JP2006522816A - 部位特異的タンパク質結合体を調製する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、本明細書に全体の内容を参考として援用している、2003年4月11日出願の米国特許仮出願番号第60/462,364号に基づく優先権を主張する。
本発明は、非結合体タンパク質の性質より優れた性質を有する化学的に改変されたタンパク質結合体に関する。詳細には、本発明は、非常に簡素化され、費用有効的であり、量産可能な、親水性ポリマーによりタンパク質を改変する方法に関する。より詳細には、本発明は、インスリンのような、選択されたタンパク質のポリエチレングリコールによる部位特異的改変に関する。本発明は、親水性タンパク質との部位特異的改変を有するタンパク質を包含する、生分解性ポリマーベースの薬剤送達処方物に関する。
PEG化インスリン誘導体を産生する種々の方法は、公知である。Davisら(米国特許第4,179,337号)は、PEGとタンパク質とのリンカーとしてトリクロロ−s−トリアジン(塩化シアヌル)を用いたPEG−インスリン構築物の合成を、記述した。彼等は、大過剰(50×)の塩化シアヌル活性化PEG(2000Da)をホウ酸緩衝液(pH9.2)中のインスリンと2時間反応させる合成スキームに従った。本発明者らは、部分的に活性な(〜50%)PEG−インスリン結合体(それは非免疫原性であり非抗原性である)を、産生することができた。Obermeierら(カナダ特許番号第1,156,217)は、上に引用したDavis特許の実施例Xに従ったPEG−インスリン結合体の調製は、約50%のトリ−PEG−インスリンを含有する結合体の不均質な混合物を産生し、他の可能なPEG−インスリン誘導体の組合せ(モノ−PEGインスリンおよびジ−PEG−インスリン)は残基PheB1で置換されていなかったことを見出した。
本発明は、タンパク質−ポリマー結合体を調製する単一工程の方法の発見に基づいている。本発明はまた、親水性タンパク質との部位特異的な改変を有する生分解性ポリマーベースの薬剤送達処方物に関する。特定の実施形態では、本発明は、置換の部位が優勢的に残基PheB1(上記B鎖のN末端)であるPEG化インスリン誘導体の単一工程の合成のための方法を提供する。そのような誘導体が、天然のインスリンより物理的に酵素的により安定であることは当該分野では周知である。さらに、上記誘導体は、インスリンより水系/有機系でより溶解性である。さらにこれらの誘導体は免疫原性がより低く、長時間の循環半減期を有していることが分かっている。
本発明の他の実施形態は、以下の詳細な説明および実施例から明らかになる。
本発明は、タンパク質−ポリマー結合体を迅速におよび効率的に調製する単一工程の方法に関する。本方法は、少なくとも1種の有機溶媒および少なくとも1種の金属キレート剤の存在下で、中性近辺の条件下で、タンパク質と親水性ポリマーを反応させる工程を包含する。本発明の特定のタンパク質−ポリマー結合体は、最小量のPEG試薬および温和な条件を用いて、アミノ末端PheB1にPEG化されたインスリンを包含する。先行技術は、PheB1が、立体的に嵩高い高分子試薬に対して、通常、インスリンの最も反応性が低いアミノ基であることを示している(例えば、Calicetiら、1999、上記)にもかかわらず、驚くべきことに、本発明の方法は、PheB1が、親水性ポリマーによる改変で利用可能な最も反応性の高い基になるような条件を作り出す。これは、PheB1でPEG化されたインスリンが最高収率の生成物であり、かつ他の結合体および未反応インスリンから分離され得る単純な単一工程の反応を可能にする。後者は、望まれる場合、さらなる結合のためにリサイクルされ得る。PheB1でPEG化されたインスリン結合体は、血糖制御で測定されるように、完全な活性を保持し、かつ上記タンパク質の天然構造が保存されている。
