JP4384492B2

JP4384492B2 - グリコシルホスファチジルイノシトール含有ポリペプチド

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Publication number: JP4384492B2
Application number: JP2003536934A
Authority: JP
Inventors: ロス、リチャード
Original assignee: Asterion Ltd
Current assignee: Asterion Ltd
Priority date: 2001-10-13
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2009-12-16
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Description

本発明は、サイトカインの受容体結合ドメインとグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの付加のためのシグナル配列を含むドメインとを含むポリペプチド、上記ポリペプチドを製造する方法、上記ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびに上記ポリペプチド含有治療用組成物に関する。

ＧＰＩアンカーは、タンパク質の翻訳後修飾であり、それはそれらのタンパク質が細胞膜の細胞外側に固着することを可能にするグリコシルホスファチジルイノシトールを付加することである。通常、ＧＰＩアンカーを有するタンパク質は膜貫通または細胞質ドメインを有さない。ＧＰＩアンカータンパク質は、タンパク質の多様なファミリーを形成し、これには限定としてではなく例として、膜結合酵素、原生動物寄生虫（トリパノソーマ・ブルーセイ種など）の外側表面を被覆する接着分子およびタンパク質が挙げられる。腎臓には、ＧＰＩ固着化タンパク質の多数の例、すなわちウロモジュリン（uromodulin）、炭酸脱水酵素ＩＶ型、アルカリホスファターゼ、Ｔｈｙ−１、ＢＰ−３、アミノペプチダーゼＰ、およびジペプチジルペプチダーゼが包含される。

全てのＧＰＩアンカータンパク質は、最初に膜貫通アンカーと共に合成され、これは、小胞体を横切って移行した後、特定のトランスアミダーゼ酵素により、切断されて予め形成されたＧＰＩアンカーに共有結合する。ＧＰＩアンカーの付加によるタンパク質の修飾は、重要な性質をタンパク質に与える。なぜなら脂質部分の付加は、タンパク質が細胞膜内に挿入されてそれによりタンパク質が固着することを可能にするからである。

合成ＧＰＩアンカー配列を作製するためにいくつかの一般的な必要条件が存在する。それら必要条件とは、塩基性残基のクラスターに続かない分子（１０〜２０アミノ酸）のＣ末端での疎水性領域、疎水性領域に先行する７〜１０残基の「スペーサードメイン」、およびスペーサー領域後の小アミノ酸であり、ここで前駆体の切断およびアンカーの付加が生じる。ＧＰＩアンカーは、予め組み立てられ、そして小胞体中の新生タンパク質に付加される。この工程に伴い、ＧＰＩアンカーがタンパク質の新たなＣ末端アミノ酸と共有結合するために、初期Ｃ末端ペプチドは除去される。

受容体と相互作用して適した生化学応答をもたらすリガンドはアゴニストとして既知であり、また生化学応答を妨げるかまたは阻害するものはアンタゴニストとして既知である。例えば、限定としてではないが、細胞特異的増殖因子は、アゴニストとして作用し、かつ細胞膜に位置する受容体に結合するリガンドである。

増殖因子の巨大な群は、サイトカインとして示され、多数の多様な細胞機能に関係している。これらは、限定としてではなく例として、免疫系の調整、エネルギー代謝の調節、ならびに増殖および発達の制御を包含する。サイトカインは、標的細胞の細胞表面で発現した受容体を介して、それら細胞機能の効果を媒介する。

サイトカイン受容体ファミリーの受容体は、単一の膜貫通ドメインを有し、かつ固有（intrinsic）酵素活性を欠いている（Kishimoto等、1994）。サイトカインがその同族受容体に結合すると、複合体は内部移行し、Ｊａｋ／ＳｔａｔおよびＭａｐｋ経路を包含するシグナル伝達カスケードの活性化を通じてシグナル伝達が生じる。内部移行にはリサイクリング工程が続き、これにより受容体分子は、細胞内でさらに使用されるために再生される。上記の例は、成長ホルモン（ＧＨ）および成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）への成長ホルモンの結合に関して記載される。

成長ホルモン（ＧＨ）の１つの分子は、２つの受容体分子と結合することが既知である（Cunningham等、1991; de Vos等、1992; Sundstrom等、1996; Clackson等、1998）。これは、ＧＨ上の２つの固有の受容体−結合部位と、２つの受容体の細胞外ドメイン上の共通結合ポケットとを通じて生じる。ＧＨ分子上の部位１は、部位２よりも高い親和性を有し、また受容体二量体化は、１つの受容体がＧＨ上の部位１に結合し、その後第二受容体を部位２へ補充することによって順次生じると考えられる。

ＧＨＲの細胞外ドメインは、それぞれ約１００アミノ酸（ＳＤ−１００）の２つの連結したドメインとして存在し、Ｃ末端ＳＤ−１００ドメインが細胞表面に最も近く、またＮ末端ＳＤ−１００ドメインが最も離れている。ホルモン結合で生じるのはこれら２つのドメインの立体配座変化であり、三量体複合体ＧＨＲ−ＧＨ−ＧＨＲの形成を伴う。

