JP2017536387A - 疎水性が高められたタンパク質及びタンパク質コンジュゲート - Google Patents

Abstract

実施例には、疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を作製する方法が含まれうる。該方法は、タンパク質水溶液を提供することを含みうる。このタンパク質水溶液は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうる。該方法はさらに、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含みうる。該方法は、有機相中で疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化することをさらに含みうる。そのプロトン化は、疎水性−ＰＥＧコンジュゲート塩を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を形成することができる。

Description

本発明は、疎水性が高められたタンパク質及びタンパク質コンジュゲートに関する。

薬物、ホルモン、タンパク質、又はその他の医学的に活性な作用薬の患者への送達には、いくつかの課題がある。医学的に活性な作用薬は、患者の体内に送達されなければならない。２つのそのような方法は経口摂取及び注射である。経口摂取では、薬物は、血流又は治療の対象領域に到達する前に患者の消化器系を通り抜けることが必要となる。注射は、医学的に活性な作用薬が血流又は治療の対象領域に迅速に又は直接的に到達することを可能にするが、患者にとって注射は不便又は苦痛となりうる。体内に入ると、医学的に活性な作用薬の、時間の関数としての濃度は、医学的に活性な作用薬の種類、医学的に活性な作用薬への種々の官能基若しくは分子の結合、医学的に活性な作用薬のカプセル化、又はその他の要因に応じて変化しうる。医学的に活性な作用薬の濃度が閾値よりも下に低下すると、その医学的に活性な作用薬は再度投与されることが必要となる。多くの医学的に活性な作用薬は、１日に数回など、頻繁に投与される必要がある。より高頻度な投与スケジュールであるほど、患者の不便さを増大させ、患者による服薬順守率を低下させ、かつ患者にとって決して最適でない転帰をもたらす可能性がある。医学的に活性な作用薬が注射によって投与される場合、新たな別の注射は、疼痛の頻度、感染の危険、及び患者における免疫応答の可能性を増大させる。

よって、患者における優れた濃度プロファイルを有する医学的に活性な作用薬が必要とされている。本明細書中に記載された方法及び組成物は、上記及びその他の必要性に対する解決策を提供する。

医学的に活性な作用薬は、脂肪鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、疎水性アニオン、又はその他の化合物に結合される場合がある。ポリエチレングリコールの結合は、医学的に活性な作用薬に分子量を追加しうるし、かつ医学的に活性な作用薬の半減期を長くすることができる。加えて、より小さなＰＥＧ分子を含むポリエチレングリコール、又は疎水性アニオンを医学的に活性な作用薬に結合させると、医学的に活性な作用薬の疎水性を高める可能性があり、かつ医学的に活性な作用薬を両親媒性にする場合がある。その医学的に活性な作用薬は、生分解性ポリマーと共に有機溶媒中により容易に溶解されうる。生分解性ポリマーは、医学的に活性な作用薬をミクロスフェアにカプセル化することができる。医学的に活性な作用薬のカプセル化は、医学的に活性な作用薬の半減期を長くする可能性がある。本明細書中に記載された製剤は、医学的に活性な作用薬を長期にわたって徐々にかつ一様に放出することができる。この放出プロファイルは、添加剤の必要を伴うことなく、意図された治療期間にわたって持続的かつほぼピークのないタンパク質レベルをもたらしうる。結果として生じる、患者における医学的に活性な作用薬の濃度プロファイルは、患者においてより最適な臨床結果をもたらしうる。本明細書中に記載された製剤は、患者に対して月に１度程度の低頻度で投与することができる。これらの製剤を製造する方法は、効率的、高生産性、又はさほど高費用でないものとなりうる。

実施例には、疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を作製する方法が含まれうる。該方法は、タンパク質水溶液を提供することを含みうる。このタンパク質水溶液は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうる。該方法はさらに、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することを含みうる。該方法は、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化することをさらに含みうる。このプロトン化は有機相において行われるであろう。このプロトン化により、疎水性−ＰＥＧコンジュゲート塩を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。

実施例には、疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを作製する方法が含まれうる。該方法は、タンパク質水溶液であってタンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうるタンパク質水溶液を提供することを含みうる。該方法は、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することをさらに含みうる。このタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは該タンパク質よりも高い疎水性を有しうる。

実施例には、疎水性が高められたタンパク質塩を作製する方法が含まれうる。該方法は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含むタンパク質水溶液を提供することを含みうる。該方法は、疎水性有機酸を用いて該タンパク質上の少なくとも１つのアミノ基をプロトン化することをさらに含みうる。このプロトン化により、タンパク質塩の疎水性を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質塩が形成されうる。

実施例において、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含有する制御放出型ミクロスフェアを作製する方法は、タンパク質水溶液を提供することを含みうる。このタンパク質水溶液は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうる。該方法は、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成することをさらに含みうる。加えて、該方法は、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化することを含みうる。このプロトン化により、疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。更に、該方法は、有機溶媒中のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を生分解性ポリマーと混合することを含みうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の疎水性アニオンは、有機溶媒中におけるこの塩の溶解度を増大させることができる。該方法はさらに、水溶液中でタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩と生分解性ポリマーとの混合物を乳化することも含みうる。加えて、該方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩及び生分解性ポリマーの乳化混合物を硬化して制御放出型ミクロスフェアとすることを含みうる。

実施例にはミクロスフェアが含まれうる。該組成物は生分解性ポリマーを含みうる。更に、ミクロスフェアは、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートと有機酸の疎水性アニオン、タンパク質と有機酸の疎水性アニオン、及びこれらの組合せからなる群から選択されたタンパク質混合物を含みうる。

実施例にはさらに、生分解性ポリマー、有機溶媒、及びタンパク質混合物を含みうる組成物が含まれうる。タンパク質混合物は、タンパク質、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート、有機酸の疎水性アニオン、又はこれらの組合せを含みうる。組成物は溶液であってもよいし懸濁液であってもよい。

実施例において、方法は、生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製することを含みうる。該方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを提供することを含みうる。該タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含まないであろう。方法はさらに、生分解性ポリマー、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、疎水性有機酸、及び有機溶媒を混合して混合物とすることを含みうる。方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートと疎水性有機酸のアニオンとを含みうるタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を形成することを含みうる。加えて、方法は、混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成することを含みうる。

いくつかの実施例は、生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法を含みうる。該方法は、生分解性ポリマーを有機溶媒に溶解して混合物を形成することを含みうる。該方法はさらに、該混合物にタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び疎水性有機酸を添加することを含みうる。該方法は、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化することをさらに含みうる。このプロトン化により、疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。更に、該方法は、混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成することを含みうる。

本明細書中に記載された実施例は優れた濃度プロファイルを提供するであろう。タンパク質はＰＥＧ化及びカプセル化の後もその活性を保持しうる。タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｓｉｔｕのうち少なくともいずれかにおいて低いバースト放出を有しうる。放出濃度はほぼゼロ次の動態プロファイルを有し、該放出濃度は、時間、又はミクロスフェア中に残された医学的に活性な作用薬の濃度によって、ほとんど変わらない。タンパク質は、患者に投与された場合にミクロスフェアから本質的に完全に放出されうる。

本発明の技術について添付の図面と併せて説明する。

実施例に従って疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を作製する方法のブロック図。 実施例に従ってタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを作製する方法のブロック図。 実施例に従って疎水性が高められたタンパク質塩を作製する方法を示す図。 実施例に従ってタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含有する制御放出型ミクロスフェアを作製する方法のブロック図。 実施例に従って生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法のブロック図。 実施例に従って生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法のブロック図。 医学的に活性な作用薬が充填されたＰＬＧＡミクロスフェアの光学顕微鏡像を示す図。 医学的に活性な作用薬が充填されたＰＬＧＡミクロスフェアの光学顕微鏡像を示す図。 実施例によるミクロスフェアに関する徐放性研究の結果を示すグラフ。 実施例によるミクロスフェアに関する徐放性研究の結果を示すグラフ。 実施例によるミクロスフェア投薬後のラット血漿試料中のＧＬＰ−１の薬物動態学的分析を示す図。 実施例によるミクロスフェア投薬後のラット血漿試料中のインスリンの薬物動態学的分析を示す図。

詳細な説明
患者に投与されることが必要とされうる医学的に活性な作用薬には、薬物、ホルモン、及びタンパク質が挙げられる。１つのそのようなタンパク質はヒト成長ホルモンである。１９１アミノ酸のペプチドであるヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、細胞増殖及び再生を促進するホルモンである。ｈＧＨは、成長障害及び成長不全を治療するために使用されうる。例えば、ｈＧＨは小児における低身長又は成人における成長ホルモン欠損症を治療するために使用されうる。ｈＧＨを投与する従来の方法には、毎日の皮下注射が挙げられる。ある研究（ローゼンフェルト アール．ジー．（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｒ．Ｇ．）、バッカー ビー．（Ｂａｋｋｅｒ Ｂ．）、「成長ホルモン療法を受けている小児及び成人患者における治療順守率及び治療継続率（Ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｉｎ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ａｎｄ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ．）」、エンドクライン・プラクティス（Ｅｎｄｏｃｒ． Ｐｒａｃｔ．）、２００８年、第１４巻、第２号、ｐ．１４３−１５４）からは、ほとんどの患者が自身のｈＧＨ治療について時々しかコンプライアンスを守っていないか又は全く守っていないということが示されている。

