ES2329228T3 - Polipeptidos que contienen glicosilfosfatidilinositol. - Google Patents
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Abstract
Un polipéptido quimérico que comprende: (i) un dominio extracelular de unión a hormona de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento; y (ii) un dominio que incluye una secuencia señal para la fijación de glicosilfosfatidilinositol.
Description
Polipéptidos que contienen
glicosilfosfatidilinositol.
Esta invención se refiere a polipéptidos que
comprenden un dominio de unión a receptor de hormona de crecimiento
y un dominio que incluye una secuencia señal para la fijación de
anclajes de glicosilfosfatidilinositol (GPI); a procedimientos para
fabricar dichos polipéptidos; a moléculas de ácido nucleico que
codifican dichos polipéptidos y a composiciones terapéuticas que
comprenden dichos polipéptidos.
Los anclajes de GPI son modificaciones
postraduccionales de proteínas que añaden glicosilfosfatidilinositol
que posibilita que estas proteínas se anclen en el lado
extracelular de membranas celulares. Típicamente, las proteínas que
tienen un anclaje de GPI no tienen un dominio transmembrana o
citoplásmico. Las proteínas de anclaje de GPI forman una familia
diversa de proteínas que incluye, por ejemplo y no a modo de
limitación, enzimas asociadas a membrana, moléculas de adhesión y
proteínas que recubren la superficie externa de parásitos
protozoarios tales como Trypanosoma brucei spp. El riñón
incluye una serie de ejemplos de proteínas ancladas por GPI,
concretamente, uromodulina, anhidrasa carbónica de tipo IV,
fosfatasa alcalina, Thy-1, BP-3,
aminopeptidasa P y dipeptilpeptidasa.
Todas las proteínas de anclaje de GPI se
sintetizan inicialmente con un anclaje transmembrana que, después
de translocación a través del retículo endoplásmico, se escinde y se
liga covalentemente a un anclaje de GPI preformado mediante una
enzima transamidasa específica. La modificación de proteínas
mediante la adición de un anclaje de GPI confiere propiedades
importantes a la proteína, puesto que la adición del resto lipídico
permite a la proteína insertarse en membranas celulares anclando así
la proteína.
Hay algunos requisitos generales para crear una
secuencia de anclaje de GPI sintética. Estos son una región
hidrófoba en el extremo C de la molécula (10-20
aminoácidos) no seguida por un conjunto de residuos básicos, un
"dominio espaciador" de 7-10 residuos que
precede a la región hidrófoba y aminoácidos pequeños después de la
región espaciadora, donde sucede la escisión del precursor y la
fijación del anclaje. Se preensambla el anclaje de GPI y se añade a
la proteína naciente en el retículo endoplásmico. Simultáneamente a
esta etapa, se retira el péptido C-terminal inicial
de modo que el anclaje de GPI se fije covalentemente a un nuevo
aminoácido C-terminal en la proteína.
Los ligandos que interaccionan con receptores
causando una respuesta bioquímica adecuada son conocidos como
agonistas, y aquellos que evitan o reducen una respuesta bioquímica
son conocidos como antagonistas. Por ejemplo, y no a modo de
limitación, los factores de crecimiento específicos de célula son
ligandos que actúan como agonistas y se unen a receptores
localizados en las membranas celulares.
Un gran grupo de factores de crecimiento,
designado como citocinas, está implicado en una serie de diversas
funciones celulares. Estas incluyen, como ejemplo y no a modo de
limitación, modulación del sistema inmunitario, regulación del
metabolismo de la energía y control del crecimiento y desarrollo.
Las citocinas median sus efectos mediante receptores expresados en
la superficie celular de células diana.
Los receptores de la familia de receptor de
citocina poseen un solo dominio transmembrana y carecen de actividad
enzimática intrínseca (Kishimoto y col., 1994). Cuando una citocina
se une a su receptor afín, se internaliza el complejo y sucede una
señalización mediante la activación de cascadas de señalización que
incluyen las rutas Jak/Stat y Mapk. La internalización es seguida
por una etapa de reciclado en la que la molécula receptora se
regenera para uso posterior en la célula. Se describe un ejemplo de
lo anterior con respecto a la hormona de crecimiento (GH) y su unión
al receptor de hormona de crecimiento (GHR).
