JP2013509402A - カテコールポリエチレングリコール誘導体と蛋白質またはペプチドの接合体、及びこれの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(a)反応槽内の極性有機溶媒にポリエチレングリコールを溶解させる工程;
(b)他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式1のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程;
(c)前記工程(b)で製造された溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(N,N-Diisopropylethylamine;DIPEA)を添加して、反応させる工程;及び
(d)前記工程(a)の溶液に前記工程(c)の溶液を添加して、反応させる工程を含む。
本発明に係る工程(a)及び工程(b)は、反応物質の溶液を各々製造する工程である。物質を溶解させる溶媒として、極性有機溶媒が使えるが、好ましくはアルコール、DMSO(Dimethyl sulfoxide)、DMF(Dimethylformaldehyde)、アセトン(Acetone)及びNMP(N-Methylpyrrolidone)が利用でき、最も好ましくはDMFが使える。DMFは、カテコール基の酸化を防止できる。
(a)反応槽内に蛋白質またはペプチドを溶解させる工程;
(b)他の反応槽内に前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程;及び
(c)前記工程(a)の溶液を工程(b)の溶液に添加して反応させる工程を含む、
ポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのN末端アミン基に単一体で接合された蛋白質またはペプチドとポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法を提供する。
本発明に係る工程(a)は、N末端アミン基を持つ蛋白質またはペプチドを反応槽内に溶解させる工程である。好ましくは、緩衝溶液に溶解させられ、使われる緩衝溶液は、リン酸塩緩衝溶液、イミダゾール緩衝溶液、トリメチルアミン緩衝溶液、トリエタノールアミン緩衝溶液、ソジウムジエチルバルビツレート緩衝溶液、ビシン(bicine)緩衝溶液、アミノメチルプロパンジオール緩衝溶液中で選択されたいずれかひとつが使える。また、前記緩衝溶液のpHは、好ましくは5.5〜10である。緩衝溶液のpHが5.5未満の場合、反応性が落ちる問題があり、10を超える場合、蛋白質またはペプチド薬物の安定性が低下する問題がある。
カテコールを持つ化合物が結合されたポリエチレングリコール(PEG)誘導体を合成するために、PEGの一例であるメトキシポリエチレングリコールを使って、カテコールを持つ化合物の一例である3,4−ジヒドロキシ桂皮酸を利用した。
(1)mPEG−CTを利用したPEG−ヒンジ−3接合体の製造
ポリエチレングリコール誘導体とペプチドを接合させるために実施例1の方法と同様にmPEG−CTを準備した(図1)。即ち、mPEG−amine(MW:5k)及びHCAをDMF溶液内でHOBt、BOP、DIPEAと共に反応させて、mPEG−CTを収得した。
その後、弱酸性条件で(pH6.5)、mPEG−CT及びヒンジ−3ペプチド(図2参照)を4度で混合して反応させた。その結果、PEG−ヒンジ−3接合体が成功的に製造された。
(2)RP−HPLC及びMALDI−TOFを介した単一ペグ化の可否確認
前記実施例2−(1)で製造されたPEG−ヒンジ−3接合体の形態がヒンジ−3ペプチドにPEGが単一体で接合した形態か否かを確認するために、RP−HPLC(Reverse phase-High performance liquid chromatography)及びMALDI−TOF(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight)分析を行った。
HPLC systemは、Agilent 1200 seriesを使って、カラムはsupelco Discovery(商標) BIO Wide Pore C18 5cm×4.6mm,3μmを使った。移動相は、水(0.1%TFA):アセトニトリル(0.1%TFA)=95:5から30分まで水(0.1%TFA):アセトニトリル(0.1%TFA)=5:95で流し、35分まで再び水95%に合わせて流した。
前記実施例2−(1)で製造されたPEG−ヒンジ−3接合体の形態が、ヒンジ−3ペプチドのN末端位置に特異的に接合された形態か否かを確認するために、tryptic分解方法後、RP−HPL及びMALDI−TOF分析を行った。ヒンジ−3と命名されたペプチドは、20個のアミノ酸を持っている(図2参照)。一方、露出された一級アミン、潜在的ペグ化位置は、合わせて7個で、リシン(K)の6個のエプシロン−アミングループとN末端のアルファ−アミングループである。全てのアミンは、ペグ化位置の候補である(図5参照)。従って、これらの位置中、N末端のアルファ−アミングループにだけペグ化されたかを確認した。ヒンジ−3配列は、ただ一つのトリプトファンアミノ酸を含有するため(図2参照)、トリプシン分解でヒンジ−3蛋白質が分解される場合、N末端にだけPEGが接合されたか否かをその切片の形態で確認することができた。
(1)mPEG−SSを利用したPEG−リゾチーム接合体の製造
ペプチドだけでなく、蛋白質もN末端ペグ化できる。従来、アミンペグ化させる最も有用な方法は、表面露出された一級アミングループと共有結合を生成できるスクシンイミジルコハク酸(succinimidyl succinate)を使うことであった。しかし、このような方法は位置特異的でない問題があった。
カテコールグループとは異なって、スクシンイミジルコハク酸は、無作為的な一級アミン基と反応するためである(図8)。従って、蛋白質の例としてリゾチームを利用して、カテコールグループとスクシンイミジルコハク酸を比較するために、mPEG−SSを利用してPEG−リゾチーム接合体を製造した。