そのうえ、受容体の細胞質ドメインを欠く切断型ＧＨ受容体は、ＧＨシグナル伝達のドミナントネガティブインヒビターとして作用する（Ross等、1997）。切断型受容体は、内部移行に不可欠な細胞質ドメインを欠いているため、細胞表面で高レベルで発現される（Maamra等、1999）。切断型受容体は細胞質ドメインを欠いているため、ＧＨの存在下において、全長受容体とヘテロ二量体化してシグナル伝達を遮断する。切断型受容体が内部移行できないため、それはＧＨ受容体複合体の内部移行を阻止するドミナントネガティブインヒビターとして作用する。

本発明者らは、ＧＰＩアンカータンパク質のドメインを含むサイトカイン受容体変異体を合成した。変異体は細胞質ドメインを欠き、したがって、シグナル伝達する能力を有さない。ＧＰＩアンカードメインの提供は、変異体が膜内に挿入して、循環ＧＨと競合し、そして細胞表面でＧＨを結合してキメラ切断型ＧＰＩ固着受容体、ＧＨ、および本来の受容体からなるヘテロ二量体複合体になることにより、ＧＨシグナル伝達の有効なインヒビターとして作用することを意味する。さらに、切断型ＧＰＩ固着ＧＨ受容体は、大量の可溶性ＧＨ受容体[これはＧＨと結合する]を産生する。

多くのサイトカインは、二量体化またはオリゴマー化を介してそれらの同族受容体を活性化し、そして本発明は、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加により修飾された配列を含むポリペプチドドメインの提供により修飾されているサイトカイン受容体の提供に関する。

本発明の第１の態様によれば、
（ｉ）サイトカイン受容体のリガンド結合ドメイン、および
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトールの付加のためのシグナル配列を包含するドメインとを含む、キメラポリペプチドが提供される。

好ましくは、上記キメラポリペプチドは、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、およびグリコシルホスファチジルイノシトールの付加のためのシグナル配列を包含するドメインからなる。

好ましくは、ポリペプチドは、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加により修飾される。

好ましくは、修飾されたポリペプチドは、サイトカイン媒介細胞シグナル伝達のモジュレーターである。

好ましくは、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加のためのシグナル配列は、ＤＫＬＶＫＣＧＧＩＳＬＬＶＱＮＴＳＷＭＬＬＬＬＬＳＬＳＬＬＱＡＬＤＦＩＳＬ、
ＰＳＰＴＰＴＥＴＡＴＰＳＰＴＰＫＰＴＳＴＰＥＥＴＥＡＰＳＳＡＴＴＬＩＳＰＬＳＬＩＶＩＦＩＳＦＶＬＬＩ、
ＬＶＰＲＧＳＩＥＧＲＧＴＳＩＴＡＹＮＳＥＧＥＳＡＥＦＦＦＬＬＩＬＬＬＬＬＶＬＶ、および
ＴＳＩＴＡＹＫＳＥＧＥＳＡＥＦＦＦＬＬＩＬＬＬＬＬＶＬＶ
からなる群より選択される。

本発明の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドはアンタゴニストである。

本発明は、サイトカインのその受容体に対する高い親和性および親油性ＧＰＩ尾部が形質膜中に再挿入する能力を活用する。本発明のポリペプチドは、サイトカイン受容体リガンド結合ドメインおよびＧＰＩアンカーの付加のための部位を含むタンパク質のドメインを含む「キメラ」である。キメラ分子は、Ｃ末端ＧＰＩアンカーを有する細胞外サイトカインホルモン結合ドメインからなるだろう。

循環中に、キメラタンパク質は、中心にＧＰＩアンカーを有する、多数のキメラタンパク質のミセルを形成することが予想される。細胞膜との接触で、ＧＰＩは細胞膜中に再挿入する。本発明は、サイトカインのキメラへの結合が受容体：ホルモン：キメラ複合体をもたらすという重要な利点を有する。ＧＨの例において、これはＧＨＲ：ＧＨ：キメラとなるだろう。キメラが切断型受容体であり、したがって受容体シグナル伝達と内部移行の両方を遮断するので、この複合体は、シグナル伝達しないだろう。

本発明の他の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドキメラは、循環(circulating)アンタゴニストとして作用する。循環中のミセル分子はその中心にＧＰＩアンカー、および外方向に向いた受容体の結合ドメインを有し、したがってホルモンと結合してその作用と拮抗し得ることが予想される。

本発明の他の好ましい実施形態において、上記ポリペプチドキメラは、遺伝子治療による局所的または遺伝子組み替え発現の結果として、アンタゴニストとして作用する。形質移入または遺伝子治療が細胞レベルまたは全身のいずれかで用いられ得ることが予想されるだろう。したがって、細胞での局所的発現はサイトカインの作用と拮抗しうる、もしくは炎症を起こした膝のような身体部分へのＤＮＡの注射が炎症サイトカイン（ＴＮＦなど）の作用を遮断する。

本発明の好ましい実施形態において、サイトカイン受容体のリガンド結合ドメインが、成長ホルモン（ＧＨ）、レプチン、エリスロポイエチン、プロラクチン、ＴＮＦ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のｐ３５サブユニット、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロフィン（cardiotrophin）−１（ＣＴ−１）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、インターフェロン、ＩＦＮαおよびＩＦＮγ、からなる群より選択される受容体に由来する。

好ましくは、サイトカイン受容体のリガンド結合ドメインが、成長ホルモン受容体に由来する。

本発明の１つの実施形態において、ポリペプチドが融合タンパク質である。

本発明のさらに好ましい実施形態において、上記ポリペプチドが、図３または図９または図１４または図１５に示されるアミノ酸配列を含む。

本発明のさらに好ましい実施形態において、本発明によるポリペプチドが提供され、これは少なくとも１個のアミノ酸残基の付加、除去、または置換により修飾されている本発明によるポリペプチドの配列変異体を提供する。

