CN107708679A - 用于制备位点特异性蛋白质偶联物的胺聚乙二醇化方法 - Google Patents

用于制备位点特异性蛋白质偶联物的胺聚乙二醇化方法 Download PDF

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Abstract

各实施例包括一种制作蛋白质‑PEG偶联物的方法。该方法可包括提供蛋白质水溶液。该水蛋白质水溶液可包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂。螯合剂可以是选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N‑取代甘氨酸、2‑(2‑氨基‑2‑氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群。该方法也可包括将氰基硼氢化钠和甲氧基聚乙二醇醛导入蛋白质水溶液中。在甲氧基聚乙二醇醛中的氰基硼氢化钠可具有在约5:1至约1.5:1范围内的摩尔比。该方法还可包括使甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质反应而形成蛋白质‑PEG偶联物。在反应期间，pH缓冲剂可将蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至4.4的范围内。

Description

用于制备位点特异性蛋白质偶联物的胺聚乙二醇化方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2015年6月4日提交的MaryS.Rosendahl等人的名称为“用于制备位点特异性蛋白质偶联物的胺聚乙二醇化方法”的美国临时专利申请序列号62/170,933的优先权，该专利申请与于2014年12月2日提交的Mary S.Rosendahl等人的名称为“具有增加的疏水性的蛋白质和蛋白质偶联物”美国临时专利申请序列号62/086,294有关，该专利申请的全部公开内容以参考的方式并入本文中用于所有目的，如同在本文中所陈述。
背景技术
将药物、激素、蛋白质、或其它医药活性剂输送进入患者面临一些挑战。医药活性剂已被输送进入患者。两个这种方法是摄入和注射。随着摄入，在到达血流或靶向区域进行治疗之前，药物会已通过患者的消化系统。注射可允许医药活性剂快速地或直接地到达血流或靶向区域进行治疗，但注射对于患者而言会是不方便或疼痛的。一旦在身体内，作为时间的函数的医药活性剂的浓度可基于医药活性剂的类型、不同的官能团或分子在医药活性剂上的结合、医药活性剂的包封、或其它因素而变化。如果医药活性剂的浓度降低至低于阈值，那么医药活性剂会需要再次给药。许多医药活性剂必须频繁地给药，包括1天数次。一个更频繁采用的给药方案会增加对患者的不方便性，可降低患者的依从率，并且可导致不太理想的患者的治疗结果。如果医药活性剂是通过注射而给药，那么多一次注射增加患者中的疼痛的频率、感染的危险性、和免疫应答的概率。因此，对于具有在患者中的优越浓度分布的医药活性剂存在着需求。本文中所描述的方法和组合物提供对这些和其它需求的解决方案。
发明内容
医药活性剂可结合到聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇的结合可增加医药活性剂的分子量并且可导致医药活性剂的半衰期的延长。此外，聚乙二醇(包括较小的PEG分子)与医药活性剂的结合可增大医药活性剂的疏水性并且可使医药活性剂具有两亲性。医药活性剂可以更容易地与可生物降解聚合物一起溶解于有机溶剂。可生物降解聚合物可将医药活性剂包封于微球中。医药活性剂的包封可延长医药活性剂的半衰期。本文中所描述的制剂可在一个时间段中缓慢地且均匀地释放医药活性剂。该释放特性可在无需赋形剂的情况下导致在预定的治疗期中持续且接近峰值的蛋白质水平。所形成的医药活性剂在患者中的浓度分布可导致在患者中的更优的临床效果。本文中所描述的制剂可以是以1个月1次的频率向患者给药。
具体地，通过亲水性蛋白质类的位点特异性修饰可有助于将医药活性剂向患者给药。在一个实施例中，可使用聚乙二醇化胰岛素衍生物，其中取代的位点主要是残基PheB1(B-链的N-末端)。这些衍生物与原生胰岛素相比在物理和酶学上更加稳定。另外，该衍生物与原生胰岛素相比可以更加可溶于水/有机系统。此外，这些衍生物可具有较小的免疫原性并且可具有延长的循环半衰期。利用本文中所描述的方法可实现这些位点特异性聚乙二醇化蛋白质类的高产率。这些和其它优点可提供治疗糖尿病或其它疾病的更有效方法。该高产率可导致更高效的、具有成本效益、且可扩展的制造工艺。
各实施例包括一种制作蛋白质-PEG偶联物的方法。该方法可包括提供蛋白质水溶液。该蛋白质水溶液可包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂。螯合剂可以是选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群。该方法也可包括将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入蛋白质水溶液中。该方法还可包括使甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质反应而形成蛋白质-PEG偶联物。
在一些实施例中，含硼还原剂可以是氰基硼氢化钠。氰基硼氢化钠与甲氧基聚乙二醇醛可具在约5:1至约1.5:1范围内的摩尔比。在反应期间，pH缓冲剂可将蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至4.4的范围内。在各实施例中，pH值可在3.8至4.0、4.0至4.2、或者4.2至4.4的范围内。
