CN101514223A - 位点特异性蛋白质偶联物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速有效的制备蛋白质－聚合物偶联物，包括胰岛素－聚合物偶联物的一步方法。根据本发明的方法，蛋白质和亲水聚合物在至少一种有机溶剂和至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下接触。因此本发明涉及用聚乙二醇在PheB1残基上对特定的蛋白质，例如胰岛素，进行位点特异性修饰。本发明还提供一种将偶联物包封在生物可降解的聚合物中的药物制剂。

Description

位点特异性蛋白质偶联物的制备方法
本申请是国际申请日为2004年4月8日的国际申请PCT/US2004/010995进入中国、申请号为200480009722.8的题为“位点特异性蛋白质偶联物的制备方法”的发明专利申请的分案申请。
相关申请
本申请要求美国临时申请号为60/462364，申请日为2003年4月11日的专利申请的优先权，并将其全部内容作为本申请的参考。
技术领域
本发明涉及比非偶联的蛋白质具有更优良性质的化学修饰的蛋白质偶联物(conjugate)。特别的是，本发明涉及一种大为简化的、节约成本的并可扩大规模的以亲水聚合物修饰蛋白质的方法。更特别的是，本发明涉及用聚乙二醇进行位点特异性修饰特定的蛋白质，例如胰岛素。本发明还涉及基于生物可降解聚合物的药物递送制剂，其包含了经亲水性蛋白质位点特异性修饰的蛋白质。
背景技术
许多生产PEG化的胰岛素衍生物的方法都是已知的。Davis等(美国专利No.4179337)中记载了应用三氯-s-三嗪(氰尿酰氯)作为PEG和蛋白质之间的连接物，合成一种PEG-胰岛素构建物。在他们的合成路线中，大量过量(50×)的氰尿酰氯活化的PEG(2000Da)与胰岛素在硼酸盐缓冲液(pH9.2)中反应2小时。发明人能够制备部分(～50％)有活性的非免疫源的和非抗原的PEG-胰岛素偶联物。Obermeier等(加拿大专利No.1156217)发现根据上述Davis的专利中实施例X制备PEG-胰岛素偶联物时产生了一种不均一的偶联物混合物，其中包含约50％三-PEG-胰岛素偶联物，以及其它在PheB1残基上未取代的可能的PEG-胰岛素衍生物的组合(单和二-PEG-胰岛素)。
Obermeier等(加拿大专利No.1156217)阐述了一种在PheB1残基上特异性修饰的PEG-胰岛素偶联物的合成。他们的发明的主要内容涉及在碱性条件下的有机溶剂(例如DMF、DMSO、吡啶等)中，用四丁基氧羰基(t-boc)或甲基磺酰乙氧羰基(Msc)保护GlyA1和LysB29残基上的反应性胺。利用常规的色谱技术，从(单、二和三)保护的胰岛素的复合混合物中分离出NαA1，NεB29-双保护的胰岛素种类。分离后，纯的NαA1，NεB29-双保护的胰岛素与一种活化(盐酸或异氰酸酯)的PEG衍生物反应，随后利用肽化学常用技术除去保护基团。发明人发现GlyA1和LysB29上的氨基在碱性条件下比PheB1的氨基的反应性强。他们认为他们的位点特异性mPEG(1500)-B1-胰岛素偶联物在降低兔血糖水平时具有100％的胰岛素活性(根据摩尔数计算)。
Geiger等(参见D.Branderburg和A.Wollmer(eds.)，Insulin：Chemistry，Structure，and Function of Insulin and RelatedHormones，Walter de Gruyter & Co.，New York，pp.409-415，1980)和Ehrat等(Biopolymer s，22，569-573，1983)描述了利用与Obermeier等描述的多步骤方法相似的一种保护/偶联/去保护方法制备的在PheB1残基上特异性修饰的PEG-胰岛素加成物。Geiger等和Ehrat等发现PEG(1500)-B1-胰岛素偶联物比原来的胰岛素抗原性小得多，稳定得多(对于肝酶)。其它的PEG-胰岛素制剂(Caliceti等，STP Pharma Sci，9，107-113，1999；Uchio等Advanced DrugDelivery Reviews，35，289-306，1999；Hinds等，Bioconj.Chem.11，195-201，2000；Hinds等，Advanced Drug Delivery Reviews，54：505-530，2002)是1)将重点放在上述基本的三步保护/偶联/去保护方法，2)导致胰岛素分子的非特异性修饰，或者3)不产生最有效的偶联物，其称之为PEG-B1-胰岛素。
Liu等(美国专利No.6323311B1)描述了一种有效的合成PEG-B1-胰岛素偶联物的方法。该方法是Obermeier三步保护/偶联/去保护方法的扩展，但是不需要分离步骤之间反应中间产物(即一锅合成)。这样，胰岛素在GlyA1和LysB29残基上保护，立即与PEG反应，随后在任何种类的分离前去保护。发明人宣称他们的一锅反应可以生产高达50％的正确位置的异构体(即PEG-B1-胰岛素)，30％未反应的胰岛素能够循环用于随后的衍生化。如果迅速进行制备这些构建物，需要至少五天完成。此外，该发明需要大量过量的PEG反应物来达到可接受的结果。虽然该发明的产物可能是有效的，它们的制备仍然需要蛋白质在不利于蛋白质的环境(高和低pH)中长时间经历三个反应步骤。
通过提供一种一步反应简便地制备在胰岛素B链(PheB1)的氮末端特异性PEG化的高纯度胰岛素衍生物的方法，本发明克服了现有技术中PEG化胰岛素方法的缺点。与表明在PheB1的PEG化是可能性最小的反应产物的现有技术(例如Caliceti等，1999，supra)相比，本发明的方法采用了特定的控制pH条件，使用金属离子鳌合剂以及加入有机溶剂加强PheB1氨基末端的相对反应性，使之成为PEG化的主要位点。基于通过在PheB1残基上位点特异性PEG化赋予胰岛素的大量有益性质(例如降低的免疫源性/抗原性；提高的蛋白水解、化学和物理稳定性；提高的循环半衰期；提高的水/有机溶剂溶解性；完整的生物活性)，一种实现上述成果的简便的、节约成本的、可简便升级的方法成为本领域中一项显著的进步。
