CZ289997A3

CZ289997A3 - Insulinový derivát, farmaceutický prostředek pro léčení diabetes a způsob jeho léčení

Info

Publication number: CZ289997A3
Application number: CZ972899A
Authority: CZ
Inventors: Jan Markussen; Ib Jonassen; Svend Havelund; Jakob Brandt; Peter Kurtzhals; Per Hertz Hansen; Niels Christian Kaarsholm
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-18
Publication date: 1998-01-14
Also published as: ATE245659T1; NO974270L; DE69629210T2; CZ289343B6; BR9607647A; PL322299A1; EP0871665A1; EP0871665B1; CN1196061A; CA2215694A1; NO974270D0; MX9707056A; PL183698B1; WO1996029344A1; KR19980703039A; AU720966B2; JPH11502110A; DE69629210D1; JP3872105B2; HUP9800523A3

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká inzulínového derivátu, farmaceutického prostředku pro léčení diabetes a způsobu jeho léčení, Podrobněji - předložený vynález se týká nového lidského inzulínového derivátu, který je rozpustný a má protráhovaný profil působení, způsobu získávání tohoto derivátu, farmaceutického prostředku, který ho obsahuje, a použití tohoto inzulínového derivátu pro léčeni diabetes.

Dosavadní stav techniky

Mnoho diabetických pacientů je léčeno vícekrát denně podávanými injekcemi inzulínu v takovém režimu, který zahrnuje jednu nebo dvě denní injekce protrahovaného inzulínu, kterými se pokryje základní požadavek dodáváni bolus injekcemi rychle působícího inzulínu pro pokryti požadavků souvisejících s jídlem.

Prostředky s protrahovaným inzulínem jsou dobře známy z oblasti techniky. Jeden z hlavních typů prostředků s protrahovaným inzulínem zahrnuje injekčně podávané vodné suspenze krystalů inzulínu nebo amorfního inzulínu. V těchto prostředcích se jako sloučeniny inzulínu typicky používá protaminový inzulín, Zn-inzulín nebo protaminový Zn-inzulín.

S používáním inzulínových suspenzí souvisí některé nevýhody. Aby se zajistilo přesné dávkování, musí být inzulínové částice homogenně suspendovány mírným třepáním před tím, než se z ampulky odebere definovaný objem suspenze nebo než se definovaný objem vytlačí 2 krabičky. Při skladování suspenzí inzulínu musí být teplota udržována v užších mezích než u inzulínových injekcí, abychom se vyhnuli tvorbě kousků nebo koagulaci.

I když bylo dříve předpokládáno, že protaminy nejsou imu·< ·» nogenní, nyní se ukázalo, že protaminy mohou být u Člověka imunogenní a Žě jejich použití pro lékařské účely může vést k tvorbě protilátek [Samuel a spol.: Studies on the immunogenicitý od prótamines in humáns and experimetal animals of a micro-complement fixation test, Clín^ Exp. Immunol. 33. 252 až 260 (1978).].

Byl Zjištěn také důkaz toho, že komplex protamin-inzulín je.sám imunogenni [Kurtz a spol.: Circulating IgG anťibody to protamine in patients treated with protamine-insuiihs, Diabetologica 25, 322 až 324 (1983).]. U některých pacientů je tedy nutné vyhnout se použití protřahovaných inzulínových prostředků obsahujících protaminy.

Jiným typem protřahovaných inzulínových prostředků jsou roztoky> které mají pH pod fysiologickým pH, při čemž se inzulín bude srážet, protože pH se zvyšuje, když se roztok podává injekčně. Nevýhodou jě to, že pevné částice inzulínu působí jako lokání dráždivě činidlo, které způsobuje 2ánět tkáně v místě injekce.

Spis WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) popisuje přotrahované, rozpustné inzulínové prostředky obsahující inzulínové komplexy trojmocného kobaltu. Protrahováni těchto komplexů jíe pouze střední a biologická životaschopnost je snížena.

Lidský inzulín má tři primární aminové skupiny: N-koncoVou skupinu A-řetězce a B-řetězce a e-aminovou skupinu Lys®²⁹. V oblasti techniky jsou Známy některé inzulínové deriváty, které mají substitováriu jednu nebo více z těchto skupin. Ták USA patent Č. 3 528 960 (Eli Lilly) se týká N-kárboxyařoylinzulínů, v nichž jedna, dvě nebo tři primární aminové skupiny molekuly inzulínu mají karboxyaroyloVou skupinu. Nebyly popsány žádné specificky N^tB29 substituované inzulíny.

Podle britského patentového spisu č. 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Corp.) bylo zjištěno, že inzulín s karbamylovou substitucí ·* ···· na N^tB2e má zlepšený profil hypoglykémického účinku.

Japonský patentový vykládací spis Č. 1-254669 (Kodama Co., Ltd.) popisuje inzulín, v němž je mastná kyselina navázána na aminovou skupinu Phě^B1 nebo na e-aminovou skupinu Lys⁰²⁹ nebo na obě tyto skupiny. Stanoveným účelem této derivatizace je získat farmakologicky přijatelný, stabilní inzulínový přípravek.

Inzulíny, které mají v poloze B30 aminokyseliny s alespoň 5 atomy uhlíku, které nemusí být nutně kódovány tripletem nukleotidů, jsou popsány v japonském patentovém vykládacím spisu č. 57-067548 (Šhionogi). Inzulínové analogy jsou nárokovány jako užitečné při léčení diabetes mellitus, zvláště u pacientů, kteří jsou resistentní na inzulín díky vzniku protilátek na hovězí nebo prasečí inzulín.

USA patent 5 359 030 (Ekwuribe, Protein Delivery, lne.) popisuje konjugaci - stabilizované polypeptidově prostředky pro orální nebo parenterální podávání obsahující polypeptid kovalentně kondenzovaný s polymerem zahrnujícím lineární polyalkylenovou část a lipofilní část. Tyto Části jsou uspořádány navzájem vůči sobě tak, že polypeptid má zvýšenou in vivo resistenei na enzymatickou degradaci.

Evropská pateritová přihláška 511600 A2 se týká, mimo jiné, proteinových derivátů obecného vzorce [protein][Z„], v němž [protein] znamená protein s n aminovými Skupinami, z nichž každá je odvozena od aminové skupiny odstraněním jednoho z jejích atomů vodíku místo aminových skupin, [ Z ] znamená skupinu obecného vzorce -CO-W-COOH, v němž W znamená dvoj vaznou uhlovodíkovou skupinu s dlouhým řetězcem, která může obsahovat také některé heteroatomy a n znamená průměrný počet amidových vazeb mezi [Z] a [proteinem]. Je uvedeno, že proteinové deriváty podle vynálezu mají mimořádně prodloužený poločas životnosti sera při srovnání s proteiny, od nichž jsou dovoženy, a že nevykazují žádnou antigeničriost. Také se Uvádí, že inzulín je jedním z proteinů, z nichž lze vyrobit deriváty podle vynálezu, ale • ft ί » •V * i i < * t; i t i ,· «. «·. » ··

I. ♦ * í¹*·

v. evropské s patentové . přihlášce 511600) nejsou popsány.', žádné špéčiflckěririzúlíňóvéVdériýáty ani nejsou uvedeny výhodné [Z] nebo (a) poloha (polohy), do nichž by měl být [Ž[] zaveden, aby se zíškaiý užitečné¹. inzulínové? deriváty: a. : ' íaqv· Jhr,í «íir MLi. . >ϊ;·;κ??4γλ· i Kdykoliv je v předloženém spisu použit pojem inzulín v několikerém významu nebo vé významu ^generickém, zahrnuje jak

·. ' t?' ,í ·.. . .· '<

v přírodě se vyskytující inzuliny_rtak analogy-inzulínu a jeho

-¹ ' *:’ *' ”· : <z- .·.* 4A ·*) , «4 ~ Wi. fi in*' R. ¹ 'ifc. —* * ‘ ·#> < ^lvX 5f' Tp* ·' * .'Wi* deriváty. Pojmem derivát inzulínů” Se* zde fózůmí polýpeptid, který má molekulární strukturupodobnou struktuře lidského inzulínu včetně disuífidových můstků mézi Cys^A7 a Cys®⁷ a mezi / >-u. '-ί: ' _e

Cys^Aaova Cys®¹⁹, vnitřní .dišulfidóvý, můstek mezi Cys^A6 a Cys*¹¹ a ';«*! r>l . .··.' íi I J’’*· ·' '.«Ífcrfb Ár>'· ••.i’* ->·· ·.> ^!.> }*· ·*-♦· ^;.· ’ί -I ^,;j ’ Λ.

který máinžůlínovou aktivitu^ 7 ’* ' V

Existuje však ještě potřeba protrahovanýchinjekčně poda'*·.··-' : ' ...ϊ'/-···.. A.' .£ \ V „ , · -ných inzulínových prostředku, kterými jsou roztoky, které obsahují inzulíny, které zůstávají po podání injekcí v roztoku a mají minimální zánětlivé a imunogenní vlastnosti.

Jedním z předmětů předloženého vynálezu je získat lidské inzulínové deriváty s protrahóvaným profilem účinku, které jsou '< ····· V- >'*· ··.·’“·; -*·· ' -i- rožpustné_rpři fysiologických hodnotách pH. _A /? & JŮ ' ' '

Jiným předmětem přédloženého vynálezů je získání farmaceutického prostředku obsahujícího lidské inzulínové deriváty podle 'vynálezu. . >/. y ·. .·) : *. rj-.s r ,,s·

Dalším předmětem vynálezů je získat způsob výroby lidských inzulínových derivátů podle vynálezu.

Podstata vynálezu . .