用語「親水性ポリマー」は、限定しないが、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化グリセリンならびに類似のポリマーを含む、如何なる水溶性線状ポリマー、分岐ポリマー、グラフト(forked)ポリマー、分岐−グラフトポリマー、デンドリマー状ポリマー、多枝(multi−armed)ポリマーまたは星型ポリマーをいう。好ましくは、上記ポリマーの分子量は、約500ダルトン〜約50000ダルトンの範囲である。本発明で使用する親水性ポリマーは、典型的には、アミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、リン酸またはヒドロキシル基を介して、関心の生理活性分子との連結に組込まれる、少なくとも一つの反応性基を有する。ポリエチレングリコールのような本発明で使用される親水性ポリマーは、メトキシ基で一端が保護され、そして他の一端が生理活性分子の活性基への容易な結合のために活性化される標準的プロトコールに従って、調製され得る。例えば、米国特許番号第6,113,906号は、タンパク質のアミノ基との反応のために、「U型」(即ち、分岐)型形態のポリエチレングリコールにコハク酸コハク酸イミド反応性基または炭酸コハク酸イミド反応性基の使用を記載している。米国特許番号5,650,234号は、安定なウレタン結合を形成するためのタンパク質のアミノ基との反応に、ポリエチレングリコールのN−ヒドロキシベンゾトリアゾール炭酸塩誘導体、2−ヒドロキシピリミジン炭酸塩誘導体およびN−ヒドロキシ−2−ピロリジノン炭酸塩誘導体の使用を記載している。米国特許番号第5,672,662号は、安定なアミド結合を形成するためのタンパク質のアミノ基との反応のために、プロピオン酸および酪酸置換ポリエチレングリコールのコハク酸イミドエステルの使用を記載している。米国特許番号第5,446,090号は、タンパク質のスルフヒドリル基と安定なチオエーテル結合を形成するために、ポリエチレングリコールのビニル−スルホン誘導体の使用を記載している。米国特許番号第5,880,255号は、単純で、安定な2級アミン結合を形成するために、タンパク質のアミノ基との反応のためにポリエチレングリコールのトレシル(2,2,2,−トリフルオロエタンスルホニル誘導体の使用を記載している。米国特許番号第5,252,714号は、安定な2級アミン結合を生じるタンパク質のアミノ基との反応のため、ポリエチレングリコールのプロピオンアルデヒド誘導体の使用を記載している。そのような親水性ポリマーの生理活性分子への連結から生じる結合は、安定または不安定(即ち可逆的)に意図的に設計され得る。さらに本発明で使用される親水性ポリマーは、生理活性分子の活性基への結合を容易にする利用可能な二つの類似な(例えば、ホモ二官能性)、または類似しない(ヘテロ官能性)官能基を用いる標準的なプロトコールに従って調製され得る。例えば、WO126692A1は、タンパク質の改変のために、ヘテロ二官能性のポリエチレングリコール誘導体の使用を記載している。これらの特許の全体的な内容は、本明細書に参考として援用されている。
インスリン処方物の非経口的投与は、75年以上前のインスリンの発見以来、依然としてインスリン依存性糖尿病(IDDM)の処置に用いられる第一治療法である。現在の治療法を不適切にしている要因の多くは、上記インスリン分子に固有の本質的な欠点である。詳細には、インスリンは、弱い物理的安定性および化学的安定性、タンパク質分解の受け易さ、免疫原性および抗原性ならびに比較的短い血漿中半減期を含む、タンパク質製剤に典型的な多くの問題に直面する。
本明細書で使用される用語「インスリンタンパク質」は、任意の天然に存在するもしくは組換えインスリンタンパク質または、例えば、残基PheB1で結合され得る関連タンパク質をいう。従って、本発明に使用されるインスリンタンパク質としては、例えば、インスリンアナログ、インスリンホモログおよびインスリン誘導体が挙げられる。任意の適切な種、例えば、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、ラット、マウス、ヒツジまたはサルからのインスリンが、用いられ得る。好ましい実施形態において、インスリンはヒトインスリンである。
本発明に従って、上記インスリンタンパク質および親水性ポリマーを少なくとも1種の有機溶媒および少なくとも1種の金属キレート剤の存在下で、上記タンパク質とポリマーの結合体の形成が促進される条件下で、接触させる(即ち、反応または結合させる)。特定の実施形態では、上記インスリンタンパク質は、最小量のPEG試薬とゆるやかな条件を用いて、PheB1アミノ末端でPEG化される。PheB1アミノ基は、通常インスリンの3つの利用可能なアミノ官能基の中で反応性が最も低い(Calicetiら、1999、上記)。本発明において、条件はPheB1アミノ基をPEG試薬に対して最も反応性にすること見出した。これらの反応条件は、このようにPheB1での単一PEG化を優性の反応生成物として産生する。