发明内容
本发明是基于一步制备蛋白质-聚合物偶联物的方法的发现。本发明还涉及基于生物可降解的聚合物的药物递送制剂，其包括具有用亲水性蛋白质位点特异性修饰的蛋白质。在一个特别实施方案中，本发明提供一种一步合成PEG化胰岛素衍生物的方法，其中取代的位置主要是PheB1残基(B链的氮末端)。本领域所熟知的是，这种衍生物比天然胰岛素在物理性质上和酶学上更稳定。此外，衍生物比胰岛素更易溶于水/有机溶剂系统。此外，这些衍生物已经显示出较低的免疫源性，具有延长的循环半衰期。
本发明的一个显著的优点是反应在接近中性的条件下进行，不需要的副反应(例如脱酰胺化，转酰胺化，氧化等)可以忽略。另一个优点是使用相对较小量的聚合物(例如PEG试剂)，这样节省成本。得到的蛋白质聚合物偶联物(例如PEG化胰岛素)可以单独使用，例如用于人类的治疗，或将其包封在缓释给药载体中，例如美国专利申请2002/0155158中所记载的。
相应的，在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备蛋白质-聚合物偶联物方法，其是通过在至少一种有机溶剂和至少一种金属鳌合剂存在下，在蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下，将胰岛素蛋白和亲水聚合物接触而进行的。然后可应用多种常规技术分离偶联物，例如柱色谱。
在本发明的一种特别的情况中，亲水聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油、以及它们的线状、分支状和氨基反应性衍生物。适合的氨基反应性衍生物包括，例如，乙醛、PEG羧酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯、PNP碳酸酯以及苯并三唑末端的亲水聚合物衍生物。典型的是，亲水聚合物和胰岛素蛋白以约10∶1-1∶1的摩尔比例存在。
用于本发明的适合的有机溶剂包括许多种已知的溶剂，包括但不限定于，易溶于水的有机溶剂，例如乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP。典型的是，有机溶剂以约0.1-10％的浓度存在。
用于本发明的适合的金属鳌合剂也包括许多已知的化合物，包括但不限定于，多价(例如二价)金属离子鳌合剂，例如EDTA、去铁敏(DEF)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和双(氨基乙基)乙二醇醚N，N，N’，N’，-四乙酸(EGTA)。通常，鳌合剂存在的浓度约0.1-10mM。
在本发明的一个特定实施方案中，胰岛素蛋白和亲水聚合物(例如PEG)在以重量计的蛋白浓度为约0.1-5％的水溶液中接触(反应或偶联)。在本发明另一个实施方案中，胰岛素蛋白和亲水聚合物在pH为约5.0-7.5，优选约7.0的水溶液中接触。这就得到含量高达50％的胰岛素-聚合物偶联物的正确位置的异构体。在另一种特殊的实施方案中，亲水聚合物和胰岛素蛋白在约4℃-50℃，优选在15℃-25℃的温度下接触。
蛋白质-聚合物偶联物一旦形成后，将其与不需要的副反应产物和未反应的胰岛素蛋白分离。这可通过多种现有技术完成，例如色谱。在一种特别的情况下，使用离子交换色谱。
在另一种实施方案中，本发明的方法进一步包含在分离偶联产物之前结束胰岛素蛋白和亲水聚合物的反应(例如偶联)的步骤。在一种特别的实施方案中，这是通过降低反应的pH值至约1-4完成的。
本发明的方法制备的特别的蛋白-聚合物偶联物包括，例如，胰岛素-聚合物偶联物，优选胰岛素-PEG偶联物(PEG化胰岛素)。这包括任何胰岛素或胰岛素相关的蛋白质，例如具有SEQ ID NO：1所示序列的人胰岛素以及相关的家族成员。在一个特别实施方案中，胰岛素在PheB1残基上特异性反应(PEG化)，在GlyA1和LysB29残基上无明显反应。得到的PEG化胰岛素能够通过现有技术熟知的任何适合的剂型给药治疗。在一种特别的实施方案中，偶联物是通过例如在给药前将偶联物包封在生物可降解的聚合物中得到的缓释剂型给药的。
本发明其它的实施方案在如下的详细说明和实施例中将会更清楚。
附图说明
图1A和1B是说明给正常大鼠静脉注射PEG-胰岛素偶联物后，位点取代(图1A)或聚合物分子量(图1B)影响的体内药效学的图。
图2A和2B是说明不同分子量胰岛素-PEG偶联物的物理聚合造成的可溶性胰岛素的损失，这些偶联物具有相同的聚合物连接位点(图2A)，以及相同分子量PEGF的不同的聚合物连接位点造成的可溶性胰岛素的损失(图2B)。
图3为说明两个mPEG(5000Da)胰岛素位置异构体的化学稳定性的图。
图4为说明F5000(PEG-胰岛素)从PGLA微球上体外释放的累积的图。
图5为说明糖尿病大鼠皮下注射给药后F5000(PEG-胰岛素)微球的体内药效学的图。
图6为说明糖尿病大鼠皮下注射给药后F5000(PEG-胰岛素)微球的体内药物代谢动力学的图。
具体实施方式
本发明涉及一种快速有效的一步制备蛋白质-聚合物偶联物的方法。该方法包括在至少一种有机溶剂和至少一种金属鳌合剂存在下，在接近中性的条件下将蛋白和亲水聚合物反应。本发明的特别的蛋白-聚合物偶联物包括应用最少的PEG试剂和温和的条件，在PheB1氨基末端PEG化的胰岛素。然而以前的研究表明PheB1通常是胰岛素的最小反应性氨基，其倾向占据大空间的大分子试剂(参见，例如Caliceti等，1999，supra)。出人意料的是，本发明的方法产生了这样的条件，在此条件下，PheB1是可用亲水聚合物修饰的最有反应性的基团。这使得在简便的一步反应中，在PheB1上PEG化的胰岛素的产量最高，并能从其它的偶联物和未反应的胰岛素中分离出来。根据需要后者可以循环用于进一步的偶联。血糖监控表明PEG化的PheB1胰岛素偶联物保留全部活性，并保留蛋白质的原有的结构。
亲水聚合物