典型的には、変異体は、その生理活性に関連しないポリペプチドの特徴を特に変更するように修飾されたキメラを包含する。例えば、システイン残基は、望まないジスルフィド結合を阻止するために、置換または除去され得る。同様に、特定のアミノ酸は、発現系でのプロテアーゼによるタンパク質分解を除去することにより、キメラの発現を高めるように変更され得る。

変異体キメラが発現され、そしてどの突然変異が所望の性質を有する変異体ポリペプチドを提供するかを決定するために、１種または複数の活性について検査される。さらなる突然変異が、ポリペプチドのアミノ酸配列に関しては無変化(silent）であるが、特定の宿主での（例えば、酵母菌およびタマホコリカビ種(Dictyostelium spp.)などの粘菌での）翻訳に好ましいコドンを提供する変異体になされ得る。

当業者はまた、保存的(conservative)アミノ酸置換がキメラポリペプチドでなされて前述のポリペプチドと機能的に等価な変異体を提供し得る、すなわち変異体はキメラの機能的能力を保持することを理解するだろう。本明細書中で使用されるとおり、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対電荷またはサイズ特性を変更しないアミノ酸置換を指す。

変異体は、例えば「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning : A Laboratory Manual）」、J. Sambrook等編、第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、または「分子生物学における最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、F. M. Ausubel等編、John Wiley & Sons, Inc., New Yorkのような編さんした参照文献に見られる、当業者に既知のポリペプチド配列を変更する方法に従って調製され得る。アミノ酸の保存的置換は、以下の群、（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、および（ｇ）Ｅ、Ｄ内で、アミノ酸間でなされる置換を含む。

キメラポリペプチドと機能的に等価な変異体を産生するためのこれらポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換が、典型的に、キメラをコードする核酸の改変によりなされる。そのような置換は、当業者に既知の様々な方法によりなされ得る。例えば、アミノ酸置換は、Kunkel(Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492,1985)の方法に従って、ＰＣＲ−指向性(PCR-directed)突然変異、部位指向性(site-directed)突然変異誘発によりなされてもよい。

あるいは、または好ましくは、上記修飾が、本発明によるキメラポリペプチドの組換え型または合成型の産生に修飾アミノ酸を使用することを包含する。

修飾アミノ酸として、限定としてではなく例として、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリシン、Ｎ^６−アセチルリシン、Ｎ^６−メチルリシン、Ｎ^６，Ｎ^６−ジメチルリシン、Ｎ^６，Ｎ^６，Ｎ^６−トリメチルリシン、シクロヘキシル（cyclohexy）アラニン、Ｄ−アミノ酸、オルニチンが挙げられることは、当業者に明らかであるだろう。

修飾アミノ酸の組み込みは、本発明によるポリペプチドに有利な性質を与え得る。例えば、修飾アミノ酸の組み込みは、キメラポリペプチドのｉｎｖｉｖｏ安定性の増加を与え、したがって患者に投与される有効量のポリペプチドを減少させ得る。

本発明のさらなる態様では、本発明によるポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子が提供される。

本発明の好ましい実施形態において、上記核酸分子は、図３または図９に表されるような核酸配列を含む。

本発明の好ましい実施形態において、厳密(stringent)なハイブリダイゼーション条件下、図３または図９に表される配列とハイブリダイズする核酸配列が提供される。

本発明のさらなる態様では、図３または図９に表されるような核酸分子によりコードされるポリペプチドが提供される。

本発明のまたさらなる態様では、本発明の前述の態様または実施形態のいずれかによるポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を包含するベクターが提供される。

本発明の好ましい実施形態において、上記ベクターは、真核生物遺伝子発現に適合した発現ベクターである。

典型的な、上記適合が、細胞／組織特異的発現を媒介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供を包含する。これらのプロモーター配列が、細胞／組織特異的、誘導性、または恒常性であってもよい。

プロモーターは、当該技術分野で認識された用語であり、明確化という目的で以下の特徴を包含するが、これらは例示としてのみ提供され限定としてではない。エンハンサーエレメントは、遺伝子の転写開始部位に対して５'でしばしば見いだされるｃｉｓ作用性核酸配列である（エンハンサーはまた、遺伝子配列に対して３'でも見いだされ得、またはイントロン配列にさえも位置し得、それゆえに位置独立性である）。エンハンサーは、エンハンサーが連結した遺伝子の転写速度を増加させるように機能する。エンハンサー活性は、エンハンサーエレメントに特異的に結合することが示されているｔｒａｎｓ作用性転写因子（ポリペプチド）に応答する。転写因子の結合／活性（David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diegoによる真核生物転写因子を参照してほしい)は、多数の環境的合図に応答し、これには、限定としてではなく例として、中間代謝産物(例えば、グルコース、脂質)、環境的エフェクター(例えば、光、熱)が挙げられる。

プロモーターエレメントはまた、転写開始部位を選択するように機能する、いわゆるＴＡＴＡｂｏｘ、およびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、とりわけＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するように機能するポリペプチドにも結合する。