医学的に活性な作用薬として使用されうる別のタンパク質は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）である。３１アミノ酸のペプチドであるＧＬＰ−１は、血中グルコース値を低下させることが可能なホルモンであるインクレチンである。ＧＬＰ−１は、インスリン放出を刺激すること及びグルカゴン放出を阻害することにより、血中グルコースに影響を及ぼすことができる。ＧＬＰ−１はさらに、胃排出能の低減により血流中への栄養素の吸収速度を遅らせること、及び食物摂取量を直接低減することもできる。ＧＬＰ−１がグルコース値に影響を及ぼす能力から、ＧＬＰ−１は２型糖尿病及びその他の病気のための潜在的な治療法とされてきた。ＧＬＰ−１は、未修飾の状態ではタンパク質分解の結果として２分未満のｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有する。ＧＬＰ−１受容体アゴニストによる治療法は、副作用を最小限にし、有効性を増大させ、かつ効果の期間を延長することにより、改善される可能性がある。

糖尿病及びその他の病気の従来の治療法は副作用をもたらす可能性がある。そのような副作用には、低血糖症、体重増加、免疫応答、膵臓炎、甲状腺がんのリスク増大、悪心、又は治療剤の注射に関係する疼痛が含まれうる。加えて、従来の治療法は糖尿病患者における目標血糖の達成に失敗する場合もある。ある種の製剤は患者に対してタンパク質の不均一な投与をもたらしうるが、これには薬物の初期バーストが含まれうる。タンパク質を投与可能な治療剤へと製剤化するプロセスは、変性又は凝集をもたらす場合もある。有効な製剤を製造する方法は、コストが高いか又は収率が低い可能性がある。

ｈＧＨ及びＧＬＰ−１と同様に、エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））は、患者に投与された時に課題に直面しうる医学的に活性な作用薬である。エンフビルチドは、ＨＩＶ及びＡＩＤＳを治療する助けとなりうる。しかしながら、エンフビルチドは１日に２回皮下注射されることが必要となる場合がある。注射剤は皮膚の過敏反応の副作用をもたらす場合があり、これは患者がエンフビルチドの使用を継続する意欲を失わせる可能性がある。投与がそれほど高頻度でないか又は期間があまり長くないエンフビルチド治療は、患者のコンプライアンスを高め、コストを下げ、かつＨＩＶ及びＡＩＤＳの患者の生活の質を高めるために、必要であると考えられる。

別の医学的に活性な作用薬は副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又はＰＴＨのフラグメントである。ＰＴＨは同化性の（骨形成性の）作用薬である。ＰＴＨは副甲状腺によって分子量９，４２５Ｄａの８４アミノ酸を含有するポリペプチドとして分泌されうる。最初の３４アミノ酸は、ミネラルホメオスタシスについての生物学的に活性な部分であろう。合成の短縮型のＰＴＨはＦｏｒｔｅｏ（登録商標）テリパラチドとしてリリー社（Ｌｉｌｌｙ）により販売されている。ＰＴＨ又はＰＴＨのフラグメントは骨粗鬆症を治療するために使用されうる。テリパラチドは、コストが高くかつ毎日の注射が必要である結果として、他の治療の後に使用されることが多いであろう。その他の医学的に活性な作用薬と同様に、投与がそれほど高頻度でないか又は期間があまり長くないＰＴＨ治療が望まれていると考えられる。

未修飾タンパク質は、所望の濃度プロファイル及びその他の好都合な特性を有しない場合がある。分子にポリエチレングリコールを結合させるプロセスであるＰＥＧ化はペプチド及びタンパク質の投与を助け、このことは薬理学的性質の改善及び有効性の増大をもたらしうる。ＰＥＧはエチレングリコールのサブユニットで構成される線状ポリマーであり、水及び数多くの有機溶媒の両方に可溶性である。ＰＥＧは柔軟性を有し、生体適合性であり、かつ無毒である。ＰＥＧの性質の結果として、ＰＥＧ化はタンパク質又はペプチドの半減期及び／又は溶解度を増大させうる。ＰＥＧはモノメトキシ基に結合させることができる。ＰＥＧは、メトキシポリエチレングリコールアルデヒドなどのポリエチレングリコールアルデヒドであってもよい。

医学的に活性な作用薬の濃度プロファイルを変化させる別の方法は、生分解性材料の中に医学的に活性な作用薬をカプセル化することであろう。該材料が患者の体中で徐々に分解するにつれて、医学的に活性な作用薬は徐々に放出されうる。医学的に活性な作用薬をカプセル化するプロセスは有機溶媒を含む場合がある。医学的に活性な作用薬は、親水性であって有機溶媒には不溶性である場合がある。カプセル化を促進するために、医学的に活性な作用薬の疎水性を増大させる場合がある。

医学的に活性な作用薬の疎水性を増大させるために、医学的に活性な作用薬がＰＥＧ化される場合がある。すべての医学的に活性な作用薬が、ＰＥＧ化された時に溶解度が上昇しかつ該作用薬の生物学的活性を保持するとは限らないであろう。例えば、小さなＰＥＧ分子はタンパク質の溶解度を高めるには十分ではない場合がある。より長い鎖状ＰＥＧ分子を付加することによりいずれはタンパク質の疎水性及び溶解度を増大させうるかもしれないが、これらのより長い鎖はタンパク質に比べて大きすぎてタンパク質の生物学的活性を損なう可能性がある。一例として、ｈＧＨを用いたＰＥＧ化の増大は、ｈＧＨ受容体に対するｈＧＨの親和性を直線的に低減することが見出された（クラーク・アール（Ｃｌａｒｋ Ｒ．）ら、「ポリエチレングリコールとのコンジュゲーションにより生成された長時間作用性の成長ホルモン（Ｌｏｎｇ−ａｃｔｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９６年、第２１７巻、ｐ．２１９６９−２１９７７）。加えて、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）のＰＥＧ化は、ＰＥＧ化の部位及びＰＥＧ分子の大きさに応じてｉｎ ｖｉｔｒｏでの比活性を低下させる場合がある（グレース・エム・ジェイ（Ｇｒａｃｅ Ｍ．Ｊ．）ら、「ｐｅｇ化の部位及びポリエチレングリコール分子の大きさはＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を通じたインターフェロン−αの抗ウイルス活性及び抗増殖活性を減弱化する（Ｓｉｔｅ ｏｆ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｉｚｅ ａｔｔｅｎｕａｔｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｄ ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ＪＡＫ／ＳＴＡＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ）」、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２００５年、第２８０巻、ｐ．６３２７−６３３６）。更に、ＰＥＧ化は溶解度を増大させない場合もある。例えば、２，０００ダルトンの小さなＰＥＧ分子を用いたＰＥＧ−インスリンコンジュゲートは、有機溶媒に十分に可溶性ではない場合がある。別例として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）のＰＥＧ化は、Ｇ−ＣＳＦの凝集を増大させ、かつ溶解度を低下させることが発見された（ベロネーゼ・エフ・エム（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ Ｆ．Ｍ．）ら、「可逆的変性によるＧ−ＣＳＦの部位特異的ｐｅｇ化（Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇ−ＣＳＦ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）」、バイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ．）、２００７年、第１８巻、第６号、ｐ．１８２４−３０）。

別例として、疎水性は、医学的に活性な作用薬に疎水性イオンを結合させることにより増大させうる。ＰＥＧ化と同様に、医学的に活性な作用薬への疎水性アニオンの結合は必ずしもすべての医学的に活性な作用薬の疎水性を増大させるわけではない。タンパク質は、疎水性アニオンと対になるのに十分な正に荷電した部位を、有しないか又は形成しない場合がある。よって、タンパク質に結合させるアニオンの数、及びさらには疎水性の増大も、制限されるであろう。例えば、血清アルブミンのような酸性タンパク質は塩基性アミノ酸よりも多くの酸性アミノ酸を含有しうる。そのような酸性タンパク質は、疎水性の酸によって容易にはプロトン化されない場合がある。

医学的に活性な作用薬に対するＰＥＧ化及び疎水性イオンの結合の組合せは、医学的に活性な作用薬の疎水性が、ＰＥＧ化のみ、及び疎水性イオンの結合のみに起因する疎水性の増大の合計から期待されうるよりも、組合せを用いると一層増大するという相乗効果的な結果を生じるかもしれない。タンパク質は、該タンパク質がタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩にされた場合に、患者において優れた転帰を達成する可能性がある。

図１に示されるように、本発明の技術の実施例には、疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を作製する方法１００が含まれうる。該方法は、タンパク質水溶液を提供するステップ１０２を含みうる。このタンパク質水溶液は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうる。ｐＨ緩衝剤には、リン酸の無機塩類が含まれうる。