一般に知らされた条件であるpH8.5でmPEG−SS20mgとリゾチーム5mgを入れて、4℃で12時間反応をさせてPEG−リゾチーム接合体を製造した。
その結果、PEG−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
実施例1のmPEG−CTを利用してPEG−リゾチーム接合体を製造するために、実施例2−(1)と同様に製造したが、蛋白質の特性を考慮してpH8.5でmPEG−CT(5k)5mgをリゾチーム5mgと共に混ぜて4度で12時間混合した。
その結果、PEG−リゾチーム接合体が製造されたことを確認した。
前記実施例3−(1)及び3−(2)のPEG−リゾチーム接合体に対してSDS−PAGE Gel分析を行って、前記接合体が単一ペグ化された形態であるか、多重ペグ化された形態であるかを確認した。
アクリルアミド(Acrylamide)分率が15%のであるDS PAGE Gelを製造し電圧をかけて、リゾチーム及びPEG−リゾチーム接合体を大きさに応じて分離した。
(1)mPEG−CTまたはmPEG−SSを利用したPEG−bFGF接合体の製造
bFGF(MW:17.1kDa)は、塩基性線維芽細胞成長因子(basic Fibroblast Growth Factor)であり、FGFの一種である。成体器官で、傷反応及び組織再生に対して機能する。前記実施例2−(1)で使った方法と同様にmPEG−CTを利用してPEG−bFGF接合体を製造して、その結果PEG−bFGF接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例3−(1)と同様な方法でmPEG−SSを利用してPEG−bFGF接合体を製造した。
実施例2−(2)と同様な方法でPEG−bFGFのSDS−PAGE分析及びMALDI−TOF分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。ただpH値は異ならせて実験した。それは、N末端アミンの環境は異なるため、互いに異なったpKa値を持つためである。bFGFは、pH6.5でペグ化の可否を観察した。
図10のAの2列目にローディングされた蛋白質は、mPEG−CTを使ってpH6.5でペグ化を行った結果であるが、既存bFGFのバンドとモノペグ化されたPEG−bFGF接合体のバンド、二つのバンドを観察することができ、3列目にローディングされた蛋白質は、これをFPLCで分離して、精製したモノペグ化されたPEG−bFGF接合体である。これにより、カテコール−ポリエチレングリコール誘導体を利用して、蛋白質−ポリエチレングリコール接合体を製造する場合、ポリエチレングリコールが単一体で蛋白質に接合されることを確認した。
実施例2−(3)と同様な方法でPEG−bFGFのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図10のCに示したように、T1切片ピークは7468で観察された。変形されないbFGFのT1切片の分子量は2495であるため(図10のB)、7468ピークはmPEG−CT(MW:5000)とbFGFのT1切片(MW:2495)が加わったことが確実になったため、この7468ピークはN末端ペグ化の確実な証拠である。これにより、mPEG−CTを利用して製造されたPEG−bFGF接合体は、bFGF蛋白質のN末端にPEGが単一体の形態で接合された形態であることを確認した。
(1)mPEG−CTまたはmPEG−SSを利用したPEG−G−CSF接合体の製造
G−CSF(Granulocyte Colony-Stimulating Factor;MW:18.8kDa)もヒト血液システムの最も重要な蛋白質であり、骨髄を刺激して、血流に放出されるようにする役割を果たす。前記実施例2−(1)と同様な方法でPEG−G−CSF接合体を製造し、その結果PEG−G−CSF接合体が製造されたことを確認した。
一方、実施例3−(1)と同様な方法でmPEG−SSを利用してPEG−G−CSF接合体を製造した。
(2)SDS−PAGE Gel分析を介したペグ化の可否確認
実施例2−(2)と同様な方法でPEG−bFGFのSDS−PAGE Gel分析及びMALDI−TOF分析を介して、単一体にペグ化されたか否かに対して確認した。
図11のAに示したように、mPEG−CTを使ってペグ化させた結果、ペグ化される前のG−CSFとモノペグ化されたG−CSFバンドだけを観察することができ(2列目)、これをFPLCで精製した結果、モノペグ化されたG−CSFだけを分離することができた(3列目)。これにより、G−CSF蛋白質に対し単一体にペグ化されたことを確認した。
実施例4−(3)と同様な方法で、G−CSF及びPEG−G−CSFのトリプシン分解を介してペグ化位置を確認した。
その結果、図11のBに示したように、G−CSFのトリプシン分解のMALDI−TOFの結果、T1切片の分子量は1792であった。一方、図11のCに示したように、カテコール−PEG−G−CSFのトリプシン分解のMALDI−TOFの結果、T1の分子量は6792であった。従って、前記結果はT1切片とPEG(MW:5000)が加わった結果と考えられるため、このことからスクシンイミジルコハク酸−PEG誘導体とは異なって、カテコール−PEG誘導体の場合、蛋白質と接合されるに当たり、単一体の形態で接合されたことを確認した。
ペグ化効率を増進させるために、酸化剤である過ヨウ素酸ナトリウムを使った。低pH条件でアルファアミン(N末端アミン)はエプシロンアミン(リシン残基アミン)に比べてNH3+陽イオン形態で存在する比が高い。このため、N末端アミンだけが過ヨウ素酸塩によって酸化されたキノンと反応することができる。従って、それぞれ違異なる過ヨウ素酸ナトリウム比率条件下でペグ化を行った。
pH6.0のバッファー溶液に5mgのリゾチーム、5mgのmPEG−CTを溶かして4℃で720分間反応させた。この時、過ヨウ素酸ナトリウムは、mPEG−CTと各々0、0.5、1、2:1の割合で添加した。
対照群実験は実施例3−(2)と共に実験した。
(1)mPEG−CTまたはmPEG−SSを利用したPEG−EPO接合体の製造及び確認
