KR20100039911A - 폴리펩타이드들을 포함하는 글리코실포스파티딜이노시톨 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이토카인의 수용체 결합 영역과 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커의 부착을 위한 시그널 시퀀스를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법과 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자와 그리고 상기 폴리펩타이드를 포함하는 치료 조성들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

폴리펩타이드들을 포함하는 글리코실포스파티딜이노시톨 {Glycosylphosphatidylinositol Containig Polypeptides}

본 발명은 사이토카인의 수용체 결합 영역(binding domain)과 글리코실포스파티딜이노시톨(glycosylphosphatidylinositol/GPI) 앵커들(anchors)의 부착을 위한 시그널 시퀀스를 포함하는 영역에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드; 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자; 그리고 상기 폴리펩타이드를 포함하는 치료 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

지피아이-앵커들(GPI-anchors)은 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)을 단백질에 첨가하는 후-유전암호해독(post-translational) 변형(modification)들로서 글리코실포스파티딜이노시톨은 이 같은 단백질들이 세포막의 세포외면에 고정되게 한다. 전형적으로 지피아이 앵커들을 가지는 단백질들은 막통과(transmembrane) 또는 세포질(cytoplasmic) 영역을 가지지 않는다. 지피아이 앵커 단백질들은 다양한 단백질 군(family of proteins)을 형성하는데 이 같은 단백질 군은, 여기에 열거된 것에 한정되는 것은 아니며, 예컨대, 막(membrane)과 관련된 효소, 부착 분자들 그리고 트리파노소마 부루세이(trypanosoma brucies pp) 같은 원생 기생충들(protozoan parasites)의 외부 표면을 코딩하는 단백질들을 포함한다. 신장은, 예컨대, 뉴로모듈린(uromodulin), 탄산탈수 효소 타입 Ⅳ(carbonic anhydrase type Ⅳ), 알카리 인산분해효소(alkaline phosphataes), Thy-1, BP-3, 아미노 펩티다아제 P(amino peptidase P), 그리고 다이펩티딜펩티다아제 (dipeptidylpeptidase)와 같은 많은 지피아이-고정된(GPI-anchored) 단백질들을 포함한다.

모든 지피아이-앵커 단백질들은 초기에는 막통과 앵커로 합성되어지고, 세포질 세망(endoplasmic reticulum)을 가로질러 이동한 후, 쪼개지고 특이 트랜스아미다아제(transamidase) 효소에 의해 이전에 형성된 지피아이-앵커에 공유적으로 연결된다. 지질 일부분(lipid moiety)의 첨가는 단백질이 세포막으로 삽입되어 그 결과 단백질을 고정하는 것을 허용하기 때문에, 지피아이-앵커의 첨가에 의한 단백질의 변형은 중요한 성질을 단백질에게 제공한다.

합성 지피아이 앵커 시퀀스를 제조하기 위해서는 몇가지 일반적인 요구 조건들이 있다. 이 같은 요구 조건들은, 분자(10-20 아미노산)의 C-종단(C-terminus)에 기본적인 잔류(residue)의 군집(cluster)이 따르지 않는 소수성 영역, 상기 소수성 영역에 선행하는 "스페이서 영역(spacer domain) 7-10 잔류들, 그리고 전구물질의 분할 및 앵커의 부착이 발생하는 스페이서 영역 이후의 작은 아미노산들이 그것들이다.

지피아이 앵커는 세포질 세망내에서 사전결합되고(preassembled) 초기 단백질(nascent protein)에 추가된다. 이 단계와 더불어 초기의 C-종단 펩타이드는 제거되어 지피아이 앵커가 단백질 상의 새로운 C-종단 아미노산이 공유적으로 부착된다.

수용체와 작용하여 적당한 생화학 반응을 가져오는 리간드는 작용제(agonist)로 알려져 있다. 한편, 생화학 반응을 방해하는 리간드, 즉, 방해자는 길항제(antagonist)로 알려져 있다. 예를 들면, 여기에 제한되는 것은 아니며, 세포 특이적 성장 인자는 길항제로 작용하여 세포막에 위치한 수용체에 결합하는 리간드이다.

사이토카인(cytokine)이라 불리는 성장 인자의 큰 그룹은 많은 다양한 세포의 기능들에 관여한다. 이 같은 기능들은, 예컨대, 여기에 한정되는 것은 아니며, 면역 시스템의 조정, 에너지 신진 대사의 조절, 그리고 성장과 발달의 조절을 포함한다. 사이토카인은 표적 세포의 세포 표면에 발현된 수용체를 경유하여 그들의 효과를 전달한다.

사이토카인 수용체 계통 군의 수용체들은 단일 막통과 영역을 구비하고, 내인성 효소 활성(intrinsic enzyme activity)을 결여하고 있다(Kishimoto et al.,1994). 사이토카인이 그 동족 수용체에 결합하면, 그 복합체(complex)는 내재화되고(internalised) Jak/Stat 와 Mark 경로를 포함한 신호 폭포(singaling cascades)의 활성화를 통하여 신호가 발생한다. 내재화에 이어서 재순환 공정과정 따르는데 이에 따라 수용체 분자는 세포내에서 더 사용되기 위해서 재생성된다. 이상의 예는 성장 호르몬(GH)및 그것이 결합하는 성장 호르몬 수용체(GHR)와 관련하여 기술되었다.

성장 호르몬의 단일 분자는 두 개의 수용체 분자와 결합한다는 것이 알려져있다(Cunningham et al.,1991; de Vos et al.,1992; Sundstrom et al.,1996; Clackson et al.,1998). 이것은 성장 호르몬에 있는 두개의 독특한 수용체-결합 자리(two unique receptor-binding sites)와 두 개의 수용체의 세포밖 영역위의 공통 결합 주머니(common binding pocket)을 통하여 발생한다. 성장 호르몬의 수용체-결합 자리 1은 수용체-결합 자리 2보다 높은 친화력을 가지며, 수용체 이합체화(dimerization)는 하나의 수용체가 성장 호르몬의 수용체-결합 위치1에 결합하고 이어서 두 번째 수용체가 성장 호르몬의 수용체-결합 위치2에 결합하는 것이 순차적으로 발생하는 것에 의해 일어난다고 생각되어 진다.

성장 호르몬 수용체의 세포밖 영역은 각각 대략 100 아미노산(SD-100)의 두 개의 연결된 수용체 영역들, 즉, 세포표면에 가장 가까이 존재하는 C-종단 SD-100 영역과 가장 멀리있는 N-종단 SD-100영역으로 존재한다. 이 두 영역들에서 입체형태적변화(conformational change)가 호르몬 결합으로 트리메트릭(trimetric) 복합체 GHR-GH-GHR 을 형성하면서 발생한다.

더욱이 수용체의 세포질 영역이 결핍된 끝이 잘린(truncated) 성장 호르몬 수용체는 성장 호르몬 신호화의 주된 음성 억제제(dominant negative inhibitors)로 동작한다(Ross et al.,1997). 끝이 잘린 수용체는 내면화에 필수적인 세포질 영역이 결핍되었기 때문에, 끝이 잘린 수용체는 세포 표면의 높은 레벨에서 발현된다(Maamra et al.,1999). 성장 호르몬의 존재시, 끝이 잘린 수용체는 세포질 영역이 결핍되었기 때문에, 끝이 잘린 수용체는 원 길이의 수용체와 이형이합체화하고 신호화를 차단한다. 끝이 잘린 수용체는 내면화에 실패하기 때문에, 끝이 잘린 수용체는 성장 호르몬 수용체 복합체의 내면화를 방지하는 주된 음성 억제제로 작용한다.

우리는 지피아이-앵커 단백질 영역을 포함하는 사이토카인(cytokine) 수용체 변종(variants)을 합성하였다. 사이토카인 수용체 변종은 세포질 영역이 결핍되고, 그러므로 신호할 능력이 없다. 지피아이-앵커 영역의 제공은, 변종이 막내부로 삽입되어 성장 호르몬의 신호능력에 대한 효과적인 억제제로 작용함을 의미한다. 이 같이 삽입된 변종의 신호능력 억제는 혈중에서 순환하는 성장 호르몬과 결합하기 위해 경쟁해서 끝이 잘린 지피아이 정착된 수용체, 성장 호르몬, 그리고 본래 수용체로 구성된 이형이합체 복합체에서 세포 표면에서 성장 호르몬과 결합하는 것에 의해서 이루어진다. 게다가 끝이 잘린 지피아이 정착된 성장 호르몬 수용체는 성장호르몬과 결합할 많은 수용성 성장 호르몬 수용체를 생산한다.

많은 사이토카인은 이합체화(dimerisation) 또는 과소합체화 oligomeristion)을 경유하여 그들의 동족 수용체를 활성화한다. 그리고, 본 발명은 글리코실포스파티딜이노시톨의 첨가에 의해 변형된 시퀀스(sequence)을 포함하는 폴리펩타이드 영역의 제공에 의해 변형된 사이토카인 수용체를 제공하는 것에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 일 태양에 따르면, 키메라 폴리펩타이드가 제공된다. 본 발명의 키메라 폴리펩타이드는:

ⅰ) 사이토카인 수용체 리간드 결합 영역; 그리고

ⅱ) 글리코실포스파티딜이노시톨의 부착을 위한 시그널 시퀀스를 포함하는 영역을 포함한다.

바람직하게는, 상기 키메라 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체 세포밖 영역과 글리코실포스파티딜이노시톨을 부착하기 위한 시그널 시퀀스을 포함하는 영역을 포함한다.

바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 글리코실포스파티딜이노시톨의 첨가에 의해 변형된다.

바람직하게는 상기 변성된 폴리펩타이드는 사이토카인 매개 세포 신호화를 조절하는 조정자이다.

바람직하게는 글리코실포스파티딜이노시톨의 부착을 위한 시그널 시퀀스는:

DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL;

PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI;

LVPRGSIEGR GTSITAYNSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV; 그리고

TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV 으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 상기 폴리펩타이드는 길항제이다.