本発明で用いられる適切な金属キレート剤としては、種々の公知のキレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、ニトリロ三酢酸(NTA)、N−2−アセトアミド−2−イミノ二酢酸(ADA)、エチレングリコールビス(2−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、trans−ジアミノシクロヘキサン四酢酸(DCTA)、グルタミン酸およびアスパラギン酸のようなアミノポリカルボン酸;ならびに、例えば、N−ヒドロキシエチルイミノ二酢酸(HIMDA)、N,N−ビス−ヒドロキシエチルグリシン(bicine)、およびN−(トリヒドロキシメチルメチルグリシン(tricine)のようなヒドロキシアミノカルボン酸;ならびにグリシルグリシンのようなN−置換グリシンが挙げられる。他の適切なキレート剤としては、2−(2−アミノ−2−オキソエチル(oxocthyl)アミノエタンスルホン酸(BES)およびデフェロキサミン(DEF)が挙げられる。本発明の方法で用いられる適切なキレート剤としては、例えば、溶液中で利用可能な酸素と反応することを不可能にする金属イオンへ結合し、それにより上記タンパク質と自由に反応および分解するOHラジカルの発生を、最小限にするまたは防止するキレート剤が挙げられる。そのようなキレート剤は、キレート剤の保護なしで処方されたタンパク質の分解を減少させ得、または防止し得る。
本発明の方法で用いられるキレート剤は、EDTA、EGTAおよび当該分野で公知の他の多価カチオンキレート剤から選択され得る。本発明の方法に従って、金属キレート剤、好ましくはEDTAが、濃度が0.1〜10mM、好ましくは1〜5mM、より好ましくは、1〜3mMで存在する。
PEG化インスリンタンパク質のような生理活性結合体薬剤は、生分解性ポリマーベースの薬物送達処方物で、有利にカプセル化され得る。PEG化生理活性剤は、対応する非PEG化生理活性剤より高濃度で、薬物送達処方物にカプセル化される。生分解性ポリマー薬物送達処方物からのPEG化生理活性剤の放出は、対応する非PEG化の生理活性剤より急速ではないことを示している。生分解性ポリマーの薬物送達処方物の中でのPEG化生理活性剤の物理的安定性および化学的安定性はより大きく、かつ抗原性および免疫原性は対応する非PEG化生理活性剤よりも低い。
(実施例1)
NαB1−メトキシポリ(エチレングリコール)−インスリン結合体の調製
1グラム(172μモル)のインスリン(Zn2+−インスリン、Intergen Co.)を、室温で100mLの2mM EDTA水溶液に溶解し、希塩酸を用いて、その溶液のpHappを7に調整した。別の容器に、1.4g(インスリンに対して1.6モル当量)の活性化PEG誘導体[モノメトキシポリ(エチレングリコール)プロピオン酸コハク酸イミド、mPEG−SPA、Shearwater Corp.]を、室温で10mLのジオキサンに溶解した。上記mPEG−SPA溶液を、上記インスリン溶液に直接注入で加え、そしてその反応を室温で2時間進行させた。上記反応を、HCl(pHapp2.5)で酸性化してクエンチし、そしてその混合物を0.02%重炭酸アンモニウムに対して限外ろ過[YM3(3000MWCO)膜を取り付けたAmicon 8200 限外ろ過装置]した。その後、その反応混合物を、1M 酢酸/7M 尿素/0.01M NaClに対して限外ろ過し、精製前に10mLまでに濃縮した。上記mPEG−PheB1−インスリン誘導体を、他の反応副生成物(mPEG−GlyA1−インスリン、mPEG−LysB29−インスリン、ジ−mPEG−インスリン、およびトリ−mPEG−インスリン)から、SP セファロース(Amersham Biosciences)カチオン交換カラムを取り付けたFPLCシステムを用いて、単離した。上記カラムを、5mL/分の流速で、1M 酢酸/0.04M NaCl含有7M 尿素で平衡化し、上記結合タンパク質をNaCl−グラジェント(0.04M〜0.12M)を用いて、80分にわたって溶出した。280nmで検出された主要なピークに対応する上記溶出液を収集し、そしていかなる低分子量の不純物をも除去するために0.02% NH4HCO3に対して限外ろ過し、その後凍結乾燥をして性質決定の前に−20℃で保存した。
