JP2017534676A - インクレチン−インスリンコンジュゲート - Google Patents

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Abstract

インクレチン−インスリンコンジュゲートがインスリン受容体および対応するインクレチン受容体でアゴニスト活性を有し、化合物を投与された個体において体重減少を刺激する、インクレチンにコンジュゲートされたインスリンアゴニストペプチドが本明細書で開示される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）に基づき、その全文が参照によって本明細書に援用される、２０１４年９月２４日出願の米国仮特許出願第６２／０５４，６６６号の優先権を主張するものである。
電子的に提出された資料の参照による援用
本明細書と同時に提出し、以下の通り識別される、コンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列リストの全文が参照によって援用される：２０１５年９月１８日作成のファイル名「２４２７０５＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の１０１４ＫＢのＡＣＩＩ（テキスト）ファイル１個。
インスリンは、若年性糖尿病および後期成人発症性糖尿病の処置のための証明された療法である。このペプチドは、プロインスリンという名称の、低効力（天然インスリンの約２％〜９％）のより大きな線状前駆体として生合成される。プロインスリンは、ペプチド（Ｃペプチド）を接続する３５残基の選択的除去によって、タンパク質分解的にインスリンに変換される。インスリン「Ａ鎖」（配列番号１）と「Ｂ鎖」（配列番号２）との間のジスルフィド結合によって形成される得られるヘテロ二本鎖は、合計５１アミノ酸であり、インスリン受容体に対する高い効力を有する（ｎＭ範囲）。天然インスリンは、関連するインスリン様増殖因子１受容体と比較してインスリン受容体に対する約１００倍選択的な親和性を有するが、ＡおよびＢという名称の、２つの異なるインスリン受容体アイソフォームに対する選択性をほとんど示さない。
インクレチンは、グルコース恒常性、インスリン分泌、胃内容排出、および腸増殖、ならびに食物摂取の調節などの様々な生理学的機能に関与する消化管ホルモン群である。プレ−プログルカゴンは、１５８アミノ酸の前駆体ポリペプチドであり、異なる組織中でプロセッシングされ、いくつかの異なるペプチドを形成する。インクレチンは、グルカゴン（配列番号７０１）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１；アミノ酸７〜３６は配列番号７０３として提供され、アミノ酸７〜３５は配列番号７０４として提供される）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２；配列番号７０８）およびオキシントモジュリン（ＯＸＭ；配列番号７０６）などの、いくつかのプログルカゴン由来ペプチドを含む。
グルカゴンは、プレ−プログルカゴンのアミノ酸３３〜６１に対応する２９アミノ酸のペプチドであるが、ＧＬＰ−１は、プレ−プログルカゴンのアミノ酸７２〜１０８に対応する３７アミノ酸のペプチドとして生成される。ＧＬＰ−１（７−３６）アミド（配列番号７０３；Ｃ末端はアルギニンアミドである）またはＧＬＰ−１（７−３７）酸（配列番号７０４；Ｃ末端はグリシンである）は、生物学的に効力のある形態のＧＬＰ−１であり、ＧＬＰ−１受容体で本質的に等価な活性を示す。
グルカゴンは、重度の低血糖の急性処置において用いられる救命薬である。オキシントモジュリンは、食欲を抑制し、体重を低下させる薬理学的能力を有すると報告されている。ＧＬＰ−１受容体アゴニストまたは安定化ＧＬＰ−１類似体に関する臨床試験は、このファミリーのペプチドがＩＩ型糖尿病にとって有効な処置であることを証明した。
さらに、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）は、グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチドとしても知られ、セクレチンファミリーのホルモンのメンバーである。ＧＩＰは、ＧＩＰ遺伝子によりコードされる１５３アミノ酸のプロタンパク質から誘導され、生物学的に活性な４２アミノ酸のペプチド（配列番号７０７）として循環する。ＧＩＰ遺伝子は、小腸ならびに唾液腺中で発現され、胃酸分泌の弱い阻害因子である。胃におけるその抑制効果に加えて、グルコースの存在下で、ＧＩＰは、生理的用量で投与された場合に、膵島ベータ細胞によるインスリン放出を増強する。ＧＩＰは、膵臓インスリンの放出を刺激し、グルコース恒常性の維持において生理学的役割を果たし得る、腸因子として機能すると考えられる。
本明細書に開示されるように、コンジュゲートは、例えば、グルカゴン、ＧＬＰ−１、またはＧＩＰアゴニスト、ＧＬＰ−１／ＧＩＰコアゴニスト、ＧＬＰ−１／グルカゴンコアゴニストもしくはグルカゴン／ＧＬＰ−１／ＧＩＰトリアゴニストなどの、インスリンペプチドとインクレチンとの間で形成され、このコンジュゲートは、インスリン受容体と対応するインクレチン受容体の両方でアゴニスト活性を有する。より具体的には、グルカゴン関連ペプチド（例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１またはグルカゴン）のコンジュゲーションは、インスリンペプチド活性の有益な改変をもたらすと予想される。例えば、グルカゴン受容体でアゴニスト活性を有するペプチドを、インスリンペプチドに連結することは、グルカゴン受容体は主に肝臓に位置するため、コンジュゲートの、肝臓への標的化を増強すると予想される。肝臓はグルコースの利用ではなく生成に主に関与するため、コンジュゲートの、肝臓への標的化が望ましい。かくして、肝臓の標的化は、インスリンが、グルコース生成の中止に加えて、低血糖のより高い危険性をもたらすグルコース使用も刺激する、筋肉または脂肪などの他の組織と接触する場合に生じるものよりも安全な、グルコース生成を止めるための手法であり得る。また、膵臓のアルファ細胞上に存在するグルカゴン受容体もある。複合体の、アルファ細胞への送達は、さらなるグルカゴン生成を抑制するか、またはアルファ細胞を低血糖に対してより敏感にし得る。出願人はまた、グルカゴン−インスリンコンジュゲート中のグルカゴンの存在が、カップリングされたインスリンの活性に対する緩衝剤として役立ち、より高いベースラインの活性を提供し、かくして、血糖値の急上昇を回避することができると予想する。
同様に、インスリンペプチドと、インクレチンＧＬＰ−１およびＧＩＰなどの他のグルカゴン関連ペプチドならびにＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ受容体で活性を有する他の関連ペプチドとのコンジュゲートは、有益な特性を有するコンジュゲートを生成すると予想される。例えば、ＧＬＰ−インスリンコンジュゲートを、視床下部に標的化して、食欲を低下させ、ならびに血糖を減少させることができる。あるいは、またはさらに、ＧＬＰ−インスリンコンジュゲートをベータ細胞に標的化して、同化応答を誘導する（インスリンの膵島ベータ細胞による生成を増加させる）ことができる。
インクレチン−インスリンペプチドコンジュゲートはまた、プロドラッグ化学の使用；アルブミンなどの血漿タンパク質の結合、またはペグ化および脂質化（例えば、Ｃ１４−Ｃ３０アルキルもしくはアシル基の付加）などの他の改変による、作用持続時間の延長；ならびにグリコシル化による物理的安定性の増強により、治療指数の改善を得ると想定されるさらなる構造的増強にとって好適である。Ｃ−ペプチドリンカーを用いた一本鎖インスリン類似体の調製もまた、これらの化学的改変の多くを上手く配置することができる新規構造的位置を提供する。本明細書に開示されるインスリンコンジュゲートの１つの使用は、体重減少を刺激するか、または体重増加を防止しながらの糖尿病の処置におけるものである。
コンジュゲートがインスリン受容体と対応するインクレチン受容体の両方でアゴニスト活性を有する、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートが提供される。より具体的には、一実施形態において、コンジュゲートがインスリン受容体とＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ受容体の両方でアゴニスト活性を有する、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートが提供される。一実施形態によれば、単一の化合物がインスリンタンパク質およびインクレチンタンパク質のコンジュゲートとして提供され、該コンジュゲートは、体重減少を誘導するか、または体重増加を防止する完全な効力のインスリンアゴニストとして作用する。コンジュゲートのインスリンペプチド成分は、天然インスリンであるか、または例えば、国際出願第ＷＯ９６／３４８８２号、第ＷＯ２０１０／０８０６０７号、第ＷＯ２０１０／０８０６０９号、第ＷＯ２０１１／１５９８８２号、第ＷＯ／２０１１／１５９８９５号および米国特許第６，６３０，３４８号（これらの開示は参照によって本明細書に援用される）に開示された任意のインスリンペプチドなどの、インスリン受容体で活性を有する任意の公知のインスリン類似体であってもよい。コンジュゲートのインクレチン成分は、例えば、天然グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰもしくは任意の公知のインクレチンなどの、本明細書に開示される任意のインクレチンペプチドまたは１つもしくは複数のインクレチン受容体で活性を有するインクレチンペプチドであってもよい。本開示による使用にとって好適なインクレチンペプチドは、例えば、国際出願第ＷＯ２００９／１５５２５８号、第ＷＯ２００９／０５８７３４号、第ＷＯ２０１１／０９４３３７号、第ＷＯ２００９／１４８０８９号、第ＷＯ２０１１／１６３４７３号および第ＷＯ２０１０／０７１８０７号（これらの開示はその全体が参照によって本明細書に明示的に援用される）に開示された任意のインクレチンペプチドを含む。
一実施形態によれば、インクレチンペプチドは、式Ｉ：
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣ1−Ｃ3アルキルからなる群から独立に選択され、
Ｙは、Ｃ、Ｓ、Ｓｅ、またはＳ＝Ｏであり、
Ｚは、Ｃ、Ｓ、Ｓｅ、−Ｓ（Ｃ1−Ｃ3）（Ｃ5−Ｃ6アリール）−であり、またはＹと組み合わせたＺは、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｏ−Ｎ＝、もしくは１，２，３トリアゾールであり、
ｎは、０または１であり、
ｍは、１、２または３であるが、但し、ＹがＳ＝Ｏである場合、ＺはＣである）
の一般構造の連結部分を介してインスリンペプチドに連結される。一実施形態では、連結部分は、一般式：
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＨおよびＣ1−Ｃ3アルキルからなる群から独立に選択され、
ｎは０または１であり、
ｍは１、２または３である）
のジスルフィドリンカーである。一実施形態では、ｎは０であり、ｍは２であり、Ｒ4はＨであり、Ｒ1、Ｒ2およびＲ3はＨ、およびメチルからなる群から独立に選択される。
一実施形態によれば、正常および糖尿病モデルマウスに注入された場合に、高効力、コンジュゲートのそれぞれの受容体での均衡のとれた活性、グルコース低下能力、および脂肪塊減少の増強を示す、式ＩまたはＩＩの連結部分を介してインクレチンペプチドをインスリンペプチドに連結させることによって形成されるコンジュゲートが提供される。一実施形態では、インクレチンペプチドのＣ末端領域は、Ａ鎖のＡ９、Ａ１４またはＡ１５、Ｂ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９位、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミド、ＡまたはＢ鎖のカルボキシ末端から選択される位置のアミノ酸の側鎖から独立に選択される位置を介して、および一本鎖インスリン類似体のＡ鎖とＢ鎖とを連結する連結部分の任意の位置のアミノ酸の側鎖で、式ＩまたはＩＩの連結部分により、インスリンペプチドに共有的に連結される。一実施形態によれば、インクレチンペプチドのカルボキシ末端は、式ＩＩのジスルフィド連結部分によりインスリンペプチドのＮ末端に連結され、インクレチンペプチドのカルボキシ末端は、式ＩＩのジスルフィド連結部分によって二本鎖インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端に連結されていてもよい。
本明細書で使用する場合、インクレチンペプチドのＣ末端領域に対する参照は、グルカゴン、ＧＬＰ−１もしくはＧＩＰペプチドの天然Ｃ末端、またはグルカゴン、ＧＬＰ−１もしくはＧＩＰ類似体の天然Ｃ末端に付加された任意のアミノ酸、または天然グルカゴン配列と比較して、それぞれ、Ｃ末端でのアミノ酸欠失により短縮されたグルカゴン類似体のＣ末端アミノ酸を包含することが意図される。例えば、天然インクレチンペプチドのＣ末端を、１〜３アミノ酸ずつ伸長させた後、Ｃ末端領域のアミノ酸の側鎖を介して、またはＣ末端カルボキシ基を介してインスリンに連結することができる。一実施形態では、インクレチンペプチドのカルボキシ末端領域は、インスリンペプチドのＢ鎖のアミノ末端領域に共有的に連結される。
一実施形態では、コンジュゲートのインスリンペプチドは、ジスルフィド結合によって互いに連結されたＡ鎖とＢ鎖とを含む二本鎖インスリン類似体である。さらなる実施形態では、コンジュゲートは、インクレチンペプチドが、Ｂ鎖のアミノ末端、Ａ鎖のカルボキシ末端領域、およびＢ鎖のカルボキシ末端領域からなる群から選択される位置でインスリンペプチドに共有的に連結される二本鎖インスリン類似体を含む。一実施形態では、インクレチンペプチドは、以下の一般構造のジスルフィド結合部分によりインスリンペプチドに連結される。
（式中、Ｒ1、Ｒ2およびＲ4は、ＨおよびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１である）
一実施形態では、インクレチンペプチドは、天然グルカゴン、天然ＧＬＰ−１および天然ＧＩＰからなる群から選択される。一実施形態では、インクレチンペプチドは、グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体またはＧＩＰ受容体から選択される２つ以上のインクレチン受容体で活性を有するグルカゴン類似体である。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチンペプチド成分は、
（ｉ）１〜３個のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列：
Ｘ1−Ｘ2−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ（配列番号８３９）
であって、
Ｘ1および／またはＸ2が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然（配列番号７０１と比較して）アミノ酸であり、
Ｚが、−ＣＯＯＨ、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７８）およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙが、１〜２個のアミノ酸であり、さらに、
（１）ラクタム架橋が、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を接続し、ｉが１２、１６、２０もしくは２４であり、または
（２）インクレチンペプチドの１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、もしくは全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、
前記インクレチンペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号７０１のアミノ酸配列であって、
２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸での置換、
２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２８位の、Ａｓｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕでの置換、
２８位の、Ａｓｐでの置換、
２８位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸での置換、
２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２９位の、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓでの置換、
２９位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位の後への、１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
２９位の後への、ＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、
２９位の後への、Ｇｌｙ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；またはこれらの組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変、
ならびにグループＡもしくはグループＢ、またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含むように改変され、
グループＡは、１５位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、および１６位のＳｅｒの、ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
グループＢは、
１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
１０位のＴｙｒの、ＰｈｅもしくはＶａｌでの置換、
１２位のＬｙｓの、Ａｒｇでの置換、
２０位のＧｌｎの、ＡｌａもしくはＡＩＢでの置換、
２１位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
２４位のＧｌｎの、ＡｌａもしくはＡＩＢでの置換、
２７位のＭｅｔの、ＬｅｕもしくはＮｌｅでの置換、
２７〜２９位のアミノ酸の欠失、
２８〜２９位のアミノ酸の欠失、
２９位のアミノ酸の欠失、
またはこれらの組合せ
からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
前記インクレチンペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号７０１のインクレチンペプチドであって、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）（１）ｉ位とｉ＋４位とのアミノ酸側鎖間の、もしくはｊ位とｊ＋３位とのアミノ酸側鎖間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０もしくは２４であり、ｊは１７である）、または
（２）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、もしくは全部の、α，α−二置換アミノ酸での置換、
（ｃ）２７、２８および２９位のうちの１、２個または全部のアミノ酸改変、ならびに
（ｄ）１〜６個のさらなるアミノ酸改変
を含むように改変され、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、インクレチンペプチド、
（ｉｖ）Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＸ12ＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17Ｘ18ＡＸ20Ｘ21ＦＸ23Ｘ24ＷＬＸ27Ｘ28Ｘ29（配列番号１９２６）の配列であって、
Ｘ1が、Ｈｉｓ、Ｄ−Ｈｉｓ、（デス−アミノ）Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルＨｉｓ、アルファ−メチルＨｉｓ、およびイミダゾール酢酸からなる群から選択され、
Ｘ2が、Ｓｅｒ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチルＳｅｒ、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）およびＮ−メチルＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ3が、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、ＯｒｎおよびＮｌｅからなる群から選択され、
Ｘ10が、Ｔｙｒ、ＶａｌおよびＴｒｐからなる群から選択され、
Ｘ12が、Ｓｅｒ、ＬｙｓおよびＡｒｇからなる群から選択され、
Ｘ15が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ16が、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ17が、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ18が、Ａｒｇ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ20が、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎおよびシトルリンからなる群から選択され、
Ｘ21が、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ23が、ＶａｌおよびＩｌｅからなる群から選択され、
Ｘ24が、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択され、
Ｘ27が、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＮｌｅからなる群から選択され、
Ｘ28が、Ａｓｎ、ＬｙｓおよびＡｓｐからなる群から選択され、
Ｘ29が、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステインおよびアセチルフェニルアラニンからなる群から選択される、配列、または前記類似体が、１、２、３、５、７、１０、１１、１３、１４、１７、１８、１９、２１、２４、２７、２８、および２９位から選択される１、２もしくは３個のアミノ酸改変が配列番号１９２６と異なる、配列番号１９２６の類似体であり、前記インクレチンペプチドがＧＬＰ−１受容体の天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を表す、配列、
（ｖ）１６、２０、２１、および／または２４位の、ＡＩＢでの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む１０個以下のアミノ酸改変、ならびにジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性の低減をもたらす１位および／または２位のアミノ酸改変が配列番号７０１と異なるアミノ酸であって、前記インクレチンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体の天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を表す、アミノ酸
を含む。一実施形態では、インクレチンペプチドは、該ペプチドがＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）のＣ末端伸長を含むようにさらに改変された、（ｉｉ）から（ｖ）までのいずれかに記載のペプチドを含む。
一実施形態によれば、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＴＦＸ7ＳＤＸ10ＳＸ12ＹＬＸ15Ｘ16Ｘ17ＡＡＸ20Ｘ21ＦＶＸ24ＷＬＬＸ28Ｘ29（配列番号２０２９）
を含み、
式中、
Ｘ1は、ＴｙｒまたはＨｉｓであり、
Ｘ2は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニンまたはＤ−アラニンであり、Ｘ2はＡｉｂであってもよく、
Ｘ3は、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、
Ｘ7は、ＴｈｒまたはＩｌｅであり、
Ｘ10は、Ｌｙｓ、ＴｙｒまたはＶａｌであり、
Ｘ12は、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＩｌｅであり、
Ｘ15は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｘ16は、ＧｌｕまたはＬｙｓであり、
Ｘ17は、ＧｌｎまたはＡｒｇであり、
Ｘ20は、ＧｌｎまたはＡｉｂであり、
Ｘ21は、ＧｌｕまたはＡｓｐであり、
Ｘ24は、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、
Ｘ28は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ａｓｐであり、
Ｘ29は、ＡｌａまたはＧｌｙである。
一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３９および配列番号１４０からなる群から選択される配列または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸改変が配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３９もしくは配列番号１４０と異なるその類似体を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、１、２または３個のアミノ酸置換が配列番号１３２、配列番号１３５、配列番号１３９または配列番号１４０と異なる配列を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号１９９１〜１９９５、２０００、２００１、２００７、２００８〜２０２１および２０２４〜２０２８からなる群から選択される配列を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０１９、配列番号２０２１、配列番号２０２７および配列番号２０２８からなる群から選択される配列または１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸改変が配列番号２０１９、配列番号２０２１、配列番号２０２７もしくは配列番号２０２８と異なるその類似体を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０１９、配列番号２０２１および配列番号２０２４〜２０２８からなる群から選択される配列または１、２もしくは３個のアミノ酸置換が配列番号２０１９、配列番号２０２１もしくは配列番号２０２４〜２０２８と異なる配列を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０１９もしくは２０２１からなる群から選択される配列または１、２もしくは３個のアミノ酸改変が配列番号２０１９、２０２１もしくは配列番号２０２４〜２０２８と異なる配列を含む。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０１９もしくは２０２１からなる群から選択される配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０１９の配列を含むか、またはそれからなる。一実施形態では、コンジュゲートのインクレチン成分は、配列番号２０３７または２０３８の配列を含む。
一実施形態では、コンジュゲートのインスリンペプチドは、Ａ鎖とＢ鎖とを含み、前記Ａ鎖は、配列ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18ＹＣＸ21−Ｒ13（配列番号１９）を含み、前記Ｂ鎖は、配列Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ３4ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）を含み、
式中、
Ｘ4は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ5は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ8は、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ9は、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ10は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ12は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ14は、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ17は、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
Ｘ21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
Ｘ25は、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
Ｘ29は、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ33は、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ34は、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ41は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ42は、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
Ｘ45は、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ22は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびＮ−末端アミンからなる群から選択され、
Ｒ13は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である。
一実施形態では、コンジュゲートのインスリンペプチドは、Ａ鎖とＢ鎖とを含み、前記Ａ鎖は、配列番号１の配列、または１、２もしくは３個のアミノ酸置換が配列番号１と異なるアミノ酸配列を含み、Ｂ鎖は、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）
ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）からなる群から選択される配列、または１、２もしくは３個のアミノ酸置換が配列番号２、５、６もしくは９と異なるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、コンジュゲートは、式ＩＶの一般構造を含むリンカーにより配列番号１のＡ鎖と配列番号２、５、６または９のＢ鎖とを含むインスリンペプチドのアミノ末端に、そのカルボキシ末端により連結された配列番号２０１９、２０２１、配列番号２０２４〜２０２８、２０３７または２０３８のインクレチンペプチドを含む。
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3である）
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミンに、またはＡ鎖のＡ９、Ａ１４およびＡ１５からなる群から選択される位置もしくはＢ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２４、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖に、または一本鎖インスリン類似体中の連結部分のアミノ酸の側鎖に連結された親水性部分を含む。あるいは、またはさらに、親水性部分を、１６、２０、２３、２４、２７、３０、３２、４３位のいずれかのアミノ酸またはＣ末端領域でインクレチンペプチドに連結してもよい。一実施形態では、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０位、またはインスリンペプチドのＢ２４、Ｂ２８もしくはＢ２９位から選択される位置の１個または２個のアミノ酸の側鎖を、親水性部分に連結する。
一実施形態では、親水性部分は、ポリエチレン鎖であり、さらなる実施形態では、ポリエチレン鎖は、インスリンペプチドが一本鎖インスリン類似体である場合、インスリンペプチド成分の連結部分のアミノ酸の側鎖に共有結合される。一実施形態では、親水性部分は、Ｆｃペプチドまたは他の免疫グロブリンペプチド断片である。一実施形態では、インスリンペプチドは、Ｂ鎖とＡ鎖とを結合させる連結部分が長さ１７アミノ酸以下のアミノ酸配列を含み、配列ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号６１）、ＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号１９２５）またはＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２３）を含む、一本鎖インスリンである。一実施形態では、Ｂ鎖とＡ鎖とを結合させるペプチドリンカーは、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ（配列番号１９２２）、ＳＳＳＳＲＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫ（配列番号１９２３）からなる群から選択される。