본 발명은 수용체를 위한 사이토카인의 고친화력과 친유성(lipophilic)의 지피아이 꼬리를 원형질막(plasma membrane)으로 다시 삽입하는 능력을 이용한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 사이토카인 수용체 리간드 결합 영역과 지피아이 앵커의 첨가를 위한 자리를 포함하는 영역을 포함하는 "키메라"이다. 키메라 분자는 C-종단 지피아이 앵커를 가지는 세포밖 사이토카인 호르몬 결합 영역을 포함할 것이다.

순환 중의 키메라 단백질은 중심에 지피아이 앵커를 가지는 다수의 키메라 단백질 미포(micelle) 형성할 것이라고 예상된다. 세포막에 접촉하여 지피아이는 세포막 속으로 다시 삽입될 것이다. 본 발명은 사이토카인이 키메라와 결합하여 수용체: 호르몬: 키메라 복합체를 형성하는 점에서 중요한 이점을 가진다. 성장 호르몬의 예에서, 이 복합체는 성장 호르몬 수용체: 성장 호르몬: 키메라가 될 것이다. 키메라가 끝이 잘린 수용체이고 따라서 수용체 신호화 및 내면화를 방해하기 때문에 이 복합체는 신호를 내지 못할 것이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 폴리펩타이드 키메라는 순환 길항제로서 작용한다. 순환 중의 미포(micellar) 분자는 그것의 중심과 외부로 향한 수용체 결합 영역에 지피아이 앵커들을 가질 것이며 따라서 호르몬과 결합할 수 있고 호르몬의 작용을 억제할 수 있을 것으로 예측된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서 상기 폴리펩타이드 키메라는 유전자 치료를 통한 국소 또는 디엔에이삽입(트렌스제닉:transgenic) 발현 후에 길항제로 작용을 한다. 핵산전달감염(트렌스펙션:transfection) 또는 유전자 치료가 세포 수준이나 몸 전체 수준에서 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 따라서, 세포에서 상기 국소 발현은 사이토카인의 작용을 차단할 수 있으며 또는 염증이 발생한 무릎 같은 신체의 일부분에 DNA를 삽입하는 것은 종양괴사인자(TNF) 같은 감염성 사이토카인의 작용을 방해할 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 사이토카인 수용체의 리간드 결합 영역은, 성장 호르몬(GH); 랩틴(leptin); 적혈구생성인자(erythropoietin); 프로락틴(prolactin); 티앤에프(TNF), 인터루킨(interleukin)(IL), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12의 p35 서브 유닛, IL-13, IL-15; 과립구집락자극인자(granulocyte colony stimulating factor)(G-CSF); 과립구대식세포자극인자(granulocyte macrophage colony stimulaing factor)(GM-CSF); 속눈썹 향정신성 인자(ciliary neurotrophic factor:CNTF); 심장자극호르몬-1( cardiotrophin-1:CT-1); 백혈병 억제인자(LIF); 온코스타틴 엠(oncostatin M:OSM); 인터페론(interferon), IFN 알파와 IFN 감마로 구성된 그룹으로부터 선택된 수용체로부터 유도된다.

바람직하게는 사이토카인 수용체의 리간드 결합 영역은 성장 호르몬 수용체로부터 유도된다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 폴리펩타이드는 융합 단백질(fusiton protein)이다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예서, 상기 폴리펩타이드는 도3 또는 도9 또는 도14 또는 도15에 보여진 아미노산 시퀀스를 포함한다.

본 발명의 보다 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 제공된다. 상기 폴리펩타이드는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 추가, 삭제 또는 치환하는 것에 의해 변형되어 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 시퀀스 변이를 제공한다.

일반적으로, 변이는 그 생리적 활성(physiological activity)에 관계 없는 폴리펩타이드의 특징을 변경하기 위해 특별히 변형되는 키메라를 포함한다. 예를 들면, 시스테인 잔기는 불필요한 디설파이드 결합(disulfide linkage)을 차단하기 위해 치환되거나 삭제될 수 있다. 마찬가지로, 어떤 아미노산은 발현 시스템 내의 프로테아제(proteases)에 의한 단백질 분해를 제거하는것에 의해 키메라의 발현이 향상되도록 바뀔 수 있다.

변이 키메라는 발현되고, 어떠한 돌연변이가 원하는 특성들을 가진 변이 폴레펩타이드를 제공하는 가를 결정하기 위해서 하나 또는 그 이상의 활성이 검사된다. 폴리펩타이드의 아미노산 시퀀스에 대해 알려져 있지 않지만 예컨대 효모 및 Dictyostelium spp 와 같은 점균류(slime mold) 같은 특별한 숙주에서 유전암호해독(translation)을 위한 바람직한 유전자부호(codon)를 제공하는 변이들에 대해서 추가적인 돌연변이가 가해질 수 있다.

당업자라면 또한 전술한 폴리펩타이드와 기능적으로 동등한 변이들(다시 말해 키메라의 기능적인 능력을 유지하는 변이들)을 제공하기 위해서, 보존 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 여기에 사용된 "보존 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어짐에 있어서 단백질의 상대적인 전하량(charge) 또는 크기 특성을 변화시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다.

변종은, 예컨대, Molecular Cloning: A Lavoratory Manual, J. Sambrook, et al., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York 와 같은 방법들을 편집한 참조들에서 발견되는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 폴리펩타이드 시퀀스 변경을 위한 방법에 따라 준비될 수 있다.

아미노산의 보존(conservative) 치환은 (a)M, I, L, V; (b)F, Y, W; (c)K, R, H; (d)A, G; (e)S, T; (f)Q, N; 그리고 (g)E, D 그룹안에 있는 아미노산 가운데 만들어진 치환을 포함한다.

폴리펩타이드의 기능상의 동등한 변이들을 만들어내기 위한 키메라 폴리펩타이드의 아미노산 시퀀스의 보존 아민산 치환은 전형적으로 키메라를 인코딩하는 핵산의 변경에 의해 만들어진다. 그런 치환은 이 기술 분야에서 통상적진 지식을 가진 자에게 알려진 여러 가지 방법에 의해 만들어 질 수 있다. 예를 들면, 아미노산 치환은 PCR-통제 돌연변이(mutation), Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82:488-492-1985의 방법에 따른 자리-통제 돌연변이(mutagenesis)에 의해 만들어질 것이다.

이와 다르게, 또는 바람직하게는, 상기 변형은 발명에 따라 키메라 폴리펩타이드의 재조합이나 합성 형태의 생산에서 변형된 아미노산의 사용을 포함한다.

변형 아미노산은 예컨대, 여기에 제한되는 것은 아니며, 4-하이드록시프롤린(5-hydroxyproline), 5-하이드록시리신(5-hydroxylysine), N⁶-아세틸리신(N⁶-acetyllysine), N⁶-메틸리신(N⁶-methyllysine), N⁶, N⁶-디메틸리신(N⁶,N⁶-dimethyllysine), N⁶,N⁶,N⁶-트리메틸리신(N⁶,N⁶,N⁶-trimethyllysine), 사이클로헥시알라닌(cyclohexyalanine), D-아미노산,오르니틴(ornithine)을 포함하는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

변형된 아미노산의 도입(incorporation)은 본 발명에 따른 폴리펩타이드에 유리한 특성을 수여할 것이다. 예를 들면, 변형 아미노산의 도입은 키메라 폴리펩타이드에게 증가된 생체 내의 안정성을 제공할 것이며, 이에 따라 환자에게 투여되는 폴리펩타이드의 유효 량을 감소시킬 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 시퀀스를 포함하는 핵산 분자가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면 상기 핵산 분자는 도3 또는 도9에 표현된 핵산 시퀀스를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 도3 또는 도9에의해 표현된 시퀀스에 대한 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 핵산 시퀀스가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면 도3 또는 도9에 표현된 것과 같은 핵산 분자에 의해 인코딩된 폴리펩타이드가 제공된다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 선행하는 본 발명의 모든 특징들 또는 실시예에 따른 폴리펩타이드를 인코딩하는 DNA 분자를 포함하는 벡터가 제공된다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 벡터는 진핵 유전자 발현(eukaryotic gene expression)에 적응된 발현 벡터이다.

일반적으로 상기 적응(adaptation)은 세포/조직 특이 발현(cell/tissue specific expression)을 매개화하는 유전암호해독 제어 시퀀스(프로모터 시퀀스)의 준비를 포함한다. 이 프로모터(promoter) 시퀀스는 세포/조직 특이적이고, 유발가능 또는 기본구성적(constitutive)일 것이다.

프로모터(promoter)는 분야에서 인정되는 용어이고, 명백성을 위하여, 예컨대, 단지 일 예로서 제공되는 그리고 여기에 제한되는 것은 아니며, 다음의 특징을 포함한다. 인핸서(enhancer) 원소는 시스 작용(cis action) 핵산 시퀀스들로서 때때로 유전자의 전사(transcription) 개시 자리 5'에서 발견된다(인핸서는 또한 유전자 시퀀스의 3'에서도 발견되며 심지어 인트론 시퀀스에 위치하며, 따라서 위치에 의존하지 않는다). 인핸서는 그것이 연결된 유전자의 전사 비율의 증가시키는 기능을 한다. 인핸서 활동성은 인핸서 요소에 특이적으로 결합하는 것으로 보이는 트랜스 작용(trans acting) 전사 요소(폴리펩타이드)에 반응한다. 전사 인자의 결합/활동성은 (David S Latchman, Academic Press Ltd, San Diego의 Eukaryotic Transcription Factors를 참고) 예컨대, 여기에 한정되는 것은 아니며, 중간 대사 물질(예를 들면 글루코스, 지질), 환경적인 요인들(예를 들면 빛, 열)를 포함하는 많은 환경성 신호(cue)에 반응한다.