タンパク質は、実施例に応じて、３，０００ダルトン以上、３，０００ダルトン〜１０，０００ダルトン、１０，０００ダルトン以上、１０，０００ダルトン〜１５，０００ダルトン、１５，０００ダルトン以上、１５，０００ダルトン〜２０，０００ダルトン、又は２０，０００ダルトン以上の分子量を有しうる。上記又はその他の実施例において、タンパク質は、３０個以上のアミノ酸単位、３０個のアミノ酸単位〜１００個のアミノ酸単位、１００個以上のアミノ酸単位、１００個のアミノ酸単位〜１５０個のアミノ酸単位、又は１５０個以上のアミノ酸単位を含みうる。タンパク質としては、例ではヒト成長ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、インスリン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンフラグメント、エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標））、又はオクトレオチド（Ｓａｎｄｏｓｔａｔｉｎ（登録商標））が挙げられる。ＧＬＰ−１は天然抽出物であってもよいし合成物であってもよい。タンパク質は、ＧＬＰ−１のアナログ又は誘導体を含みうる。タンパク質の組合せが水溶液中に含められてもよい。例えば、ＧＬＰ−１及びインスリンの両方が水溶液中に含められてもよい。

方法１００は、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップ１０４を含みうる。ＰＥＧとタンパク質との反応は、該タンパク質のＮ末端においてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成しうる。

ポリエチレングリコールとタンパク質との反応が特定のシステイン部位にＰＥＧを備えたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成する場合もあれば、該反応が特定のシステイン部位にＰＥＧを備えたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを全く又はほとんど生じない場合もある。ＰＥＧとタンパク質との反応は、ＰＥＧとタンパク質との間に少なくとも１つのアミン結合、アミド結合、エステル結合、又はジスルフィド結合を形成することを含みうる。該反応から、任意の結合又は結合群の形成が除外される場合もある。結合は、ＰＥＧポリマーの末端の反応性基を用いて形成されてもよい。

ポリエチレングリコールとタンパク質との反応には、タンパク質のシステイン残基にチオール反応性のＰＥＧを結合させることが含まれうる。チオール反応性のＰＥＧは種々の反応性基を含みうるが、該反応性基にはマレイミド及びビニルスルホンが含まれうる。チオール反応性のＰＥＧは２〜４０ｋＤａの分子量を有しうる。チオール反応性のＰＥＧを用いたＰＥＧ化反応は中性のｐＨにおけるものであってよい。いくつかのタンパク質中のシステイン残基は、ジスルフィド結合には参加しうるが誘導体化には利用できない場合がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの部位特異的突然変異誘発技法によって、追加のシステイン残基をタンパク質上の任意の特定部位に導入することが可能である。追加のシステイン残基はＰＥＧ分子の結合のための部位としての役割を果たしうる。これらの追加のシステイン残基を使用することにより、無作為なアミンＰＥＧ化反応から生じうる生成物の不均質性及び活性の喪失を回避しうる。

上記又はその他の実施例において、ポリエチレングリコールは５，０００ダルトン以下又は２，０００ダルトン以下の分子量を有しうる。より大きなポリエチレングリコールはタンパク質の半減期を延長させうる。より小さなポリエチレングリコールは、長い半減期を伴うことなくタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの溶解度を増大させうる。例えば、分子量が２，０００ダルトンのポリエチレングリコールは１時間未満の半減期を有しうる。より小さなポリエチレングリコールすなわちＰＥＧは、所望される半減期延長のほとんどを達成するタンパク質のカプセル化と併せて、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの溶解度を増大させるために使用されうる。方法１００は、ポリエチレングリコールエステルをタンパク質と反応させるステップを含まない。ポリエチレングリコールは第一級アミンに対する選択性を有しうるのに対し、ポリエチレングリコールエステルは他の官能基及びアミノ酸と反応しうる。

方法１００はさらに、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートのアミノ基をプロトン化するステップ１０６を含みうる。アミノ基のプロトン化は、有機相では生じるが水相では生じないであろう。疎水性有機酸とタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートとのモル比は、実施例に応じて、１：１〜１１：１、１：１〜５：１、５：１〜１１：１、１：１〜２：１、又は３：１〜８：１の範囲であってよい。このプロトン化により、疎水性−ＰＥＧコンジュゲート塩を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩にはモノＰＥＧ化塩が含まれうる。疎水性有機酸には、パモ酸、水素ドクサート、フロ酸、又はこれらの混合物が含まれうる。有機酸には、カルボン酸、スルホン酸、アルコール、又はチオール基を備えた有機化合物が含まれうる。疎水性有機酸からは、任意の記載された酸又は任意の記載された酸群が除外される場合もある。

疎水性アニオンには、疎水性有機酸に関連したアニオンが含まれうる。例えば、疎水性アニオンには、パモエートアニオン、ドクサートアニオン、又はフロアートアニオンが含まれうる。上記又は他の実施例において、疎水性アニオンは、脂肪酸アニオン、リン脂質アニオン、ポリスチレンスルホン酸アニオン、又はこれらの混合物であってよい。リン脂質アニオンのリン脂質には、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスホコリン、又はこれらの混合物が含まれうる。疎水性アニオンからは、任意の記載されたアニオン又は任意の記載されたアニオン群が除外される場合もある。疎水性アニオンはタンパク質上の特定の側鎖に結合する場合もあれば、タンパク質上の多数の側鎖に結合する場合もある。疎水性アニオンは１を超えるｌｏｇＰを有しうる。ｌｏｇＰとは水・オクタノール分配係数であり、水中のタンパク質塩の濃度に対するオクタノール中のタンパク質塩の濃度の対数として定義することができる。ｌｏｇＰが１を超えると、水中よりも１０倍大きいオクタノール中濃度を生じることになろう。水・オクタノール分配係数は、分子それ自体が両親媒性でありうる場合に、該分子が疎水相に分配される能力について、種々の分子を比較するのに有用となりうる。方法にはさらに、負に荷電したペプチドの電荷を打ち消して疎水性を増大させうる、ドデシルアミン塩酸塩又はセチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）のようなカチオン性洗浄剤を添加することも含まれうる。

図２に例証されるように、実施例には、疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを作製する方法２００が含まれうる。方法２００は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうるタンパク質水溶液を提供するステップ２０２を含みうる。タンパク質は先述された任意のタンパク質であってよい。タンパク質水溶液及びｐＨ緩衝剤は、本明細書中に記載された任意のタンパク質水溶液又はｐＨ緩衝剤であってよい。

方法２００は、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップ２０４をさらに含みうる。ポリエチレングリコールは本明細書中に記載された任意の分子量を有しうる。タンパク質は本明細書中に記載された任意のタンパク質であってよい。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの形成における反応は、本明細書中に記載された任意の方式で進行しうる。方法２００は、疎水性有機酸を用いてタンパク質上のアミノ基をプロトン化するステップを除外することができる。方法２００はタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を生じない。

実施例には、図３に示されるように、疎水性が高められたタンパク質塩を作製する方法３００が含まれうる。方法３００は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含んだタンパク質水溶液を提供するステップ３０２を含みうる。該タンパク質は水から分離されうる。方法３００は、疎水性有機酸を用いてタンパク質上のアミノ基をプロトン化するステップ３０４をさらに含みうる。アミノ基のプロトン化は、有機相において、かつ水の非存在下で生じうる。このプロトン化により、タンパク質塩の疎水性を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質塩が形成されうる。方法３００は、タンパク質水溶液にポリエチレングリコールを導入するステップは含まない。方法３００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート又はタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を生じない。タンパク質水溶液、タンパク質、ｐＨ緩衝剤、疎水性有機酸、及び疎水性アニオンは、先述された化合物のうち任意のものであってよい。

図４に示された実施例におけるように、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含有する制御放出型ミクロスフェアを作製する方法４００は、タンパク質水溶液を提供するステップ４０２を含みうる。該タンパク質水溶液は、タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含みうる。タンパク質には、先述された任意のタンパク質が挙げられる。方法４００は、ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップ４０４をさらに含みうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートが形成された後、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは水から分離されうる。その後、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは有機溶媒に溶解されうる。

加えて、方法４００は、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上の少なくとも１つのアミノ基をプロトン化するステップ４０６を含みうる。疎水性有機酸は、有機相には添加できるが、水相には添加できない。同様に、アミノ基のプロトン化は、有機相において、かつ水の非存在下で生じうる。このプロトン化により、疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。疎水性有機酸には本明細書中に記載された任意の酸が挙げられ、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩は本明細書中に記載された任意のコンジュゲート塩であってよい。