Es conocido que una sola molécula de hormona de
crecimiento (GH) se asocia con dos moléculas receptoras (Cunningham
y col., 1991; de Vos y col., 1992; Sundstrom y col., 1996; Clackson
y col., 1998). Esto sucede mediante dos sitios de unión a receptor
únicos en GH y un bolsillo de unión común en el dominio extracelular
de dos receptores. El sitio 1 en la molécula de GH tiene una mayor
afinidad que el sitio 2, y se cree que la dimerización del receptor
sucede secuencialmente con unión de un receptor al sitio 1 en GH
seguida del reclutamiento de un segundo receptor en el sitio 2.
El dominio extracelular de GHR existe en forma
de dos dominios ligados cada uno de aproximadamente 100 aminoácidos
(SD-100), siendo el dominio SD-100
C-terminal el más cercano a la superficie celular y
siendo el dominio SD-100 N-terminal
el más lejano. Es un cambio conformacional en estos dos dominios lo
que sucede en la unión a hormona, con la formación del complejo
trimérico GHR-GH-GHR.
Además, los receptores de GH truncados, que
carecen del dominio citoplásmico del receptor, actúan como
inhibidores negativos dominantes de la señalización de GH (Ross y
col., 1997). El receptor truncado se expresa a alto nivel sobre la
superficie celular porque carece del dominio citoplásmico esencial
para la internalización (Maamra y col., 1999). En presencia de GH,
el receptor truncado heterodimeriza con el receptor completo y
bloquea la señalización porque carece del dominio citoplásmico. Como
el receptor truncado no consigue internalizarse, actúa como
inhibidor negativo dominante que evita la internalización del
complejo de receptor de GH.
Se han sintetizado variantes de receptor de
hormona de crecimiento que comprenden un dominio de una proteína de
anclaje de GPI. Las variantes carecen de un dominio citoplásmico y
por lo tanto no tienen la capacidad de señalizar. La provisión de
un dominio de anclaje de GPI significa que la variante se inserta en
membranas y actúa como inhibidor eficaz de la señalización de GH al
competir con la GH en circulación y la GH de unión a la superficie
celular en un complejo heterodimérico que consiste en el receptor
anclado por GPI truncado quimérico, GH y el receptor nativo.
Además, el receptor de GH anclado por GPI truncado genera una gran
cantidad de receptor de GH soluble que se unirá a GH.
Muchas citocinas activan sus receptores afines
mediante dimerización u oligomerización y la invención se refiere a
la provisión de receptores de hormona de crecimiento que se han
modificado mediante la provisión de un dominio polipeptídico que
comprende una secuencia que se modifica mediante la adición de
glicosilfosfatidilinositol.
Un polipéptido quimérico comprende:
(i) un dominio extracelular de unión a hormona
de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento; y
(ii) un dominio que incluye una secuencia señal
para la fijación de glicosilfosfatidilinositol.
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Preferiblemente, dicho polipéptido quimérico
consiste en el dominio extracelular de un receptor de hormona de
crecimiento y un dominio que incluye una secuencia señal para la
fijación de glicosilfosfatidilinositol.
Preferiblemente, el polipéptido se modifica
mediante la adición de glicosilfosfatidilinositol.
Preferiblemente, el polipéptido modificado es un
modulador de la señalización celular mediada por hormona de
crecimiento.
Preferiblemente, la secuencia señal para la
fijación de glicosilfosfatidilinositol se selecciona del grupo
constituido por:
- DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL;
- PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI;
- LVPRGSIEGR GTSTTAYNSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV y
- TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV.
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En una realización preferida de la invención,
dicho polipéptido es un antagonista.
La invención explota la alta afinidad de la
hormona de crecimiento por su receptor y la capacidad de la cola de
GPI lipófila de reinsertarse en una membrana plasmática. El
polipéptido de la invención es una "quimera" que comprende un
dominio de unión a ligando de receptor de hormona de crecimiento y
un dominio de una proteína que incluye un sitio para la adición de
un anclaje de GPI. La molécula quimérica consistirá en el dominio
extracelular de unión a hormona de crecimiento con un anclaje de GPI
C-terminal.
Se espera que, en circulación, la proteína
quimérica formará una micela de un gran número de proteínas
quiméricas con los anclajes de GPI en el centro. En contacto con la
membrana celular, el GPI se reinsertará en la membrana celular. La
invención tiene la importante ventaja de que la unión de hormona de
crecimiento a la quimera da como resultado un complejo
receptor:hormona:quimera. En el ejemplo de GH, este será
GHR:GH:quimera. Este complejo no señalizará, ya que la quimera es
un receptor truncado y por lo tanto bloqueará tanto la señalización
como la internalización del receptor.