프로모터 원소는 소위 TATA 박스와 전사 개시 자리를 선택하는 기능을 하는 RNA 중합효소 개시 선택(RIS) 시퀀스를 또한 포함한다. 이 시퀀스는 또한 그 중에서도 RNA 중합효소에 의한 전사 개시 선택을 용이하게 하는 기능을 하는 폴리펩타이드에 결합한다.

적응(adaptation)은 또한 선택가능한 마커(marker)와 자동 복제 시퀀스의 준비를 포함하는데, 이들 둘은 모두 어느 진핵세포에서도 상기 백터의 유지를 향상시킨다. 자동적으로 유지되는 벡터들은 에피소말(episomal) 벡터라고 불려진다.

벡터 인코드된 유전자의 발현을 용이하게하는 적응은 전사 종료/아데닐레이션 시퀀스의 제공을 포함한다. 이것은 또한 바이시스트로닉(bicistronic) 또는 멀티-시스트로닉(multi-cistronic) 발현 카세트(cassette)로 배열된 백터 인코드된 유전자의 발현을 최대화하는 기능을 하는 내부 리보솜 출입 자리(IRES:Internal Ribosom Entry Site)를 준비하는 것을 포함한다.

이 적응은 이 분야에서잘 알려진 사실이다. 일반적으로 유전자 발현 벡터 구조와 재조합 DNA 기술에 관련된 엄청나게 많은 공표된 문헌들이 있다: Sambrook et al(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY and references therein; Marston, F(1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol 3 IRL Press, Oxford UK; DNA Cloning: F M Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.(1994).

본 발명에 따르는 벡터가 유전자 치료요법 벡터일 수 있다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에에 있어서 자명할 것이다. 유전자 치료요법 벡터는 일반적으로 바이러스를 기초로 한다. 많은 바이러스는 보통 외인성 유전자(exogenous gene)의 전달을 위한 벡터로써 사용된다. 일반적으로 채택되는 벡터는 재조합하여 변형되어 외피를 가지는(enveloped) 또는 외피를 갖지 않는 DNA와 RNA 바이러스를 포함하고, 바람직하게는 baculoviridiae, parvoviridiae, picornoviridiae, herpesveridiae, poxviridae, adenoviridiae 또는 picornnaviridiae에서 선택되는 것을 포함한다. 어버이 벡터 특성의 각각의 장점을 이용하는 키메라 벡터가 또한 채택될 수 있다(예로 Feng, et al.(1997)Nature Biotechnology 15:866-870 참조). 이런 바이러스 벡터(viral vector)는 야생-타입이거나 복사 흠결(repication deficient), 조건적인 복제 또는 복제 적격(replication competent)이 되도록 재조합 DNA 기술에 의해 수정될 수 도 있다.

바람직한 벡터는 아데노바이러스(adenoviral), 아데노바이러스의존 바이러스(adeno-associated viral)와 리트로바이러스(retroviral) 게놈(genome)으로부터 유래한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시예에서, 벡터는 인간의 아데노바이러스 게놈에서 비롯된다. 특히 바람직하게는 선택된 벡터는 인간 아데노바이러스 혈청형 2 또는 5에서 비롯된다. 그런 벡터의 복제 능력은 E1a 그리고/또는 E1b 코딩 영역에서 변형 또는 삭제에 의해 ("복제 결함"으로 인실될 수 있을 정도로) 약화될지도 모른다. 특별한 발현 특성(particular expression characteristic)을 얻거나 반복 관리(repeat administration) 또는 낮은 면역 반응(lower immune response)을 달성하기 위해 바이러스 게놈에 대한 다른 변형이 수행되는 것이 바람직하다.

또는, 바이러스 벡터는 조건적으로 복제하거나 복제 적격일 수 있다. 조건적으로 바이러스 벡터를 복제하는 것은 불리하게 넓은 광범위 감염(broad spectrum infection)을 피하면서 부분적인 세포 타입의 선택적 발현을 얻기 위해 사용될 수 있다. 조건적으로 벡터를 복제하는 예는 Pennisi, E.(1996) Science 274:342-343; Russell,그리고 S.J.(1994) Eur. J. of Cancer 30A(8):1165-1171에 기술되어 있다. 선택적인 복제 벡터의 다른 예는 프로모터의 제한하의 바이러스의 복제를 위한 게놈 필수요소안에 벡터를 포함한다. 이런 벡터의 예는 1997년 12월 16일에 발행된 Henderson, et al., United States Patent No. 5,698,443 와 1999년 2월 16일에 발행된 Henderson, et al., United States Patent No.5,871,826 에 개시되어 있으며 이들 개시 내용이 본 명세서에 참조로서 포함된다.

추가적으로, 특별한 상황에서만 복재 또는 발현을 달성하는 유도 프로모터를 포함하기 위하여 바이러스 게놈은 변형될 수 있다. 유도 프로모터의 예는 과학 인쇄물에 알려져 있다(Yoshida and Hamada(1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230:426-430; Iida, et al. (1996)J.Virol. 70(9):6054-6059; Hwang, et al.(1997) J.Virol 71(9):7129-7131; Lee, et al.(1997) Mol.Cell.Biol. 17(9):5097-5105; 그리고 Dreher, et al.(1997)J.Biol.Chem 272(46);29364-29371.참조).

벡터는 또한 비-바이러스성 일수도 있으며, 이 분야의 숙련된 기술자가 용이하게 입수할 수 있는 많은 상업적 출처로부터 입수가능하다. 예를 들면 벡터는 에피소말 또는 통합 가능한 플라스미드일 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이들 준비하는 방법은:

(ⅰ) 상기 폴리펩타이드의 제조에 도움이 되는 조건에서 본 발명의 벡터 또는 핵산으로 핵산감염(transfect)된 세포를 성장시키고; 그리고

(ⅱ) 상기 세포로부터 또는 성장 환경으로부터 상기 폴리펩타이드를 정제(purify)하는 것을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 벡터는 인코드하고 그리고 상기 재조합 폴리펩타이드에게는 상기 폴리펩타이드의 정제를 향상시키기 위한 상기 분비 호르몬이 제공된다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 벡터 또는 핵산으로 핵산감염된 세포가 제공된다.

바람직하게는 상기 진핵 세포는: 곰팡이 세포(예를 들면 Saccharomyces cerevisiae, Pichia spp); 점균류(예를 들면 Dictyostelium spp); 곤충(예를 들면 Spodoptera frugiperda); 식물 세포; 또는 포유류 세포 로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 진핵 세포는 Dictyostelium spp 이다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 의약으로서의 사용이 제공된다. 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 의약 조성물에 사용된다.

본 발명의 폴리펩타이드가 투약될 때에 본 발명의 따른 폴리펩타이드는 약학적으로 수용가능한 제조로 투약된다. 그런 제조는 염, 완충제, 방부제, 호환성 운반체 그리고 선택적으로 다른 치료제의 통상적으로 약학적으로 수용가능한 농도를 포함할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 주사를 포함하는 통상의 어떠한 경로에 의해서 투약될 수 있다. 투약은 예를 들면 경구(oral), 정맥내(intravenous), intraperitioneal, 근육내, 공동내(intracavity), 피하 또는 경피(transdermal)를 통해서 이루어 질 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 효과적인 양으로 투약된다. "효과적인 양"는 단독으로 또는 또는 그 이상의 복용량과 함께 요구되는 반응을 야기하는 조성물의 양을 의미한다. 이것은 단지 일시적으로 병의 진행을 늦게 하는 것을 포함할수 있다. 그러나 더 바람직하게는, 그것은 병의 진행을 영구적으로 정지시키는 것을 포함한다. 이것은 통상적인 방법에 따라 또는 진단 방법에 의해서 감시(monitor)될 수 있다.

환자에 따라 투여되는 폴리펩타이드의 복용량은 다른 파라미터들, 특히 투여 방식 및 환자의 상태(예를 들면 나이, 성별)에 따라서 결정된다. 투여될 때, 본 발명의 의약 조성물은 제약적으로 수용가능한 양으로 그리고 수용가능한 조성으로 적용된다. 그런 제조는 염, 완충제, 방부제, 호환성 운반체와 선택적으로 다른 치료제를 통상적으로 포함할 수도 있다. 의약으로 사용될 때, 염은 제약적으로 허용가능해야 하며, 하지만 제약 분야 이외에서 허용가능한 염 또한 제약적으로 허용가능한 염을 조제하기 위해서 사용될 수 있으며 본 발명으로 제외되지 않는다. 그와 같은 약리학적으로 그리고 제약학적으로 허용가능한 염은 여기에 제한되는 것은 아니며 다음과 같은 산으로부터 조제된다: 염화 수소산(hydrochloric), 브롬화 수소산(hydrobromic), 황산(sulfuric), 질산(nitric), 인산(phosphoric), 말레산(maleic acid), 아세트산(acetic), 살리실산(salicylic), 구연산(citric), 포름산(formic), 말론산(malonic), 숙신산(succinic) 기타 등등. 또한, 제약적으로 허용가능한 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토염(예컨대 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염)로 제조될 수 있다.

제약적 조성은 원할 경우 제약적으로 허용되는 운반체(carrier)에 결합될 수 도 있다. "제약적으로 허용가능한 운반체(pharmaceutically-acceptable carrier)" 라는 용어는 사람에게 투약되기에 적절한 하나 또는 그 이상의 호환성 고체 또는 액체 부형재(filler), 희석제 또는 캡슐화된 물질을 의미한다. "운반체"라는 용어는 그 적용을 촉진하기 위해 활성 성분이 결합하는 유기 또는 무기 성분, 천연 또는 합성물을 의미한다. 의약 조성물의 성분은 또한 원하는 의약적 효과를 실질적으로 해치지않는 상호반응을 일으키지 않는 방식으로 본 발명의 분자와 함께 섞일 수 있고, 또한 의약 조성물 성분이 서로 혼합될 수 있다.