术语“亲水聚合物”是指任何水溶的线性的、分支的、叉状的、分支叉状的、树枝状的、多臂的、或者星形的聚合物，包括但不限定于聚乙二醇和聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油、以及相似的聚合物。优选聚合物的分子量从约500道尔顿至约50000道尔顿变化。本发明所用的典型的亲水聚合物具有至少一个反应性基团，其通过氨基、羧基、巯基、磷酸根或羟基官能团与目标生物活性分子连接。用于本发明的亲水聚合物，例如聚乙二醇，能够根据常规方法制备，其中一个末端用甲氧基封端，另一个末端被活化以便于与生物活性分子上的活性基团连接。例如，美国专利US6113906记载了使用在聚乙二醇的U形(例如分支的)上的琥珀酰亚胺基琥珀酸酯或琥珀酰亚胺基碳酸酯反应性基团与蛋白质的氨基反应。美国专利US5650234记载了使用聚乙二醇的N-羟基苯并三唑碳酸酯、2-羟基嘧啶碳酸酯、以及N-羟基-2-吡咯啉酮碳酸酯衍生物与蛋白质的氨基反应形成一个稳定的脲键。美国专利US5672662记载了琥珀酰亚胺丙酸酯和琥珀酰亚胺丁酸酯取代的聚乙二醇与蛋白质的氨基反应形成一个稳定的酰胺键。美国专利US5446090记载了使用聚乙二醇的乙烯砜衍生物与蛋白质的巯基反应形成稳定的硫醚键。美国专利US5880255记载使用乙二醇的tresyl(2，2，2-三氟乙烷磺酰基)衍生物与蛋白质的氨基反应形成一个简单的、稳定的仲胺键。美国专利US5252714记载了使用聚乙二醇的丙醛衍生物与蛋白质的氨基反应得到一个稳定的仲胺键。这些亲水聚合物与生物活性分子连接得到的键能够被有意识的设计成稳定的或不稳定的(例如可逆的)。此外，本发明使用的亲水聚合物可以根据常规方法制备，其中有两个相似的(例如同型双功能的)或不相似的(例如异型双功能的)功能基团用于与生物活性分子上的活性基团偶联。例如，WO126692A1记载了异型双功能的聚乙二醇衍生物在蛋白质修饰中的应用。这些专利的全部内容在此引用作为参考。
在一种实施方案中，亲水聚合物是聚(乙烯二醇)(PEG)。PEG是指一种线性的或分支的中性聚醚，其化学式为HO(CH2CH2O)n-H。PEG极易溶于水和许多有机溶剂(例如二氯甲烷、乙醇、甲苯、丙酮和氯仿)，各种大小(分子量)和功能性的结构(例如氨基、羧基以及巯基末端的)均容易得到。已知PEG无毒，经FDA批准用于药品(肠胃外给药、局部给药、栓剂、鼻腔喷雾)，食品和化妆品。PEG在溶液中是一种高度水合的聚合物，其中每一个单体(乙烯氧单元)能结合多达三分子的水。此外，PEG具有影响更松散联系的水合水分子的几个分子层结构的能力。对水中与单表面结合的链的行为进行分子模拟表明，聚合物表现出很大程度的分段弹性。这样就推测聚合物在水性环境中占据了大的流体动力体积。这些发现能够解释PEG在PEG存在时排斥其他聚合物(天然的和合成的)存在的原因。其它聚合物被排斥主要原因是PEG具有排斥蛋白质，与其它合成聚合物形成两相系统，使该聚合物具有非免疫源性和非抗原性。当PEG以共价键结合到蛋白质上，其通常将许多聚合物的有益特性转移到形成的偶联物中。因为上述的许多有益的特性，PEG非常适合用于蛋白质的修饰。
如此处所述，术语“PEG”包括任何PEG聚合物，包括PEG的氨基反应性衍生物(“PEG试剂”)。许多用于蛋白质偶联的PEG试剂是已知的。一种典型的PEG试剂是线性的PEG聚合物，其具有一个醚键封端(O-甲基)，以及另一个反应性基团功能化的末端。其它的PEG试剂是分支的或树状的，再将非反应性末端和反应性功能基相结合连接到蛋白质上。可选择的是，带有相似的或不相似的反应性功能基相结合的相同或不同的双功能PEG试剂可用于连接蛋白质。PEG试剂的例子包括，但不限定于，乙醛、N-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯、N-羟基琥珀酰亚胺丙酸酯、对-硝基苯基碳酸酯或者苯并三唑碳酸酯封端的一类或者其它氨基反应性活化的PEG种类。
PEG聚合物的分子量可以在，例如500-50000Da的范围内。反应性功能基团可以通过连接基团从PEG链中分离出来。任选地，聚合物的PEG和连接基团之间的内部键是可任意降解的。相应的，在本发明的一种实施方案中，PEG聚合物上的反应性基团可以被亲电性活化用于与蛋白亲核试剂反应。亲电基团的例子为n-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯，tresyl和醛功能团。具有这些功能的PEG试剂将发生反应与蛋白质的氨基形成共价连接。优选的用于PEG偶联到蛋白质氨基上的PEG试剂是一种丙酸连接子的mPEG琥珀酰亚胺活化酯mPEG-SPA。另一种优选的PEG试剂是单甲氧基PEG醛(mPEG-Ald)。
胰岛素-聚合物偶联物
自从75年以前发现胰岛素以来，胰岛素制剂的肠道外给药一直作为用于治疗胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)的主要治疗方法。导致现有的治疗存在不足的许多因素是胰岛素分子固有的内在缺点。特别是胰岛素面临着许多蛋白质类药物的典型问题，包括物理和化学稳定性差，对蛋白水解敏感，免疫源性和抗原性以及相对较短的血浆半衰期。
蛋白质PEG化已经被用于改善重组人蛋白质的治疗效果。通过网状内皮系统(RES)、肾脏、脾脏和肝脏，大多数肠道外给药的蛋白质从体内快速清除掉。PEG连接到蛋白质影响其分子大小、电荷以及受体结合能力，能够用来降低偶联物的总清除率。
此外，酶对蛋白质的代谢导致治疗性蛋白质的生物活性迅速丧失。通过空间屏蔽对导致蛋白水解的因素敏感的蛋白质结构域，PEG降低了导致生物活性丧失的蛋白质水解。
此外，重组人蛋白质在重复使用后还引起免疫反应。通过空间屏蔽治疗性蛋白质的免疫源性和抗原性决定区，PEG连接通常形成了非免疫源性和非抗原性的偶联物。相应的，通过PEG化导致了肠道外蛋白质性质的变化，其结果提高了血浆半衰期和对蛋白水解降解的抗性，降低了得到的PEG蛋白构建物的免疫源性和抗原性。
胰岛素蛋白
这里使用的术语“胰岛素蛋白”是指任何天然形成的或重组的胰岛素蛋白或者相关能够在例如残基PheB1上被偶联的蛋白质。相应的，本发明使用的胰岛素蛋白包括，例如胰岛素类似物、等同物和衍生物。来自任何适合的物种的胰岛素都能够使用，例如人、猪、牛、狗、大鼠、小鼠、绵羊、或者猴子。在一个优选的实施方案中，胰岛素为人胰岛素。