En una realización preferida alternativa de la
invención, dicho polipéptido quimérico actúa como antagonista en
circulación. Se espera que la molécula micelar en circulación tenga
los anclajes de GPI en su centro y el dominio de unión del receptor
apuntando hacia fuera y por lo tanto capaz de unirse y antagonizar
la acción de la hormona de crecimiento.
En una realización preferida alternativa de la
invención, dicho polipéptido quimérico actúa como antagonista
después de la expresión local o transgénica mediante terapia génica.
Se esperaría que la transfección o terapia génica pudieran usarse a
nivel celular o del cuerpo entero.
En una realización de la invención, el
polipéptido es una proteína de fusión.
En una realización preferida adicional de la
invención, dicho polipéptido comprende la secuencia aminoacídica
mostrada en la Fig. 3 o la Fig. 9.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una
secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según la
invención.
En una realización preferida de la invención,
dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido
nucleico como se representa en la Fig. 3 o Fig. 9.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un polipéptido codificado por una molécula de ácido
nucleico como se representa en la Fig. 3 o Fig. 9.
Según un aspecto adicional más de la invención,
se proporciona un vector que incluye una molécula de ADN que
codifica un polipéptido según cualquier aspecto o realización
precedente de la invención.
En una realización preferida de la invención,
dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión
génica eucariótica.
Típicamente, dicha adaptación incluye la
provisión de secuencias de control de la transcripción (secuencias
promotoras) que median la expresión específica de célula/tejido.
Estas secuencias promotoras pueden ser específicas de célula/tejido,
inducibles o constitutivas.
Promotor es un término reconocido en la técnica
y, por razones de claridad, incluye los siguientes rasgos que se
proporcionan sólo a modo de ejemplo y no a modo de limitación. Los
elementos potenciadores son secuencias de ácido nucleico de acción
en cis a menudo encontradas 5' del sitio de inicio de la
transcripción de un gen (los potenciadores pueden encontrarse
también 3' de una secuencia génica o incluso localizados en
secuencias intrónicas, por lo tanto son independientes de la
posición). Los potenciadores funcionan aumentando la velocidad de
transcripción del gen al que está ligado el potenciador. La
actividad potenciadora es sensible a factores de transcripción de
acción en trans (polipéptidos) que se ha mostrado que se unen
específicamente a elementos potenciadores. La unión/actividad de
factores de transcripción (véase "Eukaryotic Transcription
Factors", de David S. Latchman, Academia Press Ltd, San Diego)
es sensible a una serie de indicaciones medioambientales que
incluyen, por ejemplo y no a modo de limitación, metabolitos
intermedios (por ejemplo, glucosa, lípidos) y efectores
medioambientales (por ejemplo, luz y calor).
Los elementos promotores incluyen también la
denominada secuencia TATA y secuencias de selección del inicio de
la ARN polimerasa (RIS) que funcionan seleccionando un sitio de
inicio de la transcripción. Estas secuencias se unen también a
polipéptidos que funcionan, entre otros, facilitando la selección
del inicio de la transcripción por ARN polimerasa.
Las adaptaciones incluyen también la provisión
de marcadores seleccionables y secuencias de replicación autónomas
que facilitan ambos el mantenimiento de dicho vector en la célula
eucariótica. Los vectores que se mantienen autónomamente se designan
como vectores episómicos.
Las adaptaciones que facilitan la expresión de
genes codificados por el vector incluyen la provisión de secuencias
de terminación de la transcripción/poliadenilación. Esto incluye
también la provisión de sitios internos de entrada a ribosoma
(IRES) que funcionan maximizando la expresión de genes codificados
por el vector dispuestos en módulos de expresión bicistrónicos o
multicistrónicos.
Estas adaptaciones son bien conocidas en la
técnica. Hay una cantidad significativa de bibliografía publicada
con respecto a la construcción de vectores de expresión y las
técnicas de ADN recombinante en general. Véanse, Sambrook y col.
(1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring
Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY y las referencias en el
mismo; Marston, F. (1987) "DNA Cloning Techniques: A Practical
Approach", Vol III IRL Press, Oxford UK; "DNA Cloning":
F.M. Ausubel y col, "Current Protocols in Molecular Biology",
John Wiley & Sons, Inc. (1994).