의약 조성물은 염 속의 아세트산; 염 속의 구연산; 염속의 보릭산(borric acid); 그리고 염속의 인산을 포함한 적당한 완충제를 포함할 수 있다.

의약 조성물은 또한 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride); 클로로부탄올(chlorobutanol); 파라벤(paraben) 그리고 티로살(thimertosal) 같은 임의의 적당한 방부제를 포함할 수 있다.

의약 조성물은 편리하게 기본 복용량 형태로 제공될 수 있고 제약 분야의 잘 알려진 어떤한 방법들에 의해 제조될 수 있다. 이 같은 방법들은 활성제(active agent)를 운반체와 회합하도록 가져오는 단계를 포함하는데, 운반체는 하나 또는 그 이상의 보조 성분을 구성한다. 일반적으로, 조성물은 균일하고 친밀하게 상기 활성제를 운반체, 미세하게 분할된 고체 운반체 또는 둘 모두와 회합하도록 가져오고, 그리고 필요하다면 결과물을 형상하는 것에 의해서 준비된다.

경구 투여를 위한 적절한 조성물은 각각 미리 결정된 활성 화합물 일정량을 포함하는 캡슐(capsules), 정(tablets), 작은 형태의 알약(lozenges) 같은 개별적인 유닛들로 제조된다. 다른 조성물은 방수액 또 시럽, 엘릭시르(elixir) 또는 유탁액(emulsion) 같은 비방수액 안에 부유액들을 포함한다.

비경구적 투여(parenteral administration)를 위한 적절한 조성물은 환자의 혈액의 삼투압과 동일한 등장성의 무균 방수 또는 무균 비방수 제조를 포함한다. 이 약제는 적절한 분산제(dispersing) 또는 습윤제(wetting agent) 그리고 현탁용제(suspending agent)를 사용하는 알려진 방법에 따라 만들어진다. 무균 주사 가능한 약제는 주사 투여 가능한 용제나 무독 비경구적 허용가능한 희석액 또는 용액안의 현탁액, 예를 들면 1,3-부탄 디올 안 같은 것을 포함한다. 사용되어 질 수 있는 허용가능한 용액들은 물, 링거의 용액(Ringer's solution), 그리고 등장성 나트륨 염화 용액을 포함한다. 게다가, 무균의, 불휘발성유(fixed oil)는 용매나 현탁 보존액(suspension medium)으로 통상적으로 사용된다. 이 목적을 위해서, 합성 모노-또는-다이-글리세리드를 포함하는 어떠한 무자극의 불휘발성유도 사용될 수 있다. 추가로 올레산 같은 지방산은 주사가능한 약제에 사용된다. 경구(oral), 피하(subcutaneous), 정맥내(inteaveneous), 근육내(intramuscular), 기타등등 투여를 위한 수용체 제조 공식을 레밍턴의 Pharmaceutical Sciences, Mack Puvlishing Co., Easton, PA에서 찾을 수 있다.

본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 다음과 같은 그룹의로 부터 선택된 질병의 치료에 사용하기 위한 치료제의 제조를 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 사용이 제공된다: 말단 비대증(acromegaly); 거인증(gigantism); 당뇨병(diabetes mellitus); 암(cancer); 식욕부진(anorexia); 자가면역(autoimmune) 그리고 감염성 병(infectious disease); 류마티스관절염(rheumatoid arthritis)을 포함한 염증장애(inflammatory disorder).

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면 상기 질병은 말단 비대증이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 질병은 거인증이다.

본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 상기 질병은 암이다.

본 발명은 또한 환자 또는 환축을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 환자 또는 환축 치료 방법은 폴리펩타이드 의약 조성물 또는 상기 환자 또는 환축의 치료제의 효과적인 양을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 신장의 분자 제거를 줄일수 있는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 신장에의한 분자 제거 감소 방법은 본 발명의 어떠한 실시예에 따란 약물을 형성하는 것을 포함한다. 미포의 크기가 신장의 제거율을 감소시킨다.

본 발명의 실시예는 오로지 실예에 의해 그리고 첨부된 도면들을 참고하여 설명될 것이다.
도1은 Dictyostelium 에서 발현을 위한 GHR의 세포밖 영역을 복제하는데 사용되는 벡터 pAc6-LP-MCS-GPI 의 뉴클레오티드 시퀀스를 보인것이다.
도2는 복제된 GHR 의 세포밖 영역을 가지는 pAc6-LP-MCS-GPI의 다양한 복제 자리의 일부분을 보이고, 이 새로운 벡터는 pAc6GHRGPI라고 불린다. GHR의 세포밖 영역은 대문자로 쓰여있다.
도3은 벡터 pAc6GHRGPI로부터 GHRGPI 융합 핵산 및 아미노산 시퀀스를 나타낸다. GHR의 세포밖 영역을 위한 뉴클레오티드는 대문자로 쓰여 있고 아미노산 시퀀스는 굵은 글씨체(볼드체)로 쓰여있다.
도4는 pAc6GHRGPI 으로 핵산전달감염된 Dictyostelium 클론들로부터 셀 용해질(lysate) 에서 GHRGPI 위한 스크리닝(screening)을 표현한다. GHR, Mab5 에 대한 단세포군(monoclonal) 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅(western blotting)에 의해서 스크리닝이 수행되었다. AX2 레인(rane)은 핵산전달감염되지 않은 셀의 음성 제어이고 1-7 레인은 서로 다른 스크린된 클론들이다. 1, 2, 3, & 5 레인은 정확한 사이즈에서 양성 밴드를 보이고 3 레인은 GHRGPI의 정제를 위해 선택되었다.
도5는 GHRGPI를 위한 면역염색(immunostaining)을 도시하며, 단백질이 Dictyostelium 세포 표면에서 발현되는 것을 증명한다. 위쪽 패널들 중 좌측은 핵산전달감염되지 않은 세포들에 대한 음성 제어에 대한 표면 염색을 보이고, 우측의 pAc6GHRGPI로 핵산전달감염된 세포들 세포 표면에서 양성의 면역염색을 보인다. 아래쪽 패널에서 세포는 세포내 염색을 알아보기 위하여 투과되었다. 마찬가지로 음성 조절은 왼쪽 판넬에 이루어졌고, 양성 조절은 오른쪽에 이루어 졌으며 오른쪽 판넬에서 세포내 염색을 볼 수 있다.
도6은 요오드 표식된 GH(iodinated GH) 단독의 용출 프로필(Elution profile)(Sephadex G100)과 요오드 표식된 GH 플러스 또는 마이너스 cold GH를 가지는 GHRGPI(도5의 GHRGPI를 발현하는 안정한 Dictyostelium으로 부터 정제된)GHRGPI에 대한 용출 프로필을 도시한다. GHR-GPI는 125 I-성장 호르몬(GH)(파란 선)으로 60-65 Kda 정도의 단일의 복합체를 형성한다. 노란 선은 단일의 요오드 표식된 GH이고, 분홍 선은 과잉 콜드 GH 존재시 GHR-GPI를 나타낸다. 이 같은 결는 정제된 GHRGPI에 의해 GH 의 기능적 결합을 보여준다.
도7은 정제된 GHRGPI의 존재 또는 비존재시에 성장 호르몬의 생물학적분석(bioassay)을 보인다. 성장 호르몬 수용체를 발현하는 세포는 성장 호르몬 신호에 의해 활성화되는 루시페린 정보제공자(luciferase reporter)로 핵산전달감염된다. 그리고 나서, 이 세포는 (대략 10nM의) GHRGPI의 존재 또는 부존재 속에서 용양이 점차 증가하는 성장 호르몬으로 자극된다. GHRGPI가 존재할 때 성장 호르몬 신호는 성장 호르몬의 낮은 복용량에서 소멸되었으며 또는 높은 복용량에서 감소되었다.
도8은 포유류 GPI 신호를 가지는 포유류 발현 벡터 pCR-3GPI Thy-1이다.
도9는 pCR-3GPI_Thy-1안에 포유류의 GHRGPI 앵커 폴리펩타이드의 뉴클레오티드와 아미노산 시퀀스인데 이것은 pCR3GHRGPI로 불리운다. GHR의 세포밖 영역은 BamHI와 EcorI 자리로 묶여진다. 아미노산 시퀀스 볼드체는 세포밖 영역 GHR 이고, 밑줄이 그어진 볼드 이탈릭체는 GHR 신호이며, 지피아이 신호의 시작에 밑줄이 그어져 있으며 분할되어 있다.
도10은 핵산전달감염된 CHO 세포들에 대한 FACS 분석을 나타내는 것으로 얇은 선은 단지 벡터로만 핵산전달감염된 것을, 굵은 선은 pCR3GHRGPI으로 감염된 것을 나타내며, 굵은 선은 GHR 특이 단클론 항체로 면역염색된 것이며, 거의 모든 CHO 셀들이 높은 수준의 GHRGPI 을 발현하고 있음을 알 수 있다.
도11은 GH 수용체(오로지 GH)를 발현하는 HEK293 세포내에서 그리고 GHRGPI 플라스미드로 핵산전달감염된 세포 내에서 stat5(루시페라제의 주름 유도:fold induction of luciferase)의 GH 활성을 도시하며, GHRGPI(GPI에 연결된 세포밖 영역 GHR)의 DNA 삽입(transgenic) 발현이 완전히 성장 호르몬 신호를 방해한다는 것을 증명한다.
도12는 다양한 벡터로 핵산전달감염 진행을 취소하는 포유류 세포로 부터 배지 안에 수용성 성장 호르몬 수용체(GHBP)의 측정을 도시한다. 결과들은 GHBPLIFA(리간드 면역 기능 분석)으로 부터 얻어지고 "<70"은 그 측정의 가장 낮은 표준 이하(below)을 의미한다. 결과들은 세포내에서 GHRGPI의 발현은 배지에서 매우 높은 레벨의 수용성 수용체를 초래한다는 것을 증명한다.
도13은 티앤에프 수용체 타입 1의 아미노산과 뉴클레오티드 시퀀스를 나타낸다. 녹색의 신호와 빨강의 막통과 나선인 단백질 시퀀스 P19438. 핵산 시퀀스 X55313 H.sapiens TNF-R m...[gi:37223]. 256-318은 신호이고 319-888은 세포밖 영역
도14는 TNF 수용체 세포밖 영역을 pCR-3GPI_Thy-1(도8)으로 복제 후에 벡터 pCR3TNFGPI로 부터 TNF 수용체 타입 1-GPI 융합 폴리펩타이드의 아미노산 시퀀스를 나타낸다. 볼드체는 세포밖 영역 티앤에프 수용체이고, 밑줄 그어진 볼드 이탈릭체는 티앤에프 수용체 신호이며, 밑줄 그려진 것은 쪼개진 지피아이 신호의 시작이다.
도15는 벡터 pCR-3GPI_Thy-1(도8)으로 세포밖 영역 렙틴 수용체(ObR)의 복제후에 pCR3ObRGPI로부터 렙틴 수용체-GPI 융합 아미노산 시퀀스를 나타낸다. 이탈릭체 ObR 신호, 볼드체 ObR 세포밖 영역, 밑줄 그어진 지피아이를 위한 절단자리
도16은 사이토카인 접근 번호들의 테이블이다.