在一些实施例中，含硼还原剂可包括：二甲基胺硼烷(Met2NHBH3)、三甲基胺硼烷(Met3NBH3)、2-皮考啉硼烷(2-甲基吡啶硼烷C6H7NBH3)、三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)、三乙基胺硼烷(Et3NBH3)、吗啉硼烷(C4H9ONBH)、叔丁基胺硼烷(C4H11NBH3)、或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(C8H11NBH3)。在反应期间这些含硼还原剂可以不释放氰化物气体，这可以是制造中的一个优点。含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛可具有在约25:1至约1.5:1范围内的摩尔比。在反应期间pH缓冲剂可将蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至6.0的范围内。在一些实施例中，pH值可在4.0至4.4、4.4至4.8、4.8至5.2、5.2至5.6、或者5.6至6.0的范围内。
各实施例可包括一种制作胰岛素-PEG偶联物的方法。该方法可包括提供胰岛素水溶液。该胰岛素水溶液可包含胰岛素、pH缓冲剂、有机溶剂、和螯合剂。螯合剂可包括乙二胺四乙酸(EDTA)。该方法也可包括将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入胰岛素水溶液中。含硼还原剂可以是本文中所描述的任何硼还原剂。含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛可具有在约5:1至约1:1范围内的摩尔比或者本文中所描述的任意摩尔比。此外，该方法可包括使甲氧基聚乙二醇醛与胰岛素发生反应而形成胰岛素-PEG偶联物。在反应期间，pH缓冲剂可将胰岛素水溶液的pH值维持在本文中所描述的任意范围内。甲氧基聚乙二醇醛与胰岛素的反应可以大于所有所产生胰岛素-PEG偶联物的75％的量而产生PEG-PheB1-胰岛素偶联物。
各实施例可包括一种制作含有蛋白质-PEG偶联物的控释微球的方法。该方法可包括提供蛋白质水溶液，该水溶液可包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂。螯合剂可以是选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群。该方法也可包括将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入蛋白质水溶液中。含硼还原剂可以是本文中所描述的任何含硼还原剂。含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛可具有本文中所描述的任意摩尔比。该方法还可包括使甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质发生反应而形成蛋白质-PEG偶联物，其中在反应期间pH缓冲剂将蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至6.0的范围内。此外，该方法可包括将在有机溶剂中的蛋白质-PEG偶联物与可生物降解聚合物加以混合。此外，该方法可包括使在水溶液中的蛋白质-PEG偶联物与可生物降解的聚合物的混合物乳化。该方法可包括使在可生物降解聚合物中的蛋白质-PEG偶联物的乳化混合物硬化进入控释微球中。
附图说明
下面结合附图对本发明加以说明：
图1示出了根据各实施例的制作蛋白质-PEG偶联物的方法的方框图；
图2示出了根据各实施例的制作胰岛素-PEG偶联物的方法的方框图；
图3示出了根据各实施例的制作含有蛋白质-PEG偶联物的控释微球的方法的方框图；
图4示出了根据各实施例的、作为氰基硼氢化钠的浓度的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图5A和图5B示出了根据各实施例的、作为螯合剂浓度与胰岛素初始浓度的比率的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图6示出了根据各实施例的、作为锌离子百分率的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图7示出了根据各实施例的、作为胰岛素的初始浓度的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图8示出了根据各实施例的、作为pH的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图9A和图9B示出了根据各实施例的、作为缓冲强度的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图10示出了根据各实施例的、作为用于螯合剂浓度与胰岛素初始浓度的各种比率的反应时间的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图11示出了根据各实施例的、作为氯化钠浓度的函数的单聚乙二醇化胰岛素的产率的图；
图12示出了根据各实施例的、聚乙二醇化效率与溶剂的关系的图；
图13示出了根据各实施例的、不同pH值和还原剂浓度的聚乙二醇化效率的图；
图14示出了根据各实施例的、单聚乙二醇化胰岛素的百分率与时间的关系的图；
图15示出了根据各实施例的、乙酸盐与柠檬酸盐缓冲剂对单聚乙二醇化胰岛素产率的影响的比较；
图16示出了根据各实施例的、柠檬酸盐缓冲剂的pH值对聚乙二醇化效率的影响的图。
具体实施方式
当被用作医药活性剂时，未改变的蛋白质可以不具有期望浓度分布和其它有利的特征。聚乙二醇化，使聚乙二醇(PEG)结合到分子的过程，可以有助于肽类和蛋白质类的给药，这可导致药理特性改善和疗效提高。PEG是由乙二醇的亚单位构成的线性聚合物并且可溶于水和许多有机溶剂。PEG是柔性的、生物相溶性、且无毒的。作为PEG性能的结果，聚乙二醇化增加蛋白质或肽的半衰期和/或溶解度。
生产位点特异性蛋白质-PEG偶联物的常规方法可导致较低的产率，可能仅为大约50％。此外，常规方法会需要更多的步骤来在不太有利的位点或残基位置保护蛋白质。常规方法会要求蛋白质在不利于蛋白质环境中(高和低pH值)较长时间地经历反应步骤。这些较低的产率和更不利的环境可增加成本并且降低治疗的临床疗效。
可实现比位点特异性蛋白质-PEG偶联物的常规方法的产率更高的产率。聚乙二醇醛类(polyethylene glycol aldehydes)可提供比聚乙二醇酯类(polyethyleneglycolesters)更有利的产率。较低的pH值可促进对pheB1链的N-末端的特异性。较低浓度的氰基硼氢化钠可以是优选的，因为较高浓度的还原剂会减少在PEG反应剂上的醛。可以对各种组分的浓度或比率进行选择以使位点特异性蛋白质-PEG偶联物的产率最大化。这些浓度或比率可以在一定范围内，这样的范围不能基于来自该范围的外部的产率数据预测到。