Resultará evidente para un experto en la técnica
que los vectores según la invención podrían ser vectores de terapia
génica. Los vectores de terapia génica están típicamente basados en
virus. Se usan habitualmente una serie de virus como vectores para
el suministro de genes exógenos. Los vectores empleados
habitualmente incluyen virus de ADN y ARN con cubierta o sin
cubierta modificados recombinantemente, preferiblemente
seleccionados de baculovirus, parvovirus, picornovirus, herpesvirus,
poxvirus, adenovirus o picornavirus. Pueden emplearse también
vectores quiméricos que explotan elementos ventajosos de cada una
de las propiedades del vector original (véase, por ejemplo, Feng y
col. (1997) Nature Biotechnology 15:
866-870). Dichos vectores víricos pueden ser
silvestres o pueden modificarse mediante técnicas de ADN
recombinante para ser de replicación deficiente, de replicación
condicional o de replicación competente.
Los vectores preferidos derivan de los genomas
adenovírico, vírico adenoasociado y retrovírico. En la práctica más
preferida de la invención, los vectores derivan del genoma de
adenovirus humano. Los vectores particularmente preferidos derivan
de adenovirus humanos de serotipos 2 ó 5. La capacidad replicativa
de dichos vectores puede atenuarse (hasta el punto de ser
considerados "de replicación deficiente" mediante
modificaciones o deleciones en las regiones de codificación de E1a
y/o E1b. Se prefieren otras modificaciones del genoma vírico para
conseguir características de expresión particulares o permitir la
administración repetida o reducir la respuesta inmunitaria.
Como alternativa, los vectores víricos pueden
ser de replicación condicional o de replicación competente. Los
vectores víricos de replicación condicional se usan para conseguir
una expresión selectiva en tipos celulares particulares evitando
una infección de amplio espectro desfavorable. Se describen ejemplos
de vectores de replicación condicional en Pennisi, E. (1996)
Science 274: 342-343; Russell y S.J. (1994)
Eur. J. of Cancer 30A (8): 1165-1171. Los
ejemplos adicionales de vectores de replicación selectiva incluyen
aquellos vectores en los que un gen esencial para la replicación
del virus está bajo control de un promotor que es activo sólo en un
tipo celular o estado celular particular, de tal modo que en
ausencia de expresión de dicho gen, el virus no se replicará. Se
describen ejemplos de dichos vectores en Henderson y col., patente
de Estados Unidos nº 5.698.443, expedida el 16 de diciembre de 1997
y Henderson y col., patente de Estados Unidos nº 5.871.726, expedida
el 16 de febrero de 1999.
Adicionalmente, el genoma vírico puede
modificarse para incluir promotores inducibles que consiguen la
replicación o expresión sólo en ciertas condiciones. Los ejemplos
de promotores inducibles son conocidos en la bibliografía
científica (véanse, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997) Biochem.
Biophys. Res. Comm. 230: 426-430; Iida y col.
(1996) J. Virol. 70(9): 6054-6059;
Hwang, y col. (1997) J. Virol. 71(9):
7128-7131; Lee y col. (1997) Mol. Cell. Biol.
17(9): 5097-5105 y Dreher y col. (1997) J.
Biol. Chem. 272(46); 29364-29371.
Los vectores pueden ser también no víricos y
están disponibles en una serie de fuentes comerciales fácilmente
disponibles para el experto en la técnica. Por ejemplo, los vectores
pueden ser plásmidos que pueden ser episómicos o integrativos.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un procedimiento para preparar un polipéptido según la
invención que comprende:
(i) cultivar una célula transfectada con un
vector o ácido nucleico de la presente invención en condiciones
tendentes a la fabricación de dicho polipéptido; y
(ii) purificar dicho polipéptido de dicha célula
o su entorno de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En un procedimiento preferido de la invención,
dicho vector codifica, y por tanto dicho polipéptido recombinante
está dotado de, una señal de secreción para facilitar la
purificación de dicho polipéptido.
En una realización adicional más de la
invención, se proporciona una célula transfectada con el vector o
ácido nucleico según la invención.
Preferiblemente, dicha célula eucariótica se
selecciona del grupo constituido por: una célula fúngica, por
ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp; de moho
mucilaginoso (por ejemplo, Dictyostelium spp); de insecto
(por ejemplo, Spodoptera frugiperda); una célula de planta o
una célula de mamífero.