更に、方法４００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を生分解性ポリマーと共に有機溶媒中に混合するステップ４０８を含みうる。該有機溶媒は水相と非混和性であってよい。有機溶媒には、塩化メチレン、安息香酸ベンジル、ジクロロメタン、クロロホルム、エチルエーテル、酢酸エチル、酢酸イソプロピルエステル（酢酸イソプロピル）、酢酸ｓｅｃ−ブチルエステル、アセトフェノン、酢酸ｎ−アミル、アニリン、ベンズアルデヒド、ベンゼン、ベンゾフェノン、ベンジルアルコール、ベンジルアミン、ブロモベンゼン、ブロモホルム、酢酸ｎ−ブチル、酪酸メチルエステル、カプロン酸、二硫化炭素、四塩化炭素、ｏ−クロロアニリン、クロロベンゼン、１−クロロブタン、クロロメタン、ｍ−クロロフェノール、ｍ−クレゾール、ｏ−クレゾール、シアノエタン、シアノプロパン、シクロヘキサノール、シクロヘキサノン、１，２−ジブロモエタン、ジブロモメタン、ジブチルアミン、ｍ−ジクロロベンゼン、ｏ−ジクロロベンゼン、１，１−ジクロロエタン、１，２−ジクロロエタン、ジクロロフルオロメタン、炭酸ジエチル、マロン酸ジエチル、硫化ジエチル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、ジイソブチルケトン、ジイソプロピルスルフィド、フタル酸ジメチル、硫酸ジメチル、硫化ジメチル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、エナント酸、アセト酢酸エチル、安息香酸エチル、プロピオン酸エチル、エチルベンゼン、エチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、ｅｘｘａｔｅ６００、ｅｘｘａｔｅ８００、ｅｘｘａｔｅ９００、フルオロベンゼン、フラン、ヘキサメチルホスホルアミド、１−ヘキサノール、酢酸ｎ−ヘキシル、イソアミルアルコール（３−メチル−１−ブタノール）、酢酸イソブチル、メトキシベンゼン、メチルアミルケトン、安息香酸メチル、ギ酸メチル、メチルイソアミルケトン、メチルイソブテニルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルｎ−ブチルケトン、メチルプロピルケトン、４−メチル−２−ペンタノール、Ｎ−メチルアニリン、ニトロベンゼン、ニトロエタン、１−ニトロプロパン、２−ニトロプロパン、１−オクタノール、２−オクタノール、１−ペンタノール、３−ペンタノン、２−フェニルエタノール、酢酸ｎ−プロピル、キノリン、スチレン、１，１，２，２−テトラクロロエタン、１，１，２，２−テトラクロロエチレン、トルエン、１，１，１−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエタン、１，１，２−トリクロロエチレン、トリフルオロメタン、吉草酸、ｍ−キシレン、ｏ−キシレン、ｐ−キシレン、２，４−キシレノール、又はこれらの混合物が挙げられる。有機溶媒からは、任意の溶媒又は任意の溶媒群が除外される場合もある。

方法には、溶媒の混合物が含まれうる。溶媒の混合物は水に混和性の溶媒を含みうるが、ただし溶媒の混合物は水に非混和性であってもよい。例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、又はこれらの混合物のような水に混和性の溶媒が、水に非混和性の溶媒に添加されてもよい。

生分解性ポリマーには、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリエステルとポリエーテルの共重合体、又はポリラクチドとポリエチレングリコールの共重合体が挙げられる。生分解性ポリマーから、これらのポリマー又はこれらのポリマー群のうち任意のものが除外される場合もある。生分解性ポリマーの分子量は、所望の薬物動態学的プロファイルを生じるためにＰＥＧの大きさに応じて調整されうる。

ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）は、実施例において、５，０００Ｄａ〜７，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ〜１７，０００Ｄａ、１７，０００Ｄａ〜２０，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ〜２４，０００Ｄａ、２４，０００Ｄａ〜３８，０００Ｄａ、３８，０００Ｄａ〜４０，０００Ｄａ、又は４０，０００Ｄａ〜５０，０００Ｄａの分子量を有しうる。ＰＬＧＡは、５０：５０又は７５：２５のラクチド対グリコリド比率を有しうる。いくつかの実施例において、ＰＬＧＡは、４０：６０〜５０：５０、５０：５０〜６０：４０、６０：４０〜７０：３０、７０：３０〜７５：２５、又は７５：２５〜９０：１０の範囲のラクチド対グリコリド比率を有しうる。ラクチド対グリコリド比率は、５０：５０未満若しくは５０：５０、６０：４０未満若しくは６０：４０、又は７５：２５未満若しくは７５：２５であってよく、ここで未満とはラクチドがグリコリドと比較してより少ない割合であることを指す。有機酸の疎水性アニオンは、いくつかのＰＬＧＡの放出特性を改善するが他のＰＬＧＡについては改善しないかもしれない。

考えられるＰＬＧＡには、ＰＬＧＡ５０２、ＰＬＧＡ５０３、ＰＬＧＡ７５２、及びＰＬＧＡ７５３が含まれうる。ＰＬＧＡ５０２は、５０：５０のラクチド対グリコリド比率、０．１６〜０．２４ｄＬ／ｇの固有粘度、及び７，０００〜１７，０００Ｄａの分子量を備えたポリマーであろう。ＰＬＧＡ５０３は、５０：５０のラクチド対グリコリド比率、０．３２〜０．４４ｄＬ／ｇの固有粘度、及び２４，０００〜３８，０００Ｄａの分子量を備えたポリマーであろう。ＰＬＧＡ７５２は、７５：２５のラクチド対グリコリド比率、０．１４〜０．２２ｄＬ／ｇの固有粘度、及び４，０００〜１５，０００Ｄａの分子量を備えたポリマーであろう。ＰＬＧＡ７５３は、７５：２５のラクチド対グリコリド比率、０．３２〜０．４４ｄＬ／ｇの固有粘度、及び２４，０００〜３８，０００Ｄａの分子量を備えたポリマーであろう。ＰＬＧＡポリマーはさらに、酸末端基がキャッピングされていてもよいしエステル末端基がキャッピングされていてもよい。

タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の疎水性アニオンは、この塩の有機溶媒における溶解度を増大させうる。方法４００はさらに、水溶液中で、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩及び生分解性ポリマーの混合物を乳化するステップ４１０を含みうる。加えて、方法４００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩及び生分解性ポリマーの乳化混合物を硬化して制御放出型ミクロスフェアとするステップ４１２を含みうる。該ミクロスフェアは、有機酸の疎水性アニオンを含みうる。有機酸が有機相の代わりに水相に添加された場合、有機酸及び有機酸由来のいかなるアニオンもミクロスフェアに含まれないか、又はミクロスフェア中には著しく低い濃度でしか含まれないと考えられる。

制御放出型ミクロスフェアを作製する方法は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の代わりに、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート又はタンパク質塩を含んでもよい。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート又はタンパク質塩は、本明細書中に記載された任意の方法によって作製されうる。

実施例には、生分解性ポリマーを含んだミクロスフェアが含まれうる。ミクロスフェアは、１ｍｍ未満の直径を有しうる。例えば、ミクロスフェアは、１０〜２０μｍ、２０〜３０μｍ、３０〜４０μｍ、４０〜５０μｍ、５０〜６０μｍ、６０〜７０μｍ、７０〜８０μｍ、８０〜９０μｍ、又は９０〜１００μｍの直径を有しうる。加えて、複数のミクロスフェアが、本明細書中に記載された範囲のうち１つの範囲内にミクロスフェア直径が収まるような分布を有していてもよい。直径は、その分布の平均値、メジアン（Ｄ５０）、１０パーセンタイル（Ｄ１０）、又は９０パーセンタイル（Ｄ９０）によって特徴付けられうる。大きすぎるミクロスフェアは個体の治療のためにシリンジを用いて注射できない。加えて、大きすぎるミクロスフェアはさらに、医学的に活性な作用薬の放出を遅延させるかもしれない。他方、直径が小さすぎる場合、ミクロスフェアは、処理過程、篩過、及び／又はスクリーニングの間に失われる可能性がある。

ミクロスフェアは、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート、タンパク質、及び有機酸の疎水性アニオン、又はこれらの混合物をさらに含みうる。ミクロスフェアからは、タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート又は有機酸の疎水性アニオンが除外される場合もある。タンパク質は本明細書中に記載された任意のタンパク質であってよい。該組成物は、タンパク質の組合せを含んでもよい。例えば、該組成物はＧＬＰ−１及びインスリンを含みうる。ＧＬＰ−１及びインスリンはタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの一部としてミクロスフェア中に存在してもよい。プレミックスという用語は、タンパク質又はタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートの組合せを含んだミクロスフェアを指すことができる。別例として、実施例にはポストミックスが含まれてもよく、ポストミックスとは、ミクロスフェアの混合物であって、各々のミクロスフェアは医学的に活性な作用薬を１つしか含有していないが、医学的に活性な作用薬の組合せがミクロスフェアの混合物中に含まれうるものを指す。有機酸及び有機酸の疎水性アニオンは、先述された任意の化合物であってよい。

組成物は生分解性ポリマーを含んでもよく、かつミクロスフェアとして提供されてもよい。ミクロスフェアは、最初に水溶液及び非混和性の溶液からエマルションを生成することにより準備され、続いて溶媒抽出及び乾燥が行われうる。エマルションは、静的混合、動的混合、又は充填床型乳化装置によって生成されうる。