各实施例包括一种制作蛋白质-PEG偶联物的方法，如图1中所示。方法100可包括提供蛋白质水溶液102。该蛋白质水溶液可包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂。此外，蛋白质可以是选自胰岛素、甲状旁腺激素(PTH)、甲状旁腺激素的片段、生长激素(例如，人生长激素(hGH))、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、恩夫韦肽和奥曲肽由所组成的组群。该胰岛素可包括人胰岛素。pH缓冲剂可包括磷酸的有机盐。
螯合剂可以是选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群。氨基多羧酸可以是选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸(ADA)、双(氨基乙基)乙二醇醚、N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸、和天冬氨酸所组成的组群。氨基多羧酸可排除这些化合物中的任一个或者这些化合物中的任意组。羟基氨基羧酸可以是选自由N-羟乙基亚氨基二乙酸(HIMDA)、N,N-二羟乙基甘氨酸、和N-(三羟甲基甲基)甘氨酸所组成的组群。N-取代甘氨酸可包括甘氨酰甘氨酸。
方法100也可包括导入含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛104至蛋白质水溶液中。还原剂可包括氰基硼氢化钠(NaCNBH3)、二甲基胺硼烷(Met2NHBH3)、三甲基胺硼烷(Met3NBH3)、2-皮考啉硼烷(即，2-甲基吡啶硼烷(C6H7NBH3))、三乙酰氧基硼氢化钠(NaBH(OAc)3)、三乙基胺硼烷(Et3NBH3)、吗啉硼烷(C4H9ONBH)、叔丁基胺硼烷(C4H11NBH3)、或5-乙基-2-甲基吡啶硼烷(C8H11NBH3)。在各实施例中，含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇可具有在约25:1至约1.5:1、约22:1至约5.5:1、约22:1至约1.6:1、或者约10:1至约5.5:1范围内的摩尔比。
还原剂可以是氰基硼氢化钠。在一些实施例中，方法100也可包括将氰基硼氢化钠和甲氧基聚乙二醇醛导入蛋白质水溶液中。在各实施例中，氰基硼氢化钠与甲氧基聚乙二醇醛可具有在约5:1至约1.5:1、约4:1至约1.5:1、约5:1至约2:1、或者约5:1至约3:1范围内的摩尔比。
此外，方法100可以不包括使聚乙二醇酯与蛋白质发生反应。对于伯胺类，聚乙二醇醛是可以选用的，同时聚乙二醇酯可与其它官能团和氨基酸反应。聚乙二醇酯类会要求比用于聚乙二醇醛类的pH值更高的用于反应的pH值。
方法100还可包括使甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质反应而形成蛋白质-PEG偶联物106。醛与氨基之间的反应可形成亚胺中间体。这些反应可以是酸催化的和pH依赖性的。胰岛素可具有可用于聚乙二醇化的三个氨基。各氨基可具有不同的pKa值。赖氨酸侧链可具有10.5的pKa，甘氨酸N-末端可具有9.78的pKa，苯丙氨酸N-末端可具有9.31的pKa。pH值可影响用于与醛反应的氨基选择性。在反应期间，pH缓冲剂可将蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至6.0范围内。由于将氰基硼氢化物用作还原剂，因而在反应期间pH值可在4.0至4.4的范围内。
甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质的反应可获得占根据各实施例所产生所有蛋白质-PEG偶联物的大于75％、大于85％、或大于90％的位点特异性的单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物。例如，蛋白质可包括胰岛素并且位点特异性单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物可包括PEG-PheB1-胰岛素偶联物。甲氧基聚乙二醇的反应可在没有搅拌的情况下发生。甲氧基聚乙二醇的反应可排除保护残基GlyA1和LysB29中的一个或两者的步骤。可以直到反应结束或者大体上完成之后才添加可增加混合物的电导率的氯化钠或其它盐。
如图2中所示，各实施例可包括制作胰岛素-PEG偶联物的方法200。方法200可包括提供胰岛素水溶液202。该胰岛素水溶液可包含胰岛素、pH缓冲剂、有机溶剂、和螯合剂。螯合剂可包括乙二胺四乙酸(EDTA)或者本文中所描述的任何螯合剂。有机溶剂可以是选自由乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、二氧六环、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、和N-甲基吡咯烷酮(NMP)所组成的组群。
方法200也可包括导入含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛204至胰岛素水溶液中。含硼还原剂可包括本文中所描述的任何还原剂。含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛可具有本文中所描述的任意摩尔比。
此外，方法200可包括使甲氧基聚乙二醇醛与胰岛素反应而形成胰岛素-PEG偶联物206。在反应期间，pH缓冲剂可将胰岛素水溶液的pH值维持在本文中所描述的任意范围内。在这些或其它实施例中，在反应中胰岛素水溶液的pH值可为约4.0或者本文中所描述的任意pH范围。根据各实施例，当反应开始时，甲氧基聚乙二醇醛与胰岛素可具有约10:1至约1:1、或者约8:1至约3:1、或者约6:1至约4:1、或者约5:1至约1:1的摩尔比。