人胰岛素是一种众所周知的蛋白质，可从许多商业来源方便的获得，其中包括但不限定于，Sigma Chemical Company和Novo Nordisk。天然形成人胰岛素是一种分子量约5500道尔顿，包括约51个氨基酸的蛋白质。由于生产商不同，胰岛素根据分子量活性略有差别。然而，以单位确定的胰岛素的活性是标准的。具有不同程度生物活性的胰岛素是商业上可获得的。例如，可以购买缓慢、中间的、快速起作用的胰岛素种类。具有与胰岛素相似活性或者提高胰岛素受体的非胰岛素降血糖试剂包括但不限定于，磺酰脲(例如格列本脲、甲磺吡脲、格列甲嗪、格列波脲、氯磺丙脲、甲磺氮草脲、乙酰苯磺酰环己脲以及glimopride)，噻唑烷二酮(例如曲格列酮和吡格列酮)，α-葡萄糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖和米格列醇)以及第三代胰岛素释放剂(例如KAD1220、etoxomir以及瑞格列奈)。
胰岛素分子由两个多肽链，A链和B链组成。人胰岛素的氨基酸序列在此由SEQ ID NO：1提供。A链由21个氨基酸组成(A1-A21)，长B链由30个氨基酸组成(B1-B30)。这两个链通过残基A7和B7之间以及A20和B19之间的两个链间二硫键连接，然而另一个链内二硫键连接残基A6和A11。两个链的氨基酸残基之间还有许多非共价相互作用，用来稳定胰岛素形成三维结构。
有三个反应性氨基用于修饰(例如通过PEG)，它们定位在A链和B链的N末端(分别为A1和B1)以及定位临近B链C末端(B29)的一个赖氨酸。
胰岛素蛋白还包括相关的蛋白质，例如胰岛素样生长因子(I和II)，以及来源于生长激素/泌乳素类的蛋白质。
胰岛素蛋白与亲水聚合物偶联
根据本发明，在至少一种有机溶剂和至少一种金属鳌合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下，胰岛素蛋白和亲水聚合物相接触(例如反应或偶联)。在一种特殊的实施方案中，使用最小量的PEG试剂和温和的条件，在胰岛素蛋白的PheB1氨基末端PEG化胰岛素蛋白。PheB1的氨基通常是胰岛素上的3个可用的氨基功能基中反应性最小的(Caliceti等，1999，supra)。在本发明中，发现了赋予使PheB1氨基具有与PEG试剂最大反应性的条件。因此这些反应条件形成在PheB1上单独PEG化成为主要的反应产物。
在本发明一个特殊的实施方案中，胰岛素蛋白和亲水聚合物在蛋白质浓度为约0.1-5％(w/v)，优选从0.5-1.5％，pH调节为5.0-7.5，优选为6.5-7.2的范围内的水溶液中相接触。pH可以通过加入缓冲盐、加入有机酸/碱，或者加入普通的无机酸/碱来控制。水溶液中进一步包含至少一种水溶性有机溶剂，其可以选自包括乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF、NMP等的组。在另一方面，有机溶剂优选二噁烷，存在的浓度(v/v)为0-25％，优选2-20％，更优选5-15％。
用于本发明的适合的金属鳌合剂包括许多种已知的鳌合剂，包括例如氨基聚羧酸，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、次氮基三乙酸(NTA)、N-2-乙酰氨基-2-亚胺二乙酸(ADA)、二(氨基乙基)乙二醇醚、N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)、反二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、谷氨酸和天冬氨酸；羟基氧氨基羧酸，例如N-羟基氧乙基亚胺基二乙酸(HIMDA)、N，N-双-羟基氧乙基甘氨酸(N-二(羟乙基)甘氨酸)和N-(三羟基氧甲基甲基)甘氨酸(N-三(羟乙基)甘氨酸)；N-取代甘氨酸，例如甘氨酰甘氨酸。其它适合的鳌合剂包括2-(2-氨基-2-oxocthyl)氨基乙烷磺酸(BES)和去铁敏(DEF)。本发明的方法中使用的适合的鳌合剂包括，例如，结合溶液中的金属离子使之不能与可获得的氧气反应，从而最小化或避免形成OH自由基，其与蛋白质自由反应并降解蛋白质。这些鳌合剂能够降低或避免在缺少鳌合剂保护时造成的蛋白质的降解。
本发明使用的鳌合剂以其盐的形式存在，例如羧酸或前述鳌合剂的其它酸性功能基。这些盐的例子包括与钠、钾、钙或者其它弱结合金属离子形成的盐。如本领域所知晓的，盐的性质和待中和的电荷数量有赖于存在的羧基基团的数量以及稳定螯合剂提供的pH。本领域所知的，鳌合剂与特定的目标离子结合的能力不同。通常，重金属离子比与它们相似荷电的低分子量对应物结合得更强。
本发明的方法中使用的鳌合剂也可以选自EDTA、EGTA以及其它本领域已知的多价阳离子鳌合剂。根据本发明的方法，金属鳌合剂，优选EDTA，存在的浓度为0.1-10mM，优选从1-5mM，更优选从1-3mM。
用于本发明的适合的亲水聚合物包括许多种已知的聚合物，包括例如聚乙二醇、聚丙二醇、及其线性的、分支的和氨基反应性衍生物。在本发明的另一个方面中，氨基反应性衍生物选自由乙醛、N-羟基琥珀酰亚胺、PNP碳酸酯，以及苯并三唑封端的亲水聚合物衍生物。在本发明一种特殊实施方案中，亲水聚合物，例如PEG试剂，优选PEG的琥珀酰亚胺酯，更优选mPEG-SPA，与胰岛素以约10∶1至1∶1，优选3∶1至1.2∶1，更优选1.7∶1至1.5∶1的摩尔比接触。在另一种实施方案中，亲水聚合物和胰岛素蛋白在约4℃至50℃，优选约15℃至25℃下接触。
在另一种实施方案中，本发明进一步包括在分离偶联物之前中止偶联反应的步骤。这是通过例如降低pH至约1-4，优选约2-3，更优选约2.4-2.6完成的。然后通过常规技术进行偶联物的分离，例如离子交换(例如阳离子交换)色谱，将目标偶联物收集、浓缩、脱盐以及干燥。
偶联的生物活性剂在控释给药制剂中的用途
偶联的生物活性剂，例如PEG化的胰岛素蛋白，可以事先包封在基于生物可降解的聚合物的给药制剂中。包封在药物给药制剂中的PEG化生物活性剂要比相应的非PEG化的生物活性剂的浓度高。PEG化的生物活性剂从生物可降解聚合物给药制剂中释放表明其与相应的非PEG化生物活性剂相比较少爆发(burst)。生物可降解聚合物给药制剂中的PEG化的生物活性剂比相应的非PEG化生物活性剂的物理和化学稳定性高，抗原性和免疫源性低。