生分解性ポリマーを含んだ組成物は有機溶媒中の溶液又は懸濁液であってよい。これらの溶液は人体に送達されうるが、送達の間に、有機溶媒は体液中に溶解する場合があり、生分解性ポリマーを含む組成物を沈殿させる可能性がある。有機溶媒は水と混和性であってよく、かつ該溶媒は患者に注射できるように毒性でないものとする。加えて、溶液を形成するためには、ＰＥＧ化タンパク質、有機酸、及び生分解性ポリマーは有機溶媒に溶解されなくてはならない。懸濁液については、ＰＥＧ化タンパク質、有機酸、及び生分解性ポリマーのうち少なくとも１つが、その有機溶媒に完全には可溶でないはずである。有機溶媒の例には、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、安息香酸エチル、安息香酸ベンジル、トリアセチン、ＰＥＧ４００、及びこれらの混合物が挙げられる。組成物からは、任意の有機溶媒又は有機溶媒群が除外される場合もある。本発明の技術の例には、有機溶媒を含んだ溶液中の生分解性ポリマーを用いて組成物を作製する方法が含まれうる。

図５は、生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法５００を示す。方法５００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを提供するステップ５０２を含みうる。方法５００はさらに、生分解性ポリマー、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、疎水性有機酸、及び有機溶媒を混合して混合物とするステップ５０４を含みうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含まないものであってよい。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはグルカゴン様ペプチド−１−ＰＥＧコンジュゲートであってよい。混合するステップは、混合物中に、第２のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート（インスリン−ＰＥＧコンジュゲートであってよい）を混合することを含みうる。

加えて、方法５００は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を形成するステップ５０６を含みうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩は、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び疎水性有機酸のアニオンを含みうる。このコンジュゲート塩は、既に形成された塩を提供してその塩を有機溶媒中に溶解するのではなく、該溶媒中への構成成分の溶解と同時に形成されうる。さらに、方法５００は、混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成するステップ５０８を含みうる。溶液は撹拌の後に透明な溶液となりうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、生分解性ポリマー、疎水性有機酸、及び有機溶媒は、本明細書中に記載された任意の有機溶媒であってよい。各構成成分及び各ステップは水を伴わないものであってよい。

図６は、生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法６００を示す。方法６００は、有機溶媒中に生分解性ポリマーを溶解して混合物を形成するステップ６０２を含みうる。方法６００からは、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を有機溶媒中に溶解するステップは除外されうる。方法６００はさらに、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び疎水性有機酸を混合物に添加するステップ６０４を含みうる。更に、方法６００は、疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化するステップ６０６も含みうる。このプロトン化により、疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成されうる。加えて、方法６００は、混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成するステップ６０８を含みうる。溶液は撹拌の後に透明な溶液となりうる。タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、生分解性ポリマー、疎水性有機酸、及び有機溶媒は、本明細書中に記載された任意の有機溶媒であってよい。各構成成分及び各ステップは水を伴わないものであってよい。

方法５００、方法６００、又は同様の方法によって生成される溶液から、溶液が生成されうる。該溶液は個体への注射が可能である。溶液が水と接触すると、該溶液は固体の貯留物を形成する場合がある。貯留物はその後、タンパク質又は他の医学的に活性な作用薬を徐々に放出することができる。

実施例１
ＧＬＰ−１のＣ末端システインムテイン（ＧＬＰ−１［７−３６］＋３７位に追加されたシステイン）を大きなポリペプチドとの融合体としてクローニングし、ＧＬＰ−１とその融合パートナーとの間には自己切断型の自己タンパク質分解配列を含有させた。該融合タンパク質を、Ｔ７ポリメラーゼの制御下でＩＰＴＧ誘導可能な系を使用して大腸菌において発現させた。

実施例２
ＧＬＰ−１融合タンパク質を、変性条件下にて細胞溶解産物から単離し、復元させ、切断し（自己タンパク質分解）、さらに陽イオンクロマトグラフィーを使用して精製した。ペプチドが何であるかを確認するための特性解析アッセイには、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び質量分析が含まれた。ＧＬＰ−１の市販の合成システインムテインを、これらのアッセイについて対照として使用した。

実施例３
ＧＬＰ−１のシステインムテイン（組換え又は合成化学的プロセスのいずれかによって作成したもの）を、５ｋＤａ又は１０ｋＤａのシステイン反応性マレイミド−ＰＥＧを用いて次の方法によりＰＥＧ化した。該ペプチドを最初に、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度に溶解し、等モル量のマレイミドＰＥＧ試薬を添加した。反応を一晩継続させた。ＰＥＧ化されたＧＬＰ−１ペプチドは、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）の平衡化バッファー及び０．０２％重炭酸アンモニウムの段階溶出用緩衝液を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））を使用して精製された。生成物を含有する画分をプールし、０．０２％重炭酸アンモニウムに対して透析し、凍結乾燥した。精製されたＰＥＧ化ペプチドの濃度は、ＵＶ分光法によるか又はブラッドフォード法のタンパク質アッセイによって決定した。ＰＥＧ化の後に実施される追加の分析的なアッセイには、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量スペクトル分析、Ｎ末端分析、及びエンドトキシン測定が挙げられる。２０ｋＤａのより大きなＰＥＧについても試験した。さらに大きなＰＥＧ（例えば４０ｋＤａの分岐型）も試験されうる。

実施例４
Ｎ末端側ＰＥＧ−ＧＬＰ−１を次の方法によって調製した。最初に、３０ｍｇのＧＬＰ−１を２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に溶解し、ＧＬＰ−１濃度は１〜５ｍｇ／ｍＬに到達した。次に、５５ｍｇの５ｋＤａプロピオンアデヒド（ｐｒｏｐｉｏｎａｄｅｈｙｄｅ）ＰＥＧを、続いて２ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。該反応を室温にて一晩継続させた。１６時間後、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１を陽イオン交換クロマトグラフィー（ＳＰ−ＨＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標））によって精製した。

実施例５
ｈＧＨを、Ｔ７ポリメラーゼの制御下で大腸菌のＩＰＴＧ誘導可能な系においてサブクローニングした。細胞をＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド ＩＰＴＧを、発現を誘導するために添加した。誘導された培養物を約１６時間にわたって一晩インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、−２０℃で保管した。

細胞ペレットを融解させ、細胞溶解用緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ｐＨ７．５）に懸濁させ、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標））を３回通すことによって均質化した。不溶性の材料を遠心分離によって回収し、塩緩衝液（５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、ｐＨ７．５）に懸濁させ、遠心分離によって再び収集した。この不溶性のペレット（封入体）を−２０℃で保管した。

不溶性のペレットの一部（約１５ｍｇのｈＧＨ）を融解させ、１０ｍＬの８Ｍ尿素、１０ｍＭシステイン、２０ｍＭビストリスに溶解し、室温で６０分間撹拌し、次いで１００ｍＬの２０ｍＭトリス、１５％グリセロール、ｐＨ８．５で希釈した。この再フォールディングされた混合物を４℃で１日間保持し、遠心分離し、２０ｍＭビストリス、ｐＨ７．０（緩衝液Ａ）で平衡化した５ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＸＬカラムに注入した。結合したタンパク質を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭビストリス、ｐＨ５）を用いたｐＨ／塩濃度グラジエント（０〜１００％）で溶出した。カラムの画分をＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって分析し、復元したｈＧＨを含有する画分をプールして−２０℃で保管した。

実施例６
再フォールディングされて精製されたｈＧＨについて、次のプロトコールによってＮ末端をＰＥＧ化した。最初に、３０ｍｇのｈＧＨを２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に先ず溶解させ、ｈＧＨ濃度は５ｍｇ／ｍＬに達した。次に４０ｍｇの１０ｋＤａプロピオンアデヒド（ｐｒｏｐｉｏｎａｄｅｈｙｄｅ）ＰＥＧを、続いて８ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。該反応を室温にて一晩継続させた。１６時間後、ＰＥＧ−ｈＧＨを５ｍＬのＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ＨｉＴｒａｐ（登録商標）カラムを使用して精製した。

実施例７
疎水性の対立イオンを備えた、ＧＬＰ−１が充填されたＰＬＧＡミクロスフェアを、次の方法によって調製した。最初に、３０ｍｇの５ｋＤａ−ＰＥＧ−ＧＬＰ−１を２ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。次に、５０μＬのパモ酸溶液（ジメチルホルムアミド［ＤＭＦ］中に５０ｍｇ／ｍＬ）を添加した。次に１７０ｍｇのＰＬＧＡ５０２を該ペプチド溶液に添加し、混合物を透明になるまでボルテックス混合した。その後、５ｍＬの乳化安定剤（１％ポリビニルアルコール［ＰＶＡ］）を添加し、該混合物を直ちにＧｅｎｉｅボルテックス混合機の最大速度で７〜８秒間ボルテックス混合した。その時点で、エマルションを１００ｍＬの０．３％ＰＶＡに素早く添加するのと同時に急速に撹拌した。１０分後、１５０ｍＬの２％イソプロパノールを添加し、該懸濁液を３〜１２時間撹拌して、溶媒を蒸発させミクロスフェアを硬化させた。結果として生じるミクロスフェアを沈降によって単離し、２００ｍＬの精製水で３回洗浄し、凍結乾燥した。ＧＬＰ−１及びパモ酸を含むミクロスフェアの週１回用製剤を調製するために（例えばＰＬＧＡ５０２）、又は月１回用製剤を調製するために（例えばＰＬＧＡ７５３）、種々のＰＬＧＡポリマーを使用した。