結合体純度のFPLC/HPLCによる評価
mPEG−PheB1−インスリンの純度を、流速1.0mL/分を用いた以外は、上述の単離手順で用いた条件と同一の条件下で、分析用カチオン交換カラム(MonoS 5/5、Amersham Biosciences)を用いて、分析した。直交技術(逆相HPLC)もまた、上記結合体の最終純度を証明するのに用いた。Waters Alliance HPLC システムに、Waters 996光ダイオード配列検出器(PDA)およびSymmetry300(C18、5μm 粒子サイズ、4.6×250mm)逆相カラムを取り付けた。流動層Aは、0.1%TFA(トリフルオロ酢酸)MilliQ 品質水からなり、そして流動層Bはまた、0.1%TFAを含有する、95/5ACN(アセトニトリル)/H2Oからなった。15分にわたって、30〜60%Bの直線グラジェントを用いて、化合物の溶出を276nmの検出で、進めた。上記mPEG−インスリンの純度は、95%を超えた。
結合体同一性のN末端タンパク質配列決定(エドマン分解)による確認
上記エドマン分解反応は、PEGに共有結合したN末端アミノ基では進まないということを承知の上で、PEG結合部位を決定するために、N末端タンパク質配列分析を用いた。全ての試料を、Applied Biosystems 477Aタンパク質配列分析器(Pasadena、Ca)を用いて、3回の分解サイクルで分析した。N末端アミノ酸モル比が[GlyA1/PheB1]≒1の場合は、残基LysB29(または無し)への結合を暗示し、[GlyA1/PheB1]≒0の場合は、残基GlyA1への結合を暗示し、[GlyA1/PheB1]≒30の場合はPheB1への結合を暗示する。この結果は、置換の部位が約95%PheB1であることを確証した。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)による結合体分子量の同定
この分析の性質決定技術を、分析中にPEG−インスリン結合体が分解する原因にならないような意味を持つ「軟イオン化」であるので、選択した。上記機器の出力は、各試料の質量/電荷比の定量的な尺度を提供する;従って、インスリンに連結しているPEG鎖の数を、上記結合体の分子量と未改変のインスリンの分子量との全体的な差から容易に決定することができる。全ての試料を、直線モードで操作したPerceptive Biosystems model DERP MALDI/TOF質量分析計にかけ、陽イオンをモニターした。全ての試料の上記マトリックスは、α−シアノ−4−ヒドロキシ桂皮酸であり、窒素レーザの337nm線を最終スペクトルのために平均して少なくとも64ショットで用いた。モノマーのインスリンは5807.2Daの計算分子量を有し、結合反応に用いたmPEG(5000)−SPAの数平均分子量は、5129Daであった。上記mPEG(5000)−インスリンの質量スペクトルは、一つのみのmPEG鎖がインスリンに連結しているという結論と一致した。さらに、個々のイオンピークは、一貫して44Da(エチレンオキシドモノマー単位の分子量)ごとに異なっていた。これらの結果、調製した結合体の全てにおいて、一つのみのmPEG鎖がインスリンに連結して、そしてそれらの多分散性が、もっぱらPEG固有の多分散性に、起因するものであることを確証した。
インスリンB1アミノ末端へのPEGの結合における2級アミンの形成
F5000PEG−インスリンを上記タンパク質と末端にアルデヒド基を有する活性化mPEGとを反応させて調製した。この反応は、シフ塩基中間体を経由して進行し、引き続いて上記ポリマーとタンパク質間の安定な2級アミン結合を形成するようシアノトリヒドロホウ酸ナトリウムで還元する。上記反応を以下のようにして行なった:2mM EDTA/25mM リン酸緩衝液を作り、pHをリン酸で6.0に調整した。5.5mg/mL(全容量2mL)のインスリンを440μlのジオキサンを加えたリン酸緩衝液に溶解した。一度、インスリンを2mLの10mM NaCNBH3水溶液に加え、その後5倍モルの過剰のmPEG(5000)−アルデヒド(乾燥粉末として、Shearwater Corporation、Huntsville、Alabama)を加える。結局、上記反応混合物は、およそ12.5mM リン酸(pH6)、1mM EDTA、10%ジオキサン、5mM NaCNBH3、2.5mg/mL インスリンおよび10mg/mL mPEG−アルデヒドを含有していた。