アシル化またはアルキル化は、循環中のインクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドの半減期を増大させることができる。アシル化またはアルキル化は、有利には、インスリン受容体での作用開始を遅延させる、および／または作用の持続時間を延長させることができる。インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドを、親水性部分が連結されるのと同じアミノ酸位置（例えば、一本鎖インスリン類似体を結合させる連結部分の８位など）、または異なるアミノ酸位置でアシル化またはアルキル化してもよい。一実施形態によれば、本発明のコンジュゲートは、インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０および４０位で、またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位でアシル化される。一実施形態では、本発明のコンジュゲートは、インクレチンペプチドの１０もしくは４０位で、またはインスリンペプチドのＢ２９位でアシル化され、アシル化部分は、血清中のアルブミンに結合するのに十分なサイズのものである。
また、インクレチン−インスリンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も本開示により包含される。一実施形態によれば、好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の純度レベルの本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートのいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、少なくとも０．５ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１７ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、１９ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２１ｍｇ／ｍｌ、２２ｍｇ／ｍｌ、２３ｍｇ／ｍｌ、２４ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度の本明細書に開示される一本鎖インスリンアゴニストペプチドを含有してもよい。一実施形態では、医薬組成物は、滅菌され、様々な包装容器中に保存されていてもよい水性溶液を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥粉末を含む。医薬組成物を、該組成物を患者に投与するための使い捨てデバイスを含むキットの一部としてさらに包装してもよい。容器またはキットを、周囲室温または冷蔵温度での保存のために標識してもよい。
一実施形態によれば、体重減少を増加させるか、または体重増加を防止しながら、インスリン依存性患者における血糖値を調節する改善された方法が提供される。この方法は、患者に、糖尿病の管理にとって治療的に有効な量の、インクレチンのカルボキシ末端が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶの一般構造を有するスペーサーによりインスリンペプチドのアミノ末端に連結された、インクレチン−インスリンコンジュゲートを投与するステップを含む。
インスリンサブタイプＡ（図１Ａ）およびインスリンサブタイプＢ（図１Ｂ）受容体での、ＧＬＰ−１／インスリン融合物（非コンジュゲート化インスリン類似体：ＤＰ２５Ｍ ＧＰＥＨＬＣＧＡＨＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＤＲＧＡＧＳＳＳＲＲＧＩＶＤＥＣＣＨＲＳＣＤＬＲＲＬＥＮＹＣＮ；配列番号１４５；黒三角と比較した一本鎖インスリン類似体のＮ末端に融合されたＧＬＰ−１アゴニストペプチドを含む、ＧＬＰ−ＤＰ８（ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ−ＧＰＥＨＬＣＧＡＨＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＤＲＧＡＧＳＳＳＲＲＧＩＶＤＥＣＣＨＲＳＣＤＬＲＲＬＥＮＹＣＮ；配列番号７００）；黒四角）、ＤＰ３０（逆黒三角）；およびＤＰ３１（黒菱形）および天然インスリン（左向き黒三角）の活性を示すグラフである。融合ペプチドは、Ａ受容体で約２．０７ナノモルの効力を有し、インスリンＢ受容体で約９．９ナノモルの効力を有する。これらの化合物の活性は、それぞれのＡおよびＢ受容体で約０．５および０．７６の効力を有する天然インスリン（ならびに他の非コンジュゲート化インスリン類似体）より有意に低い。 インクレチンをインスリンペプチドに結合させて、本開示によるコンジュゲートを形成させる際の使用にとって好適なリンカーの一般構造を提供する図である。開示された構造はそれぞれ、本明細書に開示される任意のインクレチンを、本明細書に開示される任意のインスリンにカップリングさせる際の使用にとって好適である。図２に示されるように、［０．０］構造は「システインジスルフィド結合」としても知られ、示される［２，０］構造は「ペニシラミンジスルフィド結合」としても知られる。 インクレチン−インスリンコンジュゲートの一般構造を調製するために用いることができるさらなるリンカーを提供する図である。 インクレチンとインスリンの融合ペプチドを合成するための合成スキームを提供する図である。 インスリンサブタイプＢ受容体での、ＧＬＰ−１／インスリン融合ペプチド（ＩＵＢ４８、配列番号１９３２；図５Ａ）およびグルカゴン／インスリン融合ペプチド（ＩＵＢ４９６、配列番号５２１；図５Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。融合ペプチドは、インクレチンとインスリンとを結合させるスペーサーに基づいて異なっており、システイン（黒丸）、ホモシステイン（黒三角）、ペニシラミン（逆黒三角）、およびシステインリンカーを含むｄｅｓＨｉｓ（左向き黒三角）などの、ジスルフィドリンカーを用いて調製される。インスリン（黒四角）ならびにＩＧＦ−１（右向き黒三角）が含まれる。ＤｅｓＨＩＵＢ４８Ｃは、インクレチン活性を除去するＮ末端ヒスチジンアミノ酸の除去によって改変されたインクレチンである。全てのインクレチン−インスリン融合物は、天然インスリンと同様、インスリン受容体で高い効力を有することがわかった。したがって、リンカーは、ＧＬＰペプチド（図５Ａ）またはグルカゴンペプチド（図５Ｂ）の融合とは関係なく、完全な効力を提供する。 ＧＬＰ−１配列がＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３２）であり、グルカゴン配列がＨＳＱＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５２１）であり、インスリンペプチドが天然インスリンである、それぞれのＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体での、ＧＬＰ−１／インスリン融合ペプチド（ＩＵＢ４８、図６Ａ）およびグルカゴン／インスリン融合ペプチド（ＩＵＢ４９６、図６Ｂ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を示すグラフである。融合ペプチドは、インクレチンとインスリンとを結合させるスペーサーに基づいて異なっており、システイン（黒丸）、ホモシステイン（黒三角）、およびペニシラミン（逆黒三角）を含むジスルフィドリンカー、ならびにシステインリンカーを含むｄｅｓＨｉｓ（左向き黒三角）を用いて調製される。グルカゴン（黒四角）ならびにＩＧＦ−１（右向き黒三角）が含まれる。ＤｅｓＨｉＵＢ４８Ｃ−インスリンは、Ｎ末端ヒスチジンアミノ酸の除去によって改変されたインクレチンであり、かくして、インクレチン活性を除去する。全てのインクレチン−インスリン融合物は、Ｎ末端ヒスチジン残基の欠失のため、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体で活性を有すると予想されないＤｅｓＨｉＵＢ４８Ｃ−インスリンを除いて、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体で高い効力を有することがわかった。ＧＬＰ−１−インスリンコンジュゲートはまた、ＧＬＰ−１がグルカゴン受容体で非常にわずかしか活性を有さないという事実のため、グルカゴン受容体でほとんど活性を示さない。したがって、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、そのそれぞれの受容体でインクレチン−インスリンコンジュゲートのＧＬＰ−１またはグルカゴンアゴニスト成分について完全な効力を示す。 血漿中のインクレチン−インスリンコンジュゲートの相対的安定性を示す図である。システインまたはペニシラミンリンカーを用いて形成されたインクレチン−インスリンコンジュゲートを、血漿中で７２時間インキュベートしたところ、有意な分解は生じず、用いた２つのリンカー間で差異は検出されなかった。 ５０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のインクレチン−インスリンコンジュゲートを正常マウスに投与した結果を示すグラフである。ＩＵＢ−４８は、血糖値を約６０ｍｇ／ｄＬまで低下させるＧＬＰ−１アゴニストである。ＩＵＢ−４８を、システイン（黒菱形）、ペニシラミン（黒丸）またはホモシステイン（黒四角）により天然インスリンに連結する場合、コンジュゲートは全て、単一の活性薬剤としてのＩＵＢ−４８を用いて達成されるものよりも低いレベルまで血糖値を低下させる。 インクレチンまたはインスリン成分がＧＬＰ−１またはインスリンペプチド活性を除去するように改変された、２０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のインクレチン−インスリンコンジュゲートを投与された正常マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。図９Ａは、実験手順の略図を提供する。ＣＩＵ−００１は、ＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲート（ＧＬＰ−１ペプチドは配列番号１９３２の配列からなり、インスリンペプチドは天然インスリンである）であり、ＣＩＵ−００４は、Ｎ末端ヒスチジンを除去するように改変された（インクレチン受容体結合活性を破壊する）ＣＩＵ−００１（配列番号１０８１）であり、ＣＩＵ−０１４は、Ｂ鎖のＣ末端がミニペグを介してＡ鎖のＮ末端に直接連結された（インスリン活性を破壊する）ＣＩＵ−００１である。図９Ｂは、結果を提示するグラフであり、ＣＩＵ−００４およびＣＩＵ−００１（インスリン活性を有する）は血糖を５０ｍｇ／ｄＬより下に低下させる際に完全な効力を有し、インスリン活性を欠く化合物は血糖を約６０ｍｇ／ｄＬ活性まで低下させるに過ぎず、ＧＬＰ−１活性と一致する。かくして、コンジュゲートは、本開示にしたがって一緒に融合された場合であっても、両方のペプチドの活性を保持する。 図１０Ａは、［リンカーがインクレチンに付加されるＣ末端システインから伸長し、インスリンＢ鎖のＮ末端アミンに共有結合された、ジスルフィドリンカー（−（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）を介して天然インスリン（配列番号１のＡ鎖と、配列番号２のＢ鎖とを有する）に連結された、ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸＣ（配列番号２０２９）；ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＸＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ配列番号２０３０）；ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ（配列番号２０３１）；およびＨＸＥＧＴＦＴＳＤＸＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸＣ（配列番号２０３２）のインクレチンを含む］インクレチン−インスリンコンジュゲートを、アシルもしくはアルキル基またはポリエチレン鎖を連結して、基礎となるインクレチン−インスリンコンジュゲートの作用持続時間を延長させるようにさらに改変することができる位置を提供する。図１０Ｂおよび図１０Ｃは、それぞれ、アシルまたはペグ化インクレチン−インスリンコンジュゲートを調製するための合成スキームを提供する。図１０Ｄは、天然の二本鎖インスリンが、ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ（配列番号２０３３）；ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＫ（ｒＥＣ１６）ＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＣ（配列番号２０３４）およびＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＧＫ（ｒＥＣ１６）Ｃ（配列番号２０３５）からなる群から選択されるインクレチンに連結された、ＧＬＰ−１、ＧＩＰおよびインスリン受容体でのアシル化インクレチン−インスリンコンジュゲートの活性を提供する。 インクレチン部分が４０位のリシンアミノ酸側鎖でアシル化された、５、１５または２０ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＵＣ（配列番号１９２７）−（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ1インスリン（ＣＩＵ−０１３））を投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。特に、配列番号１９２７の「Ｕ」は、ガンマグルタミン酸リンカー（Ｌｙｓ（γ−Ｇｌｕ−Ｃ１６））によりＣ１６アシル基でアシル化されたリシンを表す。図１１Ａは、実験手順の略図を提供する。図１１Ｂは、結果を提示するグラフであり、全用量の化合物が血糖を低下させるのに有効である。図１１Ｃは、初期血糖値および化合物の投与後の血糖の変化を測定するグラフである。図１１Ｂと図１１Ｃは両方とも、脂質化されたインクレチン−インスリンコンジュゲートが非常に強力な化合物であることを示す。 第２の用量のインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＵＣ（配列番号１９２７）−（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ1インスリン（ＣＩＵ−０１３））を、第１の用量の投与の６時間後に供給された糖尿病マウスに投与する実験の結果を提供する図である。図１２Ａは、実験手順の略図を提供する。図１２Ｂは、結果を提示するグラフであり、６時間でのコンジュゲートの２回目の投与（ＣＩＵ−１３ １０ｎｍｏｌ／ｋｇ（ｘ２））は２４時間血糖を低下させ、それを約１００ｍｇ／ｄＬに保持するのに役立つが、第２の用量を投与されなかったマウスは血糖値の増加を経験し続ける。 インクレチン−インスリンコンジュゲート（ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＵＣ（配列番号１９２７）−（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ1インスリン（ＣＩＵ−０１３））は、食物摂取を抑制しているが、ペグ化されたインスリンは抑制しないことを示す棒グラフである。したがって、ＧＬＰ−１ベースインクレチン−インスリンコンジュゲートは、ＧＬＰ−１とインスリンの両方の活性を有するため、血糖値を低下させる活性を有する、ならびに食物摂取を減少させる。 ４日間の経過にわたる、ペグ化された天然インスリンまたはインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＵＣ（配列番号１９２７）−（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ1インスリン（ＣＩＵ−０１３））を投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。アシル化されたＣＩＵ−１３コンジュゲートを、毎日、または１日２回投与した。図１４Ａは、実験手順の略図を提供する。図１４Ｂは、結果を提示するグラフであり、ペグ化されたインスリンは毎日または１日２回投与された場合、体重減少を誘導することができないが、アシル化されたＣＩＵ−１３は有意な体重減少をもたらした。図１４Ｃは、アシル化されたＣＩＵ−１３コンジュゲートが、ペグ化されたインスリン類似体の投与と比較して食物摂取を抑制することを示すグラフである。図１４Ｄは、アシル化されたＣＩＵ−１３コンジュゲートの投与（毎日もしくは１日２回）またはペグ化されたインスリン類似体の投与（毎日もしくは１日２回）後のマウスの血糖を示すグラフである。アシル化されたＣＩＵ−１３コンジュゲートは、ペグ化されたインスリンの用量の１／５で投与されるが、インスリンほど有効ではないと考えられる。 ４つの異なるアシル化されたＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲートを投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。２つの化合物を、１０位でアシル化し（ＣＩＵ−１２（配列番号１９５３）とＣＩＵ−２１（配列番号１９５８））、２つの化合物を４０位でアシル化する（ＣＩＵ−１３、配列番号１９５４と、ＣＩＵ−２２、配列番号１９５９）。インクレチンをインスリンに連結するスペーサーもまた、ＣＩＵ−１２およびＣＩＵ−１３のためのシステインジスルフィド結合ならびにＣＩＵ−２１およびＣＩＵ−２２のためのペニシラミンジスルフィド結合を有する化合物間で異なる。図１５Ａは、実験手順の略図を提供する。図１５Ｂは、結果を提示するグラフであり、全ての化合物が、血糖値を低下させる活性を示し、天然インスリンと比較して作用持続時間の延長を示す。図１５Ｃは、曲線下面積を提示する棒グラフである。結果は、４０位でのアシル化と比較して１０位でのアシル化について達成された作用持続時間が長いことを示す。ペニシラミンジスルフィド結合と比較してシステインジスルフィド結合の間で有意な差異は見られない。 ３つの異なる用量（５、１０または２０ｎｍｏｌ／ｋｇ）のペグ化されたＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０３７）を投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。ＣＩＵ−０３７（配列番号１９６６）は、ＧＬＰ−１部分の４０位で２０Ｋ ＰＥＧを用いてペグ化される。ＣＵＩ−０２３（配列番号１９６０）は、インスリン成分のＢ２９で２０Ｋ ＰＥＧを用いてペグ化される。また、動物に、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのペグ化された天然インスリン（Ｂ２９側鎖に連結された２０Ｋ ＰＥＧ）を投与した。図１６Ａは、実験手順の略図を提供する。図１６Ｂは、用量滴定の結果を提示するグラフであり、血糖値は投与された用量に反比例する。ペグ化されたＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲートは、ペグ化されたインスリン（ＣＩＵ−２６）よりも迅速に血糖値を低下させ、より長い作用持続時間を有する。図１６Ｃは、ペグ化されたコンジュゲートを含有するＧＬＰ−１は食物摂取を抑制するが、ペグ化されたインスリン類似体は抑制しなかったことを示す棒グラフである。 ３つの異なる用量（１、２．５または５ｎｍｏｌ／ｋｇ）のペグ化されたＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０３７）を投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。ＣＩＵ−０３７は、ＧＬＰ−１部分の４０位で２０Ｋ ＰＥＧを用いてペグ化される。また、動物に、２０ｎｍｏｌ／ｋｇのペグ化された天然インスリン（Ｂ２９側鎖に連結された２０Ｋ ＰＥＧ）を投与した。図１７Ａは、動物を７日間の経過にわたってモニタリングした実験手順の略図を提供する。図１７Ｂは、用量滴定の結果を提示するグラフであり、ペグ化されたインスリンと比較して、５％未満の用量を用いて血糖値の改善が達成された。図１７Ｃは、ＣＩＵ−０３７が食物摂取を抑制する能力を示すが、ＣＩＵ−２６、ペグ化されたインスリンは抑制しないことを示すグラフである。図１７Ｄは、ＣＩＵ−２６ではなく、ＣＩＵ−０３７が体重の減少を誘導することを示すデータを提示するグラフである。図１７Ｅは、ＣＩＵ−０３７により誘導される体重減少が脂肪塊に由来するものであり、除脂肪塊に由来しないことを示す一連の棒グラフである。 ＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲートモノマー（ＣＩＵ−０３７、配列番号１９６６；ＣＩＵ−０５６、配列番号１９７５；ＣＩＵ−０５７、配列番号１９７６）と比較して、３つの異なるホモダイマーのＧＬＰ−１／インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７０、配列番号１９８０；ＣＩＵ−０７１、配列番号１９８１；およびＣＩＵ−０７２、配列番号１９８２）を投与された糖尿病マウスに対して行った実験の結果を提供する図である。ＣＩＵ−０７２コンジュゲートは、ＧＬＰ−アゴニストのＬｙｓ４０の側鎖に付加されるチオールを介してジスルフィドによりダイマーを形成するように連結される。チオールは、そのカルボキシル基からリシンのアミンへのアミド結合を形成するシスタミン（デス−アミノ、Ｃｙｓ）に由来する。ＣＩＵ−０７０およびＣＩＵ−０７１コンジュゲートは、両方の末端で二官能性ペグポリマーによりダイマーを形成するように連結される。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド媒介性アミド結合形成を介して、側鎖リシンとペグ−ポリマーとの間で形成されるアミド結合が存在する。ＣＩＵ−０５６およびＣＩＵ−０５７ペプチドは、ＧＬＰ−１配列の同じ位置Ｋ２４およびＫ４０で２つの２０ｋｄ ＰＥＧを用いて二重にペグ化されるモノマーである。ＣＩＵ−０３７は、ＧＬＰ−１部分の４０位で２０Ｋ ＰＥＧを用いてペグ化される。図１８Ａは、実験手順の略図を提供する。図１８Ｂは、各ダイマーの相対グルコース低下の結果を提示するグラフである。図１８Ｃは、初期血糖から投与後の血糖値への変化に基づいて提示される各ダイマーの相対グルコース低下の結果を提示するグラフである。 ２つの異なるプロドラッグ形態のインスリンプロドラッグ（ＣＩＵ−０３５およびＣＩＵ−０３６）を投与された糖尿病マウスに対して行われた実験の結果を提供し、自己切断性ジペプチドエレメント（ＣＩＵ−０３５についてはＡｉｂ、Ｎ−Ｍｅ−ｄＬｙｓおよびＣＩＵ−０３６についてはＳａｒ、アルファ−ＭｅＬｙｓ）は、ＣＩＵ−０３５／ＣＩＵ−０３６のＮ末端に連結される。ＣＩＵ−０３５については、ジペプチドエレメントは、式ＩＩのジスルフィドリンカーによりインスリンのＢ１に連結される。ＣＩＵ−０３６については、ジペプチドエレメントは、直接アミド結合によりＢ１アミン窒素に連結される。ジペプチドエレメントは、ジペプチドペプチドのリシン側鎖に連結されたＣ２２またはＣ１８のアシル基を有する。図１９Ａは、実験手順の略図を提供し、ＣＩＵ−０３５およびＣＩＵ−０３６は、１０および５０ｎｍｏｌ／ｋｇの２つの異なる用量で投与される。図１８Ｂは、天然インスリンと比較した各プロドラッグの相対グルコース低下の結果を提示するグラフである。５０ｎｍｏｌ／ｋｇで投与されたインスリンプロドラッグは、迅速な血糖低下を示し、インスリンと比較して延長された作用持続時間を有する。図１９Ｃは、プロドラッグの投与後の最初の６時間を提示するグラフである。このグラフは、インスリンと比較してプロドラッグ形態の脂質化されたインスリンプロドラッグの作用持続時間の延長をより明確に表す。 食物摂取に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０７９（天然インスリン、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示す棒グラフである。ＣＩＵ−０７９は、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１およびインスリン受容体のそれぞれで活性を示す。 食物摂取に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０８５（デス−Ｄｉ、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示す棒グラフである。デス−Ｄｉインスリン類似体は、Ａ鎖のＮ末端に直接的に改変されたＢ鎖末端（Ｂ２７およびＢ２９が欠失している）を誘導させることにより形成されるインスリン一本鎖である。このインスリン類似体は、インスリン受容体で不活性である。ＣＩＵ−０８５は、インスリン受容体ではなく、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１受容体のそれぞれにおいて活性を示す。 食物摂取に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０９３（天然インスリン、デス−Ｔｙｒ１、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示す棒グラフである。デス−Ｔｙｒ１グルカゴン類似体は、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体で不活性である。ＣＩＵ−０８５は、インスリン受容体でだけ活性を示すが、ＧＩＰおよびＧＬＰ−１受容体の一方で活性を示さない。このコンジュゲートはインクレチン活性を有さず、したがって、食物摂取を抑制しない。 血糖に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０７９（天然インスリン、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示すグラフである。 血糖に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０８５（デス−Ｄｉ、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示すグラフである。 血糖に対するインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０９３（天然インスリン、デス−Ｔｙｒ１、ＧＩＰ−ＧＬＰコアゴニストインクレチン；表４を参照されたい）の用量滴定を示すグラフである。インクレチン活性がなければ、ＣＩＵ−０７９およびＣＩＵ−０８５に関して見られたのと同じグルコース低下を得るために、はるかにより高い用量が必要である。 野生型マウス（実線）およびＧＰＬ−１受容体ノックアウトマウス（破線）に対して行ったグルコース負荷試験のグラフである。マウスに、グルコースチャレンジの２時間前に、１ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０７９を投与した。データは、これらの化合物は野生型において完全に機能的であり、ＧＬＰ−１ノックアウトマウスにおいては活性を失うため、両方のインクレチン活性（ＧＬＰ−１およびＧＩＰ活性）を有するが、その失われた活性を用量の増加によって克服することができることを示している。 野生型マウス（実線）およびＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウス（破線）に対して行ったグルコース負荷試験のグラフである。マウスに、グルコースチャレンジの２時間前に、１ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３ｎｍｏｌ／ｋｇ用量のインクレチンインスリンコンジュゲートＣＩＵ−０８５を投与した。データは、これらの化合物は野生型において完全に機能的であり、ＧＬＰ−１ノックアウトマウスにおいては活性を失うため、両方のインクレチン活性（ＧＬＰ−１およびＧＩＰ活性）を有するが、その失われた活性を用量の増加によって克服することができることを示している。 野生型マウスまたはＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスに３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与した場合、食物摂取（グラムで測定されるＦＩ）に対する、様々なインクレチンインスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示す棒グラフである。食物摂取は、ＧＬＰ−１によって調節されるため、ＧＬＰ−１ノックアウトマウスにおいては、食物摂取の減少はいずれの投与された化合物についても見られないが、ＣＩＵ−０９３ではなく、ＣＩＵ−０７９およびＣＩＵ−０８５は野生型マウスにおいて食物摂取を抑制する。 野生型マウスに３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の血糖に対する様々なインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示すグラフである。 ＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスに３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の血糖に対する様々なインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示すグラフである。 野生型マウスまたはＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスに１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の食物摂取（グラムで測定されるＦＩ）に対する様々なインクレチンインスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示す棒グラフである。 野生型マウスに１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の血糖に対する様々なインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示すグラフである。 ＧＬＰ−１受容体ノックアウトマウスに１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の血糖に対する様々なインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８５およびＣＩＵ−０９３）の効果を示すグラフである。 食餌誘導肥満（ＤＩＯ）マウスに３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で投与された場合の血糖に対する様々なインクレチン−インスリンコンジュゲート（ＣＩＵ−０７９、ＣＩＵ−０８２およびＣＩＵ１９０、ＣＩＵ１９１、ＣＩＵ１９２およびＣＩＵ−２２５）の効果を示すグラフである。 グルコースを注入され（グルコースレベルの上昇を誘導するため−血糖の上昇と共にＧＬＰ−１およびＧＩＰ応答のみが見られる）、２つの用量のうちの１つ（３ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で皮下的にＣＩＵ０８５を投与されたサルにおける血糖値（図３５Ａ）およびペプチドＣレベル（図３５Ｂ）を測定するグラフである。インスリン活性を欠くＣＩＵ０８５は、Ｃ−ペプチド産生（インスリン産生のマーカー）を誘導することができ、かくして、これらの化合物がサルにおいてインクレチン活性を有することを示している。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下的にＣＩＵ０８５またはＣＩＵ０７９を投与された正常なミニブタにおける血糖値を測定するグラフである。これは、ＣＩＵ−０７９がインスリン活性を有し、血糖を低下させるが、血糖を低下させるＣＩＵ−０８５の能力は、それがＧＬＰ−１およびＧＩＰ活性を有するとしても最小限であることを示している。 ３ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で皮下的にＣＩＵ０８５またはＣＩＵ０７９を投与された正常なミニブタにおける血中インスリンレベルを測定するグラフである。これは、ＣＩＵ−０７９はインスリン受容体で活性であるため消失するが、インスリン受容体で活性ではないＣＩＵ−０８５は消失せず、インスリン産生を誘導し続けることを示している。
定義
本発明を記載し、請求する上で、以下の用語を、以下に記載する定義に従って使用する。
本明細書で使用する「約」の語は、１０パーセントで記述される値または値の範囲よりも大きい、または小さいことを意味するが、このより広い定義だけに任意の値または値の範囲を指定することを意図するものではない。用語「約」の後に続くそれぞれの値または値の範囲はまた、記述される絶対値または値の範囲の実施形態も包含することが意図される。
本明細書で使用する「アミノ酸」の語は、アミノ官能基およびカルボキシル官能基の両方を含むあらゆる分子を包含し、アミノ基およびカルボキシレート基は同じ炭素（アルファ炭素）に結合している。アルファ炭素は、１または２個のさらなる有機置換基を有してもよい。本開示の目的では、立体化学を特定しないアミノ酸の呼称は、アミノ酸のＬ体もしくはＤ体のいずれか、またはラセミ混合物を包含するものとされる。しかしながら、アミノ酸がその３文字コードで指定され、上付き数字を含む例においては、Ｄ型のアミノ酸は３文字コードおよび上付き数字の前に小文字のｄを含めることにより特定され（例えば、ｄＬｙｓ-1）、小文字のｄを含まない名称（例えば、Ｌｙｓ-1）は天然のＬ型アミノ酸を特定することが意図される。この命名法においては、上付き数字の含有は、インスリン類似体配列中のアミノ酸の位置を指定し、インスリン類似体配列内に位置するアミノ酸は、Ｎ末端から連続的に番号付けられる正の上付き数字によって指定される。Ｎ末端で、または側鎖を介してインスリン類似体ペプチドに連結されるさらなるアミノ酸は、インスリン類似体配列からさらに除去されるため、０から始まって、負の整数値で増大するように番号付けられる。