実施例８
上記ミクロスフェアが薬物及び疎水性イオンを充填していることの確認は、最初にミクロスフェアをアセトニトリルに溶解し、続いて水での希釈によるポリマーの沈澱生成を行うことにより、達成される。結果として生じる上清をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。その分析から、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１が充填されパモ酸を含有する生成されたミクロスフェアは、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１に対し２％〜１８％の範囲の薬物充填と、およそ０．３％〜０．５％のパモ酸を有することが示された。ＲＰ−ＨＰＬＣの結果から、パモ酸がミクロスフェアに組み込まれることが確認された。

実施例９
粒度はベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）の粒子解析器を使用して測定した。粒子は、２０〜４５μｍの平均径を有しており、これは２７ゲージのシリンジを使用して皮下に投薬するのに好都合な範囲である。光学顕微鏡法によって検査された粒子は、表面のアーチファクトや内包物が最小限の滑らかな球体を示す。該粒子はさらに、医学的に活性な作用薬を含んだいくつかの従来の粒子よりも表面のアーチファクト及び内包物が少ない。図７Ａは、パモ酸とともにＰＥＧ−ＧＬＰ−１が充填されたＰＬＧＡ５０２ミクロスフェアの光学顕微鏡像を示す。図７Ａの粒子は、１６μｍのＤ１０、３３μｍのＤ５０、及び５０μｍのＤ９０を有する。図７Ｂは、ＰＥＧ−インスリン及びＰＥＧ−ＧＬＰ−１並びにパモ酸のプレミックスが充填されたＰＬＧＡ５０２ミクロスフェアの光学顕微鏡像を示す。図７Ｂの粒子は、１８μｍのＤ１０、３０μｍのＤ５０、及び４２μｍのＤ９０を有する。測定された粒度は、シリンジで注射可能な直径を中心とした密な分布を示している。

実施例１０
初期バースト放出の研究については、ミクロスフェアを、１７０ｍｇの様々なＰＬＧＡポリマー、３０ｍｇのＰＥＧ−ＧＬＰ−１、及び５０μＬのパモ酸溶液（ジメチルホルムアミド［ＤＭＦ］中に５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製した。対照のミクロスフェアも、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１を用いて、かつ５０μＬのＤＭＦを用いる場合と用いない場合との両方で調製した。該ミクロスフェアを、凍結乾燥の後、０．４％ＰＶＡ＋０．０５％アジ化ナトリウムに懸濁し、回転式肉焼き器のような混合を行いながら３７℃でインキュベートした。２４時間後、懸濁液を遠心分離し、上清をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析して、標準曲線に基づいて放出ＰＥＧ化ペプチドの量を定量した。表１は、ミクロスフェア中に最初に存在していたＰＥＧ化ペプチドの総量に占める割合（％）を示している。一般には初期バーストの割合がより低いことが治療において望まれるであろう。表１のデータに基づくと、パモ酸は、およそ１２〜１８ｋＤａの分子範囲のＰＬＧＡポリマー（ＰＬＧＡ５０２及びＰＬＧＡ７５２）を使用して製造されたミクロスフェアからのＰＥＧ−ＧＬＰ−１の初期バーストを最小限にした。ＰＬＧＡ５０３を用いたミクロスフェアについては、パモ酸はバーストを増大させた。表１はさらに、バースト量の変化は恐らくパモ酸による結果であってＤＭＦ溶媒による結果ではなかったことも示している。

実施例１１
徐放性研究については、ミクロスフェアを、１７０ｍｇの様々なＰＬＧＡポリマー、３０ｍｇのＰＥＧ−ＧＬＰ−１、及び５０μＬのパモ酸溶液（ジメチルホルムアミド［ＤＭＦ］中に５０ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製した。対照のミクロスフェアも、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１を用いて、かつ５０μＬのＤＭＦを用いる場合と用いない場合との両方で調製した。該ミクロスフェアを、凍結乾燥の後、０．４％ＰＶＡ＋０．０５％アジ化ナトリウムに懸濁し、回転式肉焼き器のような混合を行いながら３７℃でインキュベートした。特定の時点の後、懸濁液を遠心分離し、上清をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析して、標準曲線に基づいて放出ＰＥＧ化ペプチドの量を定量した。図８及び９は、ミクロスフェアに関する上記の徐放性研究の結果のグラフを示す。該図面は、ミクロスフェア中に最初に存在するＰＥＧ化ペプチドの総量に占める割合（％）として放出の値を示している。図８及び９は、パモ酸はＰＥＧ−ＧＬＰ−１の初期放出を最小限にしたが最終的な放出プロファイルにはほとんど影響がなかったことを示している。むしろ、完全放出のタイミングは主としてＰＬＧＡポリマーの疎水性に依存していた。ＰＬＧＡ５０２は５０：５０のラクチド対グリコリド比率を有し、ＰＬＧＡ７５２は７５：２５のラクチド対グリコリド比率を有する。ラクチド対グリコリド比率が高いほど、疎水性の高いＰＬＧＡポリマーをもたらす。したがって、ＰＬＧＡ７５２はＰＬＧＡ５０２よりもＰＥＧ−ＧＬＰ−１を放出するのにより長い時間を要した。

実施例１２
ＧＬＰ−１受容体に対するＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合親和性を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）（ジー・イー・ヘルスケア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ））試験を実施した。ＧＬＰ−１受容体をバイオセンサ表面に共有結合で固定し、ＰＥＧ化ＧＬＰ−１化合物又はＧＬＰ−１を該表面の上に注入した。ＧＬＰ−１受容体との結合に関する平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）は、５ｋＤａ−ＰＥＧ−ＧＬＰ−１（Ｃｙｓアナログ）については１．６μＭであり、未修飾ＧＬＰ−１については、Ｋ_Ｄは１．０μＭであった。Ｎ末端５ｋＤＡ−ＰＥＧ−ＧＬＰ−１についての平衡定数は決定することができなかったが、おそらくは受容体とＮ末端ＰＥＧ化ペプチドとの間の相互作用が極めて弱い結果である。Ｃ末端にＰＥＧポリマーを結合させてもＧＬＰ−１の比活性にはさほど影響しないのに対し、Ｎ末端にＰＥＧポリマーを結合させると受容体との結合を妨害するのかもしれない。

実施例１３
ＰＥＧ化ＧＬＰ−１コンジュゲートのｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性は、ＣＨＯ−Ｋ１／ＧＬＰ１／Ｇα１５を使用する細胞系アッセイであるＧＬＰ−１受容体結合アッセイにおいて、及びＧＬＰ−１により引き起こされる濃度依存性の細胞内カルシウム動員の刺激をモニタリングして、測定された。細胞には、ＧＬＰ−１受容体アゴニストを用いた刺激に先立ってＣａｌｃｉｕｍ−４が充填された。細胞内カルシウムの変化はＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）によって測定した。相対蛍光単位（ＲＦＵ）を、ＧＬＰ−１の累積的投薬量（５倍希釈）の対数に対してプロットした。表２は、ＥＣ_５０（最も高い活性レベルの５０％に達する濃度）を示している。ＥＣ_５０が低いほど、高い活性を示す。実施例１２のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）のデータに一致して、Ｃ末端がＰＥＧ化されたＧＬＰ−１は未修飾のＧＬＰ−１ペプチドと比較して完全に近い活性を示した。Ｃ末端がＰＥＧ化されたＧＬＰ−１についての５ｋＤａのＰＥＧは、活性に著しく影響するようには見えなかった。Ｎ末端がＰＥＧ化されたＧＬＰ−１ペプチドの比活性は、Ｃ末端がＰＥＧ化されたＧＬＰ−１と比較して顕著に低減した。Ｎ末端がＰＥＧ化されたＧＬＰ−１について、５ｋＤａのＰＥＧの代わりに２ｋＤａのＰＥＧを使用すると、活性への有意な影響は観察されなかった。

実施例１４
ＰＥＧ−ＧＬＰ−１、ＰＥＧ−インスリン、及びパモ酸を含有する２ペプチド充填ミクロスフェアを、水中油型単相エマルションの溶媒抽出／蒸発プロセスを使用して調製した。油相は、２ｍＬのジクロロメタンに溶解された、１７０ｍｇのＰＬＧＡポリマー、１０ｍｇのＰＥＧ−インスリン、２０ｍｇのＰＥＧ−ＧＬＰ−１、及び２．５ｍｇのパモ酸（ＤＭＦ中に５０ｍｇ／ｍＬのパモ酸ストックから）で構成された。この油相を５ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＰＶＡとともにボルテックス混合することにより乳化し、この一次エマルションを１００ｍＬの０．３％ＰＶＡに３００ｒｐｍで撹拌しながら添加した。その後、１５０ｍＬの２％ＩＰＡをおよそ１０分後に添加し、溶媒蒸発を促進するために該懸濁液を撹拌した。３時間後、硬化したミクロスフェアを２００ｍＬの精製水で３回洗浄し、凍結乾燥した。