上記反応を一晩進行させ、翌日、そのpHが約5.5であることが分かった。上記反応を、酢酸の添加により、約pH2にクエンチした。小アリコートをRP−HPLCを用いて分析した。主要な反応種を以下のように決定した:約70%の上記反応生成物は、モノ−PEG化物(室温で12.5分)、約10%の未反応インスリン(室温で9.8分)および9%のジ−PEG化インスリン(室温13.8分)が残っていた。上記モノ−PEG化分画を溜めて0.02%NH4HCO3に対して透析し、そして凍結乾燥した。MALDI−TOF分析は、インスリンへ1つのPEG−5000鎖の付加に対応する単一分子質量を示した。エドマン分解分析では、約95%のモノ−PEG化種が残基PheB1で置換され、残りのモノ−PEG化種(〜5%)は殆ど残基GlyA1で置換されている。何故なら、ここで用いた反応条件下ではLysB29のアミノ基は99.99%プロトン化されている(従って反応性無い)からである。
(実施例6)
従来の多工程法を用いて、B鎖アミノ末端(F5000)へ結合したPEG−5000
組換えヒトインスリン(Intergen Co.)をジ−boc保護化中間体を用いて、PheB1位にPEG化した。ジ−NαA1、NεB29−t−boc−インスリン(ジ−boc−インスリン)を、Liuら。1997(Liuら、Bioconj.Chem.8(5):664〜672、1997)に従って合成した。上記mPEG(5000)−PheB1−インスリン結合体をHindsら、2000、上記のプロトコールに従って調製した。
B鎖Lys29に結合したPEG−5000(K5000)
組換えヒトインスリン(Intergen Co.)を、Hindsら、2000、上記の方法により、B鎖のLys29に特異的にPEG化した。上記所望のFPLC分画は、逆相HPLCおよびイオン交換FPLCのクロマトグラフのピーク面積を基礎にして、純度が98%を超えた。その精製された生成物を、MALDI−TOF質量分析およびアミノ酸配列分析でさらに性質決定を行い、そしてB鎖末端から2番目のアミノ酸LysB29で、モノ置換されていることを示した。この同じ方法をまた使用して、LysB29に連結した1種の低分子量の線状ポリマー(即ち、mPEG−SPA、Mr=2000Da)および2種のより高分子量の分岐ポリマー(即ち、mPEG2−SPA、Mr=10,000または20,000Da)を調製し、そして上記に概説した技術に従って、これらの3種の異なる結合体の性質決定を行なった。この結果は、この方法が、LysB29に連結されたポリマー構造のみ(即ち、線状もしくは分岐)またはサイズのみ(即ち、分子量)が異なる種々様々のPEG−LysB29−インスリン結合体を、首尾良く調製するのに用い得る。
コンホメーション、活性および安定性
(実施例8)
部位特異的PEG化後のインスリンコンホメーション保持性の評価
遠紫外範囲の円偏光二色性分光法を用いてインスリンのコンホメーションを調べた。通常、以下の二つの負の極小の強度を評価する:水性環境中でのインスリンのコンホメーションの分析において208nm(α−ヘリックス)および223nm(β−シーツ)。208nmの遠紫外のCD−帯は、主として残基B10〜B19、A2〜A6およびA13〜A19から形成されるα−ヘリックスに起因し、一方、β−構造は、223nmの遠紫外CD−帯の主たる成分である。上記試料に特徴的なCDスペクトルは、残基PheB1またはLysB29のいずれかへのインスリンへのmPEGの連結は、Zn2+−インスリンと比較して、上記結合体の全体的なコンホメーション(2次)を変化させない事を確認した。
PEG−インスリン結合体の薬力学
インスリン薬力学に対するPEG化の効果を調査した。これらの研究は、市販で入手可能なインスリン処方物(Humulin R、Lilly)と比較して、置換部位の異なるPEG−インスリン(位置異性体)またはPEGの分子量が異なるPEG−インスリンを含有する結合体処方物のインビボの生物学的活性(血清グルコースを低下させる能力)を評価するために実施した。絶食したSprague−DawleyラットにF5000、K2000、K5000、K10000またはHumulinR(登録商標)を静脈内に投与した後、血中グルコースレベルを測定した。0.3IU/kg(タンパク質濃度を基礎にし、そしてPEGの重量を適切に補正して;25IU/mgタンパク質と仮定する)を通常の生理食塩水に溶解し、尾静脈注射により投与した;1群N=6。試験試料の注射前および注射後6時間の期間、間隔をおいて採血を行なった。血清を標準的な操作方法で単離し、グルコースレベルをAccucheck Advantage(Boeringer Ingelheim)グルコースメータを用いて測定した。