Překvapivě bylo zjištěno, že některé inzulínové deriváty, v nichž buč'aminová skupina iN-koncové aminokyseliny B-řetězce má napojený lipofilni substituěnt s 12 až 40 atomy uhlíku nebo v nichž Skupina karboxylové kyseliny na C-konci aminokyseliny B-řetězce má napojený lipófilnírsubstituěnt *s 12 až 40 atomy

uhlíku, mají prótrahovaný profil účinku a jsou rozpustné při fysiologických hodnotách pH.

Předložený vynález se tedy ve svém nejšiřěím aspektu týká inzulínového derivátu následující obecné sekvence

S------------------_S

A-řetězec j 7 |

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12

S

I

S

B-řetězec J

Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cyš-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-řetězec (pokr.) 20

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekVi id. č. 1) 13 14 15 16 17 18 1.9 | 21

----S

I

S

B-řetězec (pokr.) |

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

B-řetězec (pokr.)

Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xáa (sekv. id. č. 2)

26 27 28 29 30 v niž

Xaa v póloze A2l znamená jakoukoliv kódovatelriou aminokyselinu kromě Lys, Arg a Cys,

Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamenají nezávisle na sobě jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys nebo jsou vynechány,

Xaa v poloze B3Ó znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma CyS, dipeptid neobsahující Cys nebo Arg, tripeptid neobsahující čys nebo Arg, tetrapeptid neobsahující čys nebo Arg nebo je vynechán., a buá aminoskupina N-korice aminokyseliny B-řetězcé má lipofilní skupinu W na ni připojenou, při čemž tato skupina má 12 až 40 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, nebo karboxyskupina na • ft · ⁶

C-konci aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu Z na ni připojenou, při čemž tato skupina má 12 až 40 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, s tím, že jestliže jedna nebo více aminokyselin v polo2e Bl, B2 a B3 jé deletováno, potom číslo N-kóhcové aminokyseliny se spočte odpočítáním od Cys“⁷, který je vždy označen číslem 7, a Že

a) jestliže Β1-β2-Β3 znamená Phe-Val-Asn, A21 znamená Asn a B26-B27-B28-B29-B30 znamená Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr nebo Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, potom W nebo Z vždy obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá,

b) jestliže B29 a B30 jsou deletovány a shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyseliny B-řetězce a ani Bl, árii B2 ani B3 není deletována> potom B1-B2 neznamená Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2 tak B26-B27-B28 znamenají jiné než uvedené sekvence, a

c) jestliže B29 a B30 jsou deletovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyseliny B-řetězce a jedna z Bl, B2 nebo B3 je deletovária, potom N-koneová aminokyselina B-řetězce neznamená Val nebo sekverice B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-tetězce tak sekvence B26-B27-B28 neznamená Val, respektive Tyr-Thr-Pro.

Ve výhodném provedeni se předložený Vynález týká inzulínového derivátu následujícího obecné sekvence:

• «v _S___----------------;-g

A-řetězec | 7. |

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12

S i

S

B-řetězec |

Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-řetězec (pokr.) 20

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekv. id. č. 1) 13 14 15 16 17 18 19 | 21

-——S

I s

B-řetězec (pokr.) |

Glu-Ala-Leu-Tyř-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

B-řetězec (pokr.)

Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (sekv. id. č. 2)

26 27 28 29 30 v níž

Xaa v poloze A21 znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu kromě Lys, Arg a Cys,

Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28, B29 a B30 znamenají nezávislé na sobě jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys nebo je vynechána a buá arainoskupina N-koňcóvé aminokyseliny B-řetězce má lipofilní Skupinu W na ni připojenou, při čemž tato skupina má 12 až 40 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, nebo karboxyskupina na C-konci aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu Z na. ni připojenou, při čemž táto skupina má 12 až 40 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá s tím, _že jestliže jedna nebo více aminokyselin v poloze Bl, B2 a B3 je deletováno, potom číslo N-kóncové aminokyseliny se zjistí odpočítáním od Cys^B'_# který je vždy označen číslem 7 a že

a) jestliže B1-B2-B3 znamená Phe-Val-Asn, A21 znamená Asn a B26-B27-B28-B29-B30 znamená Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr nebo Tyr-Thr»« *

-Pró-Lys-Ala, potom W nebo Z vždy obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá,

b) jestliže B29 a B30 jsou deletováňy a skupina shora uvedená Z je přítomna ná C-konci aminokyseliny B-řetězce a ani Bl, ani B2 ani B3 není deletována, potom B1-B2 neznamená Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2 tak B26-B27-B28 znamenají jiné než uvedené sekvence, a

c) jestliže B29 a B30 jsou delétovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyselinyB-řetězce a jedna z Bl, B2 nebo B3 je deletována, potom N-koncová aminokyselina B-řetěžce neznamená Val nebo sekvence B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-řetězce tak sekvence B26-B27-B28 neznamená Val, respektive Ťýr-Thr-Pro.

jestliže je lipofilní skupina W připojena na a-aminovou skupinu Ν-kóncové aminové skupiny B-řetězce, potom vazba mezi α-aminovou skupinou a W s výhodou znamená amidovou vazbu, v niž N-koncová aminová skupina B-řetězce znamená aminovou část a skupina obsažená ve W znamená karboxylovou část.

Jestliže je lipofilní skupina Z napojená na karboxylovou skupinu Č-koncové aminokyseliny B-řetězce, potom vazba mezi karboxylovou skupinou a Z s výhodou znamená amidovou vazbu, při čemž C-koncová karboxylová skupina znamená karboxylovou Skupinu a aminová skupina obsažená v Z znamená aminovou část.

V jiném výhodném provedení še vynález týká shora popsaného inzulínového derivátu, v němž lipofilní skupina W je připojena na u-aminovou skupinu Ň-koncóvé aminokyseliny B-řetěžce.

V jiném výhodném provedení se vynález týká Shora popsaného inzulínového derivátu, v němž lipofilní skupina Z jé připojená na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny B-řetězce.

V jiném výhodném provedeni še vynález týká inzulínového » ť. ’ k » ' »' ‘ i- · e f? ·: <' v ' ♦:

s ι>· . o* i-, · «t <·

C ' <·. r í: ^r

O o O C *'

4- · Ϊ * * ’· <: i. '

4* h í f' · ^Λϋ· .,· :»9 derivátu,;_; v·,němž aminokyselina v poloze A21 je vybrána zeskupiňy sestávající .z, Ala,> Asn, Gin,/Glu,;·Gly a Ser.

•,f -r> š t.-t ·^Γγ'·'. ’

V jiném výhodném provedení se vynález tyká inzulínového derivátu vi němž} aminokyselina £ v -poloze ; B1 znamená Phe .

.ď-.uvnt’». ; ϊφΟ⁴ tíh Wto». v s l.Vtjiném;·výhodném provedení šé vynález týká inzulínového derivátu., V němž aminokyselina v poloze B1 jé vynechána.

V jiném výhodném^provedení -se vynález týká inzulínového derivátu, v,němžaminokyselinaiv.poloze B2.je Vybrána,ze skupiny sestávající z Ala a Val.

•ř.

V jiném výhodném.provedení-se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina.v poloze B3 je vybrána ze skupiny sestávající z Asn, Gin, Glu a Thr.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B26 znamená Tyr.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B27«znamená Thr. .

-, vyýtora í.Q ,.

-, V jiném výhodném.provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Pro.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B29 znamená Lys nebo

Thr.

V jiném výhodném provedeni se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Lys a aminokyselina v poloze B29 znamená Pto.

• t Ť

I*

V jiném výhodném provedení, se. vynález týká inzulínového derivátu, v, němž. aminokyselina v poloze B30 znamená Thr nebo e-acylovaný Lys.

·* ·

V jiném výhodném provedení sé vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená dipeptid Thr-Lys.

V jiném výhodném provedeni se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená dipeptid Gly-Lys.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu., v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tripeptid Glu-Ser-Lys.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tripeptid Thr-Gly-Lys.

V jiném výhodném provedeni se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. Č. 2 znamená tetrapeptid Thr-Gly-Gly-Lys.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 3Ó v sekv. id. č..2 znamená tetrapeptid Thr-Glu-Gly-Lys.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tetrapeptid Gly-Asp-Thr-Lys. .........

V jiném výhodném provedení sě vynález týká inzulínového, derivátu, v němž C-koncová aminokyselina B-řetězce znamená €-acylovaný Lys a aminokyselina vedle C-koncově aminokyseliny znamená Gly.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B30)-inzulín.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B30)-lidský inzulín.

V jiném výhodném provedení sé vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B28-B3Ó)-inzulín.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín Znamená des(B27-B30)-inzulín.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B26-B30)-inzulín.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Pro a aminokyselina v poloze B29 znamená Thr.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina W připojena na N-koncovou α-aminoskupinu B-řetězcé, při Čemž W znamená skupinu obécného vzorce CH₃(CH₂)_nGH(COOH)NH-CO(CH₂)₂CO-, kde n znamená číslo od 9 do 15.

V jiném výhodném provedeni se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená Skupina W připojená na N-konCovou α-aminoskupinu B-řetězce, při čemž W znamená skupinu obecného vzorce CH₃(CH₂) _rCO-NHCH(COOH )(CH_a) ₂C0-, kde r znamená Číslo od 9 do 15.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina W připojena na N-kóncovou α-aminoskupinu B-řétězce, při Čemž W znamená skupinu obechého vzorce CH₃(CH₂)_eC0-NHCH( (CH₂) _aCOOH) CO-, kde s znamená číslo od 9 do 15.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina z připojena na C-kon-

·«· · • « covou aminokyselinu B-řetězce, při čemž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH) (CH₂)₄NH-CO(CH₂)_BCH₃, kde m znamená číslo od 8 do 18, tj. Z znamená N'-acyíovaný lysinový zbytek.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina Z připojena na C-koncovou aminokyselinu B-řetězee, při čemž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH) {CH₂)«NH-COCH( (CHJ₂COOH)NH-CO(CH₂)_PCH₃, kde p znamená Číslo od 10 do 16.

v jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina Z připojena na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce, při Čemž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH) (CH₂),NH-C0CCH₂)₂CH(C00H)NH-C0(CH_a),CH₃, kde q znamená Číslo od 10 do 16.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, který má shora uvedenou skupinu Z, která obsahuje částečně nebo úplně hydrogenovaný cyklopěntanfenantrenový skelet.