甲氧基聚乙二醇醛与胰岛素的反应获的PEG-PheB1-胰岛素偶联物占根据各实施例所产生的所有胰岛素-PEG偶联物的量可以大于75％或者在75％和85％之间。
如图3中所示，各实施例可包括制作含有蛋白质-PEG偶联物的控释微球的方法300。方法300可包括提供蛋白质水溶液302，该水溶液可包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂。蛋白质可以是任何的前述蛋白质。pH缓冲剂可以是本文中所描述的任何pH缓冲剂。螯合剂可以是本文中所描述的任何螯合剂。
方法300也可包括导入含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛304至蛋白质水溶液。含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛可具有本文中所描述的任意摩尔比。
方法300还可包括使甲氧基聚乙二醇醛与蛋白质发生反应而形成蛋白质-PEG偶联物306，其中在反应期间pH缓冲剂维持本文中所描述的任意pH范围。蛋白质水溶液的pH值可以是本文中所描述的任意pH值。此外，蛋白质-PEG偶联物可以是位点特异性单-聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物。该位点特异性单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物可包括PEG-PheB1-胰岛素偶联物。该PEG-PheB1-胰岛素偶联物可具有占根据各实施例所产生的所有胰岛素-PEG偶联物的75％至85％或大于75％的产率。
此外，方法300可包括将蛋白质-PEG偶联物与可生物降解的聚合物在有机溶剂中加以混合308。有机溶剂可包括二氯甲烷。可生物降解聚合物可以选自由聚乳酸、聚乙交酯；聚(d,l-乙交酯/丙交酯)共聚物、聚己内酯；聚原酸酯；聚酯与聚醚的共聚物；和聚乳酸与聚乙二醇的共聚物所组成的组群。该可生物降解聚合物可包括上述聚合物的任何聚合物或者任意组。
此外，方法300可包括使在水溶液中的蛋白质-PEG偶联物与可生物降解聚合物的混合物乳化310。方法300可包括使蛋白质-PEG偶联物与可生物降解聚合物乳化的混合物硬化312成为控释微球。
实施例1
以一系列的氰基硼氢化钠浓度([NaBH3CN])进行实验，从而确定用于实现一致的单聚乙二醇化胰岛素-PEG偶联物(“mPEGIns”)产率的操作条件和氰基硼氢化钠的限值。一系列的实验中以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.04)、[EDTA]/[rhI]0(0.17-0.18)、温度(28℃)、缓冲强度(30mM)、和pH(4.0)。[rhI]0是重组人胰岛素的初始浓度；[mPEGpropald]0是甲氧基丙二醇醛的初始浓度；[EDTA]是乙二胺四乙酸的浓度。对于每个反应而言原料也是相同的。在图4中单聚乙二醇化胰岛素-PEG偶联物产率被图示为氰基硼氢化钠的函数。在[rhI]0的该值下，mPEGIns产率显示在[NaBH3CN]＝1.0mM和[NaBH3CN]＝1.5mM之间的最优浓度。然而，在高于2mM[NaBH3CN]的浓度下，mPEGIns产率下降。在[NaBH3CN]＝1.0mM和[NaBH3CN]＝1.5mM的mPEGIns产率之间的变动为大约2mol％。如果将[NaBH3CN]的上限设定为允许mPEGIns产率有相同的变动，那么可以将[NaBH3CN]的上限设定在4.0mM。观察到与最高mPEGIns产率相对应的NaBH3CN的浓度为1.5mM。
实施例2
EDTA螯合rhI原料中的Zn2+离子，因此使rhI溶解。为了符合美国药典(USP)，rhI原料所含Zn2+必须小于或等于1.00％(w/w)。通过用适量的乙酸锌代替反应缓冲剂中的小部分的乙酸钠而模拟Zn2+浓度。
对狭窄范围的[EDTA]/[rhI]0进行试验。使用于这一系列反应的以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86-0.88mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.04)、[NaBH3CN](1.2mM)、温度(28℃)、缓冲强度(30mM)、和pH(4.0)。利用RPHPLC分析对各反应的mPEGIns产率进行监测，并且在图5A中将此结果图示为[EDTA]/[rhI]0的函数。图5A中的数据显示在0.25的[EDTA]/[rhI]0处有最大PEGIns产率。就大于0.175的[EDTA]/[rhI]0的值而言，该mPEGIns产率似乎在83.5mol％附近波动。在下降至0.05的[EDTA]/[rhI]0水平处，才存在mPEGIns产率的略微下降(～3mol％)。
实施例3
对较大范围的[EDTA]/[rhI]0重复实施例2。对于重复性实验而言是以下参数保持恒定(在方括号中的值)：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.07)、[NaBH3CN](2.0mM)、温度(28℃)、缓冲强度(40mM)、和pH(4.0)。在图5B中给出了此组实验的作为[EDTA]/[rhI]0的函数的mPEGIns产率。在图5B中所示的范围中，观察到增加[EDTA]/[rhI]0降低mPEGIns产率。
用含有0.36％(w/w)Zn2+的rhI完成实施例2和3的实验。图5A表明在0.175至0.50范围内的[EDTA]/[rhI]0应当导致大致相同的mPEGIns产率。说道Zn2+含量，[EDTA]/[Zn2+]的相应的范围为0.55至1.56。对于这种情况，[EDTA]/[Zn2+]＝0.55对应于[EDTA]/[rhI]0＝0.48。基于图5B中的数据，用于[EDTA]/[Zn2+]的范围上限可以是2.0。然而，当以实施例8中的方式考虑反应时间时，观察到[EDTA]/[Zn2+]的范围的上限为1.0。
实施例4