[실시예]

물질 및 방법

Dictyostliu으로부터 GPI와 함께 융합된 세포밖 영역 사이토카인 수용체의 정제 및 길항제 활성도 증명

Dictylostelium 균주의 감염과 유지

Dictylostelium은 인산칼슘 방법이나 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 핵산전달감염되고 안정된 클론을 선택하기 위해 G418과 배지위에 유지되었다.

키메라 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현

인간 성장 호르몬 수용체(98-834에 기초한, 식별번호 X06562)의 cDNA 세포밖 영역은 벡터(pAc6-LP-MCS-GPI)에 연결되었다(ligated). 상기 벡터(pAc6-GHR-GPI)는 Dictyostelium 액틴(actin) 6 유전자 포로모터, Dictyostelium 신호 펩타이드 코딩 영역, 다중 클로닝 자리들, 그리고 GPI 앵커를 위한 신호(PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI)를 포함한다. 그 결과 형성되는 벡터(pAc6-GHR-GPI)는 Dictyostelium 세포들 속으로 핵산전달감염되었다.

Dictyostelium 은 Nglycosylation 과 0-glycosylation을 추가한다. 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 항-GHR 항원 Mab5 를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해서 클론 발현 GHR-GPI가 선택되었다. GHR-GPI는 성장 호르몬 친화성 컬럼을 사용한 세포 용해질로부터 정제되었다. 정제된 GHR-GPI가 성장 호르몬에 결합하는 것이 증명되었으며, GH 신호화에 대한 생물학적 검사에서 GHR-GPI는 신화화를 신호를 방해하는 길항제로 작용하였다.

벡터 pAc6-LP-MCS-GPI(도1)은 BamHI와 EcoRI으로 증해(digest)되었다. 베이스 98-834(접근 X06562)로 부터 세포외부의 영역 성장 호르몬 수용체는 BamHI와 EcoRI 제한 자리 5'와 3'와 함께 제각기 PCR에 의해 확대되었고 그리고 나서 이하에 따라오는 MCS를 가지기 위하여 pAc6-LP-MCS-GPI의 MCS에 결찰되었다: cag gat cca ttt... GHR 98-834..... tac cga att cca(도2). 인코딩된 GHR 단백질은 포유류 신호 펩타이드 이후의 첫 번째 잔기로부터 막통과 영역 전의 마지막 잔기까지 이다. 결과로 얻어진 벡터는 pAc6-GHR-GPI라고 불린다.

GHR-GPI의 정제

pAc6-GHR-GPI를 위한 cDNA는 Dictyostelium 세포속으로 핵산전달감염되었고 클론은 선택된 후에 인간 성장 호르몬 수용체의 세포밖 영역에 대한 단클론 항체, Mab 5 를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 스크린되었다. 다섯 개의 클론은 40kDa(도4의 당화된 GHR-GPI의 기대되는 크기)에서 명백한 신호를 가졌다. 어느 한 클론의 면역염색은 세포 표면위에(도5)서 GHR-GPI를 명백하게 확인했다. 0.1%의 트리톤(Triton) X100 에서 세포 용해질은 PB/0.1% 트리톤 X100(나트륨-인산염 0.01몰, 염화나트륨 0.15몰, 0.02% 질산나트륨, PH7.4의 0.1% 트리톤 X-100) 에서 GH 친화성 컬럼 상에서 정화되었다. GHR-GPI의 대략적인 농도는 120 ㎍/㎖ 또는 3μM 이였다. 정제된 GHRGPI의 기능성 활성도(functional activity)는 요오드로 표식된 성장 호르몬(도6)의 결합에 의해 확인된다.

성장 호르몬 생물학적 검정(GH bioassay)

확립된 생물학적 검정은 길항제 활성을 스크린하기 위해 사용되었다(Ross et al.,1997). 전 길이 성장 호르몬 수용체를 발현하는 영구 세포 라인은 일시적으로 활성화된 Stat5에 결합하는 루시페린 정보제공자로 핵산전달감염되었다. 24시간후 세포는 길항제 존재하에 또는 길항제 없이 6시간 동안 성장 호르몬으로 자극되었다. 세포는 용해된 후 루시페린 활성이 측정되었다. 그 생물학적 검정은 대략 10nM(도7) 농도의 GHR-GPI의 존재하에 또는 부존재에서 행하여졌다. GHR-GPI는 낮은 농도에서 완벽하게 성장 호르몬 신호화를 차단했고 높은 농도에서는 신호화가 대략 50% 감소하였는데, 이는 성장 호르몬 신호에 대하여 GHR-GPI이 억제 작용을 하는 것을 확신시켜 준다.

포유류 발현 벡터로의 세포밖 영역 사이토카인 수용체 GPI의 클로닝에 의한 융합 및 사이토카인 반응 세포 라인들에 발현되었을 때 길항제 활성 증명

GHR-GPI는 DNA 삽입 치료요법으로서 작용할 수 있다.

GHR-GPI가 DNA 삽입 치료요법으로 동작하는 것을 증명하기 위하여 우리는 포유류 발현 벡터(도8-9)에서 인간 GPI 신호 시퀀스의 GHR 업스트림의 세포밖 영역을 복제하였다. 이 구성은 CHO 세포에 핵산전달감염되었고 발현은 인간 성장 호르몬 수용체(도10)에 특이한 단세포군 항체를 사용한 팍스(FACS) 분석에의해 증명되었다. CHO 세포에 결합하는 수준은 대단히 높았다. 세포 표면위에 GHR-GPI 발현이 길항제로서 동작하였는지 아닌지를 테스트 하기 위하여 GHR-GPI는 야생-타입 GHR을 발현하는 Hek293 세포로 핵산전달감염되었고 성장 호르몬으로 자극되었다. GHR-GPI의 이 공동 발현은 완전하게 성장 호르몬 신호를 차단했다(도11). 게다가 세포가 GHR-GPI로 감염된 배지는 수용성 수용체(GHBP)를 위해서 측정되었으며, 높은 수준의 수용성 수용체(GHBP)가 측정되었으며 이는 또 다른 메카니즘을 제공한다. 이 메카니즘에 의해 사이토카인 GPI 융합의 DNA 삽입 발현이 길항제조 작용할 수 있다. GPI 융합으로서 발현될수 있는 사이토카인 수용체의 다른 예는 티앤에프와 렙틴 수용체이다(도 13-16)