実施例１５
薬物動態学的研究はオスのスピローグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットを用いた２０日間の試験で実施された。ラット（１群当たり６匹）にそれぞれ、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１が充填されたミクロスフェア（ＭＳ）又はＰＥＧ−ＧＬＰ−１及びＰＥＧ−インスリンの２種充填ミクロスフェア（プレミックス）のいずれかを皮下注射した。ＰＥＧ−ＧＬＰ−１のＭＳ及びプレミックスはいずれもパモ酸及びＰＬＧＡ５０２を含有していた。追加の対照群には、希釈剤のみ（カルボキシメチルセルロースナトリウム［１％］、Ｄ−マンニトール［５％］及びポリソルベート２０［０．１％］）のプラセボ群が含まれた。ｉｎ ｖｉｖｏでの放出プロファイルは、所定時点での血漿試料の収集と、その後の該試料のＥＬＩＳＡ分析（イー・エム・ミリポア（ＥＭ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の抗ＧＬＰ−１キット）によって決定された。図１０及び１１は、ミクロスフェア投薬後のラット血漿試料中のＧＬＰ−１又はインスリンの薬物動態学的分析を示す。いずれの場合においても、ＰＥＧ化ペプチドはｉｎ ｖｉｖｏで放出されて第１７日ごろにピーク濃度を生じた。ＧＬＰ−１の放出プロファイルには、ＰＥＧ−インスリンを含めることによる著しい影響は観察されなかった。プレミックスのミクロスフェアを用いたインスリンの放出はＧＬＰ−１とほぼ同時に生じた。よって、プレミックスのミクロスフェアは、非プレミックスのミクロスフェアとほぼ同時に医学的に活性な作用薬を放出することが観察された。

実施例１６
エンフビルチド及びパモ酸を含有するＰＬＧＡミクロスフェアを、ｏ／ｗ型単相エマルションの溶媒抽出／蒸発プロセスを使用して調製した。エンフビルチドはＰＥＧ化されなかった。油相は、１７０ｍｇのＰＬＧＡ５０２、３０ｍｇのエンフビルチド、８ｍｇのパモ酸及び２ｍＬのジクロロメタンで構成された。この油相を５ｍＬの１％（ｗ／ｖ）ＰＶＡとのボルテックス混合で乳化し、この一次エマルションを１００ｍＬの０．３％ＰＶＡに３００ｒｐｍで撹拌しながら添加した。その後、１５０ｍＬの２％ＩＰＡをおよそ１０分後に添加し、ミクロスフェアの硬化を促進するために該懸濁液を撹拌した。３時間後、硬化したミクロスフェアを濾別し、大量の再蒸留Ｈ_２Ｏで洗浄し、凍結乾燥した。第２ロットのミクロスフェアも、パモ酸が混合物に添加されないこと以外は本実施例で上述されているようにして調製された。パモ酸存在下で調製されたエンフビルチドのミクロスフェアの粒度分析は、パモ酸を伴わないエンフビルチドのミクロスフェア（平均サイズ：３２．７５μＭ；Ｓ．Ｄ：３４．０７μＭ）に対してより高い均質性を示した（平均サイズ：２８μＭ；Ｓ．Ｄ：９．５μＭ）。

実施例１７
ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１、パモ酸、及びＮ−メチルピリリドン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｐｙｒｒｉｌｉｄｏｎｅ）（ＮＭＰ）を含有するｉｎ ｓｉｔｕ製剤を調製した。最初に、３４０ｍｇのＰＬＧＡ（ＰＬＧＡ５０３、ＰＬＧＡ７５２、又はＰＬＧＡ７５３のいずれか）を１ｍＬのＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）に溶解させた。次に、３０ｍｇのＰＥＧ−ＧＬＰ−１を、２．５ｍｇのパモ酸（ＤＭＳＯ中に２００ｍｇ／ｍＬのストックから）と共に添加した。該混合物を透明になるまで穏やかに旋回混合した。放出については、溶液をそれぞれ透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ、３．５ｋＤａカットオフ）に充填し、９００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水及び０．０５％ポリソルベートのビーカー内に懸濁させた。透析緩衝液を室温で一晩穏やかに撹拌した。室温で１６時間の後には、貯留物が上部に液体の層を伴ってカセット内に形成されていた。この液体及び固体を分離し、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１含量をＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって決定した。個々の貯留物について計算されたバーストは、ＰＬＧＡ５０３ポリマーについては１１％、ＰＬＧＡ７５２ポリマーについては６２％、ＰＬＧＡ７５３ポリマーについては４０％であった。バーストは、ＰＬＧＡポリマーの疎水性によって影響を受けることが観察された。

実施例１８
ＰＬＧＡ、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１、パモ酸、及びＦＤＡにより承認された溶媒の混合物を含有するｉｎ ｓｉｔｕ製剤を調製した。最初に、３４０ｍｇのＰＬＧＡ７５２を、５０％のＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）及び５０％の安息香酸ベンジルの混合物、又は５０％のＤＭＳＯ及び５０％の安息香酸ベンジルの混合物１ｍＬに溶解させた。次に、３０ｍｇのＰＥＧ−ＧＬＰ−１を、２．５ｍｇのパモ酸（ＤＭＳＯ中に２００ｍｇ／ｍＬのストックから）と共に添加した。該混合物を透明になるまで穏やかに旋回混合した。放出については、溶液をそれぞれ透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ、３．５ｋＤａカットオフ）に充填し、９００ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水及び０．０５％ポリソルベートのビーカー内に懸濁させた。室温で１６時間の後には、貯留物が上部に液体の層を伴ってカセット内に形成されていた。この液体及び固体を分離し、ＰＥＧ−ＧＬＰ−１含量をＲＰ−ＨＰＬＣ分析によって決定した。ＤＭＳＯ：安息香酸ベンジル混合物について計算されたバーストは、ｉｎ ｓｉｔｕ製剤に基づき２．６％であったのに対し、ＮＭＰ：安息香酸ベンジルについては０．２％であった。ＤＭＳＯはＮＭＰよりも極性が大きい。所望の放出速度（週１回投薬用及び月１回投薬用）は、ＰＬＧＡの疎水性及び濃度、溶媒の水和度、及び／又はパモ酸の添加に基づいて調整されうる。

実施例１９
実施例１〜１８は、ＧＬＰ−１、インスリン、及び／又はエンフビルチドの代わりに、ヒト成長ホルモン、インスリン、エンフビルチド、副甲状腺ホルモン、ＰＴＨフラグメント、オクトレオチド、又はその他の医学的に活性な作用薬を用いて繰り返される。実施例はさらに、実施例１〜１９の組成物のうち任意のものについて有機溶媒を用いてミクロスフェア及び組成物を調製することも含みうる。これらの実施例は、従来の組成物及び方法と比較して優れた濃度プロファイル及びその他の特性を示した。

本明細書において、説明を目的として、本発明の技術の様々な実施例についての理解を提供するために数多くの細部について述べてきた。しかしながら、当業者には明白であろうが、ある実施例は、上記の細部のうちの一部を伴わずに、又は追加の細部を伴って、実施されることもできる。

数例の実施例について説明したが、当業者には、様々な改変形態、代替構造、及び等価物が本発明の思想から逸脱することなく使用されうることが認識されるであろう。加えて、いくつかのよく知られた工程及び要素については、本発明を不必要に曖昧にすることを回避するため説明されていない。加えて、任意の特定の実施例の細部は、その実施例の変形形態に必ずしも存在しなくてよいし、他の実施例に対して付加されてもよい。

ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限値と下限値との間にあるそれぞれの値も、文脈からそうでないことが明白に示されない限り、下限値の単位の１０分の１まで、具体的に開示されていることが理解される。指定された範囲の中の任意の指定された値又はその範囲内にある値と、その指定された範囲の中の任意の他の指定された値又はその範囲内にある値との間の、より小さな範囲も、それぞれ包含される。これらのより小さな範囲の上限値及び下限値は独立に、その範囲に含まれてもよいし除外されてもよく、かつその上下限値がその小さな範囲にどちらか一方が含まれるか、どちらも含まれないか、又は両方が含まれるそれぞれの範囲も、その指定された範囲から任意の特定された上下限値が除外されることを条件として、本発明の範囲内に包含される。指定された範囲が上下限値のうち一方又は両方を含む場合、それらの含まれた上下限値のうち一方又は両方を除外する範囲も含まれる。

本明細書中及び添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「１つの」及び「その」、「該」、「前記」は、文脈からそうでないことが明白に示されない限り、複数の指示物を含む。よって、例えば、「方法」への言及は複数のそのような方法を含んでおり、「タンパク質」への言及は、１つ以上の、当業者に既知のタンパク質及び該タンパク質の等価物などへの言及を含んでいる。本発明はここで、明瞭であること及び理解を目的として詳細に説明されてきた。しかしながら、ある種の変更形態及び改変形態が添付の特許請求の範囲の範囲内で実行されうることは認識されるであろう。