对rhI Zn2+含量对mPEGIns产率的影响进行了试验。将乙酸锌添加到在所回收rhI上的反应中以模拟0.0％(w/w)Zn2+和0.40％(w/w)Zn2+。将乙酸锌添加到Diosynth rhI(批号SIHR010-121306A并且Zn2+含量＝0.36％(w/w))中，以模拟0.36％(w/w)、1.00％(w/w)、和1.22％(w/w)Zn2+。将用于这些实验的以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05-1.07)、[NaBH3CN](2.0mM)、温度(28℃)、和pH(4.0)。在图6中将这些批次的mPEGIns产率图示为这些批次的Zn2+含量的函数。图6中的数据类似于图5A和图5B中的数据。将[EDTA]/[rhI]0的值设定为接近得到与在rhI中Zn2+＝1.0％(w/w)时一致产率所需的最小值，因此EDTA浓度将会不能达到在1.0％(w/w)和1.2％(w/w)的Zn2+含量之间某处的最小值。如图6中所述，在mPEGIns产率相对较陡的下降出现在Zn2+含量为1.0％(w/w)和1.2％(w/w)之间。随着Zn2+含量从1.00％(w/w)减小至0.0％(w/w)，出现mPEGIns产率的平缓下降。该下降类似于图5B中所示的效果，随着相对每个rhI/Zn2+EDTA的增加，mPEGIns产率下降。在此实施例中，观察到Zn2+含量在0.0％(w/w)和1.0％(w/w)之间变化导致mPEGIns产率有占rhI约2.5mol％的变化。
实施例5
对一系列[rhI]0进行了实验。再次利用RP-HPLC对mPEGIns产率进行监测并且在图7中图示为[rhI]0的函数。随着[rhI]0中的每次下降，mPEGIns产率增加。当使[rhI]0从0.86mM减小至0.50mM时，mPEGIns产率的增加仅为0.8mol％。在一些点处，[rhI]0会变得低至反应将不发生。基于目前收集的数据，该临界的[rhI]0可出现在[rhI]0＝0.00mM和0.50mM之间的某处。
[rhI]0＝0.86mM的值代表与在10L反应体积中的50g rhI相对应的浓度。如果使批量大小保持恒定，那么[rhI]0中的每次减小与反应器体积的增加相对应。增大的体积可导致需较大质量的NaBH3CN来实现相同的浓度、以及较长的通过离子交换层析进行mPEGIns纯化的时间要求。因为是在0.50mM和0.86mM之间所，观察到的[rhI]0对mPEGIns产率的影响小，并且为了方便性和上述的安全问题，推荐的[rhI]0的设定值为0.86mM，并且下限和上限分别为0.50mM和1.0mM。
实施例6
对一pH范围进行实验。在全部系列的实验中使以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.04)、[NaBH3CN](2.0mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.175)、温度(28℃)、和缓冲强度(30mM)。在图8中将这些批次的mPEGIns产率图示为pH的函数。在pH＝3.88和pH＝4.27之间，mPEGIns产率从最小值到最大值变化小于1.5mol％。在该范围外的值显示明显更大的变化。pH的目标值可以是4.0，这是其中使mPEGIns产率最大化的pH值的近似值。
实施例7
完成乙酸盐缓冲强度变化实验。在一系列的实验中，使以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.07)、[NaBH3CN](2.0mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、和pH(4.0)。在图9A中将mPEGIns产率图示为乙酸盐缓冲强度的函数。随着更低缓冲强度存在朝向较高mPEGIns产率的总体趋势，但就在10mM和50mM之间缓冲强度而言这个趋势仅影响mPEGIns产率刚超过1mol％。在反应的开始和结束测量反应混合物的pH值，并且在图9B中将该变化量图示为乙酸盐缓冲强度的函数。在大于或等于40mM的缓冲强度下，随着反应的进程，pH值的变化显示为达到稳定状态。为了将pH变化限制在0.1pH单位内，可将缓冲强度的下限设定在20mM。为了在各批次之间一致地限制反应pH值，缓冲强度的目标值可以是在30mM。
实施例8
基于以前的数据，在大约3小时和20小时之间rhI转化率和mPEGIns产率显著地增加。执行其各种反应时间进行采样实验，包括16.6小时、18.0小时、19.2小时、和20.3小时。变化的[EDTA]/[rhI]0为0.15、0.50、1.0、和2.0。该实验使以下参数值固定：[rhI]0＝0.86mM、[mPEGpropald]0/[rhI]0＝1.07、[NaBH3CN]＝2.0mM、温度＝28℃、缓冲强度＝30mM、和pH＝4.0。在图10中将这四个批次的每个批次的mPEGIns产率图示为反应时间的函数。在图10中的标记表示[EDTA]/[rhI]0的不同值。对于[EDTA]/[rhI]0＝0.50的mPEGIns产率在16.6小时和20.3小时之间的时间点略有变化。因为mPEGIns产率不太可能随着反应时间增加而下降，所以该变化可能反映测量和分析波动而不是mPEGIns产率的实际变化。就[EDTA]/[rhI]0＝0.50而言，图10中的数据表明在16.6小时的反应时间与20.3小时的最大反应时间之间，超过16.6小时的较长反应时间不导致对mPEGIns产率的附加益处。相同的趋势(在16.6小时和20.3小时之间大致没有变化)也在[EDTA]/[rhI]0＝0.15和1.0的条件下出现，但在[EDTA]/[rhI]0＝2.0的条件下不出现。在[EDTA]/[rhI]0＝2.0时，在16.6小时和20.3小时之间mPEGIns产率增加约1mol％。为了在16.6小时处达到mPEGIns产率的稳定状态，观察到的[EDTA]/[rhI]0上限为1.0。
实施例9
对改变在mPEGIns反应混合物中的NaCl浓度对于mPEGIns产率的影响进行了测试。在整个的一系列实验中，使以下参数(在圆括号中的值)保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[NaBH3CN](1.5mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)，缓冲强度(30mM)、和pH(4.0)。在图11中将mPEGIns产率图示为[NaCl]的函数。rhI的转化率反映mPEGIns产率数据(未图示)中所见的趋势。在等于或大于100mM的[NaCl]水平下，在添加NaBH3CN(未图示)之前沉淀物明显地存在于反应混合物中。基于本实施例，NaCl的存在，甚至在50mM下，导致mPEGIns产率下降，因此可将用于控制溶液导电性的NaCl添加延迟直到反应后。