適合はまた、選択可能なマーカーおよび自己複製配列の提供を含み、これらは両方とも真核生物細胞のいずれかで上記ベクターの維持を促進する。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと呼ばれる。

ベクターでコードされた遺伝子の発現を促進する適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の提供を包含する。これはまた、ビシストロン性またはマルチシストロン性（multi-cistronic）発現カセットに配列されたベクターでコードされた遺伝子の発現を最大化するように機能する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の提供を包含する。

これらの適合は、当該技術分野で既知である。一般に発現ベクター構築および組換えＤＮＡ技法に関する文献が非常に多数出版されている。Sambrook等（1989）「分子クローニング：実験室手引書（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」、Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY およびその中の参照; Marston, F (1987)「ＤＮＡクローニング技法：実用的アプローチ第三巻（DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol III）」IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel等「分子生物学の最新プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」、John Wiley & Sons, Inc. (1994) を参照してほしい。

本発明によるベクターは遺伝子治療ベクターであり得ることが当業者に明らかであるだろう。遺伝子治療ベクターは、典型的にウイルスベースである。多数のウイルスが、一般に、外来性遺伝子の送達用ベクターとして使用される。一般に用いられるベクターとして、組換えで修飾された、外被のあるまたは外被のないＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられ、好ましくはバキュロウイルス科（baculoviridiae）、パルボウイルス科（parvoviridiae）、ピコルナウイルス科（picornoviridiae）、ヘルペスウイルス科（herpesveridiae）、ポックスウイルス科（poxviridae）、アデノウイルス科（adenoviridiae）、またはピコルナウイルス科（picornoviridiae）から選択される。親ベクターの性質のそれぞれの有利なエレメントを活用するキメラベクターもまた、用いられ得る（例えば、Feng等（1997) Nature Biotechnology 15: 866-870を参照）。そのようなウイルスベクターは、野生型であってもよく、または複製不十分であるか、条件付きで複製するか、もしくは複製適格であるように組換えＤＮＡ技法により修飾されてもよい。

好ましいベクターは、アデノウイルスの、アデノ随伴ウイルスの、およびレトロウイルスのゲノム由来である。本発明の最も好ましい実施において、ベクターが、ヒトアデノウイルスゲノム由来である。特に好ましいベクターは、ヒトアデノウイルス血清型２または５由来である。そのようなベクターの複製能力は、Ｅ１ａおよび／またはＥ１ｂ翻訳領域での修飾または除去により（「複製不十分」と判断される点まで）減弱され得る。特定の発現特性を達成するための、または繰り返し投与を許容するための、または免疫応答を低下させるための、ウイルスゲノムに対する他の修飾が好ましい。

あるいは、ウイルスベクターは、条件付きで複製するかまたは複製応答能を有するものであってもよい。条件付きで複製するウイルスベクターは、有害な広域性感染を回避しながら、特定の細胞型で選択的発現を達成するために使用される。条件付きで複製するベクターの例は、Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, and S. J.(1994) Eur. J. of Cancer 30A (8): 1165-1171に記載される。選択的に複製するベクターのさらなる例として、ウイルスの複製に必要な遺伝子の発現の非存在下ではウイルスが複製しないように、そのような遺伝子が特定の細胞型もしくは細胞状態でのみ活性であるプロモーターの制御下にあるベクターが包含される。そのようなベクターの例は、１９９７年１２月１６日発行のHenderson等の米国特許第５，６９８，４４３号、および１９９９年２月１６日発行のHenderson等の米国特許第５，８７１，７２６号に記載され、それらの全教示は、本明細書の一部とする。

さらに、ウイルスゲノムは、特定の条件下でのみ複製または発現を達成する誘導プロモーターを包含するように修飾されてもよい。誘導プロモーターの例は、科学文献で既知である（例えば、Yoshida and Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230: 426-430 ; Iida等（1996) J. Virol. 70 (9): 6054-6059; Hwang等（1997) J. Virol 71 (9): 7128-7131 ; Lee等（1997) Mol. Cell. Biol. 17 (9): 5097-5105 ; およびDreher等（1997) J. Biol. Chem 272 (46) ; 29364-29371を参照）。

ベクターはまた、非ウイルス性であってもよく、そして当業者に容易に入手可能な多数の商業的供給元から入手可能である。例えば、ベクターは、エピソームまたは組み込みであり得るプラスミドでもよい。

本発明のさらなる態様において、
（ｉ）上記ポリペプチドの製造を助ける条件下、本発明のベクターまたは核酸で形質移入した細胞を増殖させること、および
（ｉｉ）該細胞または該ポリペプチドの増殖環境から、該ポリペプチドを精製することを含む、本発明によるポリペプチドを調製する方法が提供される。

本発明の好ましい方法において、上記ベクターは、分泌シグナルをコードし、したがって上記組換えポリペプチドが分泌シグナルと共に提供されて上記ポリペプチドの精製を促進する。

本発明のまたさらなる実施形態において、本発明によるベクターまたは核酸で形質移入された細胞が提供される。

好ましくは、上記真核生物細胞は、真菌細胞（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア（Pichia）種）、粘菌（例えば、タマホコリカビ種）、昆虫（例えば、シロヤナガ（スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）））、植物細胞、または哺乳類細胞からなる群より選択される。