本申请中生物可降解的聚合物包括，但不限定于，聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d，1-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚己内酯、聚原酸酯、聚酯和聚醚的共聚物、聚(丙交酯)和聚(乙烯二醇)的共聚物等。
因此，本发明蛋白质-聚合物(例如PEG化的胰岛素)的偶联物被有利地引入的生物可降解的聚合物给药制剂包括，例如，聚(d，1-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)微粒。与非偶联的蛋白质相比，其中包封更多的蛋白偶联物，也降低了爆发(释放超过第一个24小时)。此外，与亲水聚合物偶联，例如PEG，使偶联物溶于某种有机溶剂，简化了形成PLGA微球的过程。
实施例
I.通过一步法的位点特异性PEG-胰岛素的制备和表征
实施例1
Nαβ1-甲氧聚(乙烯二醇)-胰岛素偶联物的制备
将1克(172μmol)胰岛素(Zn2+-胰岛素，Intergen公司)在室温下溶解于100mL含有2mM EDTA的水中，使用稀HCl将溶液的pHapp调节至7。在另一个容器中，将1.4g(相对于胰岛素的1.6mol的等同物)的一种活化的PEG衍生物[单甲氧基聚(乙烯二醇)琥珀酰亚胺丙酸酯，mPEG-SPA，Shearwater公司]在室温下溶解于10mL二噁烷。然后，通过直接注射将mPEG-SPA溶液加入胰岛素溶液中，反应在室温下进行2小时。然后通过HCl酸化(pHapp2.5)中止反应，用0.02％的碳酸氢铵对混合物进行完全过滤[配备YM3(3000MWCO)膜的Amicon 8200超滤器]。再用1M乙酸/7M脲/0.01M NaCl对反应混合物进行完全过滤，纯化前浓缩至10mL。使用配备SP琼脂糖(Amersham Bioscience)离子交换柱的FPLC系统，将mPEG-PheB1-胰岛素衍生物与其它反应的副产物(mPEG-GlyA1-胰岛素、mPEG-LysB29-胰岛素、二-mPEG-胰岛素以及三-mPEG-胰岛素)分离。用包含0.04M NaCl的1M乙酸/7M脲在流速为5mL/min平衡柱，使用NaCl梯度(0.04M-0.12M)溶液洗脱结合蛋白超过80分钟。收集在280nm检测时主要的峰对应的洗脱液。用0.02％的NH4HCO3进行完全过滤以除去任何低分子量的杂质，然后在鉴定之前冻干并在-20℃下保存。
同样的方法还被用于制备一种带有连接在PheB1氨基上的一种低分子量线性聚合物(即mPEG-SPA，Mr＝2000Da)偶联物，以及两种高分子量分支聚合物(即mPEG-SPA，Mr＝10000Da)偶联物。这两种独特的偶联物可以根据下述的技术进行表征。结果证实该方法能够成功的用于制备许多种PEG-PheB1-胰岛素偶联物，其差别仅在于连接在PheB1上的聚合物的结构(例如线性的或分支的)或大小(例如分子量)。
实施例2
应用FPLC/HPLC分析偶联物的纯度
使用分析型阳离子交换柱(MonoS 5/5，Amersham Bioscience)，在与上述分离步骤中相同的条件下，分析mPEG-PheB1-胰岛素的纯度，使用的流速为1.0mL/min。一种正交技术(反相HPLC)也被用于检验偶联物的最终纯度。Waters Alliance HPLC系统配备一种Waters 996光电二极管阵列检测器(PDA)和一个Symmetry 300(C18，5μm粒径，4.6×250mm)反相柱。流动相A由含有0.1％的TFA(三氟乙酸)的MilliQ优质水组成，流动相B由含有0.1％的TFA的95/5ACN(乙腈)/水组成。使用30-60％B的线性梯度超过15分钟(2％B/分钟)，在276nm下监测化合物的洗脱。mPEG-胰岛素的纯度大于95％。
实施例3
N-末端蛋白质测序(Edman降解)证明偶联物的同一性
根据Edman降解反应在任何共价结合PEG的N-末端氨基上无法进行的原理，利用N-末端蛋白质测序分析确定PEG偶联的位点。使用Applied Biosystem 477A蛋白质测序仪(Pasadena，CA)通过三个降解循环分析所有的样品。[GlyA1/PheB1]的N末端氨基酸的摩尔比例≈1表明在残基LysB29上连接(或者根本不连接)，[GlyA1/PheB1]≈0表明在残基GlyA1上连接，[GlyA1/PheB1]≈30表明在残基PheB1上连接。结果证明取代的位置约95％为PheB1。
实施例4
基质辅助激光解吸离子化(MALDI)鉴定偶联物的分子量
选择这种分析性的鉴定技术是因为它是一种“软离子化”方法，其不会造成PEG-偶联物在分析中降解。设备的输出值为每个样品的质/荷比的定量值；因此根据偶联物和未修饰的胰岛素的分子量的完全不同，能简便的确定连接到胰岛素上的PEG链的数量。所有的样品在Perceptive Biosystem型DERP MALDI/TOF质谱上以线性模式检测，并检测阳离子。所有的样品的本底为α-氰基-4-羟基肉桂酸，使用最后的光谱平均至少为64shot的337nm的氮激光线。单体胰岛素的分子量计算值为5807.2Da，偶联反应使用的mPEG(5000)-SPA的数均分子量为5129Da。mPEG(5000)-胰岛素的质谱与只有一个mPEG链连接到胰岛素的结论吻合。此外，每个离子峰都相差44Da(乙烯氧化物单体单元的分子量)。这些结果证明在所有制备的偶联物中只有一个mPEG连接在胰岛素上，它们的多分散度只归因于PEG固有的多分散度。
实施例5
在将PEG偶联到胰岛素B1的氨基末端时仲胺的形成