V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, který má shora uvedenou skupinu Z, která znamená acylovanou aminokyselinu, zvláště acyíovaný lysin.

.V jiném výhodném provedení se vynález týká Thr“⁹ lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenu ná C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.

V jiném výhodném provedení se vynález týká des(B28-B30) lidského inzulínu, který má shora uvedenou Skupinu Z připojenu na G-koncovou aminokyselinu B-řetězce.

V jiném výhodném provedení se vynález týká des_:(B27-B30) lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenu na G-koncovou aminokyselinu B-řetězce.

V jiném výhodném provedení se vynález týká des(B26-B30) . * · • · • · ·· · · ’ Σ ί J · · ··;

lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenu na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.

V jiném výhodném provedeni se vynález týká použití inzulínového derivátu podle vynálezu prd výrobu léčivého přípravku pro léčení diabetes.

V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení diabetes pacientů, kteří toto léčení potřebují, při čemž tento přípravek obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle Vynálezu společně s farmaceuticky při jatelným nosičem.

V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení diabetes u pacientů, kteří toto léčení potřebují, při čemž tento přípravék Obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle vynálezu ve směsi s inzulínem nebo analogem inzulínu, který má rychlý nástup působení, společně s. farmaceuticky přijatelným nosičem.

V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, který obsahuje inzulínový dérivát pódle vynálezu, který je rozpustný při fyšiologických hodnotách pH.

V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, který obsahuje inzulínový derivát podle vynálezu, který je rozpustný při pH V rozmezí od 6,5 do 8,5.

V jiném výhodném provedení se vynález týká přotřahováného farmaceutického přípravku obsahujícího inzulínový derivát podle

V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, kterým je roztok obsahující od 120 nmolů/ml do 1200 nmolů/ml, s výhodou 600 hmOlů/ml inzulínového derivátu podle vynálezu.

·· ·

V jiném výhodném provedení, se vynález týká způsobu léčení diabetes u pacienta, který toto léčení potřebuje, vyznačující se tím, Se se pacientovi podává terapeutický účinné množství inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

v jiném výhodném provedení še vynález týká způsobu léčení diabetes u pacienta, který toto léčení potřebuje, Vyznačující še tím, Se Se pacientovi podává terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu ve směsi s inzulínem nebo analogem inzulínu, který má rychlý nástup působení, společně s farmakologicky přijatelným nosičem.

Příklady výhodných inzulínových derivátů podle předloženého vynálezu jsou následující; (N‘^B3ů-tetradekanoyl)Thr^Ba’,Lys^B3O-lidský inzulín, (N«^DiB-tetradekanoyl )Lys^Ď28des(B29,B30)-lidský inzulín, (N^ťB2’-tetradekanoyl)Lys^B27des(B28-B30)-lidský inzulín, (N^fB26-tetradekanoyl)Lysⁿ²⁶des(B27-B30)-lidský inzulín, (N‘^M2-tetradekanoyl)Glu^B3°,Ser“¹,Lys^B32-lidský inzulín a (N^eB29-acetyl,N‘“²-tetradekanoyl) Glu“⁰, Ser“¹, Lys“²-lidský : inzulín.

Předložený vynález je dále ilustrován odkazem na připo jené obrázky, kde:

obrázek 1 ukazuje konstrukci plasmidu pKV153, pKV159, pJB173, PJB174 a pJB175 a obrázek 2a, který pokračuje jako obrázek 2b, ukazuje sekvenci pMT742, poloha 907 až 1500, a oíigonukleotidy č. 94, č. 593, č. 2371 a č. 3075 použitě pro pCRlA, pCRlB a PGR1C z příkladu 1. Sekvence o 138 aminokyselinách odpovídající MF alfa prepro-leaderu (aminokyseliny č. l až 85) a inzulínový prekursor, který má aminokyselinovou sekvenci B(l-29)AlaAlaLys. .A( 1-^21), kde A(l-21) znamená A řetězec lidského inzulínu a B(l-29) znamená B-řetězec lidského inzulínu, v němž chybí Thr(B30), je uvedena pod kódující sekvencí (aminokyseliny č. 86 až 138).

···*

V další částí spisu bude vynález popsán podrobněji.

Ťřípísměnkové kódy a jednopísměnkové kódy pro zbytky aminokyselin, jak jsou zde používány, jsou uvedeny v J. Biol. Chem. 243. 3558 (1968).

V DNA sekvencích A znamená adenin, C znamená cytosin, G znamená guanin á T znamená thymin.

Ve spisu jsou používány následující zkratky:

DříSO pro dimethylsulfoxid,

DMF pro dimethylformamid,

Boc pro terč.butoxykarbony1,

NMP pro l-methyl-2-pyrrolidon,

ŤFA pro trifluóroctovou kyselinu,

X-OSu pro N-hydroxysukcinimidový ester,

X pro acylovou skupinu a

RP-HPLC pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na obrácených fázích.

Příklady provedení vynálezu

Inzulínové deriváty podle předloženého vynálezu se mohou připravovat mimo jiné následujícími způsoby.

1. Inzulínové deriváty, vyznačující še tím, že mají v poloze B30 aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem, např. threonin (lidský inzulín) nebo alanin (vepřový inzulín)

1.1 Inzulíny modifikované připojením lipofilní skupiny W na N-koncovou aminovou skupinu, vycházející z lidského inzulínu

Lidský inzulín se nechá zreagovat s Boc-reákčnim činidlem (např. di-terc.butyldikarbonátem). Vytvoří se (Al,B29)-diBoc-lidský inzulín, tj. lidský inzulín, v němž N-konec A-řetězce ·«·· a e-aminoskupina Lys“⁹ jsou chráněny Boc-skupinou. Po případném vyčištění, např. HPLC, se do α-aminové Skupiny Phě“ zavede acylová skupina tak, Že se produkt nechá zreagovat s H-hydróxysukcinimidovým esterem obecného vzorce W-OSu, v němž W znamená acylovou skupinu jak shofa uvedeno, která má být zavedena na N-končovou g-aminovou skupinu B-řetězce. V konečném stupni se pro odstranění Boc-skupin použije TFA. Isoluje se produkt N^OB1-W lidský inzulín.

2. Inzulínové deriváty bez aminokyselinového zbytku v poloze B30, tj. des(B30) inzulíny

2.1 Výchozím materiálem je lidský nebo vepřový inzulín

Reakcí s karboxypeptidasou A v amoniakovém pufru jak lidský tak vepřový inzulín poskytly des(B30)-inzulín. Po případném vyčištění se des(B30)-inzulín nechá zreagovat s Boc-reakčním činidlem (např. di-terc.butyl-dikarbonátem). Vznikne (A1,B29)-diBoc-des(B30)-inzulín. Po případném vyčištění, např. HPLC, se ďo α-aminóvé skupiny aminokyseliny v poloze Bl záVéde acylová skupina tak, že Se produkt nechá zreagovat s N-hydfoxysukeinimidovým esterem obecného vzorce W-OSu, v němž W znamená acylovou skupinu, která má být zavedena. V konečném stupni se pro odstranění Boc-škupin použije TFA. Isoluje se produkt (N^-W) děs (B3 0) - inzul ί n.

2.2. Výchozím materiálem je prekursoř lidského inzulínu s jedním řetězcem

Jako výchozí mateirál se může použít prekuršor lidského inzulínu s jedním řetězcem, který je rozšířen v poloze Bl přidáním Ext, které je napojeno Bl argininovým Zbytkem a který má můstek od C-koncového lysinu v poloze B26, B27, B28 nebo B30 na Al. Tímto můstkem je s výhodou peptid obecného Vzorce Y„-Arg, v němž ¥ znamená kodovatelnou aminokyselinu kromě cysteinu, lysinu a argininu, a n znamená číslo nula nebo číslo mezi 1 a 35. Jestliže η>1, Y mohou znamenat různé aminokyseliny.

• fl··

Výhodnými příklady můstku od Lys v poloze B26, B27, B28 nebo B30 na Al jsou: AlaAlaArg, ŠerArg, SerAspAspAlaArg a Ařg (evropský patent č. 163 529), Reakce tohoto prekuršoru obecného vzorce Ext-5Arg-B(l-Q)-Y_n-Arg-A(l-2l ), v němž Q znamená 26, 27, 28 nebo 30, s lysylendopeptidasou, např. Achromobacter lyticus ptoteasou, poskytuje Ext-Arg-B(l-Q) Y_n-Arg-A(l-21)-inzulín. Acylace tohoto meziproduktu N-hydroxysukciniroidovým esterem obecnéhó vzorce X-OSu, v němž X znamená acylovou skupinu, zavádí acylovou skupinu X do c-aminové skupiny Lys⁸⁰ a dó N-koncově aminoskupiny A-řetězce a B-řetězce za vzniku (N^<BQ-X) X-Ext-Arg-B(l-Q) X-Y„-Árg-A( 1-21)-inzulínu. Tento meziprodukt reakcí s trypsinem ve směsi vody a vhodného organického rozpouštědla, např. DMF, DMSO nebó nižšího alkoholu, poskytuje žádaný derivát, Z-lidský inzulín, v němž Z znamená Lys^eBQ-X.