本明細書で使用する「ヒドロキシル酸」の語は、アルファ炭素のアミノ基をヒドロキシル基で置き換えるように改変されているアミノ酸を意味する。
本明細書で使用する「非コードアミノ酸」の語は、以下の２０個のアミノ酸：Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＴｙｒのいずれかのＬ−異性体ではない、あらゆるアミノ酸を包含する。
「生理活性ポリペプチド」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏで生物学的効果を発揮することができるポリペプチドを意味する。
本明細書で使用する、ペプチドに対する一般参照（ｇｅｎｅｒａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）は、改変されているアミノ末端およびカルボキシ末端を有するペプチドを包含するものとされる。例えば、標準のアミノ酸を指定するアミノ酸配列は、Ｎ末端およびＣ末端の標準のアミノ酸、ならびにＮ末端の対応するヒドロキシル酸、および／または末端のカルボン酸の代わりにアミド基を含むように改変されているＣ末端の対応するアミノ酸を包含するものとされる。
本明細書で使用する「アシル化されている」アミノ酸は、それを生成する手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシル基を含むアミノ酸である。アシル化されているアミノ酸およびアシル化されているペプチドを生成する例示的な方法は、当技術分野では知られており、アミノ酸をアシル化した後、ペプチドに含め、またはペプチド合成後にペプチドを化学的にアシル化することを含む。一部の実施形態では、アシル基は、ペプチドに、（ｉ）循環中の半減期の延長、（ｉｉ）作用開始の遅延、（ｉｉｉ）作用持続時間の延長、（ｉｖ）ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性の改善、ならびに（ｖ）ＩＧＦおよび／またはインスリンペプチド受容体での効力の増大のうちの１つまたは複数を有させる。
本明細書で使用する「アルキル化されている」アミノ酸は、それを生成する手段に関係なく、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアルキル基を含むアミノ酸である。アルキル化されているアミノ酸およびアルキル化されているペプチドを生成する例示的な方法は、当技術分野では知られており、アミノ酸をアルキル化した後、ペプチドに含め、またはペプチド合成後にペプチドを化学的にアルキル化することを含む。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、ペプチドのアルキル化は、同じではないとしても、ペプチドのアシル化と類似する効果、例えば、循環中の半減期の延長、作用開始の遅延、作用持続時間の延長、ＤＰＰ−ＩＶなどのプロテアーゼに対する耐性の改善、ならびにＩＧＦおよび／またはインスリン受容体での効力の増大を達成すると考えられる。
本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」の語には、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水もしくは水／油エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤など、標準的な製薬上の担体のいずれかが含まれる。この語はまた、米国連邦政府の監督官庁により認可されている、または米国薬局方においてヒトを含めた動物において使用するために列挙されている薬剤のいずれかも包含する。
本明細書で使用する「薬学的に許容される塩」の語は、親化合物の生物学的活性を保持し、生物学的に、または別の方法で望ましくないわけではない化合物の塩を意味する。本明細書に開示する化合物の多くは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基、またはこれらに類似する基の存在によって、酸塩および／または塩基塩を形成することができる。
薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基から調製することができる。無機塩基に由来する塩には、例示のみにより、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、およびマグネシウム塩が含まれる。有機塩基に由来する塩には、それだけには限定されないが、１級、２級、および３級アミンの塩が含まれる。
薬学的に許容される酸付加塩は、無機酸および有機酸から調製することができる。無機酸に由来する塩には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが含まれる。有機酸に由来する塩には、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などが含まれる。
本明細書で使用する「親水性部分」の語は、容易に水に溶解する、または容易に水を吸収し、毒性効果を示さずに（すなわち、生体適合性である）哺乳動物種によってｉｎ ｖｉｖｏで許容される任意の化合物を指す。親水性部分の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸コポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリメトキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ならびにヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルスターチ、ヒドロキシエチルスターチ、またはヒドロキシエチルセルロースおよびそのコポリマーなどの誘導体化セルロースおよびスターチ、ならびに例えば、Ｆｃ、アルブミン、および他のポリペプチド、ヘパリンおよびデキストランなどの天然ポリマーが挙げられる。
本明細書で使用する「処置する」の語には、特定の障害もしくは状態の予防、または特定の障害もしくは状態に付随する症状の緩和、および／または前記症状の防止もしくは除去が含まれる。例えば、本明細書で使用する「糖尿病を処置する」の語は、全般的に、血中グルコースレベルを正常レベル付近に維持することを意味し、所与の状況に応じて血中グルコースレベルの上昇または低下を含むことができる。
本明細書で使用する「有効」量または「治療有効量」のインスリン類似体は、非毒性であるが、所望の効果をもたらすのに十分な量のインスリン類似体を指す。例えば、所望の一効果は、高血糖の防止または処置である。「有効」である量は、対象ごとに、個体の年齢および全身状態、投与様式などに応じて変動する。よって、正確な「有効量」を特定するのが常に可能とは限らない。しかし、あらゆる個々の症例における適切な「有効」量は、当業者により、ルーチンの実験を使用して決定され得る。
「非経口」の語は、消化管を介さず、鼻内、吸入、皮下、筋肉内、脊髄内、または静脈内など、いくつかの他の経路によるものを意味する。
本出願を通して、文字と数による特定のアミノ酸位置（例えば、Ａ５位）に対する全ての参照は、それぞれの天然ヒトインスリンＡ鎖（配列番号１）もしくはＢ鎖（配列番号２）中のＡ鎖（例えば、Ａ５位）もしくはＢ鎖（例えば、Ｂ５位）のその位置、またはその任意の類似体における対応するアミノ酸位置でのアミノ酸を指す。例えば、「Ｂ２８位」に対する本明細書における参照は、さらに推敲することなく、配列番号２の第１のアミノ酸が欠失したインスリン類似体のＢ鎖の対応するＢ２７位を意味する。同様に、天然Ｂ鎖のＮ末端に付加されるアミノ酸は、Ｂ０から始まり、次いで、アミノ酸がＮ末端に付加されるにつれて増大する負の値の数を番号付けられる（例えば、Ｂ−１、Ｂ−２・・・）。あるいは、一本鎖類似体の連結部分におけるアミノ酸位置に対する任意の参照は、ＩＧＦ１の天然Ｃ鎖（配列番号２３）を参照して行われる。例えば、天然Ｃ鎖の９位（または「Ｃ９位」）は、アラニン残基を有する。
本明細書で使用する「天然インスリンペプチド」の語は、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖とを含む５１アミノ酸のヘテロ二本鎖、ならびに配列番号１と配列番号２とを含む一本鎖インスリン類似体を指定することが意図される。本明細書で使用する「インスリンペプチド」の語は、さらなる記述言語はなく、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖とを含む５１アミノ酸のヘテロ二本鎖、ならびに天然Ａ鎖および／またはＢ鎖の改変類似体ならびにその誘導体を含むヘテロ二本鎖および一本鎖類似体などの、その一本鎖インスリン類似体（例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれる国際出願第ＷＯ９６／３４８８２号および米国特許第６，６３０，３４８号に開示されたものなど）を包含することが意図される。そのような改変類似体は、Ａ１９、Ｂ１６もしくはＢ２５位のアミノ酸の、４−アミノフェニルアラニンへの改変またはＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸の置換またはＢ１〜４およびＢ２６〜３０位のいずれか、もしくは全部の欠失を含む。また、本明細書で定義されるインスリンペプチドは、非ペプチド部分、例えば、レトロインベルソ断片の挿入もしくは置換、またはアザペプチド結合（ＮＨにより置換されたＣＯ）もしくはシュード−ペプチド結合（例えば、ＣＨ2で置換されたＮＨ）もしくはエステル結合（例えば、１つもしくは複数のアミド（−ＣＯＮＨＲ−）結合がエステル（ＣＯＯＲ）結合により置き換えられたデスピペプチド）などの非ペプチド結合の組み込みにより天然インスリンから誘導される類似体であってもよい。
「Ａ１９インスリン類似体」は、天然インスリンのＡ鎖の１９位に、４−アミノフェニルアラニンまたは４−メトキシフェニルアラニンの、天然チロシン残基との置換を有するインスリンペプチドである。
本明細書で使用する「ＩＧＦB16B17類似体ペプチド」は、Ａ鎖が配列番号１９のペプチド配列を含み、Ｂ鎖が配列番号２０の配列を含む、Ａ鎖とＢ鎖のヘテロ二本鎖、ならびにその一本鎖インスリン類似体、ならびにＡ鎖および／またはＢ鎖の類似体が１〜３個のさらなるアミノ酸置換を含むこれらの配列の類似体を含む一般的な語であるが、但し、Ｂ鎖は配列番号２の配列を含まず、Ｂ１６位にチロシンおよびＢ１７位にロイシンを含む。
「ＩＧＦ ＹＬ類似体」は、配列番号１９のＩＧＦ Ａ鎖と、配列番号６９のＩＧＦ Ｂ鎖とを含むペプチドである。
本明細書で使用する「一本鎖インスリン類似体」の語は、インスリンもしくはＩＧＦのＡおよびＢ鎖、またはその類似体もしくは誘導体が、互いに共有的に連結されて線状ポリペプチド鎖を形成する、構造的に関連するタンパク質の群を包含する。本明細書に開示されるように、一本鎖インスリン類似体は、連結部分を介する、Ｂ鎖のカルボキシ末端の、Ａ鎖のアミノ末端への共有結合を含む。
本明細書で使用する「インスリンＡ鎖」の語は、さらなる記述言語はなく、配列番号１の２１アミノ酸の配列ならびにＡ１９インスリン類似体のＡ鎖およびＡ４、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１から選択される位置での１つまたは複数のアミノ酸の挿入、欠失または置換による配列番号１の配列の改変などの、当業者には公知の他の類似体などの、その機能的類似体および誘導体を包含することが意図される。
本明細書で使用する「インスリンＢ鎖」の語は、さらなる記述言語はなく、配列番号２の３０アミノ酸の配列、ならびにＢ１６またはＢ２５位のアミノ酸の、４−アミノフェニルアラニンへの改変またはＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置での１つもしくは複数のアミノ酸の挿入、欠失もしくは置換またはＢ１〜４位およびＢ２６〜３０位のいずれかもしくは全部の欠失などの、天然Ｂ鎖の改変された機能的類似体を包含することが意図される。
本明細書で使用する「同一性」の語は、２つ以上の配列間の類似性に関する。同一性は、同一の残基の数を、残基の合計数によって除し、成績に１００を乗じてパーセント値を実現することにより測定する。よって、正確に同じ配列の２コピーは同一性１００％であるが、相互に関してアミノ酸の欠失、付加、または置換を有する２つの配列は同一性の度合いが低い。当業者であれば、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール、Altschul et al. (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410）などのアルゴリズムを使用するものなどの、いくつかのコンピュータプログラムが、配列同一性の決定に入手可能であることを認識されよう。
「グルカゴン関連ペプチド」および「インクレチンペプチド」の語は、互換的に使用され、前記用語は、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、およびＧＩＰ受容体のいずれか１つまたは複数でアゴニストとしての生物学的活性を有し、天然のグルカゴン、天然のオキシントモジュリン、天然のエキセンジン−４、天然のＧＬＰ−１、天然のＧＬＰ−２、または天然のＧＩＰの少なくとも１つと、少なくとも４０％（例えば、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むペプチドを包含する。別段の記載がなければ、グルカゴン関連ペプチドにおけるアミノ酸位置（例えば、プロドラッグ部分、コンジュゲート部分、親水性ポリマー、アシル化、またはアルキル化の連結に対する）に対するあらゆる言及は、天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）に対する位置を意味する。
本明細書で使用する、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域に対する参照は、グルカゴンペプチドの天然のＣ末端またはＣ末端での１つもしくは複数のアミノ酸の付加により伸長されたグルカゴン類似体のＣ末端伸長の任意のアミノ酸、またはそれぞれ、天然のグルカゴン配列と比較して、１つもしくは複数のアミノ酸の欠失により短縮されたグルカゴン類似体の末端アミノ酸を包含することが意図される。グルカゴン関連ペプチドのＣ末端領域にコンジュゲートされたインスリンペプチドは、Ｃ末端領域のアミノ酸の側鎖への連結またはＣ末端カルボン酸部分を介する連結を含むことが意図される。
「ＧＬＰ−１アゴニスト」の語は、その開示が参照によって本出願に特に援用される、公開されている２００７年５月１８日公開の国際出願第ＷＯ２００７／０５６３６２号の例１３に記載されているものなどの、確証されているｉｎ ｖｉｔｒｏのモデルアッセイを使用してｃＡＭＰ生成によって測定して、ＧＬＰ−１受容体活性を刺激する化合物を意味する。
本明細書で使用する、「天然のグルカゴン」の語は配列番号７０１の配列からなるペプチドを指し、「天然のＧＩＰ」の語は配列番号７０７の配列からなるペプチドを指し、「天然のＧＬＰ−１」の語はＧＬＰ−１（７〜３６）アミド（配列番号７０３の配列からなる）、ＧＬＰ−１（７〜３７）酸（配列番号７０４の配列からなる）、またはこれら２つの化合物の混合物を指す総称である。本明細書で使用する、いかなるさらなる呼称のない「グルカゴン」または「ＧＩＰ」または「ＧＬＰ−１」に対する一般参照は、それぞれ、天然のグルカゴンまたは天然のＧＩＰまたは天然のＧＬＰ−１を意味するものと意図される。
本明細書で使用する「グルカゴンペプチド」の語は、配列番号７０１の天然のグルカゴンペプチド、および天然のグルカゴン配列に対して１つまたは複数のアミノ酸改変を有する改変されている誘導体を指す総称であり、それだけには限定されないが、アミノ酸１、２、５、７、８、１０、１２、１３、１４、１６、１７、１８、２４、２８、および２９位の置換を含んでもよい。全般的に、数による特定のアミノ酸位置の言及（例えば、２８位）は全て、天然のグルカゴン（配列番号７０１）における位置、またはそのあらゆる類似体における対応するアミノ酸位置のアミノ酸を意味する。例えば、「２８位」と言及すれば、配列番号７０１の最初のアミノ酸が欠失しているグルカゴン類似体に対して対応する２７位を意味する。同様に、「２８位」と言及すれば、配列番号７０１のＮ末端の前にアミノ酸が１つ付加されているグルカゴン類似体に対して対応する２９位を意味する。
本明細書で使用する「ＧＬＰ−１ペプチド」の語は、天然のＧＬＰ−１、および天然のＧＬＰ−１配列に対してアミノ酸改変を１つまたは複数有する改変されている誘導体を指す総称である。
本明細書で使用する「誘導体」の語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの化学的改変、例えば、ポリペプチドの１つもしくは複数の位置への側鎖中の基、例えば、チロシン残基へのニトロ基、もしくはチロシン残基へのヨウ素の導入、または遊離カルボキシル基の、エステル基もしくはアミド基への変換、またはアシル化によるアミノ基のアミドへの変換、またはヒドロキシ基をエステルにするアシル化、または一次アミンを二次アミンにするアルキル化もしくは親水性部分のアミノ酸側鎖への連結などの、化合物（例えば、アミノ酸）への化学的改変を包含することが意図される。他の誘導体は、ポリペプチド中のアミノ酸残基の側鎖の酸化または還元によって得られる。
本明細書で使用する場合、第２の受容体と比較した第１の受容体に対する分子の「選択性」の語は、以下の比：第１の受容体での分子のＥＣ50で除算した第２の受容体での分子のＥＣ50を指す。例えば、第１の受容体で１ｎＭのＥＣ50および第２の受容体で１００ｎＭのＥＣ50を有する分子は、第２の受容体と比較して第１の受容体に対する１００倍の選択性を有する。
本明細書で使用する、アミノ酸「改変」は、アミノ酸の置換、アミノ酸への／からの化学基の付加および／または除去によるアミノ酸の誘導体化を指し、ヒトタンパク質中に共通して見出される２０種のアミノ酸のいずれか、ならびに非定型または非天然アミノ酸との置換を含む。非定型アミノ酸の市販の供給源には、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＣｈｅｍＰｅｐ Ｉｎｃ．（Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）、およびＧｅｎｚｙｍｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が含まれる。非定型アミノ酸は、市販の供給業者から購入し、初めから合成し、または天然に存在するアミノ酸を化学的に改変し、もしくは誘導体化してもよい。
本明細書で使用する、アミノ酸の「置換」は、一アミノ酸残基の異なるアミノ酸残基による置き換えを意味する。
本明細書で使用する「保存的なアミノ酸置換」の語は、本明細書において以下の５つの群のうち１つ以内の交換と規定される：
Ｉ．小型の脂肪族の無極性またはわずかに極性の残基：
Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
ＩＩ．極性の負に荷電している残基、およびこれらのアミド：
Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ，システイン酸、およびホモシステイン酸：
ＩＩＩ．極性の正に荷電している残基：
Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．大型の脂肪族の無極性残基：
Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大型の芳香族残基：
Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン
本明細書で使用する「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」の総称は、一般式Ｈ（ＯＣＨ2ＣＨ2）nＯＨによって表される分枝鎖または直鎖における、エチレンオキシドおよび水の縮合重合体の混合物を意味し、式中、ｎは少なくとも２である。「ポリエチレングリコール鎖」または「ＰＥＧ鎖」は、数字の接尾辞と組み合わせて使用して、およその平均分子量を示す。例えば、ＰＥＧ−５０００は、合計分子量の平均が約５０００ダルトンであるポリエチレングリコール鎖を意味する。
本明細書で使用する「ペグ化」の語および同様の語は、ポリエチレングリコール鎖を化合物に連結することにより、その天然の状態から改変されている化合物を意味する。「ペグ化ポリペプチド」は、ポリペプチドに共有結合しているＰＥＧ鎖を有するポリペプチドである。
本明細書で使用する「リンカー」は、２つの別々の実体を相互に結合する、結合、分子、または分子の群である。リンカーは、２つの実体の最適な間隔を提供し得、または２つの実体が相互に離れているようにする不安定な連結をさらに供給し得る。柔軟な連結には、光切断性基、酸に不安定な部分、塩基に不安定な部分、および酵素切断性基が含まれる。
本明細書で使用する「ダイマー」は、リンカーによって相互に共有結合している２つのサブユニットを含む複合体である。ダイマーの語は、いかなる限定語の存在なしで使用する場合、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を包含する。ホモダイマーは同一のサブユニットを２つ含み、ヘテロダイマーは異なるサブユニットを２つ含むが、２つのサブユニットは相互に実質的に類似する。
本明細書で使用する、ｎが１〜６であってよい「Ｃ1−Ｃnアルキル」の語は、１から特定する数までの炭素原子を有する分枝または直鎖のアルキル基を意味する。典型的なＣ1−Ｃ6アルキル基には、それだけには限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。
本明細書で使用する、ｎが２〜６であってよい「Ｃ2−Ｃnアルケニル」の語は、２から特定する数までの炭素原子および少なくとも１つの二重結合を有する、オレフィン性に（ｏｌｅｆｉｎｉｃａｌｌｙ）不飽和の分枝または直鎖の基を表す。このような基の例には、それだけには限定されないが、１−プロペニル、２−プロペニル（−ＣＨ2−ＣＨ＝ＣＨ2）、１，３−ブタジエニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ＝ＣＨ2）、１−ブテニル（−ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＨ3）、ヘキセニル、ペンテニルなどが含まれる。
ｎが２〜６であってよい「Ｃ2−Ｃnアルキニル」の語は、２からｎ個までの炭素原子および少なくとも１つの三重結合を有する、不飽和の分枝または直鎖の基を表す。このような基の例には、それだけには限定されないが、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニルなどが含まれる。
本明細書で使用する「アリール」の語は、芳香環を１または２個有する単環式または二環式炭素環系を意味し、それだけには限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが含まれる。アリール環のサイズ、および置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指摘することにより示される。例えば、「（Ｃ1−Ｃ3アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）」の語は、１〜３員のアルキル鎖によって親部分に結合している５〜１０員のアリールを意味する。
本明細書で使用する「ヘテロアリール」の語は、芳香環を１または２個含み、芳香環に窒素、酸素、またはイオウの原子を少なくとも１個含む、単環式または二環式環系を意味する。ヘテロアリール環のサイズ、および置換基または連結基の存在は、存在する炭素の数を指摘することにより示される。例えば、「（Ｃ1−Ｃnアルキル）（Ｃ5−Ｃ6ヘテロアリール）」の語は、親部分に１員から「ｎ」員のアルキル鎖によって結合している５または６員のヘテロアリールを意味する。
本明細書で使用する「ハロ」の語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素からなる群の１つまたは複数のメンバーを意味する。
本明細書で使用する、さらなる呼称のない「患者」の語は、飼育されているあらゆる温血脊椎動物（例えば、それだけには限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットを含む）およびヒトを包含することが意図される。
本明細書で使用する、「単離された」の語は、その天然の環境から取り出されていることを意味する。一部の実施形態では、類似体を、組換え方法を介して作製し、類似体を、宿主細胞から単離する。
本明細書で使用する、「精製された」の語は、天然または自然の環境において分子または化合物と通常結合する夾雑物を実質的に含まない形態での分子または化合物の単離に関し、元の組成物の他の成分から分離される結果として、純度が増大していることを意味する。「精製されたポリペプチド」の語は、限定されるものではないが、核酸分子、脂質および炭水化物などの他の化合物から分離されたポリペプチドを記述するために本明細書で使用される。
「ペプチド模倣物質」とは、現存するペプチドの一般構造とは異なるが、例えば、そのペプチドの生物学的活性を模倣することによって、現存するペプチドと類似する様式で機能する構造を有する化学的化合物を指す。ペプチド模倣物質は、典型的には、天然に存在するアミノ酸および／または非天然のアミノ酸を含むが、ペプチド骨格に対する改変を含んでもよい。例えば、ペプチド模倣物質は、非ペプチド部分、例えば、レトロインベルソ断片の挿入もしくは置換、またはアザペプチド結合（ＮＨにより置換されたＣＯ）もしくはシュード−ペプチド結合（例えば、ＣＨ２で置換されたＮＨ）、もしくはエステル結合（例えば、１つもしくは複数のアミド（−ＣＯＮＨＲ−）結合がエステル（ＣＯＯＲ）結合により置き換えられたデスピペプチド）などの非ペプチド結合の組み込みを含む、天然に存在するアミノ酸の配列を含んでもよい。あるいは、ペプチド模倣物質は、いかなる天然に存在するアミノ酸も含まなくてもよい。
本明細書で使用する「荷電アミノ酸」または「荷電残基」の語は、生理学的ｐＨの水性溶液中で負に荷電している（すなわち、脱プロトン化されている）、または正に荷電している（すなわち、プロトン化されている）側鎖を含むアミノ酸を指す。例えば、負に荷電しているアミノ酸には、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、およびホモグルタミン酸が含まれ、正に荷電しているアミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。荷電アミノ酸には、ヒトのタンパク質に共通して見出される２０個のアミノ酸の中の荷電アミノ酸、および非典型的な、または天然に存在しないアミノ酸が含まれる。
本明細書で使用する「酸性アミノ酸」の語は、例えば、側鎖カルボン酸基またはスルホン酸基などの、第２の酸性部分（アミノ酸のアルファカルボン酸以外）を含むアミノ酸を指す。
本明細書で使用する、さらなる呼称のない「患者」の語は、飼育されているあらゆる温血脊椎動物（例えば、それだけには限定されないが、家畜、ウマ、ネコ、イヌ、および他のペットを含む）、哺乳動物、およびヒトを包含するものとされる。
省略形
インスリン類似体は、以下のように省略される。
インスリンＡおよびＢは、Ａ鎖については大文字ＡおよびＢ鎖については大文字Ｂで指定される。天然のインスリンおよびＩＧＦ配列から外れる改変は、ＡまたはＢ鎖の指定の後に括弧内に示され（例えば、［Ｂ1（Ｈ５，Ｈ１０，Ｙ１６，Ｌ１７）：Ａ1（Ｈ８，Ｎ１８，Ｎ２１）］）、一文字のアミノ酸省略形は置換を示し、数字は天然のインスリンのナンバリングを用いた場合のそれぞれのＡまたはＢ鎖中の置換の位置を示す。Ａ鎖とＢ鎖との間のコロンは、二本鎖のインスリンを示すが、ダッシュ記号は共有結合、かくして、一本鎖類似体を示す。一本鎖類似体では、連結部分はＡ鎖とＢ鎖との間に含まれ、Ｃ1の指定は、配列番号２３の天然のＩＧＦ １Ｃペプチドを指す。連結部分を参照する指定「Ｃ８位」は、配列番号２３の８番目のアミノ酸に対応する位置に位置するアミノ酸を指す。
実施形態
患者において血糖値を低下させる活性を有する、ならびに体重減少を誘導する、インスリンペプチドとグルカゴン関連ペプチド（インクレチン）とのコンジュゲートが本明細書に開示される。インクレチン−インスリンコンジュゲート（インクレリン）を、インクレチンのカルボキシ末端が、インスリンペプチドのＢ鎖に連結されたペプチド融合物として形成することができる。そのような化合物は、インスリン受容体とそれぞれのインクレチン受容体の両方において活性を示すことが見出された。しかしながら、そのようなコンジュゲートは、インスリン受容体で活性が実質的に減少している（図１を参照）。
本出願人は、インクレチンをインスリンに連結するための非ペプチド性線状スペーサーの使用が、インスリン受容体とインクレチン受容体で完全な効力を有するコンジュゲートをもたらすことを見出した。特に、ＧＬＰ−１およびグルカゴン受容体で、もしくはＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体で、コアゴニスト活性を、またはグルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体でトリアゴニスト活性を示すグルカゴン類似体は、以前に記載されている。本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートにおいて、インスリン受容体活性だけでなく、グルカゴン類似体のこのコアゴニストおよび／またはトリアゴニスト活性も保持される。有利には、本明細書に開示されるインクレリンは、血糖を低下させ、体重減少を誘導するか、または体重増加を防止する能力を有する。一実施形態では、本発明のインクレチン−インスリンコンジュゲートは、インスリン受容体で、より具体的には、インスリンサブタイプＢ受容体で、天然インスリンの少なくとも１０〜２００％、５０〜１５０％、または７０〜１００％の活性を有する。一実施形態では、本発明のインクレチン−インスリンコンジュゲートは、ＧＬＰ−１受容体で、天然のＧＬＰ−１の少なくとも１０〜２００％、５０〜１５０％、もしくは７０〜１００％の活性、および／またはＧＩＰ受容体で、天然のＧＩＰの少なくとも１０〜２００％、５０〜１５０％、もしくは７０〜１００％の活性を有する。一実施形態では、本発明のインクレチン−インスリンコンジュゲートは、例９のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに基づいてＧＬＰ−１受容体とＧＩＰ受容体の両方でナノモル濃度未満の活性を有し、例１０のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに基づいてインスリンサブタイプＢ受容体でナノモル濃度未満の活性を有する。
一実施形態によれば、インクレチンのカルボキシ末端は、スペーサーを介して、１）Ａ鎖のＡ１４もしくはＡ１５位のアミノ酸の側鎖、２）Ｂ鎖のアミノＮ末端、３）Ｂ鎖のＢ１、Ｂ３、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖、または４）一本鎖インスリン類似体の連結部分の任意の位置の側鎖アミノ酸に連結される。一実施形態によれば、インクレチンのカルボキシ末端は、スペーサーを介して、インスリンペプチドのＢ鎖のアミノＮ末端、またはＢ２８もしくはＢ２９アミノ酸の側鎖に連結される。一実施形態によれば、インクレチンのカルボキシ末端は、スペーサーを介して、インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端アミンに連結される。
一実施形態によれば、Ｗがインクレチンであり、Ｚがインスリンペプチドであり、ＹがＷをＺに共有的に連結するスペーサーである、一般構造Ｗ−Ｙ−Ｚを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。インクレチンペプチドは、例えば、天然のグルカゴン、ＧＬＰ−１、もしくはＧＩＰ、またはグルカゴン／ＧＬＰ−１コアゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ−１コアゴニストおよびグルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニストなどの、グルカゴン、ＧＬＰ−１、もしくはＧＩＰのアゴニスト類似体などの、公知のインクレチンのいずれかであってもよい。インスリンペプチドは、二本鎖と一本鎖インスリン類似体の両方などの、任意の公知のインスリンまたはインスリン類似体であってもよい。インクレチンとインスリンペプチドとを連結するスペーサーを、互いの連結ペプチドと適合する公知のリンカーのいずれかから選択することができる。一実施形態では、スペーサーは、リンカー鎖の骨格内の、アミノ、エーテル、チオエーテル、マレイミド、ジスルフィド、セレノエーテル、ジセレン、アミド、エステル、チオエステル、アルケン、シクロアルケン、アルキン、トリゾイル、カルバメート、カルボネート、カテプシンＢ切断性、オキシム、およびヒドラゾンからなる群から選択される部分を含む。
一部の実施形態では、スペーサー（Ｙ）は、３〜５０、３〜２５、５〜１０または６〜８個の原子の長さの原子の鎖を含む。一部の実施形態では、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、ＮおよびＳからなる群から選択される。鎖原子およびリンカーを、その予想される溶解度（親水性）にしたがって選択して、より可溶性のコンジュゲートを提供することができる。一部の実施形態では、Ｙは、標的組織または臓器または細胞中に見出される酵素または他の触媒または加水分解条件による切断を受ける官能基を提供する。