代表的なPEG−インスリン結合体の物理的安定性
加速振動試験法を用いて7種のPEG−インスリン結合体(F2000、F5000、F10000、K2000、K5000、K10000およびK20000)および亜鉛インスリンの物理的安定性を調査した。この試験は加速法でインスリン調製物の物理的安定性の正確な測定を提供する文献に、通常記載されている。このアッセイのために、上記タンパク質(結合体)の水溶液を4部(1mg/mL、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.3,0.02%アジ化ナトリウム)調製し、37℃で水平振動(100/分の振動数)させた。試料を所定の時間に取り出し、ろ過し(不溶性凝集体の除去のため)、そして溶液中に残っているタンパク質(結合体)分画を、定量化するためにRP−HPLCにより分析した。図2は、各インスリン誘導体に関して、時間の関数として可溶性タンパク質の減少を示している。
代表的PEG−インスリン結合体の化学的安定性
インスリン(またはインスリンアナログ)は、水溶液中で多くの化学分解反応を受けることはよく実証されている。例えば、インスリンA鎖のC末端のアスパラギンは、酸性条件下では、環化中間体により促進される脱アミド化機構により分解する。この高い反応性環化中間体はまた、アミノ転移反応機構を介して、異なるインスリン分子からのN末端アミノ基の一つと反応して分解し得る。
IV.PEG−インスリン生分解性ポリマー徐放送達処方物の調製、性質決定および薬物動態
(実施例12)
PLGAミクロスフェアでのPEG−インスリンのカプセル化
PEG−インスリンF5000(50mg)を、1mlの塩化メチレンに溶解した。上記溶液を150mgのPLGA45:55(lac:gly)、酸末端基を持つ0.15dl/gIVを有する1ml容量の塩化メチレンに添加した。上記塩化メチレン溶液を、15mlの遠心チューブ中の1%ポリ(ビニルアルコール)を含む5mlの水に添加し、そしてボルテックスミキサーでエマルジョンを作った。上記エマルジョンを0.3%のポリ(ビニルアルコール)を含む100mlの水に添加し、塩化メチレンを蒸発させるために3時間攪拌した。上記硬化ミクロスフェアを、Whatman1番のろ紙で真空ろ過し、そして乾燥した。
PEG−インスリンPLGAミクロスフェアの性質決定
上記PEG−インスリンミクロスフェアの表面形態および粒子サイズ分布を、それぞれ、走査型電子顕微鏡およびレーザ光散乱粒子サイズ分析で調査した。ポリマーミクロスフェア内にカプセル化されたPEG−インスリン結合体の量を定量化するために、分析用逆相HPLCを用いた。HPLC分析に先立って、測定した量のミクロスフェアを、ある容量のアセトニトリルに溶解し、そしてポリマーを沈殿させ、水溶液中へ上記結合体を抽出するために、等容量の0.1%TFA水溶液を添加した。K2000、K5000、K10000、K20000およびF5000−Aもまたこの方法を用いてカプセル化した。これらの試験の結果を表1に集めたが、そこには全ミクロスフェア中のPEG−インスリン含量%(w/w)、および(カプセル化されたPEGインスリン重量/最初に添加されたPEG−インスリン重量)として定義されたカプセル化効率を挙げている。28.3%と相対的に高い薬物含量および100%までのカプセル化効率を達成し、上記生成物を、必要とされる減少した全用量により、臨床的に有用になり、かつ出発物質の低い損失で商業的にも魅力的にした。さらに、ミクロスフェアは、乳酸とグリコール酸の比率(50:50および72:25)、分子量(6.5〜24kDa)、固有粘度(0.09〜0.27dL/g)、または末端エステル基(メチルおよびラウリル)を変えたポリマーと広い範囲の薬物負荷(5〜35重量%)を用いて調製した。
動物実験で用いられたPEG−インスリンミクロスフェア処方物のインビトロ放出