V další části popisu jsou popsány farmaceutické přípravky.

Farmaceutické přípravky obsahující derivát lidského inzulínu podle předloženého vynálezu se mohou pacientům, kteří to potřebují, podávat parenterálně. Parenterální podávání sé může provádět subkutánní, intramuskulární nebo intraveňózní injekcí injekční Stříkačkou, popřípadě injekčním perem. Parenterální podáváni se může provádět také infuzňí pumpou. Další volbou je prostředek, kterým může být prášek nebo kapalina pro podávání derivátu lidského inzulínu jako nazální sprej.

Farmaceutické prostředky obsahující sloučeninu podle předloženého Vynálezu se mohou připravovat konvenčními způsoby, např. jak je popsáno v Remington's Pharmaceutical Sciences., 1985.

Injektovatelrté lidské inzulínové prostředky podle vynálezu se mohou připravovat konvenčními způsoby farmaceutického průmyslu, které Zahrnují rozpuštění a smíchání složek tak, aby se z í ska1 žádaný produkt.

Podle jednoho postupu se lidský inzulínový derivát rózpus18 ·* * Σ • · * • « · • » · ·> ·· tl v takovém množství vody, které je poněkud menší než konečný objem prostředku, který Se připravuje. Podle potřeby se přidá isótoňické činidlo, ochranné činidlo a pufr a pH roztoku se upraví, jestliže je to nutné, kyselinou, např. kyselinou chlorovodíkovou, nebo bázi, např. vodným hydroxidem sodným, podle potřeby. A nakones se objem roztoku upraví vodou tak, aby se získala žádaná koncentrace složek.

Příklady isotoničkých činidel jsou chlorid sodný, manitol a glycerol.

Příklady ochranných činidel jsou fenol, m-křesol, méthylester p-hydroxybenzoové kyseliny a beňzylalkohol.

Příklady vhodných pufru jsou octan Sodný a fosforečnan sodný.

Výhodnými farmaceutickými prostředky příslušných inzulínů podle předloženého vynálezu jsou roztoky hexamernich komplexů. Hexamerní komplexy jsou typicky stabilizovány dvěma nebo více ionty.zinku a třemi nebo více molekulami fenolické sloučeniny, jako je fenol nebo m-kresúl nebo jejich směsi na hexamer.

Ve zvláštním provedeni se získává prostředek, který obsahuje dva různé inzulíny, jeden s protrahovaným profilem působení a jeden s rychlým nástupem působení, ve formě rozpustných hexametriích komplexů. Hexamerní komplexy jsou typicky stabilizovány dvěma nebo více iontu zinku a třemi nebo více molekulami fenolické sloučeniny, jako je fenol nebo meta-kresól riebo jejich směsi, na hexamer. Tyto komplexy jsou směsi hexamerů příslušných inzulínů a směsných hexameru, v nichž je poměr mezi dvěma různými inzulíny od 1:5 do 5:1.

Prostředek pro nazální podávání inzulínového derivátu podle předloženého vynálezu se může připravovat například tak, jak je to popsáno v evropském patentu Č,. 272 097 (Novo Nordišk

A/S).

t··

Inzulínové prostředky podle tohoto vynálezu se mohou používat pro léčení diabetes. Optimální dávka pro pacienta bude záviset na různých faktorech, mezi něž patří účinnost specifického používaného lidského inzulínového derivátu, věk, tělesná hmotnost, fyzická aktivita, dieta pacienta, na možně kombinaci S jinými léčivými látkami a na intenzitě diabetes. Doporučuje se, aby denní dávka lidského inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu byla stanovena pro každého jednotlivého pacienta odborníkem z oblasti techniky podobným způsobem jako je to u známých inzulínových prostředků.

Jestliže je to vhodné, deriváty lidského inzulínu podle tohoto vynálezu se mohóu používat ve směsi s jinými typy inzulínů, například lidským inzulínem, vepřovým inzulínem nebo analogy inzulínu s rychlejším nástupem působeni. Příklady těchto analogů inzulínu jsou popsány např. v evropských patentových přihláškách Č. 214 826 (Novo Nordisk A/S), 375 437 (Novo Nořdisk A/S) a 383 472 (Eli Lilly & Co).

Předložený vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nejsou zkonstruovány jako omezení rozsahu ochrany. Vlastnosti popsané v předcházejícím popisu a v následujících příkladech mohou, jak odděleně tak v jakékoliv kombinaci, být materiálem pro uskutečnění vynálezu v jeho různých formách.

Plasmidy a DNÁ materiál

Všechny expresní plasmidy jsou typu cPÓT. Takové plasmidu jsou popsány v evropské patentové přihlášce č, 171 142 a vyznačují se tím, že obsahují Schizosaccharomyces pombe triosofosfátisomerasový gen (POT) pro selekci a stabilizaci plasmidu. Plasmid obsahující POT-gen je dostupný z uloženého E. coli kmene (ATCC 39 685). Plasmidy dále obsahují S. carěvisiae třiosofósfátisomerasóvý promotor a terminátor (P_TPI a Ť_TPI). Jsou identické s pMT742 [Ěgel-rMitahi M. a spol.: Gene 73, 113 až 120 (1988).] (viz obr. 1) až ha oblast definovanou EčoRI-Xbal res·« ··· ·· »·♦» • · · · · ··** · ··· ·· trikčními místy zahrnujícími oblast kódující MF alfa prepro-leader/produkt. EcoRI/Xbal fragment plasmidu pMT742 samotný kóduje MF alfa prepťo-leader sekvenci Saccharomyces cerevísiae následovanou inzulínovým prekúrsorem MI3, který má můstek Ala-Ala-Lys spojující B29 a Al (tj. B(1-29)-Ala-Ala-Lys-A(1-21)) (viz obr. 2).

Syntetické DNA fragmenty byly syntetizovány na automat ic1 kém syntetizátoru DNA (Applied Biosystems model 380A) pomocí fosforamiditové chemie a komerčně dostupných reakčňích činidel [Beaucagé S.L. a Caruthers M.H.: Tetrahedron Letters 22, 1859 až 1869 (1981).].

Všechny další způsoby a materiály používají obvyklý stav znalosti z oblasti techniky [viz např. Sambrook J., Fritsch E. F. a Maniatis Ť.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.).].

Analytické 2působy

Molekulární hmotnosti vyrobených inzulínových prekursořů byly získány hmotnostní spektroskopií (MS), buá hmotnostní spektrometrií s desorpčí plasmou (PDMS) použitím přístroje Bio-Ion 20 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Švédsko) nebo hmotnostní spektrometrií š ionizaci elektrósptejěm (ESMS) použitím přístroje API III Biomolecular Maés Analyzer (Perkin Elraer Sciex Instruments, Thornhill, Kanada).

Lipofilnost inzulínových derivátů vzhledem k lidskému inzulínu, k'_xel, byla měřena na HPLC koloně LiChrošorb^<B) RP 18 (5 μίη, 250 x 4 mm) isokratickou elucí při 40 °C použitím směsi A: 0,lM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,3, obsahující 10 % (hmotn.) acetonitrilu a B: 50 % (hmotn.) acetonitrilu ve vodě. Eluce byla sledována absorpci eluátu při 214 nm. Mrtvý čas to byl zjištěn injektováním 0,lmM dusičnanu sodného. Retenční doba lidského inzulínu t>.,.„.n. byla upravena měněním poměru roztoků A a B ták, aby činila alespoň 2to. Hodnota k⁷rcl je definována « · · «

·· ···· jako poměr (t^^-tj/ft^-tj.

Jako míra protrahováhí (zpomalené uvolňování) sloučeniny podle vynálezu byla studována rychlost mizeni u prasat a byla stanovena hodnota T_5ot. T_50t je doba, za kterou vymizí 50 % hmotn. A14 Tyr(^J2SI)-značeného analogu z místa injekce, měřeno vnějším γ-počítačem (Ribel U. a spol.: The Pig ás a Model fór Subcutaneous Absorption in Man”, V.M.Serrano-Rios a P.J.Lefebre (red.): Diabetes 1985; Proceedings of the 12th GóngřeSs of the International Diabetes Federation, Madrid, Španělsko, 1985 (Excerpta Medica, Amsterodam, 891 až 896 (1986).).)

Příklad 1

Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursoru z kvasinkového kmene yKV153 použitím S.cerevisiae MF alfa prepro-leaderu

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

Č.593 5⁷-CCAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAA

CGAATCTTGTAGCCŤTTGGTTCAGCTTCAGCTTČAGCTTCTTCTCTTTTAT CCAAAGAAACACČ-3⁷

č. 94 5'-TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3⁷

č. 3075 5' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTCCTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTG-3' a

č.2371 5⁷-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3⁷.

Byly provedeny následující dvě polymerasové řetězové reakce (PCR) pomoci sestavy Gene Amp PCR reagent kit (Perkin Elmer, 761 Main Avewalk, Kt. USA) podle pokynů výrobce (viz obr.

2).

«· φφφφ • Φ φφφ*

PCR1A:

0,2μ1 ρΜΤ742 plasmidového templátu

4,0 μΐ oligonukleotídů Č. 593 (100 pmolů)

4,0 μΐ oligonukleotídů č. 94 (100 pmolů)

10,0 μΐ lOx PCR pufru

10,0 μΐ 2,5Mm dNTP

0,5 μΐ Ťaq polymerasového enzymu

71,3 μΐ vody

PCR1B:

0,2 μΐ pMT74 2 plasmidového templátu

4,0 μΐ oligonukleotídů č. 3075 (100 pmolů)

4,0 μΐ oligonukleotídů č. 2371 (100 pmolů)

10,0 μΐ lOx PCR pufru

10,0 μΐ 2,5Mm dNTP

0,5 μΐ Taq polymerasového enzymu

71,3 μΐ vody

V obou případech byly provedeny dva cykly při 94 °C l min., 45 °C 1 min. a 72 °C 1 miň. a následně 11 cyklů: 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. a 72 °C 1 min.