通过带有末端醛基的活化的mPEG与蛋白质的反应制备F5000PEG-胰岛素。该反应在希夫氏碱介质中进行，随后通过硼氢化氰钠还原，在聚合物和蛋白质之间形成一种稳定的仲胺键。反应按下列步骤进行：制备2mM EDTA/25mM磷酸缓冲液，用磷酸调节pH值为6.0。将5.5mg/mL(总体积2mL)的胰岛素溶于加入440μL二噁烷的磷酸缓冲液中。胰岛素一经溶解，加入2mL的含有10mM NaCNBH3的水溶液，然后加入过量的5倍摩尔的mPEG(5000)-乙醛(干粉状，Shearwater Corporation，Huntsville，Alabama)。反应混合物中共含有约12.5mM磷酸(pH6)，1mM EDTA，10％二噁烷，5mM NaCNBH3，2.5mg/mL的胰岛素，以及10mg/mL的mPEG-乙醛。反应进行过夜，第二天pH为约5.5。加入乙酸至pH为约2时中止反应。使用RP-HPLC对少量代表性试样进行分析。反应产物主要种类确定如下：约70％的反应产物是单PEG化(r.t.12.5min)，剩下约10％的未反应的胰岛素(r.t.9.8min)以及9％双PEG化胰岛素(r.t.13.8min)。收集单PEG化的组分，用0.02％的NH4HCO3透析并冻干。MALDI-TOF分析显示出一个对应于PEG-5000链连接到胰岛素的单分子质谱。Edman降解分析表明约95％的单PEG化种类在PheB1残基上取代，剩余的单PEG化种类(～5％)很可能是在GlyA1残基上取代，这是因为在此使用的反应条件下，LysB29的氨基中99.99％被质子化(因此未反应)。
II.制备位点特异性PEG-胰岛素偶联物的可选择的方法
实施例6
使用传统的多步骤方法将PEG-5000连接到B链氨基末端(F5000)
使用一种双叔丁氧羰基保护的中间体将重组人胰岛素(IntergenCo.)在PheB1位置上PEG化。根据Liu等1997(Liu等Bioconj.Chem.8(5)：664-672，1997)合成双NαA1，NεB29-t-叔丁氧羰基-胰岛素(双叔丁氧羰基胰岛素)。根据前述Hind等，2000的方法制备mPEG(5000)-PheB1-胰岛素偶联物。
根据反相HPLC和离子交换FPLC的色谱峰面积，通过FPLC分离的目标组分纯度大于98％。纯化的产物进一步通过MALDI-TOF质谱和氨基酸序列分析表征，其显示单取代的PEG在B链氨基末端，PheB1。根据该方法制备和纯化的mPEG(5000)-PheB1-胰岛素偶联物(F5000)与根据本发明的较简单和耗时少的方法制备的同种偶联物是等同的(实施例1)。
实施例7
PEG-5000连接B链Lys29(K5000)
根据前述Hind等，2000的方法在B链的Lys29上特异性PEG化重组人胰岛素。根据反相HPLC和离子交换FPLC的色谱峰面积，目标FPLC组分纯度大于98％。纯化的产物进一步通过MALDI-TOF质谱和氨基酸序列分析鉴定，其显示在B链倒数第二个氨基酸LysB29上单取代的PEG。同样的方法还用于制备在LysB29的氨基上连接有一个低分子量线性聚合物(例如mPEG-SPA，Mr＝2000Da)和两个高分子量分支的聚合物(例如mPEG2-SPA，Mr＝10000或2000Da)的偶联物。根据上述技术鉴定这三个不同的偶联物。结果证明该方法能够被成功用于制备许多种PEG-Lys-胰岛素偶联物，它们仅仅在连接到LysB29的聚合物的结构(例如线性的或分支的)和大小(分子量)上不同。
III.位点特异性PEG胰岛素的构象、活性和稳定性的表征
实施例8
对经过位点特异性PEG化的胰岛素的构象完整性的评价
在远紫外范围内的圆二向色性光谱被用于检测胰岛素的构象。通常评价两个反向最小值的大小，即在水相环境下，在208nm(α-螺旋)和223nm(β-片层)下分析胰岛素的构象。在208nm远紫外CD谱带主要来源于由B10-B19，A2-A6以及A13-19之间的残基形成的α-螺旋，而β结构是造成在223nm下远紫外CD谱带的主要因素。样品的CD图谱的特点证明mPEG连接在胰岛素的PheB1或LysB29残基上。与Zn2+-胰岛素相比，偶联物的完整构象(二级)不会改变。
实施例9
PEG胰岛素偶联物的药物动力学
对PEG化对胰岛素药效学的作用进行了研究。这些研究结果用于评价包含不同取代位置(位置异构体)或PEG分子量的PEG胰岛素的偶联物制剂的体内生物活性(降低血清葡萄糖的能力)，并与商业上可获得的胰岛素制剂(Humulin R，Lilly)相对比。向禁食的Sprague-Dawley大鼠静脉注射F5000、K2000、K5000、K10000、或者
Figure A20081013112200201
后测量血中的葡萄糖水平。将0.3IU/kg(基于蛋白浓度并对PEG重量作适当校正；假定25IU/mg蛋白)等量物溶解于普通生理盐水中，尾静脉注射给药。每组N＝6。在被测物注射之前以及注射后超过6小时的间歇抽血。通过常规的流程分离血清，使用Accucheck Advantage(Beringer Igelheim)葡萄糖仪测试葡萄糖水平。
图1A和1B中的结果表明当以正常人胰岛素的等量剂量使用时，F5000、K2000和K5000都能有效的降低正常大鼠的血糖水平。有趣的是，K10000偶联物降低血糖水平的程度达不到其它被测物的水平，但是发现该偶联物的作用时间超过6小时。因此K10000偶联物可以被开发成一种可溶的传统的基本胰岛素悬浮液的替代物，用来长效降低糖尿病病人的血糖。
实施例10
典型的PEG胰岛素偶联物的物理稳定性
使用一种加速振荡试验方法来测试七种PEG-胰岛素偶联物(F2000、F5000、F10000、K2000、K5000、K10000以及K20000)和锌胰岛素的物理稳定性。该试验通常在现有技术中有记载，它能够以快速的方式准确测试胰岛素制剂的物理稳定性。对于该实验，制备四份蛋白质(偶联物)的水溶液(1mg/mL，磷酸缓冲盐，pH7.3，0.02％的叠氮化钠)，在37℃下水平振荡(频率100/min)。在预定的时间点将样品撤下，过滤(除去不溶性聚集物)，通过PR-HPLC分析量化保留在溶液中的蛋白(偶联物)组分。图2显示当每一种胰岛素衍生物作为时间的函数时，可溶性蛋白减少。
这些数据证实了最近的报道，在PheB1-氨基取代的胰岛素衍生物具有实质上更高的(36-40×)物理稳定性，LysB29胰岛素在某种程度上比天然的肽更稳定(4-8×)。最近的研究显示PheB1胰岛素对纤维化的抗性提高是由于两种互补的效应。第一个效应是通过mPEG偶联，在B链的N末端形成的特殊空间位阻，导致阻止该表面参与胰岛素原纤维生长所需的疏水相互作用。第二个有助于PheB1-胰岛素提高物理稳定性的效应是非特异性和具有的天然的空间构象，并且根据聚合物的分子量成比例增加。所有的LysB29-胰岛素都表现出相对于天然多肽更高的物理稳定性，但是达不到在PheB1上取代的偶联物的程度，直到聚合物的分子量超过10kDa。这能够由LysB29没有参与纤维化反应，存在着通过参与纤维化的分子间相互作用的非特异性空间位阻造成的稳定化效应来解释。