참조

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본 발명은 사이토카인의 수용체 결합 영역과 글리코실포스파티딜이노시톨 앵커의 부착을 위한 시그널 시퀀스를 포함하는 폴리펩타이드에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법과 상기 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 분자와 그리고 상기 폴리펩타이드를 포함하는 치료 조성들을 제조하는 방법에 관한 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Ross, Richard <120> Glycosylphosphatidylinositol Containing Polypeptides <130> SW/P016107WO <140> PCT/GB2002/004665 <141> 2002-10-11 <150> PCT/GB2002/004665 <151> 2002-10-11 <150> GB 0124620.6 <151> 2001-10-13 <150> GB 0200904.1 <151> 2002-01-16 <150> GB 0218889.4 <151> 2002-08-14 <160> 15 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> signal peptide <223> signal sequence for the attachment of glycophosphatidylinositol <400> 1 Asp Lys Leu Val Lys Cys Gly Gly Ile Ser Leu Leu Val Gln Asn Thr 1 5 10 15 Ser Trp Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Leu 20 25 30 Asp Phe Ile Ser Leu 35 <210> 2 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> signal peptide <223> signal sequence for the attachment of glycophosphatidylinositol <400> 2 Pro Ser Pro Thr Pro Thr Glu Thr Ala Thr Pro Ser Pro Thr Pro Lys 1 5 10 15 Pro Thr Ser Thr Pro Glu Glu Thr Glu Ala Pro Ser Ser Ala Thr Thr 20 25 30 Leu Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Val Ile Phe Ile Ser Phe Val Leu 35 40 45 Leu Ile 50 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> signal peptide <223> signal sequence for the attachment of glycophosphatidylinositol <400> 3 Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Thr Ser Ile Thr Ala 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu Phe Phe Phe Leu Leu Ile Leu 20 25 30 Leu Leu Leu Leu Val Leu Val 35 <210> 4 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> signal peptide <223> signal sequence for the attachment of glycophosphatidylinositol <400> 4 Thr Ser Ile Thr Ala Tyr Lys Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu Phe Phe 1 5 10 15 Phe Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Val 20 25 <210> 5 <211> 6283 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> vector pAc6-LP-MCS-GPI <223> vector used to clone the extracellular domain of GHR for expression in Dictyostelium <221> misc_feature <222> (301)..(306) <223> Unknown nucleotide <400> 5 caactcagtc ccacgtttcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca 60 gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca 120 gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca 180 gattgtactg agagtgcacc ataatccttt tcatggagat tgtattatat gtgagaatcg 240 tttacccata aagggtaaaa ttattaattt tttttttttt tcaaatttta acgttaaagc 300 nnnnnngcaa ataccttaat atctggattt ttaatttttt ttgtaattta aaaaatgata 360 attaaagtaa taataaaaaa taaaaaaaca attaaaaaaa aaaccaatag cctattggtt 420 ttattttttt ttttttaagg tcggataaag atcaacaacc attaaaaaaa aagtaattaa 480 attttattat acatttaaat attattattg ttatattatt attattattt ttatgtgaag 540 cactttcatc atgatttaga aacattttct gtggacaatt gatggaccag attcatcata 600 ttcttctttt gagatccaca tttgttggaa agttgagagt gaagctaaaa tagatccacc 660 aatccagaca gagtatttac gttctggtgg agcaatgatt ttaattttca tggttgatgg 720 tgctaaagca gttaattctt tgttcatacg atcagcaata cctgggaaca tagttgtacc 780 acctgataag acgacattac cgtataaatc tttacggatg atccctgtaa tccgggcagc 840 gcaacggaac attcatcagt gtaaaaatgg aatcaataaa gccctgcgca gcgcgcaggg 900 tcagcctgaa tacgcgttta atgaccagca cagtcgtgat ggcaaggtca gaatagcgct 960 gaggtctgcc tcgtgaagaa ggtgttgctg actcatacca ggcctgaatc gccccatcat 1020 ccagccagaa agtgagggag ccacggttga tgagagcttt gttgtaggtg gaccagttgg 1080 tgattttgaa cttttgcttt gccacggaac ggtctgcgtt gtcgggaaga tgcgtgatct 1140 gatccttcaa ctcagcaaaa gttcgattta ttcaacaaag ccgccgtccc gtcaagtcag 1200 cgtaatgctc tgccagtgtt acaaccaatt aaccaattct gattagaaaa actcatcgag 1260 catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag 1320 ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg 1380 gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc 1440 aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg 1500 caaaagctta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc 1560 aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa 1620 tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa 1680 cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa 1740 tgctgttttc ccggggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa 1800 atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc 1860 tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg 1920 cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt 1980 atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggccttgttt taagaaataa 2040 gaaaaaaaaa aaaaaaaaat ctttttatgc aatctgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aatttttgaa tcccattttt tttttttaat ttgggtttta 2160 aaattttcaa ataataatta accaacccaa gtttttttaa accatttttt tttttaaaga 2220 tttgatggga ttaattaatt tgtaatctat ttaattcaaa ataaataaaa ataaataaaa 2280 atttttttta tcgatctcga gactagagag gtttattttt aaaaattaca aaaactaaaa 2340 agaaaaataa aaaggaaaaa tcttattaat ctgaaaatta cagatttgcc ccaatttaaa 2400 gaaaaattat ccaaaataat caatcaacaa cgatatcttt ttgatagata tttataaaaa 2460 ctttatcttt tttatttttt caagttgcgc aaaataataa aattaaaata aatataaaaa 2520 ctgtaaaaag aaaaaaaaaa gtgtaaaggt ttattaatta tttaattatt attcactttt 2580 tgtaattatt tttttatttt gaagaataat gatggatatt ttatataaaa aaaaaaagag 2640 atactgaaaa aataataatt ataaaaaaaa aaaaaaaaaa tagaatttta aagttttagt 2700 acaaatggat gatttttttt tttttttttt ttttttccca aataattcaa gtaataacaa 2760 caaagaacgg atattctgat gcctaattaa aaaagaaatt tttaaataaa aaatgggttt 2820 tttttaagta aagttatttg aaattgattg aaattttcaa accatgggtg gtttttcgct 2880 ttaaaattgg gattttattt ttattttttt atatttttta ttttttattt tttttttttt 2940 gaggtttctg agattataaa atgaaatttt tttttctgat gcctaattaa aaaagaaatt 3000 tttaaataaa aaatggcttt tttttaagta aagttatttg aaatcgattg aaattttcaa 3060 accatgggtg gtttttcgct ttaaaattgg gattttattt ttattttttt atatttttta 3120 ttttttattt tttttttttt gaggtttctg agattataaa atgaaatttt tttttttttt 3180 ttaattaatt caaaaaaata atcaaataaa taaatataat ataaaatgtc tagattttta 3240 ttagtattga taatattata taatatttta aatagtgcac attcagctcc aacccaggat 3300 ccaggtacca tggttaacgg agctcgaatt ccatctccaa ctccaactga aacagccacc 3360 ccatctccaa ctccaaaacc aaccagcaca ccagaagaaa ctgaagcacc ttcatcagca 3420 acaactctta tttcaccatt atctttaatt gttattttca tttcttttgt tttattaatt 3480 taagagctcg ctagagtcgt ccatcaattg ttcacagaaa atgtttctaa attatttaat 3540 aaataataaa aaaacaaatt gttgtaataa tctaatattt tctttttttt ttaatttttt 3600 ttttttaaat cttaataatt attaagttat tttaattttt tttttttttt tttttttttt 3660 tttttttttt ttctatcaaa aaaatcaaat atatttaaaa aatttattat ttacagtaca 3720 ttttgaatgg tgaagataaa tatatgcatt agatgtaaaa ggcgactggt cgtccatcaa 3780 ttgttcacag aaaatgtttc taaattattt aataaataat aaaaaaacaa attgttgtaa 3840 taatctaata ttttcttttt tttttaattt ttttttttta aatcttaata attattaagt 3900 tattttaatt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttctatc aaaaaaatca 3960 aatatattta aaaaatttat tatttacagt acattttgaa tggtgaagat aaatatatgc 4020 attagatgta aaaggcgact cgaaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 4080 tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 4140 gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 4200 ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 4260 ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 4320 gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 4380 tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 4440 aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 4500 aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 4560 ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 4620 tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc 4680 agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 4740 gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 4800 tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 4860 acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc 4920 tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 4980 caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 5040 aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 5100 aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 5160 ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggcctgac 5220 agttaccaat gcttaatctg tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc 5280 atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc 5340 cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata 5400 aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc 5460 cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc 5520 aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca 5580 ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa 5640 gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca 5700 ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt 5760 tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt 5820 tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg 5880 ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga 5940 tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc 6000 agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg 6060 acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag 6120 ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg 6180 gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg 6240 acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtc 6283 <210> 6 <211> 756 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Vector pAc6GHRGPI <223> new vector showing part of multiple cloning site of pAc6-LP-MCS-GPI with cloned GHR <400> 6 caggatccat tttctggaag tgaggccaca gcagctatcc ttagcagagc accctggagt 60 ctgcaaagtg ttaatccagg cctaaagaca aattcttcta aggagcctaa attcaccaag 120 tgccgttcac ctgagcgaga gactttttca tgccactgga cagatgaggt tcatcatggt 180 acaaagaacc taggacccat acagctgttc tataccagaa ggaacactca agaatggact 240 caagaatgga aagaatgccc tgattatgtt tctgctgggg aaaacagctg ttactttaat 300 tcatcgttta cctccatctg gataccttat tgtatcaagc taactagcaa tggtggtaca 360 gtggatgaaa agtgtttctc tgttgatgaa atagtgcaac cagatccacc cattgccctc 420 aactggactt tactgaacgt cagtttaact gggattcatg cagatatcca agtgagatgg 480 gaagcaccac gcaatgcaga tattcagaaa ggatggatgg ttctggagta tgaacttcaa 540 tacaaagaag taaatgaaac taaatggaaa atgatggacc ctatattgac aacatcagtt 600 ccagtgtact cattgaaagt ggataaggaa tatgaagtac gcgtgagatc caaacaacga 660 aactctggaa attatggcga gttcagtgag gtgctctatg taacacttcc tcagatgagc 720 caatttacat gtgaagaaga tttctaccga attcca 756 <210> 7 <211> 897 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> fusion sequence <223> GHRGPI fusion nucleic acid sequence from pAc6GHRGPI <400> 7 ttttctggaa gtgaggccac agcagctatc cttagcagag caccctggag tctgcaaagt 60 gttaatccag gcctaaagac aaattcttct aaggagccta aattcaccaa gtgccgttca 120 cctgagcgag agactttttc atgccactgg acagatgagg ttcatcatgg tacaaagaac 180 ctaggaccca tacagctgtt ctataccaga aggaacactc aagaatggac tcaagaatgg 240 aaagaatgcc ctgattatgt ttctgctggg gaaaacagct gttactttaa ttcatcgttt 300 acctccatct ggatacctta ttgtatcaag ctaactagca atggtggtac agtggatgaa 360 aagtgtttct ctgttgatga aatagtgcaa ccagatccac ccattgccct caactggact 420 ttactgaacg tcagtttaac tgggattcat gcagatatcc aagtgagatg ggaagcacca 480 cgcaatgcag atattcagaa aggatggatg gttctggagt atgaacttca atacaaagaa 540 gtaaatgaaa ctaaatggaa aatgatggac cctatattga caacatcagt tccagtgtac 600 tcattgaaag tggataagga atatgaagta cgcgtgagat ccaaacaacg aaactctgga 660 aattatggcg agttcagtga ggtgctctat gtaacacttc ctcagatgag ccaatttaca 720 tgtgaagaag atttctaccg aattccatct ccaactccaa ctgaaacagc caccccatct 780 ccaactccaa aaccaaccag cacaccagaa gaaactgaag caccttcatc agcaacaact 840 cttatttcac cattatcttt aattgttatt ttcatttctt ttgttttatt aatttaa 897 <210> 8 <211> 298 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> fusion protein <223> amino acid sequence from vector pAc6GHRGPI <400> 8 Phe Ser Gly Ser Glu Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp 1 5 10 15 Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu 20 25 30 Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys 35 40 45 His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile 50 55 60 Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp 65 70 75 80 Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe 85 90 95 Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr 100 105 110 Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile 115 120 125 Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val 130 135 140 Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro 145 150 155 160 Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu 165 170 175 Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile 180 185 190 Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr 195 200 205 Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu 210 215 220 Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr 225 230 235 240 Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Arg Ile Pro Ser Pro Thr Pro Thr Glu Thr 245 250 255 Ala Thr Pro Ser Pro Thr Pro Lys Pro Thr Ser Thr Pro Glu Glu Thr 260 265 270 Glu Ala Pro Ser Ser Ala Thr Thr Leu Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile 275 280 285 Val Ile Phe Ile Ser Phe Val Leu Leu Ile 290 295 <210> 9 <211> 5155 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> mammalian expression vector <223> Vector pCR-3GPI_Thy-1 <400> 9 gcgcgcgttg acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 60 ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 120 gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc 180 caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg 240 cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 300 ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 360 tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 420 gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 480 gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat 540 tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagcaga gctctctggc 600 taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 660 cccaagcttg gtaccgagct cggatccact agtaacggcc gccagtgtgc tggaattctg 720 cagatatcga caagctggtc aagtgtggcg gcataagcct gctggttcag aacacatcct 780 ggatgctgct gctgctgctt tccctctccc tcctccaagc cctagacttc atttctctgt 840 gactcgagca tgcatctaga gggccctatt ctatagtgtc acctaaatgc tagagctcgc 900 tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg 960 ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt 1020 gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc 1080 aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg ctctatggct 1140 tctgaggcgg aaagaaccag tggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 1200 aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 1260 gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 1320 tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1380 cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1440 ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1500 cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 1560 atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 1620 agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 1680 gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 1740 gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 1800 tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1860 agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1920 gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 1980 aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaacctgag gctatggcag ggcctgccgc 2040 cccgacgttg gctgcgagcc ctgggccttc acccgaactt ggggggtggg gtggggaaaa 2100 ggaagaaacg cgggcgtatt ggccccaatg gggtctcggt ggggtatcga cagagtgcca 2160 gccctgggac cgaaccccgc gtttatgaac aaacgaccca acaccgtgcg ttttattctg 2220 tctttttatt gccgtcatag cgcgggttcc ttccggtatt gtctccttcc gtgtttcagt 2280 tagcctcccc ctagggtggg cgaagaactc cagcatgaga tccccgcgct ggaggatcat 2340 ccagccggcg tcccggaaaa cgattccgaa gcccaacctt tcatagaagg cggcggtgga 2400 atcgaaatct cgtgatggca ggttgggcgt cgcttggtcg gtcatttcga accccagagt 2460 cccgctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg 2520 gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata 2580 tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg 2640 atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg 2700 gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg ctcgccttga gcctggcgaa cagttcggct 2760 ggcgcgagcc cctgatgctc ttgatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 2820 cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 2880 gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 2940 gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 3000 gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 3060 gctgcctcgt cttgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 3120 gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 3180 gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 3240 tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat cctgtctctt gatcgatctt tgcaaaagcc 3300 taggcctcca aaaaagcctc ctcactactt ctggaatagc tcagaggccg aggcggcctc 3360 ggcctctgca taaataaaaa aaattagtca gccatggggc ggagaatggg cggaactggg 3420 cggagttagg ggcgggatgg gcggagttag gggcgggact atggttgctg actaattgag 3480 atgcatgctt tgcatacttc tgcctgctgg ggagcctggg gactttccac acctggttgc 3540 tgactaattg agatgcatgc tttgcatact tctgcctgct ggggagcctg gggactttcc 3600 acaccctaac tgacacacat tccacagctg gttctttccg cctcaggact cttccttttt 3660 caataaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat 3720 cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc 3780 cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat 3840 accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag 3900 ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg 3960 ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc 4020 tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca 4080 acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg 4140 tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc 4200 actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta 4260 ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc 4320 aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg 4380 ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc 4440 cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc 4500 aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat 4560 actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag 4620 cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc 4680 ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 4740 tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 4800 cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 4860 tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 4920 tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 4980 cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 5040 ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 5100 gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttac 5155 <210> 10 <211> 962 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> anchor sequence <223> sequence codes for mammalian GHRGPI anchor polypeptide in pCR-3GPI_Thy-1 called pCR3GHRGPI <400> 10 taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac tatagggaga 60 cccaagcttg gtaccgagct cggatcctct agactcgagg tcctacaggt atggatctct 120 ggcagctgct gttgaccttg gcactggcag gatcaagtga tgctttttct ggaagtgagg 180 ccacagcagc tatccttagc agagcaccct ggagtctgca aagtgttaat ccaggcctaa 240 agacaaattc ttctaaggag cctaaattca ccaagtgccg ttcacctgag cgagagactt 300 tttcatgcca ctggacagat gaggttcatc atggtacaaa gaacctagga cccatacagc 360 tgttctatac cagaaggaac actcaagaat ggactcaaga atggaaagaa tgccctgatt 420 atgtttctgc tggggaaaac agctgttact ttaattcatc gtttacctcc atctggatac 480 cttattgtat caagctaact agcaatggtg gtacagtgga tgaaaagtgt ttctctgttg 540 atgaaatagt gcaaccagat ccacccattg ccctcaactg gactttactg aacgtcagtt 600 taactgggat tcatgcagat atccaagtga gatgggaagc accacgcaat gcagatattc 660 agaaaggatg gatggttctg gagtatgaac ttcaatacaa agaagtaaat gaaactaaat 720 ggaaaatgat ggaccctata ttgacaacat cagttccagt gtactcattg aaagtggata 780 aggaatatga agtgcgtgtg agatccaaac aacgaaactc tggaaattat ggcgagttca 840 gtgaggtgct ctatgtaaca cttcctcaga tgagccaatt tacatgtgaa gaagatttct 900 acgggaattc tgcagatatc gacaagctgg tcaagtgtgg cggcataagc ctgctggttc 960 ag 962 <210> 11 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> anchor polypeptide <223> mammalian GHRGPI anchor polypeptide in pCR-3GPI_Thy-1 called pCR3GHRGPI <400> 11 Arg Ile Leu Thr Arg Gly Pro Thr Gly Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Leu Ala Leu Ala Gly Ser Ser Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu 20 25 30 Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val 35 40 45 Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys 50 55 60 Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser Cys His Trp Thr Asp Glu 65 70 75 80 Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr 85 90 95 Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp 100 105 110 Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr 115 120 125 Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr 130 135 140 Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro 145 150 155 160 Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile 165 170 175 His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile 180 185 190 Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val 195 200 205 Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val 210 215 220 Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg 225 230 235 240 Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu 245 250 255 Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe 260 265 270 Tyr Gly Asn Ser Ala Asp Ile Asp Lys Leu Val Lys Cys Gly Gly Ile 275 280 285 Ser Leu Leu Val Gln Asn Thr Ser Trp Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser 290 295 300 Leu Ser Leu Leu Gln Ala Leu Asp Phe Ile Ser Leu Leu Glu His Ala 305 310 315 320 Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys Ser Ser Leu Ile 325 330 335 Ser Leu Asp Cys Ala Phe Leu Pro Ala Ile Cys Cys Leu Pro Leu Pro 340 345 350 Arg Ala Phe Leu Asp Pro Gly Arg Cys His Ser His Cys Pro Phe Leu 355 360 365 Ile Lys Gly Asn Cys Ile Ala Leu Ser Glu Val Ser Phe Tyr Ser Gly 370 375 380 Gly Trp Gly Gly Ala Gly Gln 385 390 <210> 12 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro 20 25 30 His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys 35 40 45 Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 55 60 Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp 65 70 75 80 Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu 85 90 95 Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val 100 105 110 Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125 Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe 130 135 140 Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu 145 150 155 160 Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175 Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190 Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser 195 200 205 Gly Thr Thr Val Leu Leu Pro Leu Val Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Ser Leu Leu Phe Ile Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gln Arg Trp Lys 225 230 235 240 Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Val Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255 Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro Ser 260 265 270 Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Val 275 280 285 Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300 Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Val Ala Pro Pro Tyr Gln Gly 305 310 315 320 Ala Asp Pro Ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ser Asp Pro Ile Pro Asn 325 330 335 Pro Leu Gln Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gln Ser Leu Asp 340 345 350 Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala Val Val Glu Asn Val Pro Pro 355 360 365 Leu Arg Trp Lys Glu Phe Val Arg Arg Leu Gly Leu Ser Asp His Glu 370 375 380 Ile Asp Arg Leu Glu Leu Gln Asn Gly Arg Cys Leu Arg Glu Ala Gln 385 390 395 400 Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415 Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg Val Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430 Cys Leu Glu Asp Ile Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445 Pro Ala Pro Ser Leu Leu Arg 450 455 <210> 13 <211> 2161 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 cggcccagtg atcttgaacc ccaaaggcca gaactggagc ctcagtccag agaattctga 60 gaaaattaaa gcagagagga ggggagagat cactgggacc aggccgtgat ctctatgccc 120 gagtctcaac cctcaactgt caccccaagg cacttgggac gtcctggaca gaccgagtcc 180 cgggaagccc cagcactgcc gctgccacac tgccctgagc ccaaatgggg gagtgagagg 240 ccatagctgt ctggcatggg cctctccacc gtgcctgacc tgctgctgcc gctggtgctc 300 ctggagctgt tggtgggaat atacccctca ggggttattg gactggtccc tcacctaggg 360 gacagggaga agagagatag tgtgtgtccc caaggaaaat atatccaccc tcaaaataat 420 tcgatttgct gtaccaagtg ccacaaagga acctacttgt acaatgactg tccaggcccg 480 gggcaggata cggactgcag ggagtgtgag agcggctcct tcaccgcttc agaaaaccac 540 ctcagacact gcctcagctg ctccaaatgc cgaaaggaaa tgggtcaggt ggagatctct 600 tcttgcacag tggaccggga caccgtgtgt ggctgcagga agaaccagta ccggcattat 660 tggagtgaaa accttttcca gtgcttcaat tgcagcctct gcctcaatgg gaccgtgcac 720 ctctcctgcc aggagaaaca gaacaccgtg tgcacctgcc atgcaggttt ctttctaaga 780 gaaaacgagt gtgtctcctg tagtaactgt aagaaaagcc tggagtgcac gaagttgtgc 840 ctaccccaga ttgagaatgt taagggcact gaggactcag gcaccacagt gctgttgccc 900 ctggtcattt tctttggtct ttgcctttta tccctcctct tcattggttt aatgtatcgc 960 taccaacggt ggaagtccaa gctctactcc attgtttgtg ggaaatcgac acctgaaaaa 1020 gagggggagc ttgaaggaac tactactaag cccctggccc caaacccaag cttcagtccc 1080 actccaggct tcacccccac cctgggcttc agtcccgtgc ccagttccac cttcacctcc 1140 agctccacct atacccccgg tgactgtccc aactttgcgg ctccccgcag agaggtggca 1200 ccaccctatc agggggctga ccccatcctt gcgacagccc tcgcctccga ccccatcccc 1260 aacccccttc agaagtggga ggacagcgcc cacaagccac agagcctaga cactgatgac 1320 cccgcgacgc tgtacgccgt ggtggagaac gtgcccccgt tgcgctggaa ggaattcgtg 1380 cggcgcctag ggctgagcga ccacgagatc gatcggctgg agctgcagaa cgggcgctgc 1440 ctgcgcgagg cgcaatacag catgctggcg acctggaggc ggcgcacgcc gcggcgcgag 1500 gccacgctgg agctgctggg acgcgtgctc cgcgacatgg acctgctggg ctgcctggag 1560 gacatcgagg aggcgctttg cggccccgcc gccctcccgc ccgcgcccag tcttctcaga 1620 tgaggctgcg cccctgcggg cagctctaag gaccgtcctg cgagatcgcc ttccaacccc 1680 acttttttct ggaaaggagg ggtcctgcag gggcaagcag gagctagcag ccgcctactt 1740 ggtgctaacc cctcgatgta catagctttt ctcagctgcc tgcgcgccgc cgacagtcag 1800 cgctgtgcgc gcggagagag gtgcgccgtg ggctcaagag cctgagtggg tggtttgcga 1860 ggatgaggga cgctatgcct catgcccgtt ttgggtgtcc tcaccagcaa ggctgctcgg 1920 gggcccctgg ttcgtccctg agcctttttc acagtgcata agcagttttt tttgtttttg 1980 ttttgttttg ttttgttttt aaatcaatca tgttacacta atagaaactt ggcactcctg 2040 tgccctctgc ctggacaagc acatagcaag ctgaactgtc ctaaggcagg ggcgagcacg 2100 gaacaatggg gccttcagct ggagctgtgg acttttgtac atacactaaa attctgaagt 2160 t 2161 <210> 14 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> fusion polypeptide <223> TNF receptor type 1-GPI fusion polypeptide from vector pCR3TNFGPI <400> 14 Arg Ile Leu Thr Arg Gly Pro Thr Gly Met Gly Leu Ser Thr Val Pro 1 5 10 15 Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr 20 25 30 Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg Glu Lys 35 40 45 Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn 50 55 60 Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp 65 70 75 80 Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly 85 90 95 Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser 100 105 110 Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val 115 120 125 Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr 130 135 140 Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn 145 150 155 160 Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr 165 170 175 Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser 180 185 190 Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile 195 200 205 Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Thr Thr Gly Asn Ser Ala 210 215 220 Asp Ile Asp Lys Leu Val Lys Cys Gly Gly Ile Ser Leu Leu Val Gln 225 230 235 240 Asn Thr Ser Trp Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln 245 250 255 Ala Leu Asp Phe Ile Ser Leu Leu Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr 260 265 270 Ser Ile Val Ser Pro Lys Cys Ser Ser Leu Ile Ser Leu Asp Cys Ala 275 280 285 Phe Leu Pro Ala Ile Cys Cys Leu Pro Leu Pro Arg Ala Phe Leu Asp 290 295 300 Pro Gly Arg Cys His Ser His Cys Pro Phe Leu Ile Lys Gly Asn Cys 305 310 315 320 Ile Ala Leu Ser Glu Val Ser Phe Tyr Ser Gly Gly Trp Gly Gly Ala 325 330 335 Gly Gln <210> 15 <211> 925 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> fusion protein <223> leptin receptor-GPI fusion from Vector pCR3ObRGPI <400> 15 Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile 1 5 10 15 Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg 20 25 30 Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu 35 40 45 Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr 50 55 60 Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser 65 70 75 80 Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp 85 90 95 Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val 100 105 110 Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn 115 120 125 Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val 130 135 140 Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His 145 150 155 160 Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro 165 170 175 Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu 180 185 190 Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr 195 200 205 Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser 210 215 220 Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro 225 230 235 240 Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser 245 250 255 Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys 260 265 270 Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val 275 280 285 Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr 290 295 300 Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser 305 310 315 320 Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe 325 330 335 Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys 340 345 350 Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp 355 360 365 Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val 370 375 380 Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys 385 390 395 400 Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His 405 410 415 Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile 420 425 430 Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg 435 440 445 Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu 450 455 460 Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His 465 470 475 480 Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr 485 490 495 Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp 500 505 510 Ile Arg Ile Asn His Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys 515 520 525 Val Leu Pro Asp Ser Val Val Lys Pro Leu Pro Pro Ser Ser Val Lys 530 535 540 Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys 545 550 555 560 Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu 565 570 575 Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys 580 585 590 Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala 595 600 605 Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn 610 615 620 Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met 625 630 635 640 Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys 645 650 655 Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser 660 665 670 Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn 675 680 685 Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu 690 695 700 Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile 705 710 715 720 Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser 725 730 735 Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser 740 745 750 Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met 755 760 765 Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys 770 775 780 Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His 785 790 795 800 Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met 805 810 815 Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp 820 825 830 Ile Glu Lys His Gln Ser Gly Asn Ser Ala Asp Ile Asp Lys Leu Val 835 840 845 Lys Cys Gly Gly Ile Ser Leu Leu Val Gln Asn Thr Ser Trp Met Leu 850 855 860 Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Leu Asp Phe Ile Ser 865 870 875 880 Leu Leu Glu His Ala Ser Arg Gly Pro Tyr Ser Ile Val Ser Pro Lys 885 890 895 Cys Ser Ser Leu Ile Ser Leu Asp Cys Ala Phe Leu Pro Ala Ile Cys 900 905 910 Cys Leu Pro Leu Pro Arg Ala Phe Leu Asp Pro Gly Arg 915 920 925