实施例10
使用2-甲基吡啶硼烷进行聚乙二醇化实验，并且使以下参数保持恒定(在圆括号中的值)：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[2-甲基吡啶硼烷](1.5mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、乙酸盐缓冲强度(30mM)、和pH(4.0)。利用RP-HPLC所测定的聚乙二醇化效率为在胰岛素B-链上55％单聚乙二醇化，而在胰岛素A链的N末端没有可检测的单聚乙二醇化。
实施例11
对溶剂添加对于聚乙二醇化效率的影响进行了评估，并且使以下参数保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[2-甲基吡啶硼烷](20mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、和pH＝4乙酸盐缓冲强度(30mM)。在图12中所示的结果表明乙腈(ACN)和乙酸乙酯(EtAC)对于聚乙二醇化产率具有有利作用，这可能是由于胰岛素溶解度的增加所导致。在图12中也示出了异丙醇(IPA)和甲醇(MeOH)。
实施例12
对pH值和2-甲基吡啶硼烷浓度对于聚乙二醇化效率的影响进行了评估，并且使以下参数保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、乙腈(20％)、和乙酸盐缓冲强度(30mM)。利用RP-HPLC分析测定反应混合物中的PEG-胰岛素浓度。图13中所示的结果表明在当使用5mM 2-甲基吡啶硼烷作为还原剂时在约pH＝5处为最佳。
实施例13
对胰岛素聚乙二醇化的速率进行了评估，并且使以下参数保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[2-甲基吡啶硼烷](5mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、20％乙腈、和pH＝5的乙酸盐缓冲强度(30mM)。利用RP-HPLC分析测定反应混合物中的PEG-胰岛素浓度。图14中示出了随时间推移单聚乙二醇化胰岛素的百分率。允许反应进行达16小时，在此时间点，单聚乙二醇化的百分率为大约75％并且被视为反应完全。
实施例14
对缓冲剂组合物对于聚乙二醇化的速率的影响进行了评估，并且使以下参数保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[2-甲基吡啶硼烷](5mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、20％乙腈、和pH＝5缓冲强度(30mM)。将结果示于图15。利用RP-HPLC分析测定反应混合物中的PEG-胰岛素浓度。乙酸盐缓冲液显示比柠檬酸盐缓冲液更高的产率。
实施例15
对柠檬酸盐缓冲液的pH值对于聚乙二醇化效率的影响进行了评估，并且使以下参数保持恒定：[rhI]0(0.86mM)、[mPEGpropald]0/[rhI]0(1.05)、[2-甲基吡啶硼烷](5mM)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、20％乙腈、和柠檬酸盐缓冲强度(30mM)。在3小时后利用RP-HPLC分析测定反应混合物中的PEG-胰岛素浓度，如图16中所示。
实施例16
在以下反应的参数下，对用5kDa mPEG NHS酯代替5kDa mPEG丙醛的影响进行了评估：[rhI]0(0.86mM)、[mPEG-NHS酯]0/[rhI]0(1.05)、[EDTA]/[rhI]0(0.5)、温度(28℃)、和100mM磷酸钠(pH 6.5)。在30分钟和1小时的RP-HPLC分析表明反应已结束，有大约72％的起始胰岛素仍然未被衍生化、B-链的N-末端23％被聚乙二醇化，并且5％是其它聚乙二醇化形式的胰岛素。本实施例表明mPEG NHS酯使胰岛素B-链的N-末端聚乙二醇化的效率低于mPEG丙醛。
实施例17
在以下的反应条件下使用胰高血糖素样肽1(GLP-1)进行了聚乙二醇化实验：[GLP-1]0(1-2.5mg/mL)、[mPEGpropald]0/[GLP-1]0(1.2)、[NaCNBH3](5mM)、温度(25℃)，乙酸盐缓冲强度(10mM)、和pH(4.5)。在16小时后，利用RP-HPLC对聚乙二醇化反应进行分析。观察到GLP-1的单聚乙二醇化为90-95％并且有5-10％未反应的GLP-1和1-2％二聚乙二醇化。利用阳离子交换色谱将单聚乙二醇化GLP-1纯化，缓冲交换进入0.02％碳酸氢铵，冷冻干燥。利用o/w单乳剂溶剂提取/蒸发工艺制备含有PEG–GLP-1偶联物的微颗粒。油相由溶解于MeCl2的8.5％(w/v)PLGA聚合物和5mg/mL的PEG-GLP-1所组成。使利用涡流用2.5×体积过量的1％w/v聚乙烯醇(PVA)油相乳化并且将主乳液添加到以300rpm搅拌的15×过量的0.3％PVA中。然后，在大约10分钟后添加30×过量的2％异丙醇(IPA)，将该悬浮液搅拌以便于通过溶剂蒸发使微球硬化。在3小时后，将硬化的微球过滤，用大体积的重蒸H2O清洗，并冷冻干燥。
实施例18
使用甲状旁腺激素(PTH1-34)在以下的反应条件下进行聚乙二醇化实验：[PTH]0(2.5mg/mL)、[mPEGpropald]0/[PTH]0(1.2)、[NaCNBH3](20mM)、温度(25℃)、乙酸盐缓冲强度(30mM)、和pH值(4.5)。在16小时后，对利用RP-HPLC聚乙二醇化反应进行分析。所观察到的PTH的单聚乙二醇化68％并且有24％未反应的PTH和8％的其它聚乙二醇化。利用阳离子交换色谱将单聚乙二醇化PTH纯化，缓冲交换进入0.02％的碳酸氢铵中，冷冻干燥。利用o/w单乳液溶剂提取/蒸发工艺制备含有PEG-PTH偶联物的微颗粒。油相是由溶解于MeCl2的8.5％(w/v)PLGA聚合物和1mg/mL的PEG-PTH所组成。利用涡流用2.5×体积过量的1％w/vPVA是油相乳化，将主乳液添加到以300rpm搅拌的15×过量的0.3％PVA中。然后，在大约10分钟后添加30×过量的2％IPA，将悬浮液搅拌以便于通过溶剂蒸发使微球硬化。在3小时后，将硬化的微球过滤，用大体积的双蒸馏水清洗，并冷冻干燥。