实施例11
典型的PEG胰岛素偶联物的化学稳定性
文献中广泛记载了胰岛素(或胰岛素类似物)在水溶液中经历多种化学分解反应。例如根据脱酰胺作用机制，胰岛素A链的C末端天门冬氨酸分解是在酸性条件下通过一个环状中间体完成的。根据转氨基作用反应机制，这种高反应性环状中间体还能够通过与不同胰岛素分子的N末端氨基中的一个反应而分解。
胰岛素偶联物F5000和K5000在37℃下含有0.02％叠氮化钠的PBS中水平振荡孵育。在规定的时间点(0、6、12、28和36天)，撤下每个样品并通过RP-HPLC分析来确定脱酰胺作用的程度，和通过分子排阻色谱来确定共价二聚作用的程度。
IV.PEG-胰岛素生物可降解聚合物缓释制剂的制备、鉴定和药物动力学
实施例12
将PEG-胰岛素包封在PLGA微球中
将PEG-胰岛素F5000(50mg)溶解于1ml二氯甲烷中。将溶液加入体积为1ml的含有150mg PLGA45∶55(lac∶gly)，0.15dl/g带有酸末端基团的IV的二氯甲烷。二氯甲烷溶液加入置于15ml离心管中的含有1％聚(乙烯醇)的5ml水中，漩涡混合以形成乳液。将乳液加入100ml含有0.3％聚(乙烯醇)的100ml水中，搅拌3小时蒸发二氯甲烷。使用Whatman#1滤纸真空过滤收集硬化的微球，并干燥。
实施例13
PEG-胰岛素PLGA微球的鉴定
通过扫描电子显微镜和激光散射颗粒大小分析分别观察PEG-胰岛素微球的表面形态和颗粒大小分布。分析型反相HPLC用于对包封在聚合物微球中的PEG-胰岛素偶联物定量。在HPLC分析之前，一定量的微球溶解于一定体积的乙腈中，加入等体积的0.1％的TFA水溶液中沉淀聚合物，将偶联物萃取到水溶液中。也使用这种方法将K2000、K5000、K10000、K20000和F5000-A包封。这些实验的结果列在表1中，其中列出了总微球的PEG-胰岛素的百分含量(w/w)和包封效率，是由包封的PEG-胰岛素的重量/最初加入的PEG-胰岛素的重量表示。所得的相对高的药物含量高达28.3％，包封效率达100％，由于降低了所需的总剂量使得产物可用于临床，由于起始原料损失少使得产物具有商业前景。此外，使用不同的丙交酯∶醣脂比例(50∶50和72∶25)，分子量(6.5-24kDa)，固有粘度(0.09-0.27dL/g)，或者末端酯基团(甲基或月桂基)的聚合物在大的装药量范围(5-35wt％)内制备微球。
表1
典型的PEG-胰岛素微球制剂的鉴定
Figure A20081013112200221
用PLGA(45∶55L∶G，0.15dL/g，酸末端基团)制备微球，达到25wt％的名义上的核心载量。
实施例14
用于动物试验的PEG-胰岛素微球制剂的体外释放
将15mgF5000PEG-胰岛素微球(14.1％的药物含量，PLGA45∶55；0.15dL/g IV，酸末端基团)样品混悬在1.5ml磷酸缓冲盐(pH7.4，0.02％叠氮化钠和0.02％Tween20)中，在37℃下孵育。间隔弃去上清液，用RP HPLC分析释放的PEG-胰岛素。用新鲜的PBS取代缓冲液，继续孵育。将累计释放作为孵育时间的函数来分析数据(图4)。在第一天中PEG-胰岛素释放低于1.0％，在18天内释放超过95％。低爆发释放，高的总释放以及超过约两周时间的持续释放都是缓释释放胰岛素制剂非常希望具备的特点。
通过实施例12的方法使用F5000与不同的生物可降解的聚合物，以及还使用K5000PEG-胰岛素与F5000-A偶联物制备的其它制剂也得到了在0和7.5％之间的一天释放值，缓释持续时间达到60天。
实施例15
F5000PEG-胰岛素PLGA微球的体内药效学和药物代谢动力学
将由PLGA 45∶55，0.15dl/g IV，酸末端基团(14.1％核心载量)组成的微球中的F5000PEG-胰岛素进行血糖抑制实验，对F5000在糖尿病大鼠中进行药物代谢动力学实验。在待测物给药前一天，通过皮下注射40mg/kg溶于等渗的柠檬酸盐缓冲液(10mM，pH4.5)中的链脲菌素(Sigma，St.Louis，MO)使雄性SD大鼠(～250g)产生糖尿病(Junod，A.等，J.Clin.Invest.，48：2129-2139，1969)。然后使用悬浮于2.5％无菌羧甲基纤维素(CMC)或生理盐水(阴性对照)中的PEG-胰岛素微球(～11mg/大鼠，相当于3mg胰岛素/kg体重)对动物进行治疗，在预定的时间点抽血并分离血清，随后分析血糖(PD)和F5000(PK)水平。图5和6显示超过13天时间内血清葡萄糖水平和血清PEG-胰岛素水平(数据是平均+/-SE的形式)。图5显示正如预期的一样，在整个试验中对照糖尿病大鼠的血糖水平为100％或者更高(在测量误差范围内)。对于PEG-胰岛素微球治疗的糖尿病大鼠，三天后血糖水平降低至治疗前水平的60％以下，并再保持7天的抑制。
图6显示在微球注射后(t＝1小时)很快检测到一个可以忽略的最初的爆发释放(Cmax＝0.62ng/ml)。注射后开始的24小时，治疗组的PEG-胰岛素水平稳定上升2天至治疗水平(～1-3.5ng/mL)并持续约7天，而阴性对照组F5000血清水平在任何时候低于检测限。这些数据共同显示在微球形成过程中偶联物保持生物活性，并在微球注射后一周长的释放时间内保持。重要的是，在体外(图4，第一天释放＜0.5％)和体内(图6，AUC0-1d/AUC0-13d＝0.7％实验)都发现与最初PEG-胰岛素爆发释放相近的量。此外，图5和6所示的数据的分析表明在该实施例中药物代谢动力学/药效学(PK/PD)相关联。
等同物
通过使用不超越常规的实验，本领域技术人员认知或者能够确认许多与在此描述的本发明的特定实施方案的等同物。这些等同物应被下述的权利要求所包括和覆盖。
序列表
<110>PR PHARMACEUTICALS，INC.et al.