本発明のさらに好ましい実施形態において、上記真核生物細胞はタマホコリカビ種である。

本発明のさらなる態様によれば、医薬品としての本発明によるポリペプチドの使用が提供される。好ましくは、上記ポリペプチドは医薬組成物に使用される。

投与される場合、本発明のポリペプチドは医薬的に許容可能な調製物で投与される。そのような調製物は、医薬的に許容可能な濃度の塩、緩衝化剤、保存料、適合キャリア、および他の治療薬を、日常業務上必要に応じて含んでもよい。

本発明のポリペプチドが、注射を包含する任意の従来経路で投与され得る。投与は、例えば、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、腔内（intracavity）、皮下、または経皮であってもよい。

本発明の医薬組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独またはさらなる用量と併せて、所望の応答をもたらす組成物の量である。これは、疾患の進行を一時的に遅らせるだけということも伴い得るが、より好ましくは、これは疾患の進行を永久に停止させることを伴う。これは、日常業務上の方法でモニターされ得るか、または診断法に従ってモニターされ得る。

被検体に投与されるポリペプチドの投与量は、異なる要因（parameters）に従って、特に使用される投与様式および被検体の状態（すなわち、年齢、性別）に従って選択され得る。投与される場合、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容可能な量で、かつ医薬的に許容可能な組成物で適用される。そのような調製物は、塩、緩衝化剤、保存料、適合キャリア、および他の治療薬を、日常業務上必要に応じて含んでもよい。薬剤に使用される場合、塩は医薬的に許容可能であるべきだが、非医薬的に許容可能な塩が、それらの医薬的に許容可能な塩を調製するために便宜上使用されてもよく、そして発明の範囲から排除されない。そのような医薬的かつ医薬的に許容可能な塩として、以下の酸から調製されるものが挙げられるが、それらに限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸など。同じく、医薬的に許容可能な塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属塩（ナトリウム、カリウム、またはカルシウム塩など）として調製され得る。

医薬組成物は、所望であれば、医薬的に許容可能なキャリアと組み合わせてもよい。本明細書中で使用される用語「医薬的に許容可能なキャリア」は、ヒトへの投与に適した１種またはそれ以上の、適合固体もしくは液体充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を意味する。用語「キャリア」は、活性成分が組合わされて適用を促進する、天然または合成の、有機または無機成分を示す。医薬組成物の構成成分もまた、所望の医薬的効果を実質的に損なう可能性がある相互作用がないような様式で、本発明の分子と、およびお互いに、共混合（co-mingled）し得る。

医薬組成物は、適した緩衝化剤を含有してもよく、これには、塩での酢酸、塩でのクエン酸、塩でのホウ酸、および塩でのリン酸を包含する。

医薬組成物はまた、適した保存料（塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベン、およびチメロサールなど）を必要に応じて含んでもよい。

医薬組成物は、便宜上、単位投薬形態で存在してもよく、そして医薬の分野で周知の任意の方法により調製されてもよい。全ての方法は、活性薬剤を１種または複数の補助成分を構成するキャリアと連携させる工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体キャリア、微粉化固体キャリア、またはその両方と均一かつ密接に連携させ、その後必要であれば生成物を成形することにより調製される。

経口投与に適した組成物は、別個の単位（カプセル剤、錠剤、ロゼンジなど）として存在してもよく、それぞれが所定量の活性化合物を含有する。他の組成物として、水性または非水性の懸濁液（シロップ、エリキシル剤、または乳濁液など）が挙げられる。

非経口投与に適した組成物は、便宜上、滅菌水性または非水性調製物を含み、これは好ましくは受容者の血液と等張性である。この調製物は、適した分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、既知の方法に従って配合され得る。滅菌注射用調製物はまた、無毒性の非経口的に許容可能な希釈剤または溶媒の滅菌注射用溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオールの溶液）であってもよい。許容可能な溶媒のうち、用いてもよいものは、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液である。また、滅菌、不揮発性油が、溶媒または懸濁媒体として、従来より用いられている。この目的のため、任意の無刺激性不揮発性油が用いられてもよく、これには合成モノまたはジグリセリドが挙げられる。また、オレイン酸などの脂肪酸が注射用調製物に使用されてもよい。経口、皮下、静脈内、筋肉内などの投与に適したキャリア配合物は、「レミントン薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、Mack Publishing Co. , Easton, PAに見いだされ得る。

本発明のさらなる態様によれば、末端肥大症、巨人症、真性糖尿病、癌、食欲不振症、自己免疫疾患および感染症、リウマチ様関節炎を含む炎症性障害からなる群より選択される疾患の治療に使用するための薬物の製造に関する、本発明によるポリペプチドの使用が提供される。

本発明の好ましい実施形態において、上記疾患は末端肥大症である。

本発明のさらに好ましい実施形態において、上記疾患は巨人症である。

本発明のまたさらに好ましい実施形態において、上記疾患は癌である。

本発明はまた、有効量のポリペプチドの医薬組成物または薬物を上記被検体に投与することを含む、ヒトまたは動物被検体を治療する方法を提供する。

本発明はまた、本発明の任意の実施形態による薬剤を形成することを含む、分子の腎クリアランスを減少させる方法を提供する。ミセルの大きさが腎クリアランスを減少させる。

本発明の実施形態は、以下の図面を参照して、例としてのみ記載されるだろう。

［材料および方法］
タマホコリカビからのＧＰＩと融合した細胞外ドメインサイトカイン受容体の精製およびアンタゴニスト活性の実証。
タマホコリカビ株の形質移入および維持
タマホコリカビをリン酸カルシウム法または電気穿孔法で形質移入し、Ｇ４１８とともに培養培地中維持して安定クローンを選択した。