En una realización preferida adicional de la
invención, dicha célula eucariótica es Dictyostelium spp.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso del polipéptido según la invención como producto
farmacéutico. Preferiblemente, dicho polipéptido se usa en una
composición farmacéutica.
Cuando se administra, el polipéptido de la
presente invención se administra en preparaciones farmacéuticamente
aceptables. Dichas preparaciones pueden contener rutinariamente
concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de
tamponación, conservantes, vehículos compatibles y opcionalmente
otros agentes terapéuticos.
El polipéptido de la invención puede
administrarse por cualquier vía convencional, incluyendo la
inyección. La administración puede ser, por ejemplo, oral,
intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria,
subcutánea o transdérmica.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se administran en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz"
es aquella cantidad de una composición que, sola o junto con dosis
adicionales, produce la respuesta deseada. Esto puede implicar sólo
retardar la progresión de la enfermedad temporalmente, aunque más
preferiblemente implica detener la progresión de la enfermedad
permanentemente. Esto puede controlarse mediante procedimientos
rutinarios o puede controlarse según procedimientos de
diagnóstico.
Las dosis del polipéptido administrado a un
sujeto pueden elegirse según diferentes parámetros, en particular
según el modo de administración usado y el estado del sujeto
(concretamente, edad, sexo). Cuando se administran, las
composiciones farmacéuticas de la invención se aplican en cantidades
farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente
aceptables. Dichas preparaciones pueden contener rutinariamente
sales, agentes de tamponación, conservantes, vehículos compatibles
y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Cuando se usan en
medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero
pueden usarse convenientemente sales farmacéuticamente no
aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las
mismas y no se excluyen del alcance de la invención. Dichas sales
farmacológica y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero sin
limitación, aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos:
clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico,
acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y
similares. También pueden prepararse sales farmacéuticamente
aceptables como sales de metal alcalino o alcalinotérreo tales como
sales de sodio, potasio o calcio.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las composiciones farmacéuticas pueden
combinarse, si se desea, con un vehículo farmacéuticamente
aceptable. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable"
como se usa en la presente memoria significa una o más cargas,
sustancias encapsulantes o diluyentes sólidos o líquidos compatibles
que son adecuados para su administración a un ser humano. El
término "vehículo" denota un ingrediente orgánico u inorgánico,
natural o sintético, con el que se combina el ingrediente activo
para facilitar la administración. Los componentes de las
composiciones farmacéuticas son también capaces de mezclarse con
las moléculas de la presente invención, y entre sí, de manera tal
que no haya una interacción que perjudique sustancialmente la
eficacia farmacéutica deseada.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
agentes tamponadores adecuados, incluyendo: ácido acético en una
sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal y ácido
fosfórico en una sal.
Las composiciones farmacéuticas pueden contener
también, opcionalmente, conservantes adecuados tales como: cloruro
de benzalconio, clorobutanol, parabenos y timerosal.
Las composiciones farmacéuticas pueden
presentarse convenientemente en forma de dosificación unitaria y
pueden prepararse mediante cualquiera de los procedimientos bien
conocidos en la técnica de farmacia. Todos los procedimientos
incluyen la etapa de asociar el agente activo con un vehículo que
está constituido por uno o más ingredientes accesorios. En general,
las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el
compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido
finamente dividido o ambos y después, si es necesario, conformando
el producto.
Las composiciones adecuadas para administración
oral pueden presentarse como unidades discretas tales como
cápsulas, comprimidos o pastillas masticables, conteniendo cada una
una cantidad predeterminada del compuesto activo. Otras
composiciones incluyen suspensiones en líquidos acuosos o líquidos
no acuosos tales como un jarabe, elixir o emulsión.
Las composiciones adecuadas para administración
parenteral comprenden convenientemente una preparación acuosa o no
acuosa estéril que es preferiblemente isotónica con la sangre del
receptor. Esta preparación puede formularse según procedimientos
conocidos usando agentes dispersantes o humectantes y de suspensión
adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una
disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o
disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, en
forma de una solución de 1,3-butanodiol. Entre los
disolvente aceptables que pueden emplearse están agua, disolución
de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, se
emplean convencionalmente aceites no volátiles estériles como
disolvente o medio de suspensión. Con este fin, puede emplearse
cualquier aceite no volátil insípido, incluyendo mono- o
diglicéridos sintéticos. Además, pueden usarse ácidos grasos como
ácido oleico en la preparación de inyectables. La formulación de
vehículo adecuada para administración oral, subcutánea, intravenosa,
intramuscular, etc. puede encontrarse en "Remington's
Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso del polipéptido según la invención para la
fabricación de un medicamento para uso en el tratamiento de una
enfermedad seleccionada del grupo constituido por: acromegalia,
gigantismo o cáncer.