μΐ každé PCR směsi se nanese na 2% (hmotn.) agarósový gel a podrobí še elektroforéze standardními způsoby [Sambrook a spol.: “Molecular Cloning, Čold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.]. Výsledné DNA fragmenty (452 párů nukleotidů od PCR1A a 170 párů nukleotidů od PCR1B) byly vyříznuty z agarosového gelu a byly isolovány sestavou Gene Clean (BiolOl Inci, PO Box 2284, La Jolla, Ka. USA) podle pokynů výrobce. Vyčištěné DNA fragmenty byly rozpuštěny ve 100 μΐ vody.

Byla provedena následující PCŘ:

PCR1C:

1,0 μΐ DNA fragmentu ž PCR1A

1,0 μΐ DNA fragmentu z PCR1B

10,0 μΐ lOx PCŘ pufru ·· ·« ···· • » * * * ·· ····

10,0 μί 2,5Mm dNTP

0,5 μί Tag polymerásového enzymu

69,5 μί vody

Byly provedeny dva cykly při 94 °c l miň., 45 °C 1 min. a 72 °c i min.

Potom byly přidány 4 μί oligonukleotidů č. 94 (100 pmolů a 4,0 μ1 oligonukleotidů č. 2371 (100 pmolů). To bylo provedeno 15 cyklů při 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. á 72 °C 1 min.

PCR směs se nanese na 1% (hmotn.) agarosový gel. Výsledné fragmenty o 594 párech nukleotidů (pn.) se vyčistí sestavou Gene Clean Kit jak shora popsáno. Vyčištěný PCR DNA fragment se rozpustí ve 20 μί vody a pufru restrikčních endonukleas a rozštěpí se restrikčními endonukleasami EcoRI a Xbal (New England Biolabs, lne., Ma., USA). Výsledný EcoRI/Xbal restrikční fragmént o 550 pn. se nečhá běžet na agarosovém gelu. Isoluje se vyčištěním sestavou Gene Clean.

Dvěma oddělenými štěpeními restrikčními endonukleasami se plasmid pMT742 rozštěpí i) restrikčními endonukleasami Apal a Xbal a ii) restrikčními endonukleasami Apal a EcoRI. Z těchto štěpení sé isoluje Apal/Xbál restrikční fragment o 8600 pn a Apal/ĚcoRI restrikční fragment o 2100 pn

Tyto tři fragmenty (tj. EcoRI/Xbal restrikční fragment o 550 pn ž-PCRlC., Apal/Xbal restrikční fragment o 8600 pn a Apal/ /EcoRI restrikční fragment o 2100 pn z pMT742) se spolu liguji pomocí T4 DNA ligasy za standardních podmínek [Sambrook a spol.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.] (viz obr. 1). Ligační směs se transformuje do příslušných E. coli buněk ( Ap^r“). Následu je selekce na ampicilinovou resistenci. Z výsledných E. coli kolonií še standardními DNA minipreparačními způsoby (Sambrook a spol.: Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.) isolují plasmidy, které se zkontroluji příslušnými restrikčními endo·« ···« • · e «

·· · · •· ···· • ·* « · * ♦ * * · · · · · · · • · * ·

994 49 44 · nukleašami (tj. EcoRI, Apal a Xbal). DNA sekvenační analýzou (sestavou Segueňase pd U.S. Biochemical Corp. podle pokynů výrobce) bylo ukázáno, že vybraný plasmid označéný pKV153 obsahuje správnou sekvenci kódující MF alfa prepro-leader/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Seř-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínový prekursor.

Plasmid pKVl53 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663 a vybrán pro růst na glukose, jak je popsáno v evropské patentové přihlášce publikované pod č. 214 826.

Výsledný kvasinkový kmen byl označen yKVIS3. HPLC a hmotnostní spektrometrií bylo ověřeno, že v kultivačním mediu produkuje Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínový prekursor.

Příklad 2

Syntéza Lys^B30(N^ť-tetradekanoyl)Thr^D29-lidského inzulínu

2a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Glu-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys -Ála-Thr-Arg-B(1-28) -Thr-Lys-Ser~Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) inzulínového prekursoru z kvasinkového kmene yKV153 s po užitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderů

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

Č. 3881 5·-ttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctac ÁCTCCTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3* a

č. 23715'-TTAÁTCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.

Byla provedena následující polymerasová řetězová reakce (PCR) pomocí sestavy Gene Amp PCR Reagent Kit jak shora popsáno.

»» ·«·· ·* ··· ·

PCR2:

0,2μ1 pKV153 plásmidového templátu (z přikladu 1)

4,0 μΐ oligonukleotidů č. 3881 (100 pmolů)

4,0 μΐ. oligonukleotidů Č. 2371 (100 pmolů)

10,0 μΐ 10X PCR pufru

10,0 μΐ 2,5mM dNTP

0,5 μΐ Tag polymerasového enzymu

71,3 μΐ vody

Byly provedeny dva cykly při, 94 °C 1 min., 45 °C 1 min. a 72 °c 1 min. a následně 11 cyklů: 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. a 72 °C 1 min.

PCR směs se nanese na 2% (hmotn.) agarosový gel a výsledný fragment o 174 pn se vyčistí sestavou Gene Clean Kit jak shora popsáno. Vyčištěný PCR DNA fragment se rozpustí ve 20 μΐ vody a pufru restrikčních ehdonukleas a rozštěpí se restrikčními endonukleasami HindlII a Xbál. Výsledný HindlII/Xbal restrikční fragment o 153 pn se oddělí na agarosovém gelu. Isoluje a vyčistí se sestavou Gene Clean Kit.

Dvěma oddělenými štěpeními restrikční endonukleasóu se plasmid pMT742 rozštěpí restrikčními endonukleasami Ápal a Xbal, zatímco pKV153 (z příkladu 1) se rozštěpí restrikčními endonukleasami Apal a EcoRI. Z těchto štěpení se z pMT742 isoluje Apal/Xbal restrikční fragment o 8600 pn a z pKV153 Apal/ /EcoRI restrikční fragment o 2100 pn

Tyto tři fragmenty (tj. EcoRI/Xbal restrikční fragment o 550 pn z PCR2, Apal/Xbai restrikční fragment o 8600 pn z pMT742 a Apal/EcoRI restrikční fragment o 2100 pn z pKV153) se spolu ligují pomocí T4 DNA ligasy jak shora popsáno (viz obrázek 1). Ligáční směs se transformuje do příslušných E. coli buněk (Ap^r)· Následuje selekce na ampicilinovou resistenci. Z výsledných E. coli kolonií se isolují plasmidy, které se zkontrolují příslušnými restrikčními endonukleasami (tj. HindlII, Apal a Xbal) jak shora popsáno.

·· «·«« ···· • · « · • * l««< · »· · ♦ « « · t · « · · « • · I · · • · ·« ·

DNA sekvenační analýzou bylo ukázáno, že vybraný plasmid označený pKV159 obsahuje správnou sekvenci kódujíc! MF alfa prepro-leader/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Glu-Ala-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínový prekursor.

pKV159 byl transformován do S. cerévisiae kmene MT663 a vybrán pro růst na glukose jak shora popsáno.

Výsledný kvasinkový kmen byl označen yKV159. HPLC a hmotnostní spektrometrií bylo ověřeno, že v kultivačním mediu produkuje Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pr o-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínový prekursor .

2b. Isolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-28)—Thr—Lys—Ser-Asp-Asp-Ala—Arg—A(1-21) inzulínového prekursoru

Kmen yKVl59 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 5 litrů Živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřelováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravená ha 3,0 a inzulínový prekursor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine^(R> 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline^<R> SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekursor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce ód 300 do 600 ml. pH bylo upraveno na 2,5 a prekursor byl vyčištěn RP-HPLC na 15μ kulovitém C18 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm, 0,2M Na₂S0₄, pufrem 0,04M H₃P0₄ a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu. Prekursor se eluoval 27 až 28% (hmotn.) acetonitrilem. Spojená Část obsahující střední hlavní maximum prekursoru bylá odsolena gelovou filtrací na Šephadexu^<R) G-50 F v 0,5M kyselině octové. Prekursor byl isolován lyofilizací. Výtěžek: 486 mg.

*· ·ΦΦ · φφ

ΦΦ ΦΦΦΦ .

φ » « « φ φ

ΦΦΦΦ φ

ΦΦ ·Φ· φ • «

ΦΦ φ

2c. Syntéza Ala-Thř-Arg-B(1-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu

486 mg jednovláknového prckursoru, získaného jak shora popsáno, se rozpustí ve 30 ml 0,05M glutamátového pufru při pH 9,0. Přidají sě 3 ml imobilizovaného A. lýticus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 5 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. Rozšířený inzulín o dvou řetězcích se překrystaluje přidáním 10 ml ethanolu, 845 mg dihydrátu Citrátu Sodného a 78 mg chloridu žinéčnatého. Po úpravě pH na 6,1 a skladování přeš noc při 4°C se krystaly isolují odstřeáo váním, promyjí sě dvakrát isopropanolem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek 450 mg.