一部の実施形態では、Ｙは、ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解性である。これらの実施形態では、Ｙは、ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解を受けることができる官能基を含む。ｉｎ ｖｉｖｏで加水分解を受けることができる官能基の非限定例としては、エステル、無水物、およびチオエステルが挙げられる。一部の実施形態では、スペーサーは、ｉｎ ｖｉｖｏで準安定性である。これらの実施形態では、スペーサーは、長期間にわたってもよい、ｉｎ ｖｉｖｏで化学的または酵素的に切断され得る官能基（例えば、酸不安定、還元不安定、または酵素不安定官能基）を含む。例えば、Ｙを、少なくとも１０、もしくは２０、もしくは２５、もしくは３０、もしくは６０、もしくは９０、もしくは１２０分、または３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１８もしくは２４時間にわたって血清中で安定であるように選択することができる。これらの実施形態では、Ｙは、例えば、ヒドラゾン部分、ジスルフィド部分、またはカテプシン−切断性部分を含んでもよい。Ｙが準安定性である場合、いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、Ｗ−Ｙ−Ｚコンジュゲートは、細胞外環境中で安定である、例えば、上記の期間にわたって血清中で安定であるが、細胞内環境中で、または細胞内環境を模倣する条件中で不安定であり、それは細胞中への進入時に切断する。一部の実施形態では、Ｙが準安定性である場合、Ｙは、少なくとも約２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、４２もしくは４８時間、または約２４〜４８、４８〜７２、２４〜６０、３６〜４８、３６〜７２、もしくは４８〜７２時間にわたって血清中で安定である。
一実施形態によれば、スペーサーＹは、スペーサー直鎖の骨格内にジスルフィド、チオエーテル、セレノエーテル、ジセレン、チオエーテルスルホキシド、オキシム、ヒドラゾン、トリアゾール、アルキル、またはアルケン結合を含む６〜８原子の直鎖である。一実施形態によれば、スペーサーＹは、スペーサー直鎖の骨格内にジスルフィド、チオエーテル、セレノエーテル、ジセレン、またはオキシム結合を含む６〜８原子の直鎖である。一実施形態によれば、スペーサーＹは、スペーサー直鎖の骨格内にジスルフィド、チオエーテル、セレノエーテルまたはジセレン結合を含む６〜８原子の直鎖である。一実施形態によれば、スペーサーは、以下の一般構造を有する。
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣ1−Ｃ3アルキルからなる群から独立に選択され、
Ｙは、Ｃ、Ｓ、ＳｅまたはＳ＝Ｏであり、
Ｚは、Ｃ、Ｓ、Ｓｅ、−Ｓ（Ｃ1−Ｃ3）（Ｃ5−Ｃ6アリール）−であるか、またはＹと組み合わせたＺは、−Ｃ＝Ｃ−、−Ｏ−Ｎ＝、−Ｎ−Ｎ＝、もしくは１，２，３トリアゾールであり、
ｎは０または１であり、
ｍは１、２または３であり、ＹがＳ＝Ｏである場合、ＺはＣである）
一実施形態では、スペーサーは、ＹがＣ、Ｓ、もしくはＳｅであり、ＺがＣ、Ｓ、もしくはＳｅであるか、またはＹと組み合わせたＺが、−Ｏ−Ｎ＝もしくは１，２，３トリアゾールであるが、但し、ＹとＺが両方ともＣではない、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、ＹがＣ、Ｓ＝Ｏ、もしくはＳｅであり、ＺがＣであるか、またはＹと組み合わせたＺが−Ｏ−Ｎ＝もしくは１，２，３トリアゾールである、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、ＹがＳもしくはＳｅであり、ＺがＣ、Ｓ、もしくはＳｅであるか、またはＹと組み合わせたＺが−Ｏ−Ｎ＝もしくは１，２，３トリアゾールである、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Ｙと組み合わせたＺが−Ｏ−Ｎ＝または１，２，３トリアゾールである、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Ｙと組み合わせたＺがオキシムまたはヒドラゾンを形成する、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＨおよびＣＨからなる群から独立に選択され、ＹがＣ、ＳまたはＳｅであり、ＺがＳｅまたはＳであり、ｎが０または１であり、ｍが１、２または３である、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＨおよびＣＨからなる群から独立に選択され、ＹおよびＺがＳおよびＳｅから独立に選択され、ｎが０または１であり、ｍが１、２または３である、式Ｉの一般構造を有する。
一実施形態によれば、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＨおよびＣ1−Ｃ2アルキルからなる群から独立に選択され、ＹがＳまたはＳ＝Ｏであり、ＺがＣまたはＳであり、ｎが０または１であり、ｍが１、２または３であるが、但し、ＹがＳ＝Ｏである場合、ＺがＣである、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態によれば、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＨおよびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ＹがＳであり、ＺがＣまたはＳであり、ｎが０または１であり、ｍが１、２または３である、式Ｉの一般構造を有する。一実施形態によれば、スペーサーは、式ＩＩ：
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣ1−Ｃ2アルキルからなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３である）
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーの（ＣＨ2）nＣＲ1Ｒ2Ｓ部分は、インクレチンのＣ末端アミノ酸の側鎖を表し、一実施形態（ｎが０であり、Ｒ1およびＲ2がそれぞれＨである場合）では、Ｃ末端アミノ酸はシステインである。さらに、一実施形態では、スペーサーの−ＳＣＲ1Ｒ2（ＣＨ2）m部分は、インスリンＢ鎖の、Ｎ末端のチオール誘導化、またはアミノ酸側鎖を表す。ジスルフィド結合の形成は、誘導体化されたインスリンをインクレチンに連結させて、インクレリンを形成する。
一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎが０または１であり、ｍは１、２または３である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎが０であり、ｍが１、２または３である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ2およびＲ3が両方ともＨであり、Ｒ1およびＲ4がＨ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎが０または１であり、ｍが１、２または３である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がそれぞれＨであり、Ｒ1がＨまたはＣＨ3であり、ｎが０または１であり、ｍが１または２である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ3およびＲ4がそれぞれＨであり、Ｒ1およびＲ2が独立にＨまたはＣＨ3であり、ｎが０であり、ｍが２である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がそれぞれＨであり、Ｒ1がＨまたはＣＨ3であり、ｎが０であり、ｍが２である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれＨであり、ｎは０であり、ｍは１、２または３である。
一実施形態では、スペーサーは、式ＩＩＩ：
（式中、Ｒ1はＨまたはＣＨ3であり、ＹはＳ、ＳｅまたはＳ＝Ｏであり、ＺはＣ、ＳｅまたはＳであり、ＹがＳ＝Ｏである場合、ＺはＣである）
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1がＨまたはＣＨ3であり、ＹがＳであり、ＺがＳである、式ＩＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、以下の構造を含む。
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3である）
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのスペーサーを介する、インスリンＡ鎖またはＢ鎖のアミノまたはカルボキシ末端へのインクレチンペプチドのカルボキシ末端の共有的連結を含む。別の実施形態では、インスリンペプチドのＮ末端またはＣ末端を、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのスペーサーを介して、１０、２０、２４、２８および２９から選択される位置（Ｂ２９位であってもよい）でインクレチンペプチドのアミノ酸の側鎖に共有的に連結する。
別の実施形態では、１つまたは２つのインクレチンペプチドを、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミン、Ｂ鎖のカルボキシ末端から独立に選択される位置により、または例えば、Ｃ８位などの、一本鎖インスリン類似体のＡ鎖とＢ鎖とを連結する連結部分の任意の位置でインスリンペプチドに共有的に連結する。一実施形態では、インクレチンペプチドのカルボキシ末端領域を、インスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端アルファアミンに共有的に連結する。一実施形態では、インクレチンペプチドのカルボキシ末端を、二本鎖または一本鎖インスリンペプチド類似体のＢ鎖のＮ末端アルファアミンに共有的に連結する。
一実施形態によれば、インスリンペプチドは、Ａ鎖とＢ鎖がジスルフィド結合により互いに連結された二本鎖インスリンである。一実施形態では、コンジュゲートは、インクレチンペプチドのカルボキシ末端領域がインスリンペプチドのＡ鎖のアミノ末端に共有的に連結された二本鎖インスリンペプチドを含む。一実施形態では、コンジュゲートは、インスリンペプチドのＡ鎖またはＢ鎖のカルボキシ末端がインクレチンペプチドのアミノ末端に共有的に連結された二本鎖インスリンペプチドを含む。一実施形態では、コンジュゲートは、インクレチンペプチドのカルボキシ末端がインスリンペプチドのＢ鎖のＮ末端アミンに共有的に連結された二本鎖インスリンペプチドを含む。一実施形態では、コンジュゲートは、インスリンペプチドのＢ鎖のカルボキシ末端がインクレチンペプチドのアミノ末端に共有的に連結された二本鎖インスリンペプチドを含む。これらの実施形態のそれぞれにおいて、インクレチンペプチドとインスリンペプチドとの連結は、一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのスペーサーを介するものであり、リンカーＩＶが使用される場合、インクレチンペプチドはＣ末端システインを含む。
別の実施形態では、コンジュゲートは、二本鎖インスリン類似体と、第１および第２のインクレチンペプチドとを含み、それぞれのインクレチンペプチドは、Ｂ鎖のアミノ末端、Ａ鎖のカルボキシ末端、およびＢ鎖のカルボキシ末端からなる群から選択される位置でインスリンペプチドに独立に共有的に連結される。一実施形態では、コンジュゲートは、第１のインクレチンペプチドのカルボキシ末端領域がインスリンペプチドのＢ鎖のアミノ末端に共有的に連結され、インスリンペプチドのＢ鎖のカルボキシ末端が第２のインクレチンペプチドのアミノ末端に共有的に連結された、二本鎖インスリンペプチドを含む。一実施形態では、第１および第２のインクレチンペプチドは異なり、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体からなる群から選択される２つの異なる受容体で活性を有する。一実施形態では、第１のインクレチンペプチドはグルカゴン受容体で活性を有し、第２のインクレチンペプチドはＧＬＰ−１受容体で活性を有する。一実施形態では、第１および／または第２のインクレチンペプチドは、グルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体からなる群から選択される２つの受容体で活性を有する。これらの実施形態のそれぞれにおいて、インクレチンペプチドとインスリンペプチドとの連結は、一般式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのスペーサーを介するものである。
一部の、またはあらゆる実施形態において、本明細書に開示されるコンジュゲートのインスリンペプチドは、配列番号１のＡ鎖と配列番号２のＢ鎖とを含む天然のインスリン、または例えば、配列番号１および２を含む一本鎖インスリン類似体などの、天然のインスリンの類似体である。一実施形態では、インスリンペプチドは、ＩＧＦB16B17類似体ペプチドである。本開示によれば、インスリンの類似体は、インスリン類似体がＡ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される位置での１、２もしくは３個以上のアミノ酸置換またはＢ１〜４およびＢ２６〜３０位のいずれかもしくは全部の欠失が天然のインスリンと異なる、Ａ鎖とＢ鎖とを含むポリペプチドを包含する。
一実施形態では、コンジュゲートのインクレチンペプチド成分は、天然のグルカゴン（配列番号７０１）、天然のＧＬＰ−１（配列番号７０３）および天然のＧＩＰ（配列番号７０７）からなる群から選択されるペプチドである。一実施形態では、インクレチンペプチドは、インクレチンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸に連結された、配列ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号８２１）またはＫＲＮＲ（配列番号８２２）を含むＣ末端伸長を含む。一実施形態では、Ｃ末端伸長は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）である。さらなる実施形態では、インクレチンペプチドは、２位のアミノイソ酪酸、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）のＣ末端伸長を含み、Ｃ10−Ｃ20アルキルまたはアシル基と共に、１０位および／または４０位のアルキル化またはアシル化を含んでもよく、さらに、インクレチンペプチドのＣ末端に付加された（例えば、天然のグルカゴン配列に対して４０位に）アミノ酸の側鎖でのペグ化を含んでもよい。一実施形態では、インクレチンペプチドは、２４位と４０位の両方のアミノ酸の側鎖でペグ化される。一実施形態では、インクレチンペプチドは、グルカゴンペプチドまたはＧＬＰ−１ペプチドである。一実施形態では、インクレチンペプチドは、
Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、
Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）、
Ｈ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３２）、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３３）、および
ＹａｉｂＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＹＬＤＲＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３４）からなる群から選択されるペプチド、または例えば、１０位での置換（リシンでの置換であってもよい）、および／もしくは４０位でのアミノ酸の付加（リシンであってもよい）などの、１、２もしくは３個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号７５６、１９３１、１９３２、１９３３もしくは１９３４と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、１０位および／もしくは４０位のリシンをアシル化する、ならびに／または４０位の付加されるアミノ酸をペグ化する。一実施形態では、インクレチンペプチドは、
Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、
Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）、および
Ｈ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３２）からなる群から選択されるペプチドである。一実施形態では、インクレチンペプチドは、
Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、または
Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）である。一実施形態では、インクレチンペプチドは、Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、または例えば、１０位での置換（リシンでの置換であってもよい）、および／もしくは４０位でのアミノ酸の付加などの、１、２もしくは３個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号７５６と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、１０位のリシンをアシル化する、および／または４０位の付加されるアミノ酸をペグ化する。一実施形態では、インクレチンペプチドは、Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）、または例えば、１０位での置換（リシンでの置換であってもよい）、および／もしくは４０位でのアミノ酸の付加などの、１、２もしくは３個のアミノ酸置換もしくは付加が配列番号１９３１と異なるペプチドである。さらなる実施形態では、１０位のリシンをアシル化する、および／または４０位の付加されるアミノ酸をペグ化する。
一部の実施形態では、本開示のコンジュゲートのインクレチンペプチドは、配列番号７０１のアミノ酸配列に基づくアミノ酸配列を含むが、１個または複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、一部の例では、１６個以上（例えば、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個など））の特定の、または任意選択のアミノ酸改変が配列番号７０１と異なる天然ヒトグルカゴン（配列番号７０１）の類似体である。一部の、またはあらゆる実施形態では、本開示のペプチドは、天然ヒトグルカゴン配列（配列番号７０１）と比較して、合計で１個、２個まで、３個まで、４個まで、５個まで、６個まで、７個まで、８個まで、９個まで、または１０個までのさらなるアミノ酸改変（例えば、特定のアミノ酸改変に加えて）を含む。例えば、一実施形態では、グルカゴン（配列番号７０１）の類似体は、（ａ）１位にイミダゾール側鎖を含むアミノ酸、（ｂ）２位にＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸、（ｃ）９、１０、１２、１６、２０、または３７〜４３位のいずれかでアシル化されたアミノ酸またはアルキル化されたアミノ酸、（ｄ）１６、１７、１８、１９、２０、および２１位の１つまたは複数のアミノ酸を安定化するアルファヘリックス、ならびに（ｅ）配列番号７０１と比較して１０個までのさらなるアミノ酸改変を含む。一実施形態では、本開示は、（ａ）〜（ｄ）で特定されたアミノ酸改変に加えて、１０個までのさらなるアミノ酸改変と共に、（ａ）〜（ｄ）を含むグルカゴンの類似体を提供する。一部の、またはあらゆる実施形態では、改変は、本明細書に記載のもののいずれか、例えば、アシル化、アルキル化、ペグ化、Ｃ末端でのトランケーション、１、２、３、７、１０、１２、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２４、２７、２８、および２９位の１つまたは複数でのアミノ酸の置換である。
一実施形態によれば、インクレチンペプチドと、インスリンペプチドとを含み、インクレチンペプチドが、５〜１０個の原子の直鎖スペーサーを介してインスリンペプチドに連結され、スペーサーがスペーサー直鎖の骨格内にジスルフィド、チオエーテル、チオエーテルスルホキシド、アルキル、アルケン結合を含む、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートが提供される。一実施形態では、インクレチンペプチドのＣ末端領域を、Ｂ鎖のＢ３、Ｂ２８またはＢ２９位のアミノ酸の側鎖およびＢ鎖のＮ末端アルファアミンから独立に選択される位置を介してインスリンペプチドに共有的に連結する。一実施形態では、コンジュゲートのインスリンペプチドは、ＧＩＶＥＱＣＣＸ8ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21（配列番号３）のＡ鎖配列、またはＡ５、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８から選択される位置に１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその類似体と、Ｒ22−ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ45（配列番号１５）のＢ鎖配列、またはＢ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１７、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２２およびＢ２３から選択される位置（天然インスリンと比較した位置）に１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその類似体とを含み、ここで、Ｂ鎖はジスルフィド結合を介してＡ鎖に連結され、
Ｒ22はアミン、またはＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＶＮＱ、ＮＱおよびＱからなる群から選択される１〜４アミノ酸の配列であり、
Ｘ8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
Ｘ21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
Ｘ45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである。一実施形態では、インスリンは、一般式Ｉ（本明細書で定義される）のスペーサーを介してインクレチンに連結され、インクレチンペプチドは、配列Ｘ80Ｘ81Ｘ82ＧＴＦＴＳＤＸ95ＳＸ83ＹＬＸ84Ｘ85Ｘ86Ｘ87ＡＸ88Ｘ89ＦＸ90Ｘ91ＷＬＸ92Ｘ93Ｘ94−Ｚ（配列番号１９２８）（式中、Ｘ80はＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、Ｘ81は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリン、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニンまたはＤ−アラニンであり、Ｘ82はＧｌｎまたはＧｌｕであり、Ｘ83はＬｙｓまたはＩｌｅであり、Ｘ84はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ85はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、Ｘ86はＡｒｇまたはＧｌｎであり、Ｘ87はＡｌａまたはＡｒｇであり、Ｘ88はＡｉｂ、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、Ｘ89はＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｘ90はＶａｌまたはＩｌｅであり、Ｘ91はＡｓｎ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、Ｘ92はＬｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔであり、Ｘ93はＡｓｐ、Ｌｙｓ ＡｓｎまたはＡｌａであり、Ｘ94はＧｌｙまたはＴｈｒであり、Ｚは−ＣＯＯＨ、−ＣＯＮＨ2およびＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2（配列番号８２３）からなる群から選択され、Ｘ95はＴｙｒである）を含む。一実施形態では、Ｘ80はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ86はａｉｂである。
一実施形態では、インクレチンペプチドのＣ末端アミノ酸が、Ｂ鎖のＢ３、Ｂ２８またはＢ２９位のアミノ酸の側鎖、およびＢ鎖のＮ末端アルファアミンから独立に選択される位置で直鎖スペーサーを介してインスリンペプチドに共有的に連結される、インクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。一実施形態では、インクレチンペプチドのＣ末端アミノ酸を、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミンで直鎖スペーサーを介してインスリンペプチドに共有的に連結する。一実施形態によれば、インスリンペプチドは、
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）のＢ鎖配列、または１、２もしくは３個のアミノ酸置換が配列番号１および／もしくは配列番号２と異なるＡ鎖および／もしくはＢ鎖を含み、ここで、Ｂ鎖は、ジスルフィド結合を介してＡ鎖に連結され、
直鎖スペーサーは、式ＩＩ：
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はＨおよびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３であり、ＹはＳ、ＳｅまたはＣであり、ＺはＳまたはＳｅである）、または式ＩＶのリンカー
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3である）
の一般構造を含み、
インクレチンペプチドは、配列Ｘ80Ｘ81Ｘ82ＧＴＦＴＳＤＸ79ＳＸ83ＹＬＸ84Ｘ85Ｘ86Ｘ87ＡＸ88Ｘ89ＦＸ90Ｘ91ＷＬＸ92Ｘ93Ｘ94−Ｚ（配列番号１９２８）
（式中、
Ｘ79はＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、
Ｘ80はＨｉｓ、Ｔｙｒ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
Ｘ81は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニンおよびＤ−アラニンであり、
Ｘ82はＧｌｎまたはＧｌｕであり、
Ｘ83はＬｙｓまたはＩｌｅであり、
Ｘ84はＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ85はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、
Ｘ86はＡｒｇまたはＧｌｎであり、
Ｘ87はＡｌａまたはＡｒｇであり、
Ｘ88はアミノイソ酪酸、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
Ｘ89はＡｓｐまたはＧｌｕであり、
Ｘ90はＶａｌまたはＩｌｅであり、
Ｘ91はＡｓｎ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、
Ｘ92はＬｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
Ｘ93はＡｓｐ、Ｌｙｓ ＡｓｎまたはＡｌａであり、
Ｘ94はＧｌｙまたはＴｈｒであり、
Ｘ95は結合またはＧｌｙであり、Ｚ1は−ＣＯＯＨ、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号８２１）、およびＫＲＮＲ（配列番号８２２）からなる群から選択される）
を含む。一実施形態では、インクレチンペプチドは、配列Ｘ80Ｘ81Ｘ82ＧＴＦＴＳＤＸ79ＳＸ83ＹＬＸ84Ｘ85Ｘ86Ｘ87ＡＸ88Ｘ89ＦＸ90Ｘ91ＷＬＸ92Ｘ93Ｘ94−Ｚ1（配列番号１９２８）
（式中、
Ｘ79はＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、リシンであってもよく、またはＸ80はＨｉｓもしくはＴｙｒ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンもしくはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、もしくはイミダゾール酢酸であり、Ｘ81はＤ−セリンもしくはアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）であり、Ｘ82はＧｌｎもしくはＧｌｕであり、Ｘ83はＬｙｓもしくはＩｌｅであり、Ｘ84はＡｓｐもしくはＧｌｕであり、Ｘ85はＬｙｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒもしくはＧｌｕであり、Ｘ86はＡｒｇもしくはＧｌｎであり、Ｘ87はＡｌａもしくはＡｒｇであり、Ｘ88はアミノイソ酪酸、ＧｌｎもしくはＬｙｓであり、Ｘ89はＡｓｐもしくはＧｌｕであり、Ｘ90はＶａｌもしくはＩｌｅであり、Ｘ91はＡｓｎ、ＧｌｎもしくはＡｌａであり、Ｘ92はＬｅｕ、ＶａｌもしくはＭｅｔであり、Ｘ93はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ ＡｓｎもしくはＡｌａであり、Ｘ94はＧｌｙもしくはＴｈｒであり、Ｚ1は−ＣＯＯＨ、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号８２１）、およびＫＲＮＲ（配列番号８２２）からなる群から選択される）
を含む。一実施形態では、Ｚ1は配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）である。
一実施形態によれば、インスリンペプチドは、
ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）のＢ鎖配列、または１、２もしくは３個のアミノ酸置換が配列番号１および／もしくは配列番号２と異なるＡ鎖および／もしくはＢ鎖を含み、ここで、Ｂ鎖は、ジスルフィド結合を介してＡ鎖に連結され、
直鎖スペーサーは、式ＩＩ：
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はＨおよびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３であり、ＹはＳ、ＳｅまたはＣであり、ＺはＳまたはＳｅである）、または式ＩＶのリンカー
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3である）
の一般構造を含み、
インクレチンペプチドは、配列Ｘ80Ｘ81Ｘ82ＧＴＦＴＳＤＸ79ＳＫＹＬＸ84Ｘ85Ｘ86ＡＡＸ88Ｘ89ＦＶＱＷＬＸ90Ｘ91Ｘ92Ｘ93Ｘ94ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９２９）
（式中、
Ｘ79はＣ１２−Ｃ１８アシルまたはアルキル基に共有結合したアミノ酸であり、
Ｘ80はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
Ｘ81は、ＤＰＰ−ＩＶ保護アミノ酸であり、アルファ、アルファ−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）であってもよく、
Ｘ82はＧｌｕ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ、Ｖａｌ、ＮｏｒＶａｌ、ホモセリン、Ｍｅｔ、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、アセチル−Ｏｒｎ、アセチル−ジアミノブタン酸、およびアセチル−Ｌｙｓからなる群から選択され、
Ｘ84は酸性アミノ酸であり、ＧｌｕまたはＡｓｐであってもよく、
Ｘ85はＧｌｕ、Ａｌａ、アルファ、アルファ−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）、Ｈｉｉｓ、Ｌｙｓであり、
Ｘ86はＡｒｇ、ＨｉｓまたはＧｌｎであり、
Ｘ88はアルファ、アルファ−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）またはＧｌｎまたはＨｉｓ、Ｌｙｓ、またはＡｌａからなる群から選択され、
Ｘ89は酸性アミノ酸であり、ＡｓｐまたはＧｌｕであってもよく、
Ｘ90はＬｅｕ、Ａｌａ、またはＮｌｅであり、
Ｘ91はＡｌａ、Ｌｙｓ、または酸性アミノ酸（ＡｓｐもしくはＧｌｕであってもよい）であり、
Ｘ92は脂肪族、例えば、ＡｌａまたはＧｌｙまたはＡＩＢまたはＶａｌであり、
Ｘ93は低分子脂肪族アミノ酸、例えば、ＡｌａまたはＧｌｙであり、
Ｘ94はＡｌａまたは塩基性アミノ酸（ＡｒｇもしくはＬｙｓであってもよい）である）
を含む。
さらなる実施形態において、インクレチンペプチドは、Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、
Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）、
Ｈ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３２）、
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３３）、および
ＹａｉｂＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＹＬＤＲＱＡＡａｉｂＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３４）からなる群から選択されるペプチドであるか、または１０もしくは４０位でＣ１２−Ｃ１８アシルもしくはアルキル基に共有結合したアミノ酸を含むように改変された、直前の配列の改変であってもよく、インクレチンをインスリンペプチドに結合させるスペーサーは、式ＩＩ：
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＨおよびＣ1−Ｃ2アルキルからなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３である）
の一般構造を含む。一実施形態では、スペーサーは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4がＨ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎが１であり、ｍが２である、式ＩＩの一般構造を含む。一実施形態では、リンカーは、式ＩＶ：
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3であり、Ｒ3はＨであってもよい）
の構造を含む。一実施形態では、リンカーは、
の構造からなる。
一実施形態では、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートのインスリンペプチドは、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）
ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）
からなる群から選択されるＢ鎖配列とを含む。
さらなる実施形態では、一般構造Ｘ−Ｙ−Ｚを含み、
Ｘが、配列
Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２０３７）、
Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ40（配列番号２０３８）、
Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号７５６）、または
Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−アミド（配列番号１９３１）
（式中、Ｘ1はＨｉｓまたはＴｙｒであり、Ｘ2はアミノイソ酪酸であり、Ｘ10はガンマＧｌｕリンカーを介してもよい、Ｃ１６−Ｃ２０アルキル基でアシル化されたＬｙｓであり、Ｘ20はアミノイソ酪酸であり、Ｘ40はガンマＧｌｕリンカーを介してもよい、Ｃ１６−Ｃ２０アルキル基でアシル化されたＬｙｓである）
を有するインクレチンペプチドであり、
Ｘが、インクレチンをインスリンペプチドに結合させ、式ＩＩの一般構造を含むスペーサーであり、
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３である）
または、スペーサーが、式ＩＶの一般構造を含み、
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3であり、Ｒ3はＨであってもよい）
Ｚが、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）
ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）
からなる群から選択されるＢ鎖配列とを含むインスリンペプチドである、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートが提供される。
一実施形態によれば、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、前記コンジュゲートのアミノ酸の側鎖で脂質化（例えば、非天然アシルもしくはアルキル基の付加）またはペグ化（ポリエチレングリコール鎖の付加）される。一実施形態では、脂質化は、インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０もしくは４０位から選択される位置（３０および４０位は天然のグルカゴン配列に対してインクレチンペプチドに付加されるＣ末端伸長である）および／またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位で起こる。一実施形態では、インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０もしくは４０位およびインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位から選択される２つの部位が脂質化される。一実施形態では、インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０もしくは４０位から選択される１つまたは２つの部位が脂質化される。一実施形態では、インクレチンペプチドの１０および４０位から選択される１つまたは２つの部位が脂質化され、これらの位置の１つまたは２つでアシル基により脂質化されてもよい。一実施形態では、インクレチンペプチドは、Ｃ１４−Ｃ１８アシル基を用いて１０位でアシル化される。一実施形態では、インクレチンペプチドは、インクレチンペプチドの１０または４０位（天然のグルカゴンのナンバリングに基づく）の側鎖に共有的に連結される、Ｃ１４−Ｃ３０またはＣ１４−Ｃ２０、またはＣ１６−Ｃ２０の非天然アシルまたはアルキル基を含む。一実施形態では、Ｃ１２、Ｃ１３、Ｃ１４、Ｃ１５、Ｃ１６、Ｃ１７、Ｃ１８、Ｃ１９またはＣ２０アシルまたはアルキル基は、１０または４０位でアミノ酸の側鎖に連結され、ガンマグルタミン酸などのリンカーを介してもよい。
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０位から選択される位置（３０および４０位は天然グルカゴン配列に対してインクレチンペプチドに付加されるＣ末端伸長である）および／またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位でペグ化される。一実施形態では、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０位およびインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位から選択される２つの部位がペグ化される。一実施形態では、インクレチンペプチドの２４、３０または４０位から選択される２つの部位がペグ化される。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチンペプチドの２４および４０位でペグ化される。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチンペプチドの４０位でのみペグ化される。
一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、脂質化とペグ化の両方を含み、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０もしくは４０位から選択される位置またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位で脂質化され、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０位から選択される位置またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位でペグ化されるが、但し、ペグ化と脂質化は異なる位置で起こる。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、脂質化とペグ化の両方を含み、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、１０位で脂質化され、４０位でペグ化される。
一実施形態では、
Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２０３７）およびＸ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ40（配列番号２０３８）
（式中、
Ｘ1は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり、
Ｘ2は、アミノイソ酪酸であり、
Ｘ10は、ガンマＧｌｕリンカーを介してもよくＣ１６−Ｃ２０アルキル基でアシル化されたＬｙｓであり、
Ｘ20は、アミノイソ酪酸であり、
Ｘ40は、ガンマＧｌｕリンカーを介してもよくＣ１６−Ｃ２０アルキル基でアシル化されたＬｙｓである）
からなる群から選択されるインクレチンペプチドと、
ＧＩＶＥＱＣＣＸ8ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21（配列番号３）のＡ鎖配列、および
Ｒ22−ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ４５（配列番号１５）のＢ鎖配列
（式中、Ｂ鎖はジスルフィド結合を介してＡ鎖に連結され、
Ｒ22は、結合であるか、またはＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号９）、ＶＮＱ、ＮＱおよびＱからなる群から選択される１〜４個のアミノ酸の配列であり、
Ｘ8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
Ｘ21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
Ｘ45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである）
を含むインスリンペプチドと、
スペーサーが、
（式中、直鎖スペーサーのシステインアミノ酸は、アミド結合を介してインクレチンのカルボキシ末端に連結され、Ｑ1はインスリンＢ鎖のＮ末端である）
の一般構造を含む、インクレチンをインスリンペプチドに結合させる直鎖スペーサーと
を含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。さらなる実施形態では、インスリンペプチドは、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）およびＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）からなる群から選択されるＢ鎖配列と
を含む。一実施形態では、インスリン成分は、二本鎖インスリンである。
一実施形態では、インクレチンは、
（式中、Ｉ1は、アミド結合を介して式Ｖのシステインにそのカルボキシ末端を介して連結された、配列番号１９８７、１９９３、２０１４および２０１５からなる群から選択されるインクレチンであり、Ｑ1は、Ｂ鎖のＮ末端を介して連結されたインスリンペプチドである）
の一般構造を含み、
Ａ鎖は、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）の配列を含み、Ｂ鎖は、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）およびＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）からなる群から選択される配列を含む、または１もしくは２個のアミノ酸置換が配列番号１９８７、１９９３、２０１４および２０１５と異なるインクレチンおよび／または１もしくは２個のアミノ酸置換が配列番号１と異なるインスリンＡ鎖および／または１もしくは２個のアミノ酸置換が配列番号２と異なるインスリンＢ鎖を含む。
インスリンペプチド
本開示のコンジュゲートのインスリンペプチド成分は、ヒトインスリンの天然のＢ鎖およびＡ鎖配列（それぞれ、配列番号１および２）またはヘテロ二本鎖中で互いに連結された場合、インスリンアゴニスト活性を示す任意の公知のその類似体もしくは誘導体を含んでもよい。そのような類似体は、例えば、インスリン類似体のインスリン活性を破壊しない、１つもしくは複数のアミノ酸欠失、１つもしくは複数のアミノ酸置換、および／または１つもしくはアミノ酸挿入を有することが、ヒトインスリンのＡ鎖およびＢ鎖と異なる、Ａ鎖とＢ鎖とを有するタンパク質を含む。コンジュゲートのインスリンペプチド成分は、例えば、国際出願第ＷＯ９６／３４８８２号、第ＷＯ２０１０／０８０６０７号、第ＷＯ２０１０／０８０６０９号、第ＷＯ２０１１／１５９８８２号、第ＷＯ／２０１１／１５９８９５号および米国特許第６，６３０，３４８号（これらの開示は参照により本明細書に援用される）に開示された任意のインスリンペプチドを含んでもよい。
一実施形態では、インスリンペプチドは、
（ａ）Ｂ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、またはＡｌａで置換され、Ｂ２９位のアミノアシル残基がＬｙｓまたはＰｒｏで置換される、
（ｂ）Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９、およびＢ３０位のいずれかのアミノ酸残基が欠失するか、または非天然アミノ酸で置換される、
インスリン類似体である。一実施形態では、Ｂ２８位で置換されたＡｓｐ、または２８位で置換されたＬｙｓおよびＢ２９位で置換されたプロリンを含むインスリン類似体が提供される。さらなるインスリン類似体は、Chanceらの米国特許第５，５１４，６４６号；Chanceらの米国特許出願第０８／２５５，２９７号；Brems, et al., Protein Engineering, 5:527-533 (1992)；Brangeらの欧州特許出願公開第２１４，８２６号（１９８７年３月１８日公開）；およびBrange, et al., Current Opinion in Structural Biology, 1:934-940 (1991)に開示されている。これらの開示は、参照により本明細書に明示的に援用される。
インスリン類似体はまた、アミド化されたアミノ酸の、酸性型との置き換えを有してもよい。例えば、Ａｓｎを、ＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えることができる。同様に、Ｇｌｎを、ＡｓｐまたはＧｌｕで置き換えることができる。特に、Ａｓｎ（Ａ１８）、Ａｓｎ（Ａ２１）、もしくはＡｓｐ（Ｂ３）、またはこれらの残基の任意の組合せを、ＡｓｐまたはＧｌｕにより置き換えることができる。また、Ｇｌｎ（Ａ１５）またはＧｌｎ（Ｂ４）、またはその両方を、ＡｓｐまたはＧｌｕのいずれかにより置き換えることができる。
本明細書に開示されるように、Ｂ鎖のカルボキシ末端が、連結部分を介してＡ鎖のアミノ末端に連結された、ヒトインスリンのＢ鎖とＡ鎖、またはその類似体もしくは誘導体を含む一本鎖インスリンアゴニストが提供される。一実施形態では、Ａ鎖は、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ（配列番号１）、ＧＩＶＤＥＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＡ（配列番号６８）またはＧＩＶＥＥＣＣＦＲＳＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡ（配列番号７０）からなる群から選択されるアミノ酸配列であり、Ｂ鎖は、配列
ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、
ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴ（配列番号６９）またはＡＹＲＰＳＥＴＬＣＧＧＥＬＶＤＴＬＹＬＶＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＡ（配列番号７１）、またはＢ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０に対応する１〜５個のアミノ酸が欠失されたそのカルボキシ短縮配列、ならびに、それぞれの配列が、Ａ５、Ａ８、Ａ９、Ａ１０、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２１、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ２０、Ｂ２２、Ｂ２３、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ２８、Ｂ２９およびＢ３０から選択される天然のインスリン位置に対応する位置（図１に示されるペプチドアラインメントを参照されたい）に１〜５個のアミノ酸置換を含むように改変されたこれらの配列の類似体を含む。一実施形態では、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。インスリンの所望の活性に有害に影響しないこれらの位置での好適なアミノ酸置換は、例えば、Mayer, et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007;88(5):687-713（この開示は参照により本明細書に援用される）に示されるように、当業者には公知である。
さらなるアミノ酸配列を、例えば、一連の負に荷電したアミノ酸を、Ｂ鎖のアミノ末端に付加することができる。例えば、１〜１２、１〜１０、１〜８または１〜６アミノ酸長のペプチドを含み、例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸などの１つまたは複数の負に荷電したアミノ酸を含む、本発明の一本鎖インスリンアゴニストのＢ鎖のアミノ末端に、またはＡ鎖のカルボキシ末端に付加することができる。一実施形態では、Ｂ鎖アミノ末端伸長は、１〜６個の荷電アミノ酸を含む。一実施形態によれば、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートは、Ａ鎖上にＣ末端カルボキシレートの代わりにＣ末端アミドまたはエステルを含む。
また、インスリンペプチド成分として、国際出願第ＷＯ２０１０／０８０６０７号（この開示は参照により本明細書に明示的に援用される）に記載された改変ＩＧＦ ＩおよびＩＧＦ ＩＩ配列の使用に基づいて、高効力インクレチン−インスリンコンジュゲートを調製することもできる。より具体的には、天然インスリンのＢ１６およびＢ１７に対応する位置に、チロシンロイシンジペプチドの、天然ＩＧＦアミノ酸との置換を含むＩＧＦ ＩおよびＩＧＦ ＩＩの類似体は、インスリン受容体で１０倍高い効力を有する。
一実施形態によれば、本開示における使用のためのインスリンペプチドは、Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）のＢ鎖配列と、ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18ＹＣＸ21−Ｒ44（配列番号１９）のＡ鎖配列とを含み、
式中、
Ｘ4は、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ5は、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ8は、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ9は、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ10は、イソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ12は、セリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ14は、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ15は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ17は、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アスパラギン酸またはリシン、オルニチンであり、
Ｘ18は、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
Ｘ21は、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
Ｘ25は、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
Ｘ29は、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ30は、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ33は、アスパラギン酸、グルタミンおよびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ34は、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ41は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ42は、アラニン、リシン、オルニチンおよびアルギニンからなる群から選択され、
Ｘ45は、チロシン、ヒスチジン、アスパラギンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ22は、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸および結合からなる群から選択され、
Ｒ13は、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である。一実施形態では、Ａ鎖とＢ鎖は、天然インスリンのＡ鎖とＢ鎖との間で形成するものなどの、ジスルフィド結合により互いに連結される。代替的な実施形態では、Ａ鎖とＢ鎖は、線状一本鎖インスリンペプチドとして一緒に連結される。
一実施形態によれば、インスリンペプチドのＡ鎖が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ8ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21Ｒ13（配列番号３）またはＡ５、Ａ９、Ａ１０、Ａ１２、Ａ１４、Ａ１５、Ａ１７、Ａ１８から選択される位置に１もしくは２個のアミノ酸置換を有するその類似体を含み、Ｂ鎖が、配列Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45ＹＴ−Ｚ1−Ｂ1（配列番号６７）を含み、
式中、
Ｘ8がトレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
Ｘ21がアスパラギンまたはグリシンであり、
Ｘ25がヒスチジンまたはトレオニンであり、
Ｘ29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ42がアラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
Ｘ45がチロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ22がＦＶＮＱ（配列番号１２）、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミンおよびＮ−末端アミンからなる群から選択され、
Ｚ1がアスパラギン酸−リシン、リシン−プロリン、およびプロリン−リシンからなる群から選択され、
Ｂ1がトレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される、インスリン類似体が提供される。
一本鎖インスリンペプチドアゴニスト
本明細書に開示されるように、連結部分を用いて、ヒトインスリンＡ鎖とＢ鎖、またはその類似体もしくは誘導体を連結することができ、Ｂ鎖のＢ２５アミノ酸のカルボキシ末端を、連結部分の第１の末端に直接連結し、連結部分の第２の末端を、介在連結部分を介してＡ鎖のＡ１アミノ酸のアミノ末端に直接連結する。
一実施形態によれば、インスリンペプチドは、ＢがインスリンＢ鎖を表し、ＡがインスリンＡ鎖を表し、ＬＭがＢ鎖のカルボキシ末端をＡ鎖のアミノ末端に連結する連結部分を表す、一般構造Ｂ−ＬＭ−Ａを含む一本鎖インスリンアゴニストである。Ｂ鎖をＡ鎖に結合させるための好適な連結部分は、「一本鎖インスリン類似体のための連結部分」の見出しならびにそれぞれの小見出し「ペプチドリンカー」および「非ペプチドリンカー」の下で本明細書に開示される。一実施形態では、連結部分は、連結ペプチドを含み、より具体的には、一実施形態では、ペプチドはＩＧＦ−１Ｃペプチドの類似体を表す。連結部分のアミノ酸位置は、ＩＧＦ１の天然Ｃ鎖（配列番号１７）中の対応する位置に基づいて指定される。別の実施形態では、ペプチド連結部分は、ＳＳＳＳＸ50ＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＸ51（配列番号１９２４）（式中、Ｘ50およびＸ51はアルギニンおよびリシンから独立に選択される）に対する７０％、８０％、９０％を超える配列同一性を有する２９個の連続するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、連結部分は、長さ８〜１６アミノ酸の配列に近い比較的に短い二官能性非ペプチドポリマーのリンカーを含む非ペプチドリンカーである。一実施形態では、非ペプチドリンカーは、以下の構造：
（式中、ｍは１０〜１４の整数であり、連結部分はＢ鎖のＢ２５アミノ酸に直接連結される）
を有する。一実施形態によれば、非ペプチド連結部分は、約４〜２０、８〜１８、８〜１６、８〜１４、８〜１２、１０〜１４、１０〜１２または１１〜１３個のモノマーのポリエチレングリコールリンカーである。
一実施形態では、ＩＢが配列Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）を含み、ＬＭがＩＢをＩＡに共有的に連結する本明細書に開示される連結部分であり、ＩＡが配列ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18ＹＣＸ21−Ｒ44（配列番号１９）を含み、
式中、
Ｘ4がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ5がグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ8がヒスチジンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ9がアルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンから選択され、
Ｘ10がイソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ12がセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ14がチロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ15がアルギニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ17がグルタミン酸またはグルタミンであり、
Ｘ18がメチオニン、アスパラギンまたはトレオニンであり、
Ｘ21がアラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
Ｘ25がヒスチジンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ42がアラニン、リシン、オルニチンおよびアルギニンからなる群から選択され、
Ｒ22がＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびＮ末端アミンからなる群から選択され、
Ｒ13がＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2であり、さらに、指定Ｘ45のアミノ酸が連結部分ＬＭに直接結合する（すなわち、本明細書で用いられる指定ＩＢ−ＬＭ−ＩＡは、Ｂ鎖のカルボキシル末端とＡ鎖のアミノ末端が、さらなる介在アミノ酸なしに、連結部分ＬＭに直接連結されることを表すことが意図される）、構造ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有するインスリンペプチドを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。
一実施形態では、連結部分（ＬＭ）は、１７個以下のアミノ酸長のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、連結部分は、配列ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号６１）、ＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号２３）またはＧＡＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴ（配列番号６４）を含む。
別の実施形態では、連結部分は、Ｂ鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された、２９個の連続するアミノ酸配列を含み、前記２９個の連続するアミノ酸配列は、ＳＳＳＳＸ50ＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＸ51（配列番号１９２４）（式中、Ｘ50およびＸ51はアルギニンおよびリシンから独立に選択される）に対する７０％、８０％、９０％を超える配列同一性を有する。一実施形態では、連結ペプチドは、合計２９〜１５８個または２９〜５８個のアミノ酸を含み、配列番号６８の配列を含む。別の実施形態では、連結部分は、Ｂ鎖のカルボキシ末端アミノ酸に直接連結された、２９個の連続するアミノ酸配列を含み、前記２９個の連続するアミノ酸配列は、ＳＳＳＳＸ50ＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＸ51（配列番号１９２４）（式中、Ｘ50およびＸ51はアルギニンおよびリシンから独立に選択される）に対する９０％を超える配列同一性を有する。一実施形態では、連結部分は、配列ＳＳＳＳＲＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫ（配列番号１９２３）またはＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ（配列番号１９２２）を含み、１または２個のアミノ酸置換を含んでもよい。
一実施形態によれば、ヒトインスリンのＢ鎖とＡ鎖、またはその類似体もしくは誘導体を含み、天然のＢ鎖の最後の５個のカルボキシアミノ酸が欠失し（すなわち、Ｂ２６〜Ｂ３０）、アミノ酸Ｂ２５介在連結部分を介してＡ鎖のアミノ酸Ａ１に連結される、一本鎖インスリンアゴニストポリペプチドが提供される。一実施形態では、連結部分は、以下の構造を含む。
（式中、ｍは１０〜１４の整数であり、連結部分はＢ鎖のＢ２５アミノ酸に直接連結される）
一実施形態では、ＩＢが配列Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）を含み、ＬＭが配列ＳＳＳＳＲＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫ（配列番号１９２３）、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ（配列番号１９２２）、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号６１）またはＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号１９２５）を含み、ＩＡが配列ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18ＹＣＸ21−Ｒ44（配列番号１９）を含み、
式中、
Ｘ4がグルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
Ｘ5がグルタミンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ8がヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
Ｘ9がセリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ10がイソロイシンまたはセリンであり、
Ｘ12がセリンまたはアスパラギン酸であり、
Ｘ14がチロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
Ｘ15がグルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
Ｘ17がグルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
Ｘ18がメチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
Ｘ21がアラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
Ｘ25はヒスチジンまたはトレオニンであり、
Ｘ29がアラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
Ｘ30がヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
Ｘ33がアスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
Ｘ34がアラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
Ｘ41がグルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
Ｘ42がアラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