En una realización preferida de la invención,
dicha enfermedad es acromegalia.
En una realización preferida adicional de la
invención, dicha enfermedad es gigantismo.
En una realización preferida adicional más de la
invención, dicha enfermedad es cáncer.
La invención proporciona también un
procedimiento de aclaramiento renal reducido de una molécula que
comprende formar un agente según cualquier realización de la
invención. El tamaño de las micelas reduce el aclaramiento
renal.
Se describirá ahora una realización de la
invención sólo a modo de ejemplo y con referencia a las siguientes
figuras en la presente memoria:
La Figura 1 muestra la secuencia nucleotídica
del vector
pAc6-LP-MCS-GPI
usado para clonar el dominio extracelular del GHR para expresión en
Dictyostelium.
La Figura 2 muestra parte del sitio de clonación
múltiple de
pAc6-LP-MCS-GPI con
el dominio extracelular del GHR clonado, y el nuevo vector se llama
pAc6GHRGPI. El dominio extracelular del GHR está en mayúsculas.
La Figura 3 representa la secuencia de ácido
nucleico y aminoácidos de la fusión GHRGPI del vector
pAc6GHRGPL. Los nucleótidos del dominio extracelular del GHR están en mayúsculas y la secuencia aminoacídica está en negrita.
pAc6GHRGPL. Los nucleótidos del dominio extracelular del GHR están en mayúsculas y la secuencia aminoacídica está en negrita.
La Figura 4 ilustra el cribado de GHRGPI en
lisados celulares de clones de Dictyostelium transfectados
con pAc6GHRGPI. Se efectuó el cribado mediante transferencia Western
usando un anticuerpo monoclonal de GHR, Mab5. El carril AX2 es un
control negativo de células no transfectadas y los carriles
1-7 diferentes clones cribados. Los carriles 1, 2, 3
y 5 muestran una banda positiva del tamaño correcto y se seleccionó
el carril 3 para purificación de GHRGPI.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La Figura 5 ilustra la inmunotinción de GHRGPI y
demuestra que la proteína se expresa en la superficie celular de
Dictyostelium. Los paneles superiores muestran la tinción de
superficie con un control negativo a la izquierda de células no
transfectadas, a la derecha, las células transfectadas con
pAc6GHRGPI muestran inmunotinción positiva en la superficie celular.
En los paneles inferiores, se han permeabilizado las células para
estudiar la tinción intracelular. De nuevo, el control negativo está
a la izquierda y el control positivo a la derecha muestra la tinción
intracelular.
Figura 6 Perfil de elución (Sephadex G100) de GH
yodada sola y GHRGPI (purificado de clones de Dictyostelium
estables que expresan el GHRGPI identificado en la figura 5) con GH
yodada más o menos GH fría. El GHR-GPI forma un solo
complejo de aproximadamente 60-65 KDa con
^{125}I-GH (línea azul). La línea amarilla es GH
yodada sola y la línea rosa GHR-GPI en presencia de
GH fría en exceso. El resultado muestra la unión funcional de GH por
GHRGPI purificado.
La Figura 7 muestra un bioensayo de hormona de
crecimiento en presencia o ausencia de GHRGPI purificado. Las
células que expresan receptor de hormona de crecimiento se
transfectan con un indicador de luciferasa activado por la
señalización de hormona de crecimiento. Se estimularon después las
células con dosis crecientes de hormona de crecimiento en presencia
o ausencia de GHRGPI (aproximadamente 10 nM). En presencia de
GHRGPI, se anuló la señal de hormona de crecimiento a dosis bajas de
hormona de crecimiento o se redujo a dosis altas.
La Fig 8 es
pCR-3GPI_Thy-1, un vector de
expresión de mamífero con señal GPI de mamífero.
La Figura 9 es la secuencia nucleotídica y
aminoacídica de un polipéptido de anclaje de GHRGPI de mamífero en
pCR-3GPI_Thy-1 y llamado pCR3GHRGPI.
El dominio extracelular del GHR está ligado al sitio BamHI y EcoRI.