实施例19
使用人生长激素(hGH)在以下的反应条件下继续聚乙二醇化实验：[hGH]0(2.5mg/mL)、[mPEGpropald]0/[hGH]0(3)、[NaCNBH3](20mM)、温度(25℃)、乙酸盐缓冲强度(30mM)、和pH(5.5)。在16小时后，利用RP-HPLC对聚乙二醇化反应进行分析。所观察的hGH的单聚乙二醇化为65％并且有30％的未反应的hGH和5％的其它聚乙二醇化。利用阴离子交换色谱将单聚乙二醇化hGH纯化，缓冲交换进入0.02％碳酸氢铵中，并冷冻干燥。利用o/w单乳液溶剂提取/蒸发工艺制备含有PEG-hGH偶联物的微颗粒。油相是由溶解于MeCl2的8.5％(w/v)PLGA聚合物和5mg/m的PEG-hGH所观察。利用涡流使用2.5×体积过量的1％w/v PVA使油相乳化，将主乳液添加到以300rpm搅拌的15×过量的0.3％PVA中。然后，在大约10分钟后添加30×过量的2％IPA，将该悬浮液搅拌以便于通过溶剂蒸发使微球硬化。在3小时后，将硬化的微球过滤，用大体积的双蒸馏H2O清洗，冷冻干燥。
在本说明中，为了解释的目的，已陈述了许多细节从而提供对本发明各种实施例的理解。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，某些实施例可在没有部分的这些细节的情况下、或者具有额外细节的情况下实施。
上面已描述了若干实施例，本领域技术人员将应理解在不背离本发明的精神的前提下可采用各种修改、替代的结构、和等同物。此外，已描述了一些公知的工艺和要素以避免不必要地使本发明难以理解。此外，任何具体实施例的细节可以不始终存在于该实施例的变体中或者可是添加到其它实施例中。
在提供一系列值的情况下，应当理解的是除非上下文中清楚地指出,也具体地揭示该范围的上限与下限之间的各中间值，下限的第十的单位。包括在指定范围内的任何指定值或中间值与在指定范围内的任何其它指定或中间值之间的各较小范围。这些较小范围的上限和下限可单独地被包括或被排除在该范围内，并且其中任一个限值、没有限值、或两个限值被包括在较小范围内的各范围也被包括在本发明中，受到在指定范围中的任何具体排除的限值的限值。在指定范围包括一个或两个限值的情况下，也包括排除任一个限值或两个限值的范围。
在本文中和所附权利要求中所使用的单数形式“一”、“一种”、和“该”包括多个所指对象，除非上下文中清楚地指出。因此，例如，对“一方法”的引述包括多个的这种方法并且对“蛋白质”的引述包括对对于本领域技术人员为已知的一个或多个蛋白质及其等同物的引述等。现在已为了清楚和理解的目的而详细地描述了本发明。然而，应当理解的是在所附权利要求的范围内可进行某些变更和修改。

Claims (34)

1.一种制作蛋白质-PEG偶联物的方法，所述方法包括：
提供包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂的蛋白质水溶液，其中所述螯合剂选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群；
将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入所述蛋白质水溶液中，其中所述含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛具有在约25:1至约1.5:1范围内的摩尔比；和
所述甲氧基聚乙二醇醛与所述蛋白质反应而形成所述蛋白质-PEG偶联物，其中在所述反应期间所述pH缓冲剂将所述蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至6.0的范围内。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述含硼还原剂选自由氰基硼氢化钠、二甲基胺硼烷、三甲基胺硼烷、2-甲基吡啶硼烷、三乙酰氧基硼氢化钠、三乙基胺硼烷、吗啉硼烷、叔丁基胺硼烷、和5-乙基-2-甲基-吡啶硼烷所组成的组群。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述含硼还原剂是2-甲基吡啶硼烷。
4.根据利要求1所述的方法，其中所述甲氧基聚乙二醇醛与所述蛋白质的反应获得占所生成的所有蛋白质-PEG偶联物的大于75％的位点特异性单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质选自由胰岛素、甲状旁腺激素、甲状旁腺激素的片段、生长激素、胰高血糖素样肽-1、恩夫韦肽、和奥曲肽所组成的组群。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述蛋白质包括胰岛素，并且所述位点特异性单-聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物包括PEG-PheB1-胰岛素偶联物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质包含甲状旁腺激素的片段。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括磷酸的无机盐。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述氨基多羧酸选自由乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基乙酸(ADA)、双(氨基乙基)乙二醇醚、N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)、反式-二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸、和天冬氨酸所组成的组群。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述氨基多羧酸是乙二胺四乙酸(EDTA)。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述羟基氨基羧酸选自由N-羟乙基亚氨基二乙酸(HIMDA)、N,N-双-羟乙基甘氨酸、和N-三羟甲基甲基甘氨酸所组成的组群。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述N-取代甘氨酸包括甘氨酰甘氨酸。