Claims (16)

1. (ⅰ) 인간 성장 호르몬 수용체의 세포외 영역; 및
   (ⅱ) 글리코실포스파티딜이노시톨의 부착을 위한 시그널 시퀀스 영역
   을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리펩타이드는 글리코실포스파티딜이노시톨의 첨가에 의해 변형되는 폴라타이드.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
   상기 글리코실포스파티딜이노시톨의 부착을 위한 시그널 시퀀스는 PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI; DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL; LVPRGSIEGR GTSITAYNSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV; 또는 TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV로 이루어진 그룹으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드.
4. 제 1 항의 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산.
5. 제 4 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
6. 제 5 항에 있어서,
   상기 벡터는 진핵 유전자 발현을 위해 적용된 발현 벡터인 벡터.
7. 상기 재조합 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키기 위한 분비 시그널과 함께 제공되는 제 5항 또는 제 6항의 벡터.
8. (ⅰ) 제 6항의 벡터로 핵산감염된(transfected) 세포를 성장시키는 단계, 및
   (ⅱ) 상기 세포 또는 이것의 성장환경으로부터 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 준비방법.
9. 폴리펩타이드를 준비하고 정제하되, 폴리펩타이드를 GPI 앵커를 포함하지 않도록 정제하는 방법으로서,
   (ⅰ) 제 6항의 벡터로 핵산감염된(transfected) 셀을 성장시키는 단계; 및
   (ⅱ) 성장 환경으로부터 상기 폴리펩타이드를 정제하는 단계를 포함하는 폴리펩타이드를 준비하고 정제하는 방법.
10. 제 5 항의 벡터로 핵산감염된(transfected) 진핵 세포.
11. 제 10 항의 진핵 세포는, 곰팡이, 점균류, 곤충, 식물 또는 포유류 세포로 구성된 그룹으로부터 선택되는 진핵 세포.
12. 제 11 항의 세포는 점균류 세포 및 Dictyostelium spp인 세포.
13. 말단 비대증(acromegaly) 또는 거인증(gigantism)의 치료를 위한 약학적 용도로 사용되는 제 1 항의 폴리펩타이드.
14. 제 1 항의 폴리펩타이드와, 제약적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 말단 비대증(acromegaly) 또는 거인증(gigantism)의 치료를 위한 약학적 조성물 또는 약물.
15. 말단 비대증(acromegaly) 또는 거인증(gigantism)의 치료에 사용되기 위한 약물을 제조하기 위한 제 1 항의 폴리펩타이드.
16. (ⅰ) 인간 성장 호르몬 수용체의 세포외 영역; 및
    (ⅱ) PSPTPTETAT PSPTPKPTST PEETEAPSSA TTLISPLSLI VIFISFVLLI; DKLVKCGGIS LLVQNTSWML LLLLSLSLLQ ALDFISL; LVPRGSIEGR GTSITAYNSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV; 또는 TSITAYKSE GESAEFFFLL ILLLLLVLV로 이루어진 그룹으로부터 선택된 시그널 시퀀스를 포함하는 도메인을 포함하는 키메라 폴리펩타이드.

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