キメラポリペプチドのクローニングおよび発現
ヒトＧＨＲのｃＤＮＡ細胞外ドメイン（塩基９８−８３４、受入番号（accession number）Ｘ０６５６２）を、タマホコリカビアクチン６遺伝子プロモーター、タマホコリカビシグナルペプチド翻訳(code)領域、多重クローニング部位およびＧＰＩアンカーについてのシグナル（ＰＳＰＴＰＴＥＴＡＴＰＳＰＴＰＫＰＴＳＴＰＥＥＴＥＡＰＳＳＡＴＴＬＩＳＰＬＳＬＩＶＩＦＩＳＦＶＬＬＩ）を含むベクター（ｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩ）中に連結した。結果として得られるベクター（ｐＡｃ６−ＧＨＲ−ＧＰＩ）を、タマホコリカビ細胞に形質移入した。

タマホコリカビは、ＮおよびＯグリコシル化を加える。その後、ＧＨＲ−ＧＰＩを発現するクローンを、抗ＧＨＲ抗体Ｍａｂ５を使用して、免疫組織化学およびウエスタンブロット法により選択した。ＧＨアフィニティーカラムを使用して、細胞溶解物からＧＨＲ−ＧＰＩを精製した。精製したＧＨＲ−ＧＰＩはＧＨに結合することが実証され、そしてバイオアッセイで、ＧＨＲ−ＧＰＩはＧＨシグナル伝達についてアンタゴニスト阻害シグナル伝達として作用した。

ベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩ（図１）を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。塩基９８−８３４（受入番号Ｘ０６５６２）からの細胞外ドメインＧＨＲを、それぞれＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位５'および３'でＰＣＲにより増幅し、その後ｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのＭＣＳ中に連結して以下のＭＣＳを得た: ｃａｇｇａｔｃｃａｔｔｔ．．．ＧＨＲ９８−８３４．．．．．ｔａｃｃｇａａｔｔｃｃａ（図２）。コードされたＧＨＲタンパク質は、哺乳類シグナルペプチドの後の第一残基から膜貫通ドメインの前の最後の残基までである。結果として得られるベクターを、ｐＡｃ６−ＧＨＲ−ＧＰＩと呼んだ。

ＧＨＲ−ＧＰＩの精製
ｐＡｃ６−ＧＨＲ−ＧＰＩについてのｃＤＮＡをタマホコリカビ細胞に形質移入し、その後クローンをＭａｂ５（ヒトＧＨＲの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体）を使用してウエスタンブロット法により選択しスクリーニングした。５つのクローンが、グリコシル化ＧＨＲ−ＧＰＩの予想される大きさの４０ｋＤａで明白なシグナルを与えた（図４）。１つのクローンでの免疫染色により、細胞表面に明らかにＧＨＲ−ＧＰＩが同定された（図５）。その後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００中の細胞溶解物を、ＰＢＳ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００（Ｎａ−ホスフェート０．０１Ｍ、ＮａＣｌ０．１５Ｍ、０．０２％ＮａＮＯ３、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００Ｐｈ７．４）中のＧＨアフィニティーカラムで精製した。ＧＨＲ−ＧＰＩの近似(approximate)濃度は、１２０ｕｇ／ｍｌまたは３μＭであった。精製ＧＨＲＧＰＩの機能活性を、ヨウ素化ＧＨの結合により確かめた（図６）。

ＧＨバイオアッセイ
アンタゴニスト活性についてスクリーニングするために確立されたバイオアッセイを用いた（Ross等、1997）。全長ＧＨＲを発現する永久細胞株に活性化Ｓｔａｔ５と結合するルシフェラーゼレポーターを一過的に形質移入した。２４時間後、細胞をアンタゴニストを用いて、または用いずに６時間ＧＨで刺激した。その後、細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定した。約１０ｎＭの濃度でのＧＨＲ−ＧＰＩの存在下または非存在下で、バイオアッセイを行った（図７）。ＧＨＲ−ＧＰＩは、低濃度のＧＨでシグナル伝達を完全に遮断し、かつ高濃度のＧＨでシグナル伝達の約５０％の減少を引き起こし、ＧＨＲ−ＧＰＩのＧＨシグナル伝達におけるアンタゴニスト的作用を確実にした。

哺乳類発現ベクター中に融合した細胞外ドメインサイトカイン受容体ＧＰＩのクローニングおよびサイトカイン応答性細胞株で発現した場合のアンタゴニスト活性の実証。
ＧＨＲ−ＧＰＩは、遺伝子組換え治療として作用し得る。
ＧＨＲ−ＧＰＩが遺伝子組換え治療として作用し得ることを実証するために、本発明者らは、哺乳類発現ベクター中のヒトＧＰＩシグナル配列のＧＨＲ上流の細胞外ドメインをクローニングした（図８〜図９）。その後、この構築物をＣＨＯ細胞に形質移入し、発現をヒトＧＨＲに特異的なモノクローナル抗体を使用してＦＡＣＳ分析により実証した（図１０）。ＣＨＯ細胞での結合レベルは極度に高かった。細胞表面でのＧＨＲ−ＧＰＩ発現がアンタゴニストとして作用するかどうかを検査するために、ＧＨＲ−ＧＰＩを野生型ＧＨＲを発現するＨｅｋ２９３細胞中に形質移入してＧＨで刺激した。ＧＨＲ−ＧＰＩのこの同時発現は、ＧＨシグナル伝達を完全に遮断した（図１１）。さらに、ＧＨＲ−ＧＰＩで形質移入した細胞からの培地を可溶性受容体（ＧＨＢＰ）について測定し、高レベルが見いだされ（図１２）、サイトカインＧＰＩ融合体の遺伝子組換え発現がアンタゴニストとして作用し得ることによる別の機構を提供する。ＧＰＩ融合体として発現し得るサイトカイン受容体の他の例は、ＴＮＦおよびレプチン受容体である（図１３〜図１６）。

タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。タマホコリカビで発現させるためにＧＨＲの細胞外ドメインをクローニングするのに使用したベクターｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩのヌクレオチド配列を示す。クローニングされたＧＨＲの細胞外ドメインを有するｐＡｃ６−ＬＰ−ＭＣＳ−ＧＰＩの多重クローニング部位の一部を示し、この新規ベクターはｐＡｃ６ＧＨＲＧＰＩと呼ばれる。ＧＨＲの細胞外ドメインは大文字である。ベクターｐＡｃ６ＧＨＲＧＰＩからのＧＨＲＧＰＩ融合核酸およびアミノ酸配列を表す。ＧＨＲの細胞外ドメインに対するヌクレオチドは大文字であり、またアミノ酸配列は太字である。ｐＡｃ６ＧＨＲＧＰＩで形質移入したタマホコリカビクローンからの細胞溶解物でのＧＨＲＧＰＩについてのスクリーニングを図示する。スクリーニングは、ＧＨＲに対するモノクローナル抗体、すなわちＭａｂ５を使用して、ウエスタンブロット法により行った。レーンＡＸ２は、形質移入していない細胞のネガティブコントロールであり、レーン１〜レーン７は、異なるクローンのスクリーニングである。レーン１、レーン２、レーン３、およびレーン５は、適格な大きさで陽性のバンドを示し、レーン３がＧＨＲＧＰＩの精製に選択された。ＧＨＲＧＰＩについての免疫染色を図示し、タンパク質がタマホコリカビ細胞表面で発現することを示す。上部パネルは、左側が非形質移入細胞でのネガティブコントロールによる表面染色を示し、右側はｐＡｃ６ＧＨＲＧＰＩで形質移入された細胞の細胞表面での陽性免疫染色を示す。下部パネルで、細胞は、細胞内染色を検討するために透過処理されていた。再度、ネガティブコントロールは左にあり、そして右側のポジティブコントロールが細胞内染色を示す。ヨウ素化ＧＨ単独、およびヨウ素化ＧＨ＋または−冷(cold)ＧＨでのＧＨＲＧＰＩ（図５で同定されたＧＨＲＧＰＩを発現する安定タマホコリカビクローンから精製）の溶出プロファイル（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００）である。ＧＨＲ−ＧＰＩは、１２５Ｉ−ＧＨと約６０〜６５Ｋｄａの単一複合体を形成する（青線）。黄線はヨウ素化ＧＨ単独のものであり、そしてピンクの線は過剰な冷ＧＨの存在下のＧＨＲ−ＧＰＩである。結果として、精製ＧＨＲＧＰＩによるＧＨの機能的結合を示す。精製ＧＨＲＧＰＩの存在下または非存在下での成長ホルモンについてのバイオアッセイを示す。成長ホルモン受容体を発現する細胞が、成長ホルモンシグナル伝達により活性化するルシフェラーゼレポーターで形質移入される。その後、細胞は、ＧＨＲＧＰＩの存在下または非存在下、成長ホルモンの用量の増加で刺激された（約１０ｎＭ）。ＧＨＲＧＰＩ存在下、成長ホルモンシグナルは、低用量の成長ホルモンで消滅したか、または高用量の成長ホルモンで減少した。ｐＣＲ−３ＧＰＩ＿Ｔｈｙ−１、哺乳類ＧＰＩシグナルを有する哺乳類発現ベクターである。ｐＣＲ−３ＧＰＩ＿Ｔｈｙ−１、哺乳類ＧＰＩシグナルを有する哺乳類発現ベクターである。ｐＣＲ−３ＧＰＩ＿Ｔｈｙ−１における哺乳類ＧＨＲＧＰＩアンカーポリペプチドのヌクレオチドおよびアミノ酸配列であり、ｐＣＲ３ＧＨＲＧＰＩと呼ぶ。ＧＨＲの細胞外ドメインは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏｒＩ部位中に連結される。アミノ酸配列について、太字は細胞外ドメインＧＨＲであり、下線の付いた太字の斜体はＧＨＲシグナルであり、そして下線がついているのはＧＰＩシグナル始点であり、これは切断される。ベクターのみで（細線）、およびＧＨＲ特異的モノクローナル抗体で免疫染色したｐＣＲ３ＧＨＲＧＰＩ（太線）で形質移入されたＣＨＯ細胞のＦＡＣＳ分析であり、ほとんど全てのＣＨＯ細胞が高レベルのＧＨＲＧＰＩを発現していることを実証する。ＧＨ受容体（ＧＨのみ）を発現するＨＥＫ２９３細胞およびＧＨＲＧＰＩプラスミドで形質移入したＨＥＫ２９３細胞でのＳｔａｔ５のＧＨ活性化（ルシフェラーゼのフォールディング誘導）。ＧＨＲＧＰＩ（ＧＰＩに連結した細胞外ドメインＧＨＲ）の遺伝子組換え発現が完全にＧＨシグナル伝達を阻害することを実証する。様々なベクターでの形質移入を受けていない哺乳類細胞からの培地での可溶性ＧＨ受容体（ＧＨＢＰ）の測定である。結果は、ＧＨＢＰ−ＬＩＦＡ（リガンド免疫機能アッセイ）により得られ、「＜７０」は、アッセイの最低水準未満を意味する。結果として、細胞でのＧＨＲＧＰＩ発現が媒体において非常に高レベルの可溶性受容体をもたらすことを実証する。ＴＮＦ受容体１型のアミノ酸およびヌクレオチド配列を表す。タンパク質配列Ｐ１９４３８、シグナルは緑、そして膜貫通螺旋は赤である。核酸配列Ｘ５５３１３ヒト（H. sapiens）ＴＮＦ−Ｒｍ．．．［ｇｉ：３７２２３］。２５６〜３１８はシグナルであり、３１９〜８８８は細胞外ドメインである。細胞外ドメインＴＮＦ受容体のベクターｐＣＲ−３ＧＰＩ＿Ｔｈｙ−１（図８）内へのクローニング後の、ベクターｐＣＲ３ＴＮＦＧＰＩからのＴＮＦ受容体１型−ＧＰＩ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を表す。太字は細胞外ドメインＴＮＦ受容体であり、下線の付いた太字の斜体はＴＮＦ受容体シグナルであり、そして下線が付けられているのはＧＰＩシグナルの始点であり、これは切断される。細胞外ドメインレプチン受容体（ＯｂＲ）のベクターｐＣＲ−３ＧＰＩ＿Ｔｈｙ−１（図８）内へのクローニング後の、ｐＣＲ３ＯｂＲＧＰＩからのレプチン受容体−ＧＰＩ融合のアミノ酸配列を表す。斜体はＯｂＲシグナル、太字はＯｂＲ細胞外ドメイン、その後ＧＰＩへの連結、そして下線が付けられているのはＧＰＩについての切断部位である。サイトカイン受入番号の表である。