15mgのF5000PEG−インスリンミクロスフェア(14.1%薬物含量、PLGA 45:55;0.15dl/gIV、酸末端基)を1.5mlのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4、0.02%アジ化ナトリウムおよび0.02%Tween20)に懸濁し、37℃でインキュベートした。上記上清を、間隔的に取り出し、放出されるPEG−インスリンをRP HPLCで分析した。上記緩衝液を、新鮮なPBSで置換し、そのインキュベーションを続けた。データをインキュベーション時間の関数として累積放出量を分析した(図4)。最初の日は、1.0%未満の上記PEG−インスリンの放出で、18日以内で、95%を超える量が放出される。約2週間を越える低い「バースト」放出、高い全放出量および持続期間は、徐放インスリン処方物の非常に所望の特徴である。
異なる生分解性ポリマーおよびF5000とを用い、ならびにK5000PEG−インスリンおよびF5000−A結合体もまた、用いる実施例12の方法で作った他の調製物もまた、1日放出値が0〜7.5%の間で、持続放出期間も60日までもあった。
F5000PEG−インスリンPLGAミクロスフェアのインビボ薬力学および薬物動態
PLGA45:55、0.15dl/gIV、酸末端基(14.1%核負荷)から構成されるミクロスフェア中のF5000PEG−インスリンを、糖尿病ラットでグルコース抑制およびF5000薬物動態の試験をした。雄性SDラット(〜250g)に、等張クエン酸緩衝液(10mM、pH4.5)に溶解した40mg/kgのストレプトゾトシン(Sigma、St.Louis、MO)を、試験試料投与する1日前に皮下投与をして糖尿病にした(Junod,Aら、J.Clin.Invest.、48:2129〜2139、1969)。動物を2.5%滅菌カルボキシメチルセルロース(CMC)または生理食塩水(陰性コントロール)に懸濁したPEG−インスリンミクロスフェア(〜11mg/ラット、体重1kgあたり3mgインスリン当量に相当する)で処置し、そして血清単離、引き続くグルコース(PD)およびF5000(PK)レベルの分析のために所定の間隔で採血した。図5および6は、13日の期間の血清グルコースレベルおよび血清PEG−インスリンレベルを示す(データは平均値±標準誤差)。図5は、予想したとおり、実験の間中、血中グルコースレベルがコントロールの糖尿病ラットに対して100%以上(測定誤差内)を示す。PEG−インスリンミクロスフェア処置糖尿病ラットに関しては、血中グルコ−スレベルは、3日後未処置レベルの60%より低いレベルに低下し、さらに7日間、抑制が持続している。
当業者は、本明細書に記載している本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を単なる慣用的実験を用いて、認識または確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含され、網羅されることが意図されている。
Claims (27)
- タンパク質−ポリマー結合体を調製する方法であって、以下の工程:
(a)インスリンタンパク質を、少なくとも1種の有機溶媒および少なくとも1種の金属キレート剤の存在下、該タンパク質と該ポリマーの結合体の形成を促進する条件下で、親水性ポリマーと接触させる工程;および
(b)該結合体を単離する工程
を包含する、方法。 - 前記インスリンタンパク質が、ヒトインスリンを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記親水性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール/ポリプロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化グリセリンならびにそれらの線状、分岐およびアミノ反応性誘導体からなる群より選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記アミノ反応性誘導体が、アルデヒド、N−ヒドロキシコハク酸イミド、PNP炭酸塩およびベンゾトリアゾール(benzotrizole)末端親水性ポリマーからなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 