2d... Syntéza N·**, N^³, N*“^ů-tris (tetradekanolyl) -Ala-Thr-Arg-B(1-28)-Thr-Lyε-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínu .450 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích, získaného jak shora uvedeno, se rozpustí ve směsi 3,15 ml DMSO a 0,69 ml 2M diisopropylethylaminu v NMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,69 ml 0,3M N-hydroxyšukcinimidóVěho esteru tetřadekahové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 ^eC se reakce zastaví přidáním 112 ml 0,01M glyčinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví ná 10,0. Nebyl isolovánLriacylovaný meziprodukt. 2ě. Syntéza Lys“° (N*-tetradekanoyl)-Thr“* lidského inzulínu

K roztoku ž předcházejícího stupně se přidá 5 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 16 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (2,5 x 25 cm) s náplní QAE-Sephadex‘^R) A-25. Isokratická eluce byla prováděna rychlostí 17,3 ml/h 0,12M NH₄C1 puf rem ve směsi ethanol/voda (60:40, óbj.) upraveném amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 650 ml. Byl spojen podíl od 650 do 754 ml. Nakonec byl pufr změněn na Ο,ΟΙΜ NH₄HCO₃ .· ♦··* · ·· ··. ···; • : .· • * · · · · · ··· ;

• · · · · · ·

..·· · ··· ·* ·· · gelovu filtrací ná náplní Sephadex^ÍB’ G-50 Fine. Produkt byl isolován v suchém stavu lyofilizaci. Výtěžek: 91 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučeniny zjištěná MS: 6020 ± 6, vypočteno: 6018. Molekulová hmotnost B-řetězce zjištěná MS: 3642 ± 5, vypočteno: 3640. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteasóu zjištěná MS: 1326 ± 2, vypočteno: 1326. Relativní lipofilnost k^freX 113. Poločas vymizeni T_6ot po subkutánhí injekci vepřům: 20,3 ± 5,2 h (n=6).

Příklad 3

Syntéza Lys®²⁸ (N'-tetradekanoy 1)-des(B29-B30)-lidského inzulínu

3á. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursoru z kvasinkového kmene yJB173 použitím S. cérevisiae MF alfa prepro-leaderu

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy: č. 627 5'-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGÁAAGAGGTTTCTTC

TACACTAAGTCŤGACGAŤGCTAG-3' a č. 2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.

DMA kódu jící Glu-Gl u-Ala-GIu-A±a-Giu_Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 s náhradou oligónukleótidu č. 3881 oligonukleotiděm Č. 627.

Výsledný plasmid byl označen pJB173 a kvasinkový kmen exprimuj ící Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byl označen yJB173.

0000 «0 0000

0 0 0 0

3b. Isolacé Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-ThrArg-B(1-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursoru

Kmen.yJB173 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 4,8 1 živně půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřelováním a hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0. Vodivost byla 7,8 mS/cro. Inzulínový prekursor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine^<R> 50 naplněné 300 ml ionexu Štřeamline^<R) SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrera, pH 3,6, byl prekursor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve Vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 280 ml bylá upravena kyselinou chlorovodíkovou ria 9,0.

3c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B( 1-27)-Lys, Ser-Asjp-ASp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu

280 ml roztoků 118 mg jednovláknóvého prekursoru, získaného jak shora popsáno, se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 24 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipoře^(R’. Rozšířený inzulín se dvěma řetězci byl vyčištěn ve dvou ptríii-icvri Rr-HrLe iiá lop 'kulovitém ciu oxiau Křemičitém o velikosti pórů 1000 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2řt Na₂S0₄, 0,04M H₃PO₄, pH 3,5, jako pufr a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu rychlosti 4 ml/min a teplotě kolony 40 °C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 30 až 31 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (70 ml) odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněný gelóvou filtrací ria koloně (5 x 47 cm) Sephadexu G-50 F v 0,5M kyselině octové. Rozšířený irizůlín s dvojitým řetězcem byl isolován lyofilizaci. Výtěžek: 110 mg.

·· ·· ···· ·«»·<· ·

4 4 4· ·

44 4444 • 4 · · ·

44 44 4

4« ··♦ • · * ·

4«

4

444 4 ·

3d. Syntéza Ν^αΑ ⁵tris(tétradekanoyl)-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínu

110 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích, který se získá jak shora popsáno, se rozpustí ve směsi 0,84 ml DMSO a 0,275 ml 2M diisopropylethýlaminu v NMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,185 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidoyéhó esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °G se reakce zastaví přidáním 32,5 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/Vodě (60:40, óbj\) a pH se upraví na 10,0. Nebyl isolován tťiacýlovaný meziprodukt.

3e. Syntéza L^Bi’(N*-tétradékanoyl)-des(B29-B30) lidského inzulínu

K výslednému roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1,5 ml imobili2ovaného trypšinového gelu (Viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 18 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 21 cm) s náplní QAE-Sephadex^<R> A-25. Isokratická eluce byla prováděna rychlostí 10 ml/h 0,12M NH₄C1 pufrem ve směsi ethaňol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 250 až 390 ml s maximem u 330 ml. Nakonec byl pufr Změněn na 0,0IM NH₄HG0₃ ^CÍWT U - Ir4.-4. U4.UVX -χία παρχιτχ—DcpiauCA ' Γ~Χ1Η5 · jrXOCLUJVL· 'uyx isolován v suchém stavu lyofilizaeí. Výtěžek: 47 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5820 ± 2, vypočteno: 5819. Molekulová hmotnost B-řetě2ce nalezená MS: 3444 ± 4, vypočteno: 3442. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 protesou naležená MS: 1128 + 2, vypočteno: 1128. Relativní lipofilnost k'_tel = 121. Poločas vymizení T_5O1 po subkutánní injekci u vepřů: 19,6 ± 3,6 h (n 4), ·« «··· ·· ····

Příklad 4

Syntéza Lys“’(N^e-tetraděkanoyl)-dés('B28-b307 lidského inzulínu

4a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursóru z kvasinkového kmene yJB174 s použitím S. cerevisiáe MF alfa prepro-leaderu

Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:

Č. 628 5'-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC

TACAAGTCTGACGATGCTAG-3' a

Č. 2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.

DNA kódu jící Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Árg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se bligonákleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 628.

Výsledný plasmid byl označen pJB174 a kvasinkový kmen exprimujícl Glu-Glu-Ala-GÍu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byl označen yJB174.

4b. Isolace Giu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursóru

Kmen yJB174 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,5 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřelováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn vodou na 8 litrů, aby se snížila koncentrace soli. Výsledná vodivost byla 7,9 mS/cm. Inzulínový prekursor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine^(R> 50 naplněné 300 ml ionéxu Střeaialine^(R’ SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekursor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 • · · · · ·

do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 280 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.

4c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(1-26)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu

K roztoku 280 ml jednovláknového prekursoru, získaného jak shora popsáno, se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 13 h při 30 °C Se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 2,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipore^<R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve čtyřech podílech RP-HPLC na 15μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M Na₂S0₄, 0,04M H₃P0₄ pufř, pH 2,5, a gradientem od 24 do 33 % hmotn. acetonitrilu. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 30 aS 31 % (hmotn.) acetoni tri lu. Aeetonitril byl ze spojených podílů odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu G-50 F v Q,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 ciň). Rozšířený inzulín s’ dvojitým řetězcem byl isolován lyófilizací. Výtěžek: 69 mg.

4d. Syntéza N“^A ⁵,Ň^eB ³,N*^Ba7-tris(tetradekanolylj-Ala-Thr-Ařg-B(l-26)-Lýs, Ser-Ašp-Ášp-Xla-Arg-Á(í-21) inzulínu mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích získaného jak popsáno pod 4e, se rozpustí ve směsi 0,44 ml DMSO a 0,15 ml 2M diisopropylethylaminu v NMP. Tento roztok Se Ochladí na 15 °C a přidá se 0,096 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 17 ml Ο,ΟΙΜ glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl isolován triacylovaný meziprodukt.

*· ο»* • fl flflfl «·« fl * * • ·· fl fl • fl • fl i

4e. Syntéza L“⁷(N^<-tetradekanoyl)-des(B28-B30) lidského inzulínu

K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1 ml imobiližovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °Č po dobu 26 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 á roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplni QAE-Sephadex^(R) A-25. Isokratická eíuee byla prováděna rychlostí 17,3 ml/h 0,12M NH₄C1 pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 360 rol. Byl shromažďován podíl 272 až 455 ml. Nakonec byl piifr změněn na 0,01M NH₄HCÓ₃ gelovu filtrací na náplni Sephadex^<R) G-50 Fine. Produkt byl isolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 38 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5720 ±6, vypočteno: 5718. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3342 ± 4, vypočteno: 3340. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 protesou nalezená MS: 1027 ± 2, vypočteno: 1027. Relativní lipofilnost k^zrol = 151. Poločas vymizení T_sot po subkutánní injekci U vepřů: 15,2 ± 2,2 h (n = 5).

Příklad 5

Syntéza Lys^B26(N^<-tetradekanoyl)des(B27-B30) lidského inzulínu

5a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pró-Lys-Alá-Thr-Arg-B(1-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekUrsořu z kvasinkového kmene yJB175 s použitím. S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu

Byly Syntetizovány následující oligonukleotidy:

č. 629 5'-cacttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagagGťttcttc

AAAGTCTGACGATGCTAG-3' a

č. 2371 5'-TTAATCŤTAGTTTCTAGAGCCTGGGGG-3·.

»· AAAA • A A .

A A β « ·

DNA kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-AlaΤΗΓ-Ατ9-Β(1τ25)-ϊ.γ8-8θΓ-Αδρ-Α3ρ-Α1ύ-τΑΓ9-Α(1-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v přikladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 náhradí oligonukleotidem č. 629.

Výsledný plásmid byl označen pJB175 a kvasinkový kmen exprimujlcí Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byl označen yJB175.

5b. Isolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Ařg-B(l-25)-Lys-Ser-Ašp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursorů

Kmen yJB175 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,7 litru

Živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřelováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn vodou na 8,5 litru, ábý se snížila koncentrace soli. Výsledná vodivost byla 7,7 mS/cm. Inzulínový prekursor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Streálihe^<8> 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline^<Il) SP. Pó promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekursor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 270 ml byla upravena kyselinou Chloroyod-lkovnn najt-A. „₇. -··: ......