Para la secuencia aminoacídica, la negrita es GHR de dominio
extracelular, tanto cursiva como subrayado es señal de GHR y
subrayado es el inicio de la señal de GPI que se escinde.
Figura 10 Análisis FACS de células CHO
transfectadas con vector sólo (línea fina) y con pCR3GHRGPI (línea
gruesa) inmunoteñido con anticuerpo monoclonal específico de GHR, y
demuestra que casi todas las células CHO están expresando un alto
nivel de GHRGPI.
Figura 11 Activación por GH de Stat5 (inducción
en veces de luciferasa) en células HEK293 que expresan el receptor
de GH (GH sólo) y células transfectadas con el plásmido de GHRGPI.
Demuestra que la expresión transgénica de GHRGPI (dominio
extracelular de GHR ligado a GPI) inhibe completamente la
señalización de GH.
Figura 12 Medida de receptor de GH soluble
(GH-BP) en medios de células de mamífero que
experimentan transfección con diversos factores. Se obtuvieron los
resultados mediante el ensayo GHBP-LIFA (ensayo
inmunofuncional de ligando) y "<70" significa por debajo del
menor patrón del ensayo. Los resultados demuestran que la expresión
de GHRGPI en células da como resultado niveles muy altos de receptor
soluble en el medio.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectaron Dictylostelium mediante
el procedimiento de fosfato de calcio o electroporación y se
mantuvieron en medio de cultivo con G418 para seleccionar clones
estables.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ligó el dominio extracelular de ADNc de GHR
humano(bases 98-834, número de acceso X06562)
en un vector
(pAc6-LP-MCS-GPI)
que contenía el promotor del gen de actina 6 de
Dictyostelium, una región de codificación de péptido señal
de Dictyostelium, el sitio de clonación múltiple y la señal
(PSPITTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI) de un
anclaje de GPI. Se transfectó el vector resultante
(pAc6-GHR-GPI) en células de
Dictyostelium.
El Dictyostelium añade N- y
O-glucosilaciones. Se seleccionaron entonces clones
que expresaban GHR-GPI mediante inmunohistoquímica
y transferencia Western usando un anticuerpo
anti-GHR Mab5. Se purificó la
GHR-GPI de los lisados celulares usando una columna
de afinidad de GH. Se demostró que la GHR-GPI
purificada se unía a GH y, en un bioensayo de señalización de GH, la
GHR-GPI actuaba como antagonista inhibiendo la
señalización.
Se digirió el vector
pAc6-LP-MCS-GPI (Fig
1) con BamHI y EcoRI. Se amplificó el dominio extracelular de GHR
de las bases 98-834 (acceso X06562) mediante PCR con
los sitios de restricción BamHI y EcoRI 5' y 3' respectivamente, y
se ligaron después en el MCS de
pAc6-LP-MCS-GPI,
dando el siguiente MCS: cag gat cca ttt...GHR
98-834..... tac cga att cca (Fig 2). La proteína
GHR codificada es del primer residuo después del péptido señal de
mamífero al último residuo antes del dominio transmembrana. El
vector resultante se llamó
pAc6-GHR-GPI.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfectó el ADNc de
pAc6-GHR-GPI en células de
Dictyostelium y se seleccionaron entonces clones y se
cribaron mediante transferencia Western usando Mab5, un anticuerpo
monoclonal del dominio extracelular del GHR humano. Cinco clones
dieron una clara señal 40 kDa, el tamaño esperado de
GHR-GPI glucosilada (Fig 4). La inmunotinción de un
clon identificó claramente a GHR-GPI sobre la
superficie celular (Fig. 5). Se purificaron entonces los lisados
celulares en Triton X-100 al 0,1% en una columna de
afinidad de GH en PBS/0,1% de Triton X100 (fosfato de Na 0,01 M,
NaCl 0,15 M, 0,02% de NaNO_{3}, 0,1% de Triton
X-100, pH 7,4). La concentración aproximada de
GHR-GPI era de 120 \mug/ml o 3 \muM. Se confirmó
la actividad funcional del GHRGPI purificado mediante unión de GH
yodada (Fig 6).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó un bioensayo establecido para cribar la
actividad antagonista (Ross y col., 1997). Se transfectó
transitoriamente una línea celular permanente que expresa el GHR
completo con un indicador de luciferasa que se une a Stat5
activada. 24 horas después, se estimulan las células con GH durante
6 horas con o sin antagonista. Se lisan entonces las células y se
mide la actividad luciferasa. Se efectuó el bioensayo en presencia o
ausencia de GHR-GPI a una concentración de
aproximadamente 10 nM (Fig 7). La GHR-GPI bloqueó
completamente la señalización a baja concentración de GH y causó
una reducción de aproximadamente un 50% en la señalización a
concentraciones mayores de GH, confirmando la acción antagonista de
GHR-GPI sobre la señalización de GH.