前記親水性ポリマーおよびインスリンタンパク質が、モル比で約10:1〜1:1で接触させられる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、エタノール、メタノール,DMSO、ジオキサン、DMFおよびNMPからなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒が、約0.1〜10%の濃度で存在する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、約0.1〜5.0%のタンパク質濃度で接触させられる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、pHが約5.0〜7.5で接触させられる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が、多価金属イオンキレート剤、EDTA、デフェロキサミン(DEF)、ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)およびエチレングリコールビス(2−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)からなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記キレート剤が、約0.1〜10mMの濃度で存在する、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記インスリンタンパク質および親水性ポリマーが、約4〜50℃の温度で接触させられる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記結合体を単離する前に、該結合体の形成をクエンチする工程をさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチングが、該pHを約1〜4に低下させることにより達成される、請求項13に記載の方法。
- 前記単離が、クロマトグラフィーにより達成される、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーが、イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記結合体を、生分解性ポリマーでカプセル化する工程をさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
- インスリン−PEG結合体の調製方法であって、以下の工程:
(a)インスリンを、少なくとも1種の有機溶媒および少なくとも1種の金属キレート剤の存在下、該インスリンとPEGとの結合体の形成を促進する条件下で、PEGと接触させる工程;および
(b)該結合体を単離する工程
を包含する、方法。 - 前記インスリンが、ヒトインスリンを含む、請求項18に記載の方法。
- 前記PEGが、アルデヒド、N−ヒドロキシコハク酸イミド、PNP炭酸塩およびベンゾトリアゾール末端親水性ポリマーからなる群より選択されるアミノ反応性PEG誘導体を含む、請求項18または19に記載の方法。
- 前記PEGおよびインスリンが、モル比で約10:1〜1:1で接触させられる、請求項18〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PEGおよびインスリンが、約0.1〜5.0%のタンパク質濃度で接触させられる、請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記PEGおよびインスリンが、pHが約5.0〜7.5で接触させられる、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、前記結合体を単離する前に、該結合体の形成をクエンチする工程をさらに含む、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチングが、該pHを約1〜4に低下させることにより達成される、請求項24に記載の方法。
- 前記単離が、イオン交換クロマトグラフィーにより達成される、請求項18〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記結合体を、生分解性ポリマーでカプセル化する工程をさらに含む、請求項18〜26のいずれか1項に記載の方法。
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