5c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(1-25)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Ařg-A(l-21) inzulínu

K roztoku 270 ml jedno vláknového prekursorů získaného jak shora popsáno se přidají 3 ml imóbilizováného A. lyticus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném mícháni po dobu 23 h při 30 °G se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 2,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipóre‘^R>. Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve Čtyřech podílech RP-HPLC na 15μ kulovitém G18 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm (kolona 2 x 20 dm·)., 0,2M Na₂S0„, 0,04M H₃P0„ pufr, • Φ φφφφ * φ φ ΦΦ φφφφ φφφ» φ φ φ

Φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ * · · S ··· ·· ·· ρΗ 3,5, a gradientem od 24 do 33 % hmotn. acetoňitrilu. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 29 až 31 % (hmotn.) acetoňitrilu. Acetonitril byl ze Spojených podílů odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu^<R) G-50 F v Ó,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín š dvojitým řetězcem byl isolován lypfilizací. Výtěžek: 81 mg.

5d. Syntéza N“*•⁸/lf^íB“^s,N^rtae“třis(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg^-B(l-25)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Árg-A(l-21) inzulínu mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích se rozpustí ve směsi 0,56 ml DMSO a 0,19 ml 2M diisopropylethylaminu v NMP. Tento roztok se ochladí ná 15 °C a přidá še 0,124 ml 0,3M Ň-hydroxysukcinimidóvého esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 21,8 ml 0,01M glycihového pufru v ethanólu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl isolován triacylovaný meziprodukt .

5e. Syntéza L^B36(N*-tetradekanoyl )-des(B27-B30) lidského inzulínu

K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1 ml imóbilizovanéhg trvůsínového gel ii (vJ z P.C.T/DK-9_4/-0íJ-3-47,- strana 46-) . - po mírném míchání při 15 °C po dobu 23 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplní QAE-Sephadex’¹⁰ A-25. Isokratická eluce byla prováděna rychlostí 19,3 rol/h 0/12M NH₄C1 pufrem ve směsi ěthanol/voda (60:40, obj.) Upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 320 ml. Byla shromažďována frakce od 320 do 535 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0/01M NH₄HC0₃ gélóvu filtrací na náplni Sephadex'“’ G-50 Fine. Produkt byl isolován v suchém stavu lyofiližací. Výtěžek: 25 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučéniny nalezená MS: 5555

9999.

9, 9999

999 9 9* · 9 9999*999

9 9 « 9 9 9 >·« 9 999 99 99 9 .36 ±6, vypočteno: 5555. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3179 ± 4, vypočteno: 3178. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 protesóu nalezená MS: 864 + 1, vypočteno: 863,5. Relativní lipofilnošt k^zrel = 151. Poločas vymizení T_5Ol po subkutánní injekci u vepřů: 14,4 ± 1,5 h (n = 5).

Příklad 6

Syntéza (N- (1-karboxytridecyl) -2-aminosukcinyl) -Phe^-des (B30) lidského inzulínu

Al,B29-diBoc-des(B30) lidský inzulín (200 mg, 0,033 mmolu) byl rozpuštěn v DMF (15 ml). K tomuto roztoku byl přidán triethy lamin (20 pl). Přidá se N-hýdroxysukcinimidový ester Ň-(l-karbomethoxytridecyl)-2-amidojantarové kyseliny (16 mg, 0,033 mmolu). Po 4 h za teploty místnosti se reakční směs odpaří ve vakuu dosucha. Boc skupiny se odstraní 30 minutovou reakcí s trifluoroctovou kyselinou (5 ml) za teploty místnosti. Trifluoroctová kyselina se odstraní odpařením ve vakuu. Odparek se rozpustí při 0 °C v 0,lN NaOH (20 ml). Zmýdelnění methylesteru se provede během 1 h při 0 °C. Hodnota pH reakční směsi se přidáním kyseliny octové a ethanolu (5 ml) upraví ha 5,0. Vytvoří se Sraženina, která Sé odstřeluje.

Titulní sloučenina se ze sraženiny vyčistí ionexovou chromatografií na koloně 2,5 x 27 cm s náplni QAE Sephadex^(R)Á25.

Sraženina se rozpustí ve směsi ethanolu S vodou (60:40, obj.) (25 ml) upravením hodnoty pH na 9,8 (amoniakem) a roztok se nanese na kolonu. Eluce se provádí pufrem NH₃/NH₄C1 při pH 9,0, lineárním gradientem od 0,12 do 0,l8M NH₄C1 v ethanolu s vodou (60:40, Obj.). Celkové množství eluentu bylo 1000 ml. UF absorbance eluátu byla sledována při 280 nm. Byly sbírány frakce po TO ml. Titulní Sloučenina byla eluována z kolony ve frakcích 62 až 72. Titulní sloučenina byla vysrážena zředěním spo«9 «999 »99 9* 9999 • β 9 ·«··«« 9 «*«*9 9

9 9 99999999

9 9 9 9 · 9

9999 9 «9999 99 9 jeného podílu 2 objemy vody a úpravou pH na 5,0. Po odstřelování byla Sraženina promyta vodou a po druhém odstřeňování byl produkt vysušen ve vakuu. Výtěžek: 10 mg.

Molekulová hmotnost nalezená PDMS: 6032 , vypočteno: 6032 . Relativní lipofilnost k^/rol = 140. Poločas vymizení T_5O, po subkutánni injekci u vepřu: 8,65 ± .1,65 h (n - 5).

Příklad 7

Phé^-Tetradekanolyl-glutaraýl-glycyl-desCBSO) lidský inzulín

Al,B29-diBoc-des(B30) lidský inzulín (200 mg, 0,033 mmolu) se rozpustí v DMF (15 ml). Přidá se triethylamin (100 μΐ). Přidá se N-hydroxysukcinimidový ester myristoyl-Glu(Y-OtBu)-Gly (95 mg, 0,17 mmolu) a po 4 h za teploty místnosti se reakční směs odpaří dosucha ve vakuu. Boc a tBu skupiny byly odstraněny 30minutovou reakcí za teploty místnosti s trif luor octovou kyselinou (5 ml) . Trifluoroctoyá kyselina byla odstraněna odpařením ve vakuu. Titulní sloučenina byla vyčištěna ze sraženiny RP-HPLC na koloně s Č18 oxidem křemičitým , eluce lineárním gradientem od 16 do 64 % hmotn. acetonitrilu v 50mM Tris/fosforečnanóvém pufru obsahujícím 75mM (NH₄)SO₄ při pH 7. Titulní sloučenina byla elúóvána z kolony 50 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl odpařen ve vakuu. Přidá se ethanol na 20 % (obj-). Úpravou hodnoty pH na 5,0 dojde k vysrážení produktu. Po odstřeňování se sraženina rozpustí v lOmM NH₄Heo₃, odsolí se gelóvou filtrací na nosiči Sephadex G-25 a lyofilizuje se. Výtěžek: 97 mg.

Molekulová hmotnost nalezená PDMS: 6105, vypočteno: 6104.

• i ·· « « *

Příklad 8

Syntéza Gly®³⁸,Thr^B2‘*,Lys^B30(N‘^!-tetradekanoyl)-lidského inzulínu

8a. Syntéza Glu-Glu-Ála-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21)inzulínového prekursoru 2 kvasinkového kmene yKV195 s použitím S. cereVisiae MF alfa prepro-leaderu

Byly syntetizovány následující oíigonukleotidy:

Č. 4790 5'-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC AGTGGTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3⁷ a

č. 2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.

DNA kódu jící Glu^Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až ná to, že sě oligonukleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 4790.

Výsledný plasmid byl označen pKV195 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-Á(1-21) byl označen yKV195.

8b. Isoláce Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ála-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Ašp-Ala-Árg-A(1-21)inzulínového prekursoru

Kmen yKV195 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 4,4 litru živné půdy. Buňky kvasinek býly odstraněny odstřeŮováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn 3,6 litry vody, aby se snížila koncentrace solí na vodivost 7,7 mS/cm. inzulínový prekursoř byl Zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine^<R> 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline^<B>SP. Po promytí 3 litry 25mM citrátového pufru, pH 3,6, byl pre• φ *··» φ • * Α¹ • · · · · * · · · • · • · * · · kursor eluován 0,5Μ amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen 2a teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 280 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.

8c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu

K roztoku 280 ml jednovláknového prekursóru (300 mg) se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 17 h při 30 ’C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Mi-lli.pore^w. Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve třech podílech RP-HPLC na 10μ kulovitém C18 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1200 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M Na₂SG₄, 0,04M H₃P0₄ pufr, pH 3,5, a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu při rychlosti 4 ml/min a teplotě kolony 40 “C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem Se eluovál při 30 až 31% (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (70 ml) odstraněn odpařením vě vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadéxu^(B’ G-50 F v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl isolován lyofilizací. Výtěžek: 176 mg.

8d. syntéza N^^N^^N^-trisCtetradekanolylj-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínu

176 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích se rozpustí ve směsi 1,4 ml DMSO a 0,275 ml 2M diisopropylěthylaminu v NMP. Tento roztok še ochladí na 15 °C a přidá se 0,963 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 20 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 50 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a PH se upraví na 10,0. Nebyl isolován triacylovaný meziprodukt.