エリスロポエチン(MW:30kDa)は、腎臓で生成されるホルモンで、骨髄で赤血球の生成を促進する。最も重要な機能は、赤血球の分化と発生を促進することである。本実験では、mPEG−CT(MW:30kDa)を使っているが、その理由は少なくとも20kDaのPEGを付着するペグ化がin vivo環境で効果があるためである。
In vivo薬物動態学(pharmacokinetic)実験のために、陽性対照群として多重−ペグ化EPO、即ち、前記実施例7−(1)で製造したmPEG−SSを利用して製造した多重PEG−EPOを使った。
マウスに対して100μg蛋白質/kg(マウス体重)の量を静脈注射でEPOを投入後、In vivoを循環する時間を測定した。各蛋白質に対し、5匹のマウスを使って、各マウスに〜2.5μgの蛋白質を注入した。これは、転化因子が2.56×104mIUだと仮定した時、6.4×104mIUのEPOに該当する量である。プラズマの蛋白質はELISAで定量し、定量値は各蛋白質サンプル、即ちPEG−EPO、多重PEG−EPOとEPOの各々異なるELISA抗体の親和度に応じて調整した。
生物学的活性を測定するために、血サンプルにある血液の容積に対する赤血球の相対的容積比率(hematocrit)を測定した。
マウスから抽出した血にEDTAを混ぜて凝固を防いだ後、VetScan HM5(Abaxis社)を使って、赤血球の相対的容積比率を測定した。
Claims (30)
- 下記化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体:
- 前記誘導体は蛋白質またはペプチドのN末端アミン基に単一体で接合できることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシp−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−L−フェニルアラニン、アミン基を含む3−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む3,4−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む3,4−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 前記カテコールを持つ化合物の分子量は、1,000以下であることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 前記誘導体の分子量は、500〜100,000Daであることを特徴とする請求項1に記載のポリエチレングリコール誘導体。
- 下記化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのN末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体:
- 前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシp−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記ポリエチレングリコールとしては、直線型、分枝型、ブラシ型、及びスター型からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−L−フェニルアラニン、アミン基を含む3−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む3,4−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む3,4−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項10に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記カテコールを持つ化合物の分子量は、1,000以下であることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記ポリエチレングリコール誘導体の分子量は、500〜100,000Daであることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記蛋白質はリゾチーム、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポエチン(EPO)、上皮細胞成長因子(EGF)、ヒト成長ホルモン(hGH)、インターフェロン(IFN)、インターロイキン−2(IL−2)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、黄体化ホルモン放出ホルモン(LHRH)、成長ホルモン放出ホルモン(GHRH)、ウリカーゼ(uricase)、及びアルギニンデイミナーゼ(ADI)からなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 前記ペプチドは、ヒンジ−7、ヒンジ−3、ブフォリン、ヒストニン、プロテグリン、インドリシジン、ヒスタチン、BIP、マガイニン2、グルカゴン類似ペプチド(GLP−1)、GNRH/LHRHアゴニスト、ソマトスタチン類似体、免疫調節ペプチドのグラチラマー、サーモンカルシトニン、テスモプレシン、血小板凝固抑制ペプチド、エプチフィバチド、及びHIV細胞流入抑制剤のエンフュービルタイドからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項8に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体。
- 次の工程を含む、下記化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法:
(b)他の反応槽内の極性有機溶媒に架橋剤及び化学式1のカテコールを持つ化合物を溶解させる工程;
(c)上記工程(b)で製造された溶液にN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)を添加して、反応させる工程;及び