13.一种制作胰岛素-PEG偶联物的方法，所述方法包括：
提供包含胰岛素、pH缓冲剂、有机溶剂、和包括乙二胺四乙酸(EDTA)的螯合剂的胰岛素水溶液；
将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入所述胰岛素水溶液中，其中所述含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛具有在约25:1至约1.5:1范围内的摩尔比；和
使所述甲氧基聚乙二醇醛与所述胰岛素反应而形成所述胰岛素-PEG偶联物，其中在所述反应期间所述pH缓冲剂将所述水胰岛素溶液的pH值维持在4.0至6.0的范围内，并且其中所述甲氧基聚乙二醇醛与所述胰岛素的反应获得占所生成的所有胰岛素-PEG偶联物的大于75％的PEG-PheB1-胰岛素偶联物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述含硼还原剂选自所述由氰基硼氢化钠、二甲基胺硼烷、三甲基胺硼烷、2-甲基吡啶硼烷、三乙酰氧基硼氢化钠、三乙基胺硼烷、吗啉硼烷、叔丁基胺硼烷、和5-乙基-2-甲基吡啶硼烷所组成的组群。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述含硼还原剂是2-甲基吡啶硼烷。
16.根据权利要求13所述的方法，其中当所述反应开始时，所述甲氧基聚乙二醇醛与所述胰岛素具有约10:1至约1:1的摩尔比。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛具有在约22:1至约5.5:1范围内的摩尔比。
18.根据权利要求13所述的方法，其中所述有机溶剂是选自由乙醇、甲醇、二甲基亚砜(DMSO)、二氧六环、乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)、和N-甲基吡咯烷酮(NMP)所组成的组群。
19.根据权利要求13所述的方法，其中所述有机溶剂是二氧六环。
20.根据权利要求13所述的方法，其中在所述反应期间所述胰岛素水溶液的pH值为5.0。
21.根据权利要求13所述的方法，其中所述胰岛素包括人胰岛素。
22.根据权利要求13所述的方法，其中所述甲氧基聚乙二醇醛与所述胰岛素的反应获得占所有所产生胰岛素-PEG偶联物75％至85％的所述PEG-PheB1-胰岛素偶联物。
23.一种制作含有蛋白质-PEG偶联物的控释微球的方法，所述方法包括：
提供包含蛋白质、pH缓冲剂、和螯合剂的蛋白质水溶液，其中所述螯合剂选自由氨基多羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸(BES)、和去铁胺(DEF)所组成的组群；
将含硼还原剂和甲氧基聚乙二醇醛导入所述蛋白质水溶液中，其中所述含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇具有在约25:1至约1.5:1范围内的摩尔比；
使所述甲氧基聚乙二醇醛与所述蛋白质反应而形成所述蛋白质-PEG偶联物，其中在所述反应期间所述pH缓冲剂将所述蛋白质水溶液的pH值维持在4.0至6.0的范围内；
将所述蛋白质-PEG偶联物在有机溶剂中与可生物降解聚合物加以混合而形成混合物；
使所述蛋白质-PEG偶联物与所述可生物降解聚合物的混合物在水溶液中乳化而形成乳化的混合物；和
使所述蛋白质-PEG偶联物与所述可生物降解聚合物的乳化的混合物硬化成为所述控释微球。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述含硼还原剂选自由氰基硼氢化钠、二甲基胺硼烷、三甲基胺硼烷、2-甲基吡啶硼烷、三乙酰氧基硼氢化钠、三乙基胺硼烷、吗啉硼烷、叔丁基胺硼烷、和5-乙基-2-甲基吡啶硼烷所组成的组群。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述含硼还原剂是2-甲基吡啶硼烷。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述蛋白质包括胰岛素、所述蛋白质-PEG偶联物是位点特异性单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物，并且所述位点特异性单聚乙二醇化蛋白质-PEG偶联物包括PEG-PheB1-胰岛素偶联物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述PEG-PheB1-胰岛素偶联物具有所有所产生胰岛素-PEG偶联物的75％至85％的产率。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述pH缓冲剂包括磷酸的无机盐。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述螯合剂包括乙二胺四乙酸(EDTA)。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述含硼还原剂与甲氧基聚乙二醇醛具有在约25:1至约5:1范围内的摩尔比。
31.根据权利要求23所述的方法，其中在所述反应期间所述蛋白质水溶液的pH值为5.0。
32.根据权利要求23所述的方法，其中所述有机溶剂包括二氯甲烷。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述可生物降解的聚合物选自由聚乳酸；聚乙交酯、聚乙丙交酯；聚己内酯；聚原酸酯；聚酯与聚醚的共聚物；和聚乳酸与聚乙二醇的共聚物所组成的组群。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述可生物降解聚合物包括聚乙丙交酯。
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