Ｘ45がチロシンまたはフェニルアラニンであり、
Ｒ22がＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびＮ末端アミンからなる群から選択され、
Ｒ44がＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である、一般式ＩＢ−ＬＭ−ＩＡを有するインスリンペプチドを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。
グリコシル化
新生ｉｎ ｖｉｖｏタンパク質産生の間に、グリコシル化部位を含むインスリン類似体は、糖（グリコシル）残基を、グリコシル化として知られるプロセスにおいて酵素的に付加することができる、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセッシングを受けてもよい。共有的に連結されたオリゴ糖側鎖を担持する得られるタンパク質は、グリコシル化されたタンパク質または糖タンパク質として知られる。したがって、グリコシル化部位を担持するタンパク質は、グリコシル化されている必要はない。一実施形態によれば、真核発現系において発現された場合に、高グリコシル化を受けやすいペプチド配列を含むように改変されたインスリンアゴニスト類似体が提供される。
非天然および天然グリコシル化配列は、当業者には公知であり、Ｎ−結合グリコシル化部位、およびＯ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識部位として働くペプチド配列である。Ｏ−結合グリコシル化配列トリペプチドは、アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）を含む。かくして、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作出する。Ｏ−結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的には、セリンまたはトレオニンの側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識部位として働くペプチド配列であるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンを用いてもよい。一実施形態では、Ｏ−結合グリコシル化された糖は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースである。いくつかのＯ−結合グリコシル化部位は、当業界で公知であり、文献中で報告されている。例えば、Ten Hagen et al. (11029) J. Biol. Chem. 274(39):27867-74；Hanisch et al. (2001) Glycobiology 11:731-740；およびTen Hagen et al. (2003) Glycobiology 13:1R-16Rを参照されたい。
一実施形態によれば、高グリコシル化インスリン類似体を産生する方法が提供される。この方法は、非天然のグリコシル化部位を含むように改変されたインスリン類似体（例えば、ＣＴＰペプチド配列）をコードする遺伝子を含む真核宿主細胞を提供すること、およびインスリン類似体遺伝子の発現を可能にする条件下で細胞を培養することを含む。一実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞中で産生されたグリコシル化されたタンパク質（糖タンパク質）がヒト細胞のものと同一であるタンパク質グリコシル化を示すような、ヒトグリコシル化酵素を発現する（開示が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００４／００１８５９０号および第２００２／０１３７１３４号を参照されたい）。一実施形態によれば、真核宿主細胞は、酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）または哺乳動物（ＣＨＯもしくはＨＥＫ２９３）細胞から選択される。
一実施形態では、グリコシル化部位は、ベースインスリン類似体へのアミノ酸配列の付加によって導入される。より具体的には、出願人は、タンパク質が真核細胞発現系中で発現される場合にＯ−結合高グリコシル化を受けやすい、Ｃ末端ペプチド（ＣＴＰ：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ；配列番号１９２２）と命名されたペプチド配列を、インスリン類似体の固有のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を弱体化させることなく、インスリン類似体に共有的に連結することができることを発見した。
一実施形態によれば、Ａ鎖と、Ｂ鎖と、ＣＴＰペプチドが（配列番号１９２２）との少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、または９５％の配列同一性を有するペプチドである、ＣＴＰペプチドとを含むインスリン類似体が提供される。一実施形態では、ＣＴＰペプチドは、（配列番号１９２２）の１８〜２９アミノ酸の領域と少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６または９８％の配列同一性を共有する１８〜２９アミノ酸の配列を含むペプチドである。一実施形態では、ＣＴＰペプチドは、類似体が１、１〜２、３〜４、４〜６個または８個までのアミノ酸置換が（配列番号１９２２）と異なる、（配列番号１９２２）の類似体を含む。一実施形態では、アミノ酸置換は、（配列番号１９２２）の１〜４、７〜１５、１８、２０、２１、２４および２７から選択される１つまたは複数の位置にある。一実施形態では、アミノ酸置換は、（配列番号１９２２）の１、２、３、４、１０、１３、１５および２１から選択される１つまたは複数の位置にある。一実施形態では、アミノ酸置換は、（配列番号１９２２）の７、８、９、１２、１４、１８、２０、２４および２７から選択される１つまたは複数の位置にある。一実施形態では、ＣＴＰペプチドは、１〜２個のアミノ酸置換が配列番号１９２２と異なる２９アミノ酸の配列を含む。さらなる実施形態では、ＣＴＰペプチドは、断片が配列番号１９２２内に含まれるアミノ酸配列と同一である１８〜２８個の連続するアミノ酸配列を表す、配列番号１９２２の断片を含む。
インスリンペプチドのペグ化
出願人は、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートのペプチドまたはインクレチンへの親水性部分の共有的連結が、活性のより遅い開始、長い持続時間を有し、ベースプロファイルを示す類似体を提供することを発見した。一実施形態では、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートを、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０からなる群から選択される位置、および／またはＡ鎖のＡ９、Ａ１４およびＡ１５位のアミノ酸の側鎖、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミンまたはＢ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖またはインスリン一本鎖類似体中のＡ鎖とＢ鎖とを連結する連結部分の任意の位置、またはその任意の組合せに共有的に連結された親水性部分を含むようにさらに改変する。例示的な実施形態では、この親水性部分を、これらの位置のいずれかにおいてＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニン残基に共有的に連結する。一実施形態では、インスリンペプチドは、一本鎖類似体であり、親水性部分は、Ａ鎖とＢ鎖とを結合させる連結部分のアミノ酸の側鎖に共有的に連結される。
例示的な親水性部分は、例えば、約１，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、または約２０，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトンの分子量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。さらなる適切な親水性部分には、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール（例えば、ＰＯＧ）、ポリオキシエチレン化ソルビトール、ポリオキシエチレン化グルコース、ポリオキシエチレン化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロース、ポリアセタール、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリ（β−アミノ酸）（ホモポリマーもしくはランダム共重合体のいずれか）、ポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー（ＰＰＧ）、および他のポリアルキレンオキシド、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、コラン酸（ｃｏｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）または他の多糖ポリマー、Ｆｉｃｏｌｌまたはデキストランおよびこれらの混合物が含まれる。
ポリエチレングリコール鎖などの親水性部分は、一部の実施形態によれば、約５００〜約４００００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。一実施形態では、ＰＥＧなどの親水性部分の分子量は、約５００〜約５０００ダルトン、または約１０００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される。別の実施形態では、ＰＥＧなどの親水性部分の分子量は、約１００００〜約２００００ダルトンである。さらに他の例示的な実施形態では、ＰＥＧなどの親水性部分の分子量は、約２００００〜約４００００ダルトンである。一実施形態では、親水性部分、例えば、ＰＥＧは、約２０，０００ダルトンの分子量を有する。一実施形態では、類似体の１つまたは複数のアミノ酸がペグ化され、共有的に連結されたＰＥＧ鎖の組み合わせた分子量が約２０，０００ダルトンである、インスリンペプチドが提供される。
一実施形態では、デキストランを、親水性部分として使用する。デキストランは、グルコースサブユニットが、優先的にα１−６連結によって連結されている多糖ポリマーである。約１ｋＤ〜約１００ｋＤ、または約５、１０、１５、もしくは２０ｋＤから約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、もしくは９０ｋＤなどの多くの分子量範囲のデキストランが入手可能である。
直鎖または分枝のポリマーが企図される。結果として生じるコンジュゲートの調製物は、本質的に単分散または多分散であってよく、ペプチド１個あたりポリマー部分を約０．５、０．７、１、１．２、１．５、または２個有していてよい。
一実施形態では、親水性部分は、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０からなる群から選択される位置のアミノ酸の側鎖、および／またはＢ鎖のＢ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖またはインスリン一本鎖類似体中のＡ鎖とＢ鎖とを連結する連結部分の任意の位置、またはその任意の組合せに連結された、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０からなる群から選択される位置の１、２個以上のアミノ酸、またはＢ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖またはその任意の組合せでペグ化される。一実施形態では、共有的に連結されるＰＥＧ鎖の合計分子量は、約２０，０００ダルトンである。
ポリエチレングリコールなどの親水性部分を、タンパク質を活性化されたポリマー分子と反応させるために使用される任意の好適な条件下でインクレチン−インスリンコンジュゲートに結合させることができる。ＰＥＧ部分上の反応基（例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α−ハロアセチル、マレイミド、またはヒドラジノ基）を介した、標的化合物上の反応基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、エステル基、チオール基、α−ハロアセチル基、マレイミド基、またはヒドラジノ基）への、アシル化、還元的アルキル化、マイケル付加、チオールアルキル化、または他の化学選択的なコンジュゲーション／ライゲーション方法を含めた、当技術分野では知られているあらゆる手段を使用することができる。水溶性ポリマーを１つまたは複数のタンパク質に連結するのに使用することができる活性化基には、制限なく、スルホン、マレイミド、スルフヒドリル、チオール、トリフレート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、アジジリン（ａｚｉｄｉｒｉｎｅ）、オキシラン、および５−ピリジルが含まれる。還元的アルキル化によりペプチドに結合させる場合、選択されるポリマーには、重合度を制御するように、単一の反応性アルデヒドがなければならない。例えば、Kinstler et al., Adv. Drug. Delivery Rev. 54: 477-485 (2002)、Roberts et al., Adv. Drug Delivery Rev. 54: 459-476 (2002)、およびZalipsky et al., Adv. Drug Delivery Rev. 16: 157-182 (1995)を参照されたい。
アシル化
一部の実施形態では、インスリンペプチドまたはインクレチン−インスリンコンジュゲートのインクレチンを、アシル基を含むように改変する。アシル基を、インクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に直接的に、またはインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸とアシル基との間に位置するスペーサーを介してインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に間接的に共有的に連結してもよい。インクレチン−インスリンコンジュゲートを、親水性部分が連結されるのと同じアミノ酸位置で、または異なるアミノ酸位置でアシル化してもよい。例えば、アシル化は、非アシル化インクレチン−インスリンコンジュゲートにより示される活性がアシル化時に保持されるのであれば、インクレチンペプチドの１０、１６、３０もしくは４０位のいずれかまたはＡ鎖もしくはＢ鎖の任意のアミノ酸ならびに連結部分内の位置を含む任意の位置で行ってもよい。非限定例としては、Ａ鎖のＡ１４およびＡ１５位、またはＢ鎖のＢ１、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位または連結部分の任意の位置でのアシル化が挙げられる。さらなる非限定例としては、Ｃ末端伸長インクレチンペプチドの１０、１６、および２０、ならびに３０または４０位でのアシル化が挙げられる。
一実施形態によれば、インクレチン−インスリンコンジュゲートのインクレチンは、１０位の天然アミノ酸Ｔｙｒの、アシル基またはアルキル基に共有的に連結された側鎖を含む式Ｉａ：
（式中、ｎ＝１〜４である）
のアミノ酸との置換を含む。一実施形態では、ｎは４である。
本発明の１つの特定の態様では、インスリン類似体は、インクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸の側鎖のアミン、ヒドロキシル、またはチオールの直接的アシル化によってアシル基を含むように改変される。一部の実施形態では、インスリン類似体は、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して直接アシル化される。一部の実施形態では、アシル化は、Ｂ２８またはＢ２９位（天然のインスリンＡおよびＢ鎖配列のアミノ酸ナンバリングによる）にある。これに関して、例えば、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位（天然のインスリンＡおよびＢ鎖配列のアミノ酸ナンバリングによる）または側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸を有する連結部分の任意の位置などの、ＡまたはＢ鎖配列中の１つまたは複数のアミノ酸置換によって改変されたインスリン類似体を提供することができる。本発明の一部の特定の実施形態では、インスリンペプチドの直接的アシル化は、Ｂ２８またはＢ２９位（天然のインスリンＡおよびＢ鎖配列のアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して行われる。
一実施形態によれば、アシル化されたインスリン類似体は、ペプチドとアシル基との間にスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、スペーサーに共有結合しており、スペーサーはアシル基に共有結合している。一部の例示的な実施形態では、インスリンペプチドは、スペーサーのアミン、ヒドロキシル、またはチオールのアシル化によりアシル基を含むように改変されており、このスペーサーはＢ２８もしくはＢ２９位（天然のインスリンのＡもしくはＢ鎖のアミノ酸ナンバリングによる）で、またはスペーサー部分の任意の位置で、アミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合するインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸は、スペーサーに対する連結を可能にする部分を含む任意のアミノ酸であってよい。例えば、側鎖−ＮＨ2、−ＯＨ、または−ＣＯＯＨを含むアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕ）が好適である。
一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートとアシル基との間のスペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸（または側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチドもしくはトリペプチド）である。一部の実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーを含む。具体的な一実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えば、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から市販されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などである。一実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。
一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドとアシル基との間のスペーサーは、疎水性二官能性スペーサーである。疎水性の二官能性スペーサーは、当技術分野では知られている。例えば、その全文が参照によって本明細書に援用される、Bioconjugate Techniques, G. T. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996)を参照されたい。ある特定の実施形態によれば、二官能性スペーサーは、長さ３〜１０原子であるアミノ酸のバックボーン（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、および８−アミノオクタン酸）を含む、合成の、または天然に存在するアミノ酸であってよい。あるいは、スペーサーは、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であるペプチドバックボーンを有するジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーであってよい。インクレチン−インスリンコンジュゲートに結合しているジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーの各アミノ酸は、例えば、天然に存在するアミノ酸（Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）のＤもしくはＬ異性体のいずれか、または、β−アラニン（β−Ａｌａ）、Ｎ−α−メチル−アラニン（Ｍｅ−Ａｌａ）アミノ酪酸（Ａｂｕ）、α−アミノ酪酸（γ−Ａｂｕ）、アミノヘキサン酸（ε−Ａｈｘ）、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、アミノメチルピロールカルボン酸、アミノピペリジンカルボン酸、アミノセリン（Ａｍｓ）、アミノテトラヒドロピラン−４−カルボン酸、アルギニンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、β−アスパラギン酸（β−Ａｓｐ）、アゼチジンカルボン酸、３−（２−ベンゾチアゾリル）アラニン、α−ｔｅｒｔ−ブチルグリシン、２−アミノ−５−ウレイド−ｎ−吉草酸（シトルリン、Ｃｉｔ）、β−シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、アセトアミドメチル−システイン、ジアミノブタン酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、ジメチルチアゾリジン（ＤＭＴＡ）、γ−グルタミン酸（γ−Ｇｌｕ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、イソロイシンＮ−メトキシ−Ｎ−メチルアミド、メチル−イソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、イソニペコチン酸（Ｉｓｎ）、メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、メチル−リシン、ジメチル−リシン、トリメチル−リシン、メタノプロリン、メチオニン−スルホキシド（Ｍｅｔ（Ｏ））、メチオニン−スルホン（Ｍｅｔ（Ｏ2））、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチル−ノルロイシン（Ｍｅ−Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、パラ−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、メチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＯ２））、４−シアノフェニルアラニン（（Ｐｈｅ（４−ＣＮ））、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、ピペリジニルアラニン、ピペリジニルグリシン、３，４−デヒドロプロリン、ピロリジニルアラニン、サルコシン（Ｓａｒ）、セレノシステイン（Ｓｅｃ）、Ｕ−ベンジル−ホスホセリン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（Ｓｔａ）、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸（ＡＣＨＰＡ）、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸（ＡＨＰＰＡ）、１，２，３，４，−テトラヒドロ−イソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、テトラヒドロピラングリシン、チエニルアラニン（Ｔｈｉ）、Ｕ−ベンジル−ホスホチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、メトキシチロシン、エトキシチロシン、Ｏ−（ｂｉｓ−ジメチルアミノ−ホスホノ）−チロシン、チロシン硫酸テトラブチルアミン、メチル−バリン（ＭｅＶａｌ）、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸（Ａｃｘ）、アミノ吉草酸、ベータ−シクロプロピル−アラニン（Ｃｐａ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒｇ）、アリルグリシン（Ａｌｇ）、２−アミノ−２−シクロヘキシル−プロパン酸（２−Ｃｈａ）、ｔｅｒｔブチルグリシン（Ｔｂｇ）、ビニルグリシン（Ｖｇ）、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸（Ａｃｐ）、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸（Ａｃｐｅ）、アルキル化３−メルカプトプロピオン酸、１−アミノ−１−シクロブタンカルボン酸（Ａｃｂ）からなる群から選択される天然に存在しないアミノ酸のあらゆるＤまたはＬ異性体を含む、天然に存在する、および／または天然に存在しないアミノ酸からなる群から独立に選択することができる。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。
インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドは、任意のサイズの長鎖アルカンのアシル化によりアシル基を含むように改変されていてもよく、任意の長さの炭素鎖を含んでもよい。長鎖アルカンは直鎖でも、または分枝でもよい。ある特定の態様では、長鎖アルカンはＣ4〜Ｃ30アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ4アルカン、Ｃ6アルカン、Ｃ8アルカン、Ｃ10アルカン、Ｃ12アルカン、Ｃ14アルカン、Ｃ16アルカン、Ｃ18アルカン、Ｃ20アルカン、Ｃ22アルカン、Ｃ24アルカン、Ｃ26アルカン、Ｃ28アルカン、またはＣ30アルカンのいずれかであってよい。一部の実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ8〜Ｃ20アルカン、例えば、Ｃ14アルカン、Ｃ16アルカン、またはＣ18アルカンを含む。
一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートのアミン、ヒドロキル、またはチオール基は、コレステロール酸でアシル化されている。特定の実施形態では、ペプチドは、アルキル化されているｄｅｓ−アミノＣｙｓスペーサー、すなわちアルキル化されている３−メルカプトプロピオン酸スペーサーを介してコレステロール酸に連結している。アミン、ヒドロキシル、およびチオールによるペプチドのアシル化の適切な方法は当技術分野では知られている。例えば、Miller, Biochem Biophys Res Commun 218: 377-382 (1996)、Shimohigashi and Stammer, Int J Pept Protein Res 19: 54-62 (1982)、およびPreviero et al., Biochim Biophys Acta 263: 7-13 (1972)（ヒドロキシルを介するアシル化の方法に対して）、およびSan and Silvius, J Pept Res 66: 169-180 (2005)（チオールを介するアシル化の方法に対して）、Bioconjugate Chem. "Chemical Modifications of Proteins: History and Applications" pages 1, 2-12 (1990)、Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. "Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity" Vol. 6, No: 2 pp.171-176 (1989)を参照されたい。
アシル化されているインクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドのアシル基は、あらゆる長さの炭素鎖など、あらゆるサイズであってよく、直鎖でも、または分枝でもよい。本発明の一部の具体的な実施形態では、アシル基はＣ4〜Ｃ30脂肪酸である。例えば、アシル基は、Ｃ4脂肪酸、Ｃ6脂肪酸、Ｃ8脂肪酸、Ｃ10脂肪酸、Ｃ12脂肪酸、Ｃ14脂肪酸、Ｃ16脂肪酸、Ｃ18脂肪酸、Ｃ20脂肪酸、Ｃ22脂肪酸、Ｃ24脂肪酸、Ｃ26脂肪酸、Ｃ28脂肪酸、またはＣ30脂肪酸のいずれかであってよい。一部の実施形態では、アシル基はＣ8〜Ｃ20脂肪酸、例えば、Ｃ14脂肪酸またはＣ16脂肪酸である。
代替の一実施形態では、アシル基は胆汁酸である。胆汁酸は、それだけには限定されないが、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸を含めたあらゆる適切な胆汁酸であってよい。
アルキル化
一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、アルキル基を含むように改変される。アルキル基を、インスリンペプチドもしくはインクレチンペプチドのアミノ酸に直接的に、またはインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸とアルキル基との間に位置するスペーサーを介してインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸に間接的に共有的に連結することができる。アルキル基を、エーテル、チオエーテル、またはアミノ結合によりインクレチン−インスリンコンジュゲートに結合することができる。例えば、インクレチン−インスリンコンジュゲートを、親水性部分が連結されるのと同じアミノ酸位置で、または異なるアミノ酸位置でアルキル化してもよい。
アルキル化を、インスリン活性が保持されるのであれば、例えば、インクレチンペプチドの１０、１６、３０もしくは４０位、またはＢ鎖のＣ末端領域中、または連結部分中の位置などの、インクレチン−インスリンコンジュゲート内の任意の位置で実行することができる。本発明の具体的な一態様では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、インクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールの直接的なアルキル化によりアルキル基を含むように改変される。一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、アミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して直接アルキル化される。本発明の一部の特定の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートの直接的アルキル化は、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリンに基づくＢ鎖について）、Ｂ２（ＩＧＦ−１に基づくＢ鎖について）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８またはＢ２９位（天然のインスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸の側鎖アミン、ヒドロキシル、またはチオールを介して行われる。非限定例としては、Ａ鎖のＡ１４およびＡ１５位、またはＢ鎖のＢ１、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位、または連結部分の任意の位置でのアルキル化が挙げられる。さらなる非限定例としては、Ｃ末端伸長インクレチンペプチドの１０、１６、および２０位ならびに３０または４０位でのアルキル化が挙げられる。
本発明の一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、ペプチドとアルキル基との間にスペーサーを含む。一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートはスペーサーに共有結合しており、スペーサーはアルキル基に共有結合している。一部の例示的な実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、コンジュゲートのアミン、ヒドロキシル、またはチオールのアルキル化によりアルキル基を含むように改変され、スペーサーは、Ａ１４、Ａ１５、Ｂ１（インスリンに基づくＢ鎖について）、Ｂ２（ＩＧＦ−１に基づくＢ鎖について）、Ｂ１０、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位（天然のインスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸ナンバリングによる）またはインクレチンペプチドの１０、１６、３０もしくは４０位のアミノ酸の側鎖に結合している。スペーサーが結合するインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸は、スペーサーへの連結を可能にする部分を含む任意のアミノ酸（例えば、単一にα−置換されたアミノ酸またはα，α−二置換されたアミノ酸）であってもよい。側鎖−ＮＨ2、−ＯＨ、または−ＣＯＯＨを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートのアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、またはＧｌｕ）が好適である。一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドとアルキル基との間のスペーサーは、側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸または側鎖アミン、ヒドロキシル、もしくはチオールを含むアミノ酸を含むジペプチドもしくはトリペプチドである。