<120>位点特异性蛋白质偶联物的制备方法
<130>PRJ-013PC
<150>60/462,364
<151>2003-04-11
<160>1
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>51
<212>PRT
<213>人
<400>1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
 1               5                  10                  15
Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu
            20                  25                  30
Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr
        35                  40                  45
Pro Lys Thr
    50

Claims (39)

1.一种制备蛋白质-聚合物偶联物的方法，其包括：
(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物以约1.7∶1-1.2∶1的摩尔比例在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下接触；以及
(b)分离偶联物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述摩尔比例是1.7∶1-1.5∶1。
3.一种制备蛋白质-聚合物偶联物的方法，其包括：
(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物在约5.0-7.5的pH下，在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下接触；以及
(b)分离偶联物。
4.一种制备蛋白质-聚合物偶联物的方法，其包括：
(a)将胰岛素蛋白和亲水聚合物在至少一种金属螯合剂存在下，在促进蛋白质和聚合物形成偶联物的条件下接触；
(b)分离偶联物；以及
(c)将所述偶联物包封在生物可降解的聚合物中。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白包括人胰岛素。
6.前述权利要求中任一项所述方法，其中所述亲水聚合物选自聚乙二醇、聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚氧乙基化甘油，以及它们的线状的、分支状的和氨基反应性的衍生物。
7.权利要求6所述的方法，其中所述氨基反应性衍生物选自醛、N-羟基琥珀酰亚胺、PNP-碳酸酯，以及苯并三唑封端的亲水聚合物。
8.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白和亲水聚合物以约0.1-5.0％的蛋白浓度相接触。
9.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述螯合剂选自多价金属离子螯合剂、EDTA、去铁敏(DEF)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，以及双(氨基乙基)乙二醇醚N，N，N’，N’-四乙酸(EGTA)。
10.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述螯合剂以约0.1-10mM的浓度存在。
11.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述胰岛素蛋白和亲水聚合物在约4-50℃温度下接触。
12.前述权利要求任一项所述的方法，其中该方法进一步包括在分离偶联物之前中止偶联物形成的步骤。
13.权利要求12所述的方法，其中通过降低pH至约1-4来中止反应。
14.前述权利要求任一项所述的方法，其中使用色谱技术进行分离。
15.权利要求14所述的方法，其中所述色谱技术包括离子交换色谱。
16.前述权利要求任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将胰岛素蛋白和亲水聚合物在至少一种有机溶剂存在下接触的步骤。
17.权利要求16所述的方法，其中所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP。
18.一种制备胰岛素-PEG偶联物的方法，其包括：
(a)将胰岛素和PEG在约5.0-7.5的pH下，在至少一种金属螯合剂存在下，在促进胰岛素和PEG形成偶联物的条件下接触；以及
(b)分离偶联物。
19.权利要求18所述方法，其中所述胰岛素包括人胰岛素。
20.权利要求18-19任一项所述方法，其中所述PEG包括选自醛、N-羟基琥珀酰亚胺、PNP-碳酸酯，以及苯并三唑封端的PEG中的氨基反应性PEG衍生物。
21.权利要求18-20任一项所述方法，其中所述PEG和胰岛素以约10∶1-1∶1的摩尔比例接触。
22.权利要求18-21任一项所述方法，其中所述PEG和胰岛素在约0.1-5.0％的蛋白浓度相接触。
23.权利要求18-22任一项所述方法，其进一步包括在分离偶联物之前中止偶联物形成的步骤。
24.权利要求23所述方法，其中通过降低pH至约1-4来中止反应。
25.权利要求18-24任一项所述的方法，其中使用离子交换色谱进行分离。
26.权利要求18-25任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括将胰岛素蛋白和亲水聚合物在至少一种有机溶剂存在下接触的步骤。
27.权利要求26所述的方法，其中所述有机溶剂以约0.1-10％的浓度存在。
28.权利要求26所述的方法，其中所述有机溶剂以约0-25％的浓度存在。
29.权利要求26-28任一项所述的方法，其中所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、DMSO、二噁烷、DMF和NMP。
30.权利要求26-29任一项所述的方法，其中所述有机溶剂是二噁烷。
31.权利要求18-30任一项所述的方法，其进一步包括将偶联物包封在生物可降解的聚合物中。
32.根据前述权利要求任一项所述的方法生产的胰岛素-PEG偶联物。
33.包封胰岛素-PEG偶联物的聚(丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)微球，所述偶联物包含在PheB1末端氨基连接到胰岛素上的PEG。
34.权利要求32或33所述胰岛素-PEG偶联物，其中所述PEG的分子量为550-5,000Da。
35.权利要求32-34任一项所述胰岛素-PEG偶联物，其中所述PEG的分子量为5,000Da。
36.药物送递制剂，其包含包封在生物可降解的聚合物中的权利要求32-35任一项所述胰岛素-PEG偶联物。
37.权利要求36所述药物送递制剂，其中所述生物可降解的聚合物选自聚(丙交酯)、聚(乙交酯)、聚(d，1-丙交酯-共聚-乙交酯)、聚己内酯、聚原酸酯、聚酯和聚醚的共聚物以及聚(丙交酯)和聚(乙二醇)的共聚物。
38.权利要求36或37所述药物送递制剂，其中所述胰岛素-PEG偶联物包封在聚(d，1-丙交酯-共聚-乙交酯)(PLGA)微球中。
39.权利要求32-35任一项所述胰岛素-PEG偶联物或权利要求36-38任一项所述药物送递制剂在制备用于治疗糖尿病的药物中的用途。
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