• · fe * » · · • « · fc * 4· · · · · • · · · » * · * ·«« * *·· «» «» *

8e. Syntéza Gly^B28,Thr“’,Lys^B3O(Nⁱ-tetradekanoylj lidského inzulínu

K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 2,5 ml imobiližovaněho trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 5 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplní QÁE-Sephadex^<H) A-25 * Isokratická eluce byla prováděna rychlostí 9,3 ml/h 0,12M NH «Cl pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony při eluování 325 až 455 ml s maximem při 380 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH„HC0₃ gelovu filtrací na náplni Sephadex^<R) G-50 Fine. Produkt byl isolován v suchém stavu lyofiližací. Výtěžek: 50 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5979 ± 6, vypočteno: 5977. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3600 ± 4, vypočteno: 3600. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 protesou nalezená MS: 1286 ± 2, vypočteno: 1286. Relativní lipofilnost k'_rei = 103. Poločas vymizení T_5OS po subkutánní injekci u vepřů: 17 ± 2 h (n = 4).

Příklad 9

Syntéza Gly“⁸,Lys“⁹(N*-tetradekanoyl)-lidského inzulínu

9a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursoru z kvasinkového kmene yKV196 s použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu

Bylý syntetizovány následující oligonukleotidy:

Č. 4791 5'-TTGGTTGAÁGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC

ACCGGTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3⁷ a č. 2 3 71 5 ⁷-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3⁷.

DNA kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-AlaΦ φ • * φ φ

Φ· • * φ φ * *

-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 nahradí oligohukleotidem č. 4791 ·. Výsledný plasmid byl označen pKV196 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lýs-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) byl označen yKV196.

9b. Isolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(1-21) inzulínového prekursoru

Kmen yKV196 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,6 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřelováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn 3,4 litry vody, aby se snížila koncentrace solí na vodivost 7,7 mS/čm. Inzulínový prekursor byl Zahuštěn ná 300 ml postupem popsaným v příkladu 8b.

9c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(1-27)-Gly-Lys, Ser-Asp-Ašp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu

K roztoku 300 ml jednovláknového prekursoru (390 mg) o pH 9,0 sé přidá 5 ml imobilizovaného A. lytičus proteasového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 40 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl 2filtrován 0,45μ filtrem Millipúre^(R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve třech podílech RP-HPLC na 10μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1200 nm (kolona 2 X 20 cm), 0,2M Na_aS0₄ , 0,04M H₃P0₄ pufr, pH 3,5, a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu při rychlosti 4 ml/min a teplotě kolony 40 °C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 29 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (60 ml) odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu⁰⁰ G-25 v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl isolován lyofilizací. Výtěžek: 154 mg.

• · « · · ft t fr » ··· · * · · * ·· ·« ·♦ ·

9d. Syntéza N°^A‘⁵,N^aB'³,N^<!B30-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-rA(l-21) inzulínu

154 mg rozšířeného inzulínů o dvou řetězcích še rozpustí ve směsi 1,05 ml DMSO a 0,329 ml 2M diisopřopylethylaminu v NMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,22 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/ /NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 40 ml 0,-OlM glycinovéhó pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl isolován triacylovaný meziprodukt .

9ě. Syntéza Gly^S2®,Lys^B29(N*-tetrádekanoyl) lidského inzulínu

K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1,5 ml imobilizovanéhó trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, Strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 21 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a produkt ve 43 ml roztoku se nanese ná kolonu (1,5 x 26,0 em) s náplni QAE-Sephádex^<E> A-25. Isokratická eluce byla prováděna rychlostí 9,5 ml/h 0,12M NH₄C1 pufrem ve směsi ethanól/voda (60:40, obj.) upraveným amoniakem ňa pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony při eluování 190 až 247 ml s maximem při 237 ml. Nakonec byl pufr změněn ná 0,01M NH₄HCO₃ gelovu filtrací na náplni Sephádex'*’ G-50 Fine. Produkt byl isolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 67 mg.

Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5877 ± 2, vypočteno: 5876. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3499 ± 3, vypočteno: .3499.

Molekulová hmotnost C-kóncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 protesou nalezená MS: 1184 ± 2, vypočteno: 1185. Relativní lipofilnost k'_tel = 118,5. Poločas vymizení T^» pó subkutánní injekci u vepřů: 25 ± 9 h (n =4).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Inzulínový derivát následující obecné sekvence

S—---.--A-řetězee | 7 ]

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 ] 8 9 10 11 12

S

I s

B-řetěZěc |

Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A-řetězeč (pokr.) 20

Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekv. id. č. 1) 13 14 15 16 17 18 19 ) 21 ——S

I s

B-řetězec (pokr.) |

Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23. 24

B-řétěžec (pokr.)

Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (sekv. id. č. 2)

25 26 27 28 29 30 v níž

Xaa v poloze A21 znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu kromě Lys, Arg a Cys,

Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamenají nezávisle na sobě jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys nebo jsou vynechány,

Xaa v poloze B30 znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys, dipeptid neobsahující Cys nebo Arg, tripeptid neobsahující Cys nebo Arg, tetrapeptid neobsahující Cys nebo Arg nebo je vynechána, a bud aminoskupina na N-konci aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu W na ni připojenou, při čemž tato skupina má 12 až 40 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, nebo karboxyskupína na C-konci aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu Z na ni připoV « «V. *««« • · * ♦ · · · ♦ · * · ♦ · » «<

• * · · * · · · · · ·

1 · · * · ♦ · ····* * · * · · · · * jenou, při čemž tato skupina má 12 až 40 atomů uhlíků a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, s tím. Že jestliže jedna nebo více aminokyselin v poloze Bl, B2 a B3 je deletováno, potom číslo N-koncové aminokyseliny sé spočte Odpočítáním od Cys^B7, který je ‘ vždy označen číslem 7, a že

a) jestliže B1-B2-B3 znamená Phe-Val-Asn, A21 znamená

Asn a B26-B27-B28-B29-B30 znamená Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr nebo Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, potom W nebo Z vždy obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, bj jestliže B29 a B30 jsou de letovány a Shora uvedená skupina Z je přítomna ha C-konci aminokyseliny B-řetězce a ani Bl, ani B2 ani B3 není deletována, potom B1-B2 neznamená Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2 tak B26-B27-B28 znamenají jiné než uvedené sekvence, a

c) jestliže B29 a B30 jsou deletovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyseliny B-řetězce a jedna z Bl, B2 nebo B3 je deletována, potom N-kortcová aminokyselina B-řetězce neznamená Val nebo sekvence B26-B27-B28 neznamená Týr-Thr-Pro nebo jak N-konCová aminokyselina B-řetězce tak sekvence B26-B27-B28 neznamená Val., respektive Tyr-Thr-Pro.
2. Inzulínový derivát podlé nároku 1, v němž lipofllní skupina W je připojena ha aminovou skupinu N-kóncové aminokyseliny B-řetězce.
3. Inzulínový derivát podle nároku 1, v němž lipofllní skupina Z je připojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny B-řetězce.
4. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze A21 znamená aminokyselinu, která je vybrána ze skupiny sestávající z Ala, Asn, Gin, Glu, Gly a Ser.

«φ · · ♦ · · ··♦

I* .
5.
6.
7.
8,
9.
10.

12.

13.

14.

15.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž Xaa v poloze Bl znamená Phe nebo je deletována.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B2 Znamená Ala nebo Val.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B3 znamená aminokyselinu, která je vybrána ze skupiny sestávající z Asn, Gin, Glu a Thr.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B26 znamená Tyr.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B27 Znamená Thr.

inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená Pro.

inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B29 znamená Lys nebo Thr.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B30 znamená Thr nebo e-acylovaný Lys.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv Z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B30 je deletována.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená Lys a Xaa v poloze B29 znamená Pro.

Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená Pro a Xaa v poloze B29 znamená Thr.

16.

Inzulínový derivát podle nároku 2, v němž je shora uvedená

00 00*0 • 0 0

0 0 * V* «* «*««

00 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 00 00 ··0 0 0 0 0 0 0

000 00 00 '0 skupina W připojena na aminoskupinu N-koncové.aminokyseliny amidovou vazbou.

17. Inzulínový derivát podle nároku 16, v němž W znamená skupinu obecného vzorce CH₃(CH₂)_nCH(CG0H)NH-C0(CH₂)₂C0-, kde n znamená číslo od 9 do 15.

18. Inzulínový derivát podle nároku 3, v němž je skupina Z připojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny amidovou vazbou.

19. Inzulínový derivát podle nároku 18, v němž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH) (CHj₄NH-C0(CH₂)_nCH₃, kde m znamená číslo od 8 do 18.

20. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená Thř^B’⁹-lidský inzulín.

21. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená des(B28-B30)-lidský inzulín.

22. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená des(B27-B30)-lidský inzulín.

23. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená des(B26-B30)-lidský inzulín.

24. Inzulínový derivát podle nároku 1, v němž C-koncová aminokyselina B-řetězce znamená e-acylovaný Lys a aminokyselina vedle C-koncové aminokyseliny znamená Gly.

25. Farmaceutický prostředek pro léčení diabetes pacientů, kteří toto léčení potřebují, vy z n a Č u j í c i s é t í m, že obsahuje terapeuticky účinné množství ** »·· • Β Β Β Β » Β * * * · · » » ··· · • » · · · · ·

ΟΧ » ··· ·· ·· * inzulínového derivátu podle nároku 1 společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

26. Farmaceutický prostředek prů léčení diabetes u pacientů, kteří toto léčeni potřebují, vyznačující se t í m, že obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1 ve směsi s inzulínem . nebo analogem inzulínu, kteřý má rychlý nástup působení, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

27. Způsob léčeni diabetes u pacienta, který toto léčení potřebuje, v y z načující s e t í m, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1 společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

28. Způsob léčení diabetes u pacienta,, který toto léčeni potřebuje, vyznačuj í c í se t í m, žé se pacientovi podává terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1 ve směsi s inzulínem nebo analogem inzulínu, který má rychlý nástup působení, společně s farmakologicky přijatelným nosičem.