Claims

（ｉ）ヒト成長ホルモン受容体の細胞外ドメイン、および
（ｉｉ）グリコシルホスファチジルイノシトールの付加のためのシグナル配列を包含するドメインとを含む、キメラポリペプチド。
前記ポリペプチドが、グリコシルホスファチジルイノシトールの付加により修飾される、請求項１に記載のポリペプチド。
グリコシルホスファチジルイノシトールの前記付加のための前記シグナル配列が、ＰＳＰＴＰＴＥＴＡＴＰＳＰＴＰＫＰＴＳＴＰＥＥＴＥＡＰＳＳＡＴＴＬＩＳＰＬＳＬＩＶＩＦＩＳＦＶＬＬＩ、ＤＫＬＶＫＣＧＧＩＳＬＬＶＱＮＴＳＷＭＬＬＬＬＬＳＬＳＬＬＱＡＬＤＦＩＳＬ、ＬＶＰＲＧＳＩＥＧＲＧＴＳＩＴＡＹＮＳＥＧＥＳＡＥＦＦＦＬＬＩＬＬＬＬＬＶＬＶ、またはＴＳＩＴＡＹＫＳＥＧＥＳＡＥＦＦＦＬＬＩＬＬＬＬＬＶＬＶからなる群より選択される、請求項１または２に記載のポリペプチド。
請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
請求項４に記載の核酸分子を含むベクター。
真核生物遺伝子発現に適合した発現ベクターである、請求項５に記載のベクター。
前記ベクターは分泌シグナルをコードし、したがって前記組換えポリペプチドが前記分泌シグナルと共に提供されて前記ポリペプチドの精製を促進する、請求項５または６に記載のベクター。
（ｉ）請求項６または７に記載のベクターで形質移入した細胞を増殖させること、および
（ｉｉ）前記細胞または前記細胞の増殖環境から、該ポリペプチドを精製することを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリペプチドを調製する方法。
（ｉ）請求項６または７に記載のベクターで形質移入した細胞を増殖させる工程；および
（ｉｉ）前記ポリペプチドの増殖環境から、該ポリペプチドを精製する工程とを含み、前記精製ポリペプチドがＧＰＩアンカーを包含しない、請求項１に記載のポリペプチドを調製および精製する方法。
請求項４に記載の核酸または請求項５〜７のいずれか１項に記載のベクターで形質移入した真核生物細胞。
真菌、粘菌、昆虫、植物細胞、または哺乳類細胞からなる群より選択される、請求項１０に記載の真核生物細胞。
粘菌細胞であり、かつタマホコリカビ（Dictyostelium）種である、請求項１１に記載の細胞。
末端肥大症又は巨人症を治療するための医薬として使用するための、配列番号：８及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるキメラポリペプチド。
配列番号：８及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるキメラポリペプチド、および医薬的に許容可能なキャリアを必要に応じて含む、末端肥大症又は巨人症を治療するための医薬組成物。
末端肥大症又は巨人症の治療に使用するための医薬の製造のための、配列番号：８及び配列番号１１のアミノ酸配列からなるキメラポリペプチド。