アルファアミンがアルキル化されている場合、スペーサーのアミノ酸はあらゆるアミノ酸であってよい。例えば、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒなどの疎水性アミノ酸であってよい。あるいは、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってよい。例示的な実施形態では、スペーサーのアミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノオクタン酸などの疎水性アミノ酸であってよい。あるいは、アルキル化が酸性残基のアルファアミン上で生じるのであれば、スペーサーのアミノ酸は、ＡｓｐおよびＧｌｕなどの酸性残基であってよい。スペーサーのアミノ酸の側鎖アミンがアルキル化されている場合、スペーサーのアミノ酸は、式Ｉａのアミノ酸など、側鎖アミンを含むアミノ酸である（例えば、ＬｙｓまたはＯｒｎ）。この場合、アルファアミンおよびスペーサーのアミノ酸の側鎖アミンの両方がアルキル化され、したがってペプチドがジアルキル化されているのが可能である。本発明の実施形態は、このようなジアルキル化分子を含む。
一部の実施形態では、スペーサーは、親水性の二官能性スペーサーを含む。具体的な一実施形態では、スペーサーは、アミノポリ（アルキルオキシ）カルボキシレートを含む。これに関して、スペーサーは、例えば、ＮＨ2（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n（ＣＨ2）mＣＯＯＨを含むことができ、式中、ｍは１〜６のあらゆる整数であり、ｎは２〜１２のあらゆる整数であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ）から市販されている、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸などである。一部の実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドとアルキル基との間のスペーサーは親水性の二官能性スペーサーである。ある特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン、ヒドロキシル、チオール、およびカルボキシル基、またはこれらのあらゆる組合せなどの２つ以上の反応基を含む。ある特定の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、ヒドロキシル基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、アミン基およびカルボキシレートを含む。他の実施形態では、親水性の二官能性スペーサーは、チオール基およびカルボキシレートを含む。
スペーサー（例えば、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性の二官能性スペーサー、または疎水性の二官能性スペーサー）は、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子（例えば、６、７、８、９、または１０原子））である。より具体的な実施形態では、スペーサーは、長さ約３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であり、アルキルはＣ14アルキル基、Ｃ16アルキル基などのＣ12−Ｃ18アルキル基であり、したがってスペーサーおよびアルキル基の合計の長さは１４〜２８原子、例えば、約１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、または２８原子である。一部の実施形態では、スペーサーおよびアルキルの長さは１７〜２８（例えば、１９〜２６、１９〜２１）原子である。
一実施形態によれば、二官能性スペーサーは、長さ３〜１０原子であるアミノ酸のバックボーンを含む、合成の、または天然に存在しないアミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、５−アミノ吉草酸、７−アミノヘプタン酸、および８−アミノオクタン酸）である。あるいは、スペーサーは、長さ３〜１０原子（例えば、６〜１０原子）であるペプチドのバックボーンを有するジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーであってよい。インクレチン−インスリンコンジュゲートに結合しているジペプチドまたはトリペプチドのスペーサーは、例えば、本明細書に教示するアミノ酸のいずれかを含めた、天然に存在するアミノ酸、および／または天然に存在しないアミノ酸からなっていてよい。一部の実施形態では、スペーサーは全体的に負の電荷を含み、例えば、１または２個の負に荷電しているアミノ酸を含む。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、Ａｌａ−Ａｌａ、β−Ａｌａ−β−Ａｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γ−アミノ酪酸−γ−アミノ酪酸、およびγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕからなる群から選択される。一実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕである。
アミン、ヒドロキシル、およびチオールによるペプチドのアルキル化の適切な方法は、当技術分野では知られている。例えば、ウィリアムソンエーテル合成を使用して、インスリンペプチドとアルキル基との間にエーテル連結を形成してもよい。また、ペプチドのハロゲン化アルキルとの求核置換反応により、エーテル、チオエーテル、またはアミン連結のいずれかが生じ得る。アルキル化されているインクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドのアルキル基はあらゆるサイズ、例えば、あらゆる長さの炭素鎖であってよく、直鎖でも、または分枝でもよい。本発明の一部の実施形態では、アルキル基はＣ4〜Ｃ30アルキルである。例えば、アルキル基は、Ｃ4アルキル、Ｃ6アルキル、Ｃ8アルキル、Ｃ10アルキル、Ｃ12アルキル、Ｃ14アルキル、Ｃ16アルキル、Ｃ18アルキル、Ｃ20アルキル、Ｃ22アルキル、Ｃ24アルキル、Ｃ26アルキル、Ｃ28アルキル、またはＣ30アルキルのいずれかであってよい。一部の実施形態では、アルキル基は、Ｃ8−Ｃ20アルキル、例えば、Ｃ14アルキルまたはＣ16アルキルである。
一部の具体的な実施形態では、アルキル基は、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、リトコール酸、タウロコール酸、グリココール酸、およびコレステロール酸などの胆汁酸のステロイド部分を含む。
長鎖アルカンがインクレチン−インスリンコンジュゲートまたはスペーサーによってアルキル化されている場合、長鎖アルカンは、あらゆるサイズであってよく、あらゆる長さの炭素鎖を含むことができる。長鎖アルカンは、直鎖でも、または分枝でもよい。ある特定の態様では、長鎖アルカンは、Ｃ4〜Ｃ30アルカンである。例えば、長鎖アルカンは、Ｃ4アルカン、Ｃ6アルカン、Ｃ8アルカン、Ｃ10アルカン、Ｃ12アルカン、Ｃ14アルカン、Ｃ16アルカン、Ｃ18アルカン、Ｃ20アルカン、Ｃ22アルカン、Ｃ24アルカン、Ｃ26アルカン、Ｃ28アルカン、またはＣ30アルカンのいずれかであってよい。一部の実施形態では、長鎖アルカンは、Ｃ8−Ｃ20アルカン、例えば、Ｃ14アルカン、Ｃ16アルカン、またはＣ18アルカンを含む。
また、一部の実施形態では、アルキル化は、インスリン類似体とコレステロール部分との間に生じ得る。例えば、コレステロールのヒドロキシル基は、長鎖アルカン上の脱離基の位置を変えて、コレステロール−インスリンペプチド生成物を形成することができる。
制御放出製剤
あるいは、本明細書に記載のインクレチン−インスリンコンジュゲートが、それが投与される体内に放出される様式が体内で時間および位置に関して制御されるように、本開示のコンジュゲートをデポー製剤に改変してもよい（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。デポー型の本開示のコンジュゲートは、例えば、本開示のコンジュゲートと、ポリマーなどの多孔性または非多孔性材料とを含む埋込み可能な組成物であってもよく、本開示のコンジュゲートは、前記材料により包含される、または該材料を通って、および／もしくは非多孔性材料の分解により拡散する。次いで、デポーは体内の所望の位置に埋め込まれ、本開示のコンジュゲートは埋込み体から所定の速度で放出される。
あるいは、大きいデポーポリマーを、本明細書に記載されるコンジュゲートに共有結合する自己切断性ジペプチドエレメントに連結することができる。この実施形態では、デポーポリマーは、それが後に所定の速度で非酵素反応によって一本鎖類似体から切断されるまで、その投与部位にインクレチン−インスリンコンジュゲートを効率的に隔離する。自己切断性ジペプチドを使用したインスリン類似体のデポー製剤は、国際出願第ＷＯ２０１０／０８０６０７号（その開示は本明細書に援用される）に記載されている。一実施形態では、ジペプチドプロドラッグエレメントがＰＥＧまたはデキストランなどの大きいポリマーに連結されるジペプチドプロドラッグエレメントを含むインクレチン−インスリンコンジュゲートが提供される。一実施形態では、大きいデポーポリマー（例えば、ＰＥＧなど）を含む自己切断性ジペプチドエレメントは、例えば、連結部分のＣ８位のアミノ酸などの連結部分のアミノ酸の側鎖に連結される。
一本鎖類似体を含み、所望のｉｎ ｖｉｖｏ放出プロファイルを有するように製剤化された医薬組成物を調製することができる。一部の態様において、医薬組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、延長放出、遅延放出、または二相放出製剤である。制御放出のためのペプチドまたはコンジュゲートを製剤化する方法は、当業界で公知である。例えば、J Pharm 374: 46-52 (2009)ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１３０１５８号、第ＷＯ２００４／０３３０３６号、第ＷＯ２０００／０３２２１８号、および第ＷＯ１９９９／０４０９４２号を参照されたい。本組成物は、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの他の封入形態をさらに含んでもよく、または延長放出形態で投与して、長期的な保存および／もしくは送達効果を提供してもよい。開示される医薬製剤を、例えば、毎日（１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、１日６回）、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、２週毎、３週毎、毎月、または２カ月毎などの、任意のレジメンにしたがって投与してもよい。
一実施形態によれば、デポーポリマーは、当業者には公知の生体適合性ポリマーから選択される。デポーポリマーは、典型的には、約２０，０００〜１２０，０００ダルトンの範囲から選択されるサイズを有する。一実施形態では、デポーポリマーは、約４０，０００〜１００，０００または約４０，０００〜８０，０００ダルトンの範囲から選択されるサイズを有する。一実施形態では、デポーポリマーは、約４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００または８０，０００ダルトンのサイズを有する。好適なデポーポリマーとしては、限定されるものではないが、デキストラン、ポリラクチド、ポリグリコリド、カプロラクトンベースポリマー、ポリ（カプロラクトン）、ポリアンヒドリド、ポリアミン、ポリエステラミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリホスホエステル、ポリエステル、ポリブチレンテレフタレート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、スクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシセルロース、ポリサッカリド、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、およびコポリマー、テルポリマーおよびその混合物、ならびにカプロラクトンベースポリマー、ポリカプロラクトンおよびポリブチレンテレフタレートを含むコポリマーなどの生分解性ポリマーおよびそのコポリマーが挙げられる。一実施形態では、デポーポリマーは、ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸とグリコール酸とのコポリマーからなる群から選択され、１つの特定の実施形態では、デポーポリマーはポリエチレングリコールである。一実施形態では、デポーポリマーは、ポリエチレングリコールであり、ジペプチドエレメントに連結されたデポーポリマーの組み合わせた分子量は、約４０，０００〜８０，０００ダルトンである。
一実施形態によれば、Ｕがアミノ酸またはヒドロキシル酸であり、ＪがＮ−アルキル化されたアミノ酸である、構造Ｕ−Ｊを含む自己切断性ジペプチドエレメントが提供される。一実施形態では、１つまたは複数のジペプチドエレメントを、インスリン成分のＢ鎖のＮ末端アミノ基、インクレチンペプチド成分のＮ末端、またはコンジュゲート中に存在するアミノ酸の側鎖アミノ基から選択される１つまたは複数のアミノ基を介して形成されるアミド結合を介してインクレチン−インスリンコンジュゲートに連結する。一実施形態によれば、１つまたは複数のジペプチドエレメントを、コンジュゲートのＮ末端アミノ基、または天然のインスリンのＡ１９、Ｂ１６もしくはＢ２５位に対応する位置に存在する４−アミノ−フェニルアラニン残基の芳香族アミンの側鎖アミノ基、または一本鎖インスリン類似体の連結部分のアミノ酸の側鎖、またはコンジュゲートのインクレチンペプチドもしくはインスリンペプチド成分のＮ末端から選択されるアミノ基でインクレチン−インスリンコンジュゲートに連結する。
一実施形態では、ジペプチドプロドラッグエレメントは、式Ｘ：
（式中、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ4およびＲ8は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、ＷはＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ1およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ12シクロアルキルもしくはアリールを形成するか、またはＲ4およびＲ8は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、
Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から選択されるか、またはＲ4およびＲ3は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ5は、ＮＨＲ6またはＯＨであり、
Ｒ6は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ8アルキルであるか、またはＲ6およびＲ2は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環であり、
Ｒ7は、ＨおよびＯＨからなる群から選択される）
の一般構造を含む。一実施形態では、プロドラッグエレメントがインクレチン−インスリンコンジュゲートのＮ末端アミンに連結され、Ｒ4およびＲ3が、それらが結合する原子と一緒になって、４、５または６員の複素環を形成する場合、Ｒ1およびＲ2の少なくとも一方はＨ以外のものである。
一実施形態によれば、構造Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｑを含むインクレチン／インスリンコンジュゲートプロドラッグが提供され、
式中、Ｑは、本明細書に開示されるインクレチン／インスリンコンジュゲートであり、
Ａは、側鎖を含むアミノ酸またはヒドロキシル酸であり、（Ｃ1−Ｃ8アルキル）ＮＨ2であってもよく、Ａの側鎖は、例えば、哺乳動物血清アルブミンなどの哺乳動物血漿タンパク質に不可逆的に結合する部分に共有的に連結される。一実施形態では、Ａの側鎖は、好ましくは、少なくとも１８、１９、２０、２１または２２個の炭素の長さである、脂肪酸、コール酸、胆汁塩または胆汁酸のステロイド部分などの、アシル基またはアルキル基に共有的に連結される。一実施形態では、Ａの側鎖は、Ｃ16−Ｃ30アシル基またはＣ16−Ｃ30アルキル基に共有的に連結される。
Ｂは、Ｎ−アルキル化されたアミノ酸であり、
Ｃは、アミド結合Ｘ70またはＸ70Ｘ71であり、Ｘ70およびＸ71は、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から独立に選択されるアミノ酸であり、Ａ−Ｂ−Ｃは、Ｑの脂肪族アミノ基を介するアミド結合によりＱに連結される。
Ａの側鎖と、アシル基またはアルキル基との結合は、１または２個の荷電アミノ酸を含むスペーサーを介するものであってもよい。一実施形態によれば、構造Ａ−Ｂ−Ｃは、インクレチンペプチド、Ａ鎖もしくはＢ鎖のＮ末端アミノ酸上のアルファアミノ基から選択される脂肪族アミノ基、またはインスリンペプチドのＢ３、Ｂ２８もしくはＢ２９アミノ酸の側鎖上の脂肪族アミノ基でのアミド結合連結によりＱに連結される。一実施形態では、Ｂは、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ3−Ｃ18アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ4−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ5複素環）、または（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）でＮ−アルキル化されたアミノ酸である。
別の実施形態では、Ａ−Ｂ−Ｃは、
の構造を含み、
式中、
Ｒ1は、（Ｃ1−Ｃ6アルキル）ＮＨ−Ｒ9または（Ｃ1−Ｃ6アルキル）ＮＨ−Ｓ1−Ｒ9であり、
Ｒ2は、ＨまたはＣ1−Ｃ6アルキルであり、
Ｒ3は、Ｃ2−Ｃ4アルキル、Ｃ3−Ｃ8アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ4−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10複素環）であるか、またはＲ4およびＲ3は、それらが結合する原子と一緒になって、４、５もしくは６員の複素環を形成し、
Ｒ4およびＲ8は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1はＮ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ4およびＲ8は、それらが結合する原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、
Ｒ5は、ＮＨＲ6またはＯＨであり、
Ｒ6は、ＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり、
Ｒ7は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＨからなる群から選択され、
Ｒ9は、Ｃ18−Ｃ30アシルからなる群から選択され、
Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、Ｈ、ＣＨ2、ＣＨＯＨ、ＣＨ2ＳＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2およびＣＨ2（Ｃ3−Ｎ2複素環）からなる群から独立に選択され、
Ｓ1は、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される１個または２個の荷電アミノ酸からなるスペーサーであり、Ａ−Ｂ−Ｃは、Ｑの脂肪族アミノ基を介するアミド結合によりＱに連結される。一実施形態では、Ｒ1は、（Ｃ1−Ｃ6アルキル）ＮＨ−Ｓ1−Ｒ9であり、Ｒ3は、Ｃ2−Ｃ4アルキルからなる群から選択され、Ｒ2、Ｒ4、Ｒ11およびＲ13は、それぞれＨであり、Ｒ5は、ＮＨ2であり、Ｒ8は、ＨまたはＣ1−Ｃ8アルキルであり、Ｒ9は、Ｃ18−Ｃ30アシルであり、Ｒ10およびＲ12は、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2からなる群から独立に選択され、Ｓ1はアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、ホモシステイン酸、ホモグルタミン酸、アルギニン、リシンおよびヒスチジンからなる群から選択される１個または２個の荷電アミノ酸を含むスペーサーである。
さらなる実施形態では、直前の段落に開示されたペプチドプロドラッグエレメントＡ−Ｂ−Ｃは、保存中の、および患者への投与の前のペプチドプロドラッグエレメントの切断を防止するようにさらに改変される。一実施形態では、ペプチドプロドラッグエレメントのＮ末端アミンは、患者への投与までＮ末端に結合したままである部分に連結される。一実施形態では、式Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｑのインスリンプロドラッグは、ＡのＮ末端アミンを介してＡに連結される血清酵素切断性部分をさらに含む。一実施形態では、酵素切断性部分は、例えば、Ａｒｇ−Ｐｒｏ、Ｌｙｓ−ＰｒｏまたはＧｌｕ−Ｐｒｏのジペプチドなどの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）により切断されるペプチドである。
グルカゴン関連ペプチド
出願人は、グルカゴン、ＧＬＰ１およびＧＩＰ受容体での活性が変化したグルカゴンの類似体を発見した。これらの類似体のいずれか（一般には、インクレチンと呼ばれる）を、本明細書に記載のコンジュゲート中でグルカゴン関連ペプチドとして使用することができる。より具体的には、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載のクラス１、クラス２またはクラス３グルカゴンペプチドのいずれかであってもよい。
クラス１グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびにその内容の全文が参照によって援用される、国際特許出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４３７号（２００９年６月１６日出願）、および２００８年７月１７日公開の国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０８６０８６号に記載される、クラス１のグルカゴン関連ペプチドである。
クラス１グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて参照する生物学的配列（配列番号８０１〜９１５）は、国際特許出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４３７号における配列番号１〜１１５に対応する。
活性
クラス１グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンペプチド（配列番号８０１）に対してグルカゴン受容体活性を保持している。例えば、グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンの、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％の活性、８０％の活性、８５％の活性、または９０％の活性を保持し得る（グルカゴン関連ペプチド対グルカゴンに対するＥＣ５０の逆比として計算、例えば、例７において全般的に記載するアッセイを使用したｃＡＭＰ生成によって測定して）。一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンと同じまたはグルカゴンを超える活性（本明細書において「作用強度」の語と同義に使用される）を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンペプチドの約１００％、１０００％、１００００％、１０００００％、または１００００００％以下の活性を表す。
溶解性の改善
天然グルカゴンは、特に生理学的ｐＨの水溶液中で難溶性（ｐｏｏｒ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）を表し、経時的に凝集および沈澱する傾向がある。対照的に、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、一部の実施形態では、６〜８の間、または６〜９の間のｐＨで、例えば、ｐＨ７、２５℃で２４時間後に、天然グルカゴンに比べて少なくとも２倍、５倍、またはさらに高い溶解性を表す。
したがって、一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号８０１）の野生型ペプチドに対して、特に約５．５〜約８．０の範囲のｐＨの水溶液中のペプチドの溶解性を改善し、一方で天然のペプチドの生物学的活性を保持するように改変されている。
例えば、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかの溶解性は、親水性部分をペプチドに結合させることによりさらに改善することができる。このような基の導入は、循環中の長時間の半減期などによって測定して、作用の持続時間も増大する。親水性部分は本明細書にさらに記載するものである。
荷電している残基での改変
一部の実施形態では、天然の非荷電アミノ酸を、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸で置換することにより、または荷電アミノ酸をペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端に加えることにより、クラス１グルカゴン関連ペプチドに電荷を加えることによって溶解性を改善する。
一部の実施形態によれば、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端部分に、および一部の実施形態では、配列番号８０１のＣ末端から２７位の位置に導入する、アミノ酸の置換および／または付加によってペプチドが改変されている事実により、溶解性が改善されている。荷電アミノ酸１、２、または３個をＣ末端部分内に導入してもよく、一部の実施形態では、Ｃ末端から２７位に導入してもよい。一部の実施形態によれば、２８位および／もしくは２９位の天然のアミノ酸（複数可）を荷電アミノ酸で置換し、ならびに／または、１〜３個の荷電アミノ酸をペプチドのＣ末端、例えば、２７、２８、もしくは２９位の後に付加する。例示的な実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は負に荷電している。他の実施形態では、１、２、３個、または全ての荷電アミノ酸は正に荷電している。
具体的な例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、以下の改変：Ｎ２８のＥでの置換、Ｎ２８のＤでの置換、Ｔ２９のＤでの置換、Ｔ２９のＥでの置換、２７、２８、または２９位の後へのＥの挿入、２７、２８、または２９位の後へのＤの挿入、例えば、Ｄ２８Ｅ２９、Ｅ２８Ｅ２９、Ｅ２９Ｅ３０、Ｅ２８Ｅ３０、Ｄ２８Ｅ３０のいずれか１つまたは２つを含んでいてよい。
例示的な一実施形態によれば、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８１１のアミノ酸配列、または天然のグルカゴンに対して１〜３個のさらなるアミノ酸改変（グルカゴンアゴニストに関して本明細書に記載する）を含むその類似体、またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。配列番号８１１は改変されているクラス１グルカゴン関連ペプチドを表し、天然のタンパク質の２８位のアスパラギン残基はアスパラギン酸で置換されている。別の例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは配列番号８３８のアミノ酸配列を含み、天然のタンパク質の２８位のアスパラギン残基はグルタミン酸で置換されている。他の例示的な実施形態は、配列番号８２４、８２５、８２６、８３３、８３５、８３６、および８３７のクラス１グルカゴン関連ペプチドを含む。
安定性の改善
クラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、２５℃で２４時間後にオリジナルのペプチドの少なくとも９５％を保持するなど、安定性の改善および／または分解の低減をさらに表し得る。クラス１グルカゴン関連ペプチドは、作用強度の増大、循環中の長時間の半減期、有効期間の増大、沈殿もしくは凝集の低減、および／または分解の低減、例えば、貯蔵後の切断もしくは化学改変の出現の低減など、薬学上の性質を変更するさらなる改変を含むことができる。
またさらなる例示的な実施形態では、前述のクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、特に酸性またはアルカリ性バッファー中、経時的なペプチドの分解を低減するために配列番号８０１の１５位のアミノ酸を改変することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態では、１５位のＡｓｐをＧｌｕ、ホモ−Ｇｌｕ、システイン酸、またはホモ−システイン酸で置換する。
あるいは、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、配列番号８０１の１６位のアミノ酸を改変することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態では、１６位のＳｅｒをＴｈｒもしくはＡＩＢで置換し、またはグルカゴン受容体の作用強度を増強するクラス１グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に記載するアミノ酸置換のいずれかで置換する。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６間のペプチド結合の切断は低減する。
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス１グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、２０、２１、２４、または２７位のうちのあらゆる１、２、３、または４つ全てを改変することにより、様々なアミノ酸位置での分解を低減するようにさらに改変することができる。例示的な実施形態には、２０位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕまたはＮｌｅでの置換が含まれる。メチオニンの除去または置換により、メチオニンの酸化による分解は低減する。ＧｌｎまたはＡｓｎの除去または置換により、ＧｌｎまたはＡｓｎの脱アミドによる分解は低減する。Ａｓｐの除去または置換により、環状スクシンイミド中間体を形成するＡｓｐの脱水および後続のイソ−アスパルテートへの異性体化により生じる分解は減少する。
作用強度の増強
別の実施形態によれば、グルカゴン受容体での作用強度が増強しているクラス１グルカゴン関連ペプチドを提供し、ペプチドは天然グルカゴン（配列番号８０１）の１６位のアミノ酸改変を含む。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。１６位のセリンのグルタミン酸での置換は、グルカゴン受容体でのグルカゴン活性を少なくとも２倍、４倍、５倍、および最高１０倍大きく増強する。一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する選択性を、ＧＬＰ−１受容体に対して、例えば少なくとも５倍、１０倍、または１５倍の選択性を保持している。
ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性
一部の実施形態では、本明細書に開示するクラス１グルカゴン関連ペプチドは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１位または２位がさらに改変されている。より詳しくは、一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの１位および／または２位を、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ抵抗性アミノ酸（複数可）で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位を、アミノイソ酪酸で置換する。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位を、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリン、およびε−アミノ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。別の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの２位を、Ｄ−セリン、グリシン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換する。一部の実施形態では、２位のアミノ酸はＤ−セリンではない。
グルカゴン関連ペプチドの１位および／または２位のアミノ酸を改変した時のグルカゴン活性の低減は、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を安定化することにより回復することができる。アルファヘリックス構造は、本明細書にさらに記載する通り、例えば、共有結合または非共有結合による分子内架橋の形成（例えば、ｉが１２〜２５の整数である、「ｉ」位と「ｉ＋４」位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋）、１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／または挿入により安定化することができる。