\vskip1.000000\baselineskip
Para demostrar que la GHR-GPI
puede actuar como terapia transgénica, se ha clonado el dominio
extracelular de GHR cadena arriba de una secuencia señal de GPI
humano en un vector de expresión de mamífero (Fig.
8-9). Se transfectó entonces este constructo en
células CHO y se demostró la expresión mediante análisis FACS usando
un anticuerpo monoclonal específico de GHR humano (Fig. 10). El
nivel de unión en células CHO era extremadamente alto. Para ensayar
si la expresión de GHR-GPI en la superficie celular
actuaba como antagonista, se transfectó la GHR-GPI
a células HEK 293 que expresaban GHR de tipo silvestre y se
estimularon con GH. Esta coexpresión de GHR-GPI
bloqueó completamente la señalización de GH (Fig. 11). Además, se
midió en los medios de células transfectadas con GHRGPI el receptor
soluble (GHBP) y se encontraron niveles altos (Fig. 12),
proporcionando otro mecanismo mediante el que la expresión
transgénica de fusiones de citocina-GPI podría
actuar como antagonista.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante no tiene otro propósito que servir de ayuda al lector y
no forma parte del documento de Patente Europea. A pesar de la gran
atención dedicada a su confección, no puede descartarse la presencia
de errores u omisiones, en cuyo caso la OEP declina toda
responsabilidad.
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Claims (16)
1. Un polipéptido quimérico que comprende:
(i) un dominio extracelular de unión a hormona
de crecimiento de un receptor de hormona de crecimiento; y
(ii) un dominio que incluye una secuencia señal
para la fijación de glicosilfosfatidilinositol.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un polipéptido según la reivindicación 1, en
el que el polipéptido se modifica mediante la adición de
glicosilfosfatidilinositol.
3. Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2,
en el que la secuencia señal para la fijación de
glicosilfosfatidilinositol se selecciona del grupo constituido por
PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI
VIFISFVLLI; DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL; LVPRGSIEGR GTSITAYNSE GESAEF
FFLL ILLLLLVLV; o TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV.
VIFISFVLLI; DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL; LVPRGSIEGR GTSITAYNSE GESAEF
FFLL ILLLLLVLV; o TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV.
4. Una molécula de ácido nucleico que comprende
una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. Un vector que comprende una molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 4.
6. Un vector según la reivindicación 5, en el
que dicho vector es un vector de expresión adaptado para expresión
génica eucariótica.
7. Un vector según la reivindicación 5 ó 6, en
el que dicho polipéptido recombinante se dota con una señal de
secreción para facilitar la purificación de dicho polipéptido.
8. Un procedimiento para preparar un polipéptido
de las reivindicaciones 1-3 que comprende:
(i) cultivar una célula transfectada con un
vector según la reivindicación 6 ó 7; y
(ii) purificar dicho polipéptido de dicha célula
o su entorno de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Un procedimiento para prepara y purificar un
polipéptido de la reivindicación 1-3, en el que
dicho polipéptido purificado no incluye un anclaje de GPI, que
comprende las etapas de:
(i) cultivar una célula transfectada con un
vector según la reivindicación 6 ó 7; y
(ii) purificar dicho polipéptido de su entorno
de crecimiento.
\vskip1.000000\baselineskip
10. Una célula eucariótica transfectada con un
ácido nucleico según la reivindicación 4 o un vector según
cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
11. Una célula eucariótica según la
reivindicación 10 seleccionada del grupo constituido por: célula de
hongo, moho mucilaginoso, insecto, planta o mamífero.
12. Una célula según la reivindicación 11, en la
que dicha célula es una célula de moho mucilaginoso y es
Dictyostelium spp.
13. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para uso como producto farmacéutico.
14. Una composición farmacéutica o medicamento
que comprende un polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Un polipéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 para la fabricación de un medicamento para
uso en el tratamiento de acromegalia o gigantismo.
16. Una micela que comprende una pluralidad de
polipéptidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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