2,第一外显子E1,5’内含子,3’同源臂,和酶切位点EcoRI的基因片段连接到表达载体上;所述3’内含子和5’内含子的组成来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2序列中其一的同一序列;
s2.质粒线性化和纯化;
s3.体外转录和环化,纯化后得到环状RNA。
10.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,所述3’内含子和5’内含子如权利要求3-6任一项所述。
11.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤s3包括以下:
s3.1.体外转录:纯化后的线性化质粒DNA为模板,在转录酶的催化下进行体外转录;然后去除多余未反应的线性化模板;
s3.2.进行第一步环化,并对环化的RNA进行柱纯化;
s3.3.进行第二步环化,并对环化的RNA进行柱纯化,得到环状RNA。
12.根据权利要求9所述的制备方法,其特征在于,步骤s3包括以下:
s3.1’:配制一步法反应体系,将一步法体系中的各成分混合均匀后,保持恒温使其发生环化;其中所述一步法反应体系中包括RNA聚合酶、RNase抑制剂、焦磷酸酶、环化反应缓冲液和碱基,无酶无菌水、线性化质粒;所述外源性RNA的环化反应缓冲液,包括Tris-HCL缓冲液,亚精胺、TCEP或DTT、Mg2+,pH为6.5~8.5,所述Mg2+的浓度为190mM~400mM,所述亚精胺的浓度为5mM~80mM;所述TCEP的浓度为5mM~35mM,所述DTT的浓度为180~220mM;
s3.2’:线性化模板去除;
s3.3’:RNA纯化和去除线性RNA;纯化后即得环状RNA。
13.根据权利要求9-12任一项所述制备方法得到的环状RNA。
14.根据权利要求13所述的环状RNA在制备mRNA疫苗中的应用。
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