Claims (40)

1. ミクロスフェアであって、
   生分解性ポリマーと、
   タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート及び有機酸の疎水性アニオン、タンパク質及び有機酸の疎水性アニオン、並びにこれらの組合せからなる群から選択されたタンパク質混合物と
   を含むミクロスフェア。
2. 前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートのタンパク質、又は前記タンパク質は、ヒト成長ホルモンを含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
3. 前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートのタンパク質、又は前記タンパク質は、グルカゴン様ペプチド−１を含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
4. インスリン−ポリエチレングリコールコンジュゲートをさらに含む、請求項３に記載のミクロスフェア。
5. 前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートのタンパク質、又は前記タンパク質は、インスリン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンのフラグメント、エンフビルチド、及びオクトレオチドからなる群から選択される、請求項１に記載のミクロスフェア。
6. 前記有機酸は、パモ酸、水素ドクサート、フロ酸、又はこれらの混合物を含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
7. 前記タンパク質混合物は有機酸の疎水性アニオンを含み、
   前記有機酸の疎水性アニオンは、脂肪酸アニオン、リン脂質アニオン、ポリスチレンスルホン酸アニオン、又はこれらの混合物を含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
8. 前記疎水性アニオンはリン脂質アニオンを含み、前記リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスホコリン、又はこれらの混合物である、請求項７に記載のミクロスフェア。
9. 前記タンパク質混合物はタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含み、
   前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートのポリエチレングリコールはメトキシポリエチレングリコールアルデヒドを含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
10. 前記タンパク質混合物は有機酸の疎水性アニオンを含み、
    前記有機酸はパモ酸を含み、前記疎水性アニオンはパモエートアニオンを含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
11. 前記タンパク質混合物はタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート及び有機酸の疎水性アニオンを含み、
    前記有機酸の疎水性アニオンと前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートとのモル比は１：１〜１１：１の範囲にある、請求項１に記載のミクロスフェア。
12. 前記タンパク質混合物はタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含み、
    前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートはモノＰＥＧ化コンジュゲートを含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
13. 前記生分解性ポリマーは、ポリラクチド；ポリグリコリド；ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリエステルとポリエーテルの共重合体；及びポリラクチドとポリエチレングリコールの共重合体からなる群から選択される、請求項１に記載のミクロスフェア。
14. 前記生分解性ポリマーはポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、請求項１に記載のミクロスフェア。
15. 前記生分解性ポリマーは７，０００Ｄａ〜１７，０００Ｄａの分子量を有する、請求項１に記載のミクロスフェア。
16. 疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を作製する方法であって、
    タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含むタンパク質水溶液を提供するステップと；
    ポリエチレングリコールを前記タンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップと；
    疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化するステップであって、プロトン化により、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の疎水性を増大させる疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成される、ステップと
    を含む方法。
17. ポリエチレングリコールを前記タンパク質と反応させるステップは、
    ポリエチレングリコールと前記タンパク質との間に、アミン結合、アミド結合、エステル結合、若しくはジスルフィド結合を形成すること、又は
    前記タンパク質のシステイン残基にチオール反応性のポリエチレングリコールを結合させること
    を含む、請求項１６に記載の方法。
18. 疎水性が高められたタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを作製する方法であって、
    タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含むタンパク質水溶液を提供するステップと；
    ポリエチレングリコールを前記タンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップであって、タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは前記タンパク質よりも高い疎水性を有する、ステップと
    を含む方法。
19. 前記方法は、疎水性有機酸を用いて前記タンパク質上のアミノ基をプロトン化するステップを含まない、請求項１８に記載の方法。
20. タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含有する制御放出型ミクロスフェアを作製する方法であって、
    タンパク質及びｐＨ緩衝剤を含むタンパク質水溶液を提供するステップと；
    ポリエチレングリコールをタンパク質と反応させてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを形成するステップと；
    有機相中で疎水性有機酸を用いてタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化するステップであって、プロトン化により疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成される、ステップと；
    有機溶媒中で前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を生分解性ポリマーと混合して混合物を形成するステップであって、前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の疎水性アニオンは前記有機溶媒中の前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶解度を増大させる、ステップと；
    水溶液中で前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩及び前記生分解性ポリマーの混合物を乳化して乳化混合物を形成するステップと；
    前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩及び前記生分解性ポリマーの乳化混合物を硬化して制御放出型ミクロスフェアとするステップと
    を含む方法。
21. 生分解性ポリマーと；
    有機溶媒と；
    タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲート及び有機酸の疎水性アニオン、タンパク質及び有機酸の疎水性アニオン、並びにこれらの組合せからなる群から選択されたタンパク質混合物と
    を含む組成物であって、前記組成物は溶液又は懸濁液として提供される、組成物。
22. 前記組成物は溶液として提供される、請求項２１に記載の組成物。
23. 前記組成物は懸濁液として提供される、請求項２１に記載の組成物。
24. 前記タンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートのタンパク質、又は前記タンパク質は、ヒト成長ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１、インスリン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンのフラグメント、エンフビルチド、及びオクトレオチドからなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
25. 前記有機酸は、パモ酸、水素ドクサート、フロ酸、又はこれらの混合物を含む、請求項２１に記載の組成物。
26. 前記タンパク質混合物はタンパク質及び有機酸の疎水性アニオンを含み、
    前記有機酸の疎水性アニオンは、脂肪酸アニオン、リン脂質アニオン、ポリスチレンスルホン酸アニオン、又はこれらの混合物を含む、請求項２１に記載の組成物。
27. 前記有機溶媒は、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、安息香酸エチル、安息香酸ベンジル、トリアセチン、ＰＥＧ４００、又はこれらの混合物を含む、請求項２１に記載の組成物。
28. 前記生分解性ポリマーは、ポリラクチド；ポリグリコリド；ポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリエステルとポリエーテルの共重合体；及びポリラクチドとポリエチレングリコールの共重合体からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
29. 前記生分解性ポリマーはポリ（ｄ，ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含む、請求項２１に記載の組成物。
30. 前記生分解性ポリマーは２４，０００Ｄａ〜３８，０００Ｄａの分子量を有する、請求項２１に記載の組成物。
31. 前記生分解性ポリマーは、約５０％以下のラクチドと、約５０％以上のグリコリドとを含む、請求項２１に記載の組成物。
32. 生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法であって、
    タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを提供するステップであって、前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を含まない、ステップと；
    生分解性ポリマー、前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、疎水性有機酸、及び有機溶媒を混合して混合物とするステップと；
    前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び前記疎水性有機酸のアニオンを含むタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を形成するステップと；
    前記混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成するステップと
    を含む方法。
33. 前記有機溶媒は、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、安息香酸エチル、安息香酸ベンジル、トリアセチン、ＰＥＧ４００、又はこれらの混合物を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは第１のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートであり、
    前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはグルカゴン様ペプチド−１−ＰＥＧコンジュゲートを含み、
    前記混合するステップは、第２のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートを、前記混合物中で前記生分解性ポリマー、前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート、前記疎水性有機酸、及び前記有機溶媒と混合することをさらに含み、
    前記第２のタンパク質−ＰＥＧコンジュゲートはインスリン−ＰＥＧコンジュゲートを含む、請求項３２に記載の方法。
35. 生分解性ポリマー及びタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩の溶液又は懸濁液を作製する方法であって、
    有機溶媒中に前記生分解性ポリマーを溶解して混合物を形成するステップと；
    前記混合物にタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート及び疎水性有機酸を添加するステップと；
    疎水性有機酸を用いて前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲート上のアミノ基をプロトン化するステップであって、プロトン化により疎水性アニオンを有するタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩が形成される、ステップと；
    前記混合物を撹拌して溶液又は懸濁液を形成するステップと
    を含む方法。
36. 前記方法はタンパク質−ＰＥＧコンジュゲート塩を有機溶媒に溶解するステップを含まない、請求項３５に記載の方法。
37. 前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは、ヒト成長ホルモン、グルカゴン様ペプチド−１、インスリン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンのフラグメント、エンフビルチド、及びオクトレオチドからなる群から選択されたタンパク質を含む、請求項３５に記載の方法。
38. 前記疎水性有機酸は、パモ酸、水素ドクサート、フロ酸、又はこれらの混合物を含む、請求項３５に記載の方法。
39. 前記有機溶媒は、Ｎ−メチルピロリドン、ジメチルスルホキシド、プロピレングリコール、安息香酸エチル、安息香酸ベンジル、トリアセチン、ＰＥＧ４００、又はこれらの混合物を含む、請求項３５に記載の方法。
40. 前記タンパク質−ＰＥＧコンジュゲートは、
    ポリエチレングリコールとタンパク質との間の、アミド結合、エステル結合、若しくはジスルフィド結合、又は、
    前記タンパク質のシステイン残基に結合したチオール反応性のポリエチレングリコール
    を含む、請求項３５に記載の方法。