(d)上記工程(a)の溶液に上記工程(c)の溶液を添加して、反応させる工程。 - 前記極性有機溶媒はアルコール、DMSO、DMF、アセトン及びNMPからなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項16に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- 前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシp−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項16に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- 前記架橋剤は、ベンゾトリアゾリルオキシトリス(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(BOP)、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、エチル−(ジメチルアミノ)プロピルカルボイミドハイドロクロライド(EDC)、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)、N−ジヒドロキシスクシンイミド(NHS)及びシアノヒドリドほう酸ナトリウムからなる群より選択された一つ以上であることを特徴とする請求項16に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- 前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−L−フェニルアラニン、アミン基を含む3−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む3,4−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む3,4−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項16に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- (e)前記工程(d)の溶液を透析する工程をさらに含むことを特徴とする請求項16に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- (f)前記工程(e)で透析された溶液を凍結乾燥する工程をさらに含むことを特徴とする請求項21に記載の化学式1のカテコールを持つ化合物が結合されているポリエチレングリコール誘導体の製造方法。
- 次の工程を含む、請求項1〜6のいずれか一項のポリエチレングリコール誘導体が蛋白質またはペプチドのN末端アミン基に単一体で接合されていることを特徴とする蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法:
(a)反応槽内の蛋白質またはペプチドを溶解させる工程;
(b)他の反応槽内の前記ポリエチレングリコール誘導体を溶解させる工程;及び
(c)前記工程(a)の溶液に前記工程(b)の溶液を添加して、反応させる工程。 - 前記ポリエチレングリコールは、メトキシアルデヒドポリエチレングリコール、スクシンイミドプロピオン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミドブタン酸ポリエチレングリコール、メトキシスクシンイミジルコハク酸ポリエチレングリコール、メトキシベンゾトリアゾールカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシエポキシドポリエチレングリコール、メトキシカルボニルイミダゾールポリエチレングリコール、メトキシp−ニトロフェニルカルボン酸ポリエチレングリコール、メトキシイソシアン酸ポリエチレングリコール、一級アミンを含むメトキシアミンポリエチレングリコール、メトキシヒドラジドポリエチレングリコール及びカルボキシル基を含むメトキシカルボキシルポリエチレングリコールからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- 前記カテコールを持つ化合物は、カルボキシル基とアミン基を含むジヒドロキシ−L−フェニルアラニン、アミン基を含む3−ヒドロキシ−チラミン、カルボキシル基を含む3,4−ジヒドロキシヒドロけい皮酸、アルデヒド基を含む3,4−ジヒドロキシベンゾアルデヒド及びノルエピネフリンからなる群より選択される一つであることを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- (d)前記工程(c)の溶液を透析したあと接合体を分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- 前記工程(d)で接合体を分離する方法は液状クロマトグラフィーを利用することを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- 前記工程(d)はポリエチレングリコール誘導体と酸化剤を1:1〜1:10のモルとして反応槽内で溶解させることを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- 前記酸化剤は、NaIO4、MnCl2、FeCl2、FeCl3、KMnO4、H2O2、Na2Cr2O7及びNa3VO4からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする請求項28に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
- 前記工程(b)の反応は2〜100時間の間4〜25℃の温度で行われることを特徴とする請求項23に記載の蛋白質またはペプチド−ポリエチレングリコール誘導体の接合体の製造方法。
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