３位の改変
グルカゴン受容体活性は、３位（野生型グルカゴンのアミノ酸ナンバリングによる）のアミノ酸改変、例えば、３位の天然に存在するグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により低減することができる。例えば、３位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換は、グルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊する。
グルカゴン受容体の活性の維持または増強を、３位のＧｌｎを、本明細書に記載するグルタミン類似体で改変することにより実現してもよい。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７０、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、および配列番号８７４のアミノ酸配列を含むことができる。
ＧＬＰ−１活性のＣ末端アミドおよびエステルでの増強
ＧＬＰ−１受容体の活性の増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。逆に、ペプチドのＣ末端の天然のカルボン酸を保持することで、グルカゴン受容体対ＧＬＰ−１受容体に対するクラス１グルカゴン関連ペプチドの比較的高い選択性が維持される（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０倍を超える）。
さらなる改変および組合せ
クラス１グルカゴン関連ペプチドに対して、溶解性および／または安定性および／またはグルカゴン活性をさらに増大し得るさらなる改変を行ってもよい。クラス１グルカゴン関連ペプチドは、溶解性または安定性に実質的に影響を及ぼさず、グルカゴン活性を実質的に低減しない他の改変を、代替的に含むことができる。例示的な実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、天然のグルカゴン配列に対して、合計最高１１、または最高１２、または最高１３、または最高１４個のアミノ酸改変を含むことができる。例えば、保存的な、または非保存的な置換、付加、または欠失を、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位のいずれかで行ってもよい。
クラス１グルカゴン関連ペプチドの例示的な改変には、それだけには限定されないが、
（ａ）少なくとも部分的なグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で非保存的な置換、保存的な置換、付加、または欠失、例えば、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、または２９位の１つまたは複数の保存的置換、１０位のＴｙｒのＶａｌまたはＰｈｅでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、これらの１つまたは複数の位置のＡｌａでの置換、
（ｂ）少なくとも部分的にグルカゴンアゴニスト活性を保持し、一方で２９位および／または２８位の、および２７位でもよいアミノ酸の欠失、
（ｃ）分解を低減し得る、グルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換などによる、１５位のアスパラギン酸の改変；あるいはトレオニン、ＡＩＢ、グルタミン酸、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸などによる、または代替的に、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６結合の切断による分解を同様に低減し得る、グルタミン、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸のいずれか１つでの、１６位のセリンの改変、
（ｄ）溶解性および／または半減期を増大し得る、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸などの、本明細書に記載する、水溶性ポリマーのポリエチレングリコールなどの親水性部分の付加、
（ｅ）酸化的分解を低減するための、ロイシンまたはノルロイシンでの置換などによる、２７位のメチオニンの改変、
（ｆ）Ｇｌｎの脱アミドによって生じる分解を低減するための、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換などによる、２０位または２４位のＧｌｎの改変、
（ｇ）環状スクシンイミド中間体を形成するためのＡｓｐの脱水および後続のイソ−アスパルテートへの異性体化によって生じる分解を低減するための、Ｇｌｎでの置換などによる、２１位のＡｓｐの改変、
（ｈ）ＤＰＰ−ＩＶ切断に対する抵抗性を改善する、「ｉ」位と「ｉ＋４」位の間のラクタム架橋などの分子内架橋と組み合わせてもよい、本明細書に記載する１位または２位の改変（ｉは１２、１６、２０、２４などの１２〜１５までの整数である）、
（ｉ）親水性部分の付加と組み合わせてもよい、さらにまたはあるいは、ＧＬＰ−１ペプチドの活性を選択的に低減する改変と組み合わせてもよい、グルカゴン受容体および／もしくはＧＬＰ−１受容体での活性を増大し得、循環中の半減期を増大し得、ならびに／または作用の持続時間を延長し得、ならびに／または作用の開始を遅らせ得る、本明細書に記載するグルカゴン関連ペプチドのアシル化またはアルキル化；例えば、７位のＴｈｒの改変、例えば、７位のＴｈｒの、ＡｂｕまたはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換；Ｃ末端アミノ酸から２７位のアミノ酸の欠失（例えば、２８位および２９位のアミノ酸の１つまたは両方の欠失、アミノ酸の長さ２７または２８個のペプチドが得られる）、
（ｊ）本明細書に記載するＣ末端伸長、
（ｋ）本明細書に記載するホモ二量体化またはヘテロ二量体化；および（ａ）から（ｋ）までの組合せ
が含まれる。
一部の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドの例示的な改変には、グループＡから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変、ならびにグループＢおよび／またはグループＣから選択される少なくとも１つまたは複数のアミノ酸改変が含まれ、グループＡは、
２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸での置換、
２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２８位の、Ａｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕでの置換、
２８位の、Ａｓｐでの置換、
２８位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸での置換、
２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
２９位の、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＬｙｓでの置換、
２９位の、Ｇｌｕでの置換、
２９位の後への、１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
２９位の後への、ＧｌｕもしくはＬｙｓの挿入、
２９位の後への、Ｇｌｙ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；またはこれらの組合せであり、
グループＢは、
１５位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
１６位のＳｅｒの、ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換であり、
グループＣは、
１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
１２位のＬｙｓの、Ａｒｇでの置換、
２０位のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、
２１位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
２４位のＧｌｎの、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢでの置換、
２７位のＭｅｔの、ＬｅｕまたはＮｌｅでの置換、
２７〜２９位のアミノ酸の欠失、
２８〜２９位のアミノ酸の欠失、
２９位のアミノ酸の欠失、
またはこれらの組合せである。
例示的な実施形態では、１２位のＬｙｓはＡｒｇで置換されている。他の例示的な実施形態では、２９位および／または２８位のアミノ酸は欠失し、２７位のアミノ酸は欠失してもよい。
いくつかの具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、（ａ）ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を付与する１位および／または２位のアミノ酸改変、例えば、１位のＤＭＩＡでの、または２位のＡＩＢでの置換、（ｂ）１２〜２９位内の分子内架橋、例えば、１６位および２０位、または１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のα，α二置換アミノ酸での１つまたは複数の置換を含み、（ｃ）ＰＥＧなどの親水性部分に対する、例えば、２４、２９位のＣｙｓを介して、またはＣ末端アミノ酸での連結、（ｄ）ＭｅｔをＮｌｅなどで置換する２７位のアミノ酸改変、（ｅ）分解を低減する、２０、２１、および２４位のアミノ酸改変、ならびに（ｆ）配列番号８２０に対する連結を含んでもよい。グルカゴン関連ペプチドが配列番号８２０に連結している場合、２９位のアミノ酸は、ある特定の実施形態では、ＴｈｒまたはＧｌｙである。他の具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、（ａ）Ａｓｐ２８Ｇｌｕ２９、またはＧｌｕ２８Ｇｌｕ２９、またはＧｌｕ２９Ｇｌｕ３０、またはＧｌｕ２８Ｇｌｕ３０、またはＡｓｐ２８Ｇｌｕ３０を含み、（ｂ）Ｓｅｒを、ＴｈｒまたはＡＩＢなどで置換する１６位のアミノ酸改変、および（ｃ）Ｍｅｔを、Ｎｌｅなどで置換する２７位のアミノ酸改変、および（ｄ）分解を低減する、２０、２１、および２４位のアミノ酸改変を含んでもよい。具体的な一実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、Ｔ１６、Ａ２０、Ｅ２１、Ａ２４、Ｎｌｅ２７、Ｄ２８、Ｅ２９である。
いくつかの特定の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、アミノ酸改変を１から３個有する、以下のアミノ酸配列を含む。
Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ1（配列番号８３９）
［配列中、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減（または抵抗性を増大）する、非天然のアミノ酸であり、
Ｚ1は、−ＣＯＯＨ（天然に存在するＣ末端のカルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙは、アミノ酸１〜２個であり、分子内架橋は、好ましくは共有結合であり、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を接続し、ｉは１２、１６、２０、または２４である］
一部の実施形態では、分子内架橋はラクタム架橋である。一部の実施形態では、配列番号８３９のｉ位およびｉ＋４位のアミノ酸はＬｙｓおよびＧｌｕであり、例えば、Ｇｌｕ１６およびＬｙｓ２０である。一部の実施形態では、Ｘ１は、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｎ−メチル−Ｈｉｓ、アルファ−メチル−Ｈｉｓ、イミダゾール酢酸、ｄｅｓ−アミノ−Ｈｉｓ、ヒドロキシル−Ｈｉｓ、アセチル−Ｈｉｓ、ホモ−Ｈｉｓ、およびアルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）からなる群から選択される。他の実施形態では、Ｘ２は、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、Ｖａｌ、およびアルファ，アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）からなる群から選択される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位のアミノ酸のいずれかで、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で、親水性部分に共有結合により連結している。例示的な実施形態では、この親水性部分は、これらの位置のいずれかで、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチルフェニルアラニン残基に共有結合により連結している。例示的な親水性部分は、分子量約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、または約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンなどのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
他の実施形態では、クラス１グルカゴン関連ペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ1（配列番号８３９）［配列中、Ｘ１および／またはＸ２は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減（または抵抗性を増大）する、非天然のアミノ酸であり、グルカゴン関連ペプチドの１６、２０、２１、および２４位のうちの１、２、３、４つ、またはそれを超えてα，α−二置換アミノ酸で置換されており、Ｚ1は、−ＣＯＯＨ（天然に存在するＣ末端カルボキシレート）、−Ａｓｎ−ＣＯＯＨ、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙは、１〜２個のアミノ酸である］
前述のクラス１グルカゴン関連ペプチドもしくは類似体に対する例示的なさらなるアミノ酸改変には、アシル基またはアルキル基に（スペーサーを介してもよい）共有結合により結合している側鎖を含むアミノ酸の置換もしくは付加と組み合わせてもよい、７位のＴｈｒの、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、Ｉｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換が含まれ、このアシル基もしくはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然であり、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒもしくはＡＩＢでの置換、２０位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、もしくはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕもしくはＮｌｅでの置換、２８位のＡｓｎの荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎのＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕでの置換、２８位のＡｓｐでの置換、２８位のＧｌｕでの置換、２９位のＴｈｒの荷電アミノ酸での置換、２９位のＴｈｒのＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２９位のＡｓｐ、Ｇｌｕ、もしくはＬｙｓでの置換、２９位のＧｌｕでの置換、２９位の後への荷電アミノ酸１〜３個の挿入、３０位（すなわち２９位の後）のＧｌｕもしくはＬｙｓの挿入を有し、３１のＬｙｓの挿入を有してもよい、配列番号８２０のＣ末端への付加（２９位のアミノ酸はＴｈｒもしくはＧｌｙであってもよい）、親水性部分に共有結合により結合しているアミノ酸の置換もしくは付加、またはこれらの組合せである。
グルカゴン受容体活性を増大し、部分的なグルカゴン受容体活性を保持し、溶解性を増大し、安定性を増大し、または分解を低減する、クラス１グルカゴンアゴニストに関して上記に記載した改変のいずれかは、個々に、または組み合わせて、クラス１グルカゴン関連ペプチドに適用することができる。
クラス１グルカゴン関連ペプチドの実施形態の例
一部の実施形態によれば、２８位および／または２９位の天然のアミノ酸を、負に荷電しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換し、負に荷電しているアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）をペプチドのカルボキシ末端に付加してもよいことにより、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを改変する。代替的な一実施形態では、２９位の天然のアミノ酸を、正に荷電しているアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）で置換し、１または２個の正に荷電しているアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、またはヒスチジン）をペプチドのカルボキシ末端上に付加してもよいことにより、配列番号８０１の天然のグルカゴンペプチドを改変する。一部の実施形態によれば、２８位もしくは２９位の少なくとも１つのアミノ酸が酸性アミノ酸で置換されており、および／またはさらなる酸性アミノ酸が配列番号８３４のカルボキシ末端に付加されているという前提で、溶解性および安定性が改善されているグルカゴン類似体を提供し、類似体は配列番号８３４のアミノ酸配列を含んでいる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。
一部の実施形態によれば、溶解性および安定性が改善されているグルカゴンアゴニストを提供し、アゴニストは配列番号８３３のアミノ酸配列を含み、２７、２８、または２９位の少なくとも１つのアミノ酸は、非天然のアミノ酸残基で置換されている（すなわち、類似体の２７、２８、または２９位に存在する少なくとも１つのアミノ酸は、配列番号８０１における対応する位置に存在するアミノ酸と異なる酸性アミノ酸である）。一部の実施形態によれば、２８位のアミノ酸がアスパラギンであり、２９位のアミノ酸がトレオニンである場合、ペプチドは、グルカゴンペプチドのカルボキシ末端に付加されたＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、またはＧｌｕからなる群から独立に選択されるアミノ酸を１から２つさらに含むという前提で、配列番号８３３の配列を含むグルカゴン関連アゴニストを提供する。一部の実施形態によれば、天然のペプチドの２７位に存在するメチオニン残基を、ロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化的分解を防ぐ。
一部の実施形態では、配列番号８３３のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜６個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なる。別の実施形態によれば、配列番号８３３のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜３個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なる。別の実施形態では、配列番号８０７、配列番号８０８、または配列番号８３４のグルカゴン類似体を提供し、類似体の１、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、または２４位から選択される１〜２個のアミノ酸は配列番号８０１の対応するアミノ酸と異なり、さらなる一実施形態では、これら１〜２個の異なるアミノ酸は、天然の配列（配列番号８０１）に存在するアミノ酸に対する保存的なアミノ酸置換を表す。一部の実施形態では、配列番号８１１または配列番号８１３のグルカゴン関連ペプチドを提供し、グルカゴン関連ペプチドは、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、または２９位から選択される位置にアミノ酸置換を１、２、または３個さらに含む。一部の実施形態では、２、５、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、１９、２０、２７、または２９位の置換は保存的なアミノ酸置換である。
一部の実施形態では、配列番号８０１の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストを提供し、類似体は、２位にセリン以外のアミノ酸を有し、２８位もしくは２９位の天然のアミノ酸に対して酸性アミノ酸が置換しており、または配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に酸性アミノ酸が付加されていることが配列番号８０１と異なる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴン類似体を提供し、類似体は親分子と２位の置換が異なる。より詳しくは、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、アラニン、Ｄ−アラニン、グリシン、ｎ−メチルセリン、およびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
別の実施形態では、配列番号８０１の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストを提供し、類似体は、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有し、２８位もしくは２９位の天然のアミノ酸に対して酸性アミノ酸が置換しており、または酸性アミノ酸が配列番号８０１のペプチドのカルボキシ末端に付加されていることが配列番号８０１と異なる。一部の実施形態では、酸性アミノ酸はアスパラギン酸またはグルタミン酸である。一部の実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴン類似体を提供し、類似体は親分子と１位の置換が異なる。より詳しくは、類似体ペプチドの１位は、ＤＭＩＡ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、およびホモ−ヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換されている。
一部の実施形態によれば、改変されているグルカゴン関連ペプチドは、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、および配列番号８３２からなる群から選択される配列を含む。さらなる一実施形態では、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２のＣ末端に付加されているアミノ酸を１または２つさらに含む、配列番号８０９、配列番号８１２、配列番号８１３、または配列番号８３２の配列を含むグルカゴン関連ペプチドを提供し、さらなるアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、またはホモシステイン酸からなる群から独立に選択される。一部の実施形態では、カルボキシ末端に付加されているさらなるアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、もしくはＧｌｕからなる群から選択され、またはさらなる一実施形態では、さらなるアミノ酸はＡｓｐもしくはＧｌｕである。
別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７の配列またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１２、および配列番号８１３からなる群から選択される配列を含む。別の実施形態では、ペプチドは、配列番号８０８、配列番号８１０、および配列番号８１１からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端に付加された、ＡｓｐおよびＧｌｕからなる群から選択される、さらなるアミノ酸をさらに含む、配列番号８０８、配列番号８１０、および配列番号８１１の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは配列番号８１１または配列番号８１３の配列を含み、さらなる一実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは配列番号８１１の配列を含む。
一部の実施形態によれば、以下からなる群から選択される改変されているグルカゴン関連ペプチドを含む、グルカゴンアゴニストを提供し、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１１）および
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号８１３）
式中、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸であり、酸性残基が２８、２９、または３０位のうちの１つに存在するという前提で、２８位のＸａａはＡｓｎまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａはＴｈｒまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは酸性アミノ酸、ＣＯＯＨ、またはＣＯＮＨ2である。一部の実施形態では、ＲはＣＯＯＨであり、別の実施形態では、ＲはＣＯＮＨ2である。
本開示はグルカゴン融合ペプチドも包含し、第２のペプチドがグルカゴン関連ペプチドのＣ末端に融合してグルカゴン関連ペプチドの安定性および溶解性を増強する。より詳しくは、融合グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３４）を含むグルカゴンアゴニスト類似体を含むことができ、Ｒは、酸性アミノ酸、または結合、およびグルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端のアミノ酸に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号８３３、配列番号８０７、または配列番号８０８からなる群から選択される。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９に連結している、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号８０２、配列番号８０３、配列番号８０４、配列番号８０５、および配列番号８０６またはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態によれば、融合ペプチドは、１６、１７、２１、２４、２９位のアミノ酸に、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で連結しているＰＥＧ鎖をさらに含み、ＰＥＧ鎖は５００〜４００００ダルトンの範囲から選択される。一部の実施形態では、配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合を介してグルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９に結合している。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴン関連ペプチド部分は、配列番号８１０、配列番号８１１、および配列番号８１３からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのグルカゴン関連ペプチド部分は、配列番号８１１または配列番号８１３の配列を含み、ＰＥＧ鎖はそれぞれ、２１、２４、２９位で、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で連結している。
別の実施形態では、融合ペプチドのグルカゴン関連ペプチド配列は、配列番号８１１の配列を含み、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９に連結している配列番号８２０（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号８２１（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）、または配列番号８２２（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドは、配列番号８２４、配列番号８２５、および配列番号８２６からなる群から選択される配列を含む。本発明の融合ペプチドが、標準のカルボン酸基を有するＣ末端アミノ酸を有するのが典型的である。しかし、Ｃ末端アミノ酸がカルボキシル酸に対して置換されているアミドを有するこれらの配列の類似体も、実施形態として包含される。一部の実施形態によれば、融合グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８１０、配列番号８１１、および配列番号８１３からなる群から選択されるグルカゴンアゴニスト類似体を含み、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９に連結している配列番号８２３（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ−ＣＯＮＨ2）のアミノ酸配列をさらに含む。
本発明のグルカゴンアゴニストは、グルカゴン関連ペプチドの生物学的活性を保持し、一方で水溶液中のペプチドの溶解性および安定性を改善するようにさらに改変することができる。一部の実施形態によれば、配列番号８１１のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類似体の１６、１７、２０、２１、２４、および２９位から選択される１つまたは複数の位置に親水性基を導入すると、ｐＨを安定化するグルカゴン類似体の溶解性および安定性が改善されると予測される。より詳しくは、一部の実施形態では、配列番号８１０、配列番号８１１、配列番号８１３、または配列番号８３２のグルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドの２１位および２４位に存在するアミノ酸の側鎖に共有結合により連結している親水性基を１つまたは複数含むように改変される。
一部の実施形態によれば、配列番号８１１のグルカゴン関連ペプチドは、１６、１７、２０、２１、２４、および／または２９位のアミノ酸置換を１つまたは複数含むように改変され、天然のアミノ酸は、ＰＥＧなどを含めた親水性部分と架橋連結するのに適する側鎖を有するアミノ酸で置換されている。天然ペプチドは、天然に存在するアミノ酸または合成（天然に存在しない）アミノ酸で置換できる。合成または天然に存在しないアミノ酸とは、ｉｎ ｖｉｖｏで天然に存在しないが、それにもかわらず、本明細書に記載するペプチド構造に組み込むことができるアミノ酸のことをいう。
一部の実施形態では、配列番号８１０、配列番号８１１、または配列番号８１３のグルカゴンアゴニストを提供し、天然のグルカゴンペプチドの配列は、天然の配列の１６、１７、２１、２４、２９位のうちの少なくとも１つに、Ｃ末端伸長内、またはＣ末端アミノ酸で、天然に存在するアミノ酸または合成のアミノ酸を含むように改変され、アミノ酸置換は親水性部分をさらに含む。一部の実施形態では、置換は２１位または２４位であり、さらなる一実施形態では、親水性部分はＰＥＧ鎖である。一部の実施形態では、配列番号８１１のグルカゴン関連ペプチドは少なくとも１つのシステイン残基で置換され、システイン残基の側鎖は、マレイミド、ビニルスルホン、２−ピリジルチオ、ハロアルキル、およびハロアシルなどを含めたチオール反応性試薬でさらに改変される。これらのチオール反応性試薬は、カルボキシ、ケト、ヒドロキシル、およびエーテル基、ならびに他の親水性部分、例えば、ポリエチレングリコール単位を含んでいてよい。代替的な一実施形態では、天然のグルカゴンペプチドはリシンで置換され、置換性のリシン残基の側鎖は、カルボン酸の活性のエステル（スクシンイミド、無水物など）、またはポリエチレングリコールなどの親水性部分のアルデヒドなどのアミン反応性試薬を使用してさらに改変される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８１４、配列番号８１５、配列番号８１６、配列番号８１７、配列番号８１８、および配列番号８１９からなる群から選択される。
一部の実施形態によれば、ペグ化グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドに共有結合している２つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、グルカゴン鎖の合計分子量は約１０００〜約５０００ダルトンである。一部の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号８０６のペプチドを含み、ＰＥＧ鎖は２１位および２４位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、２本のＰＥＧ鎖を合わせた分子量は約１０００〜約５０００ダルトンである。別の実施形態では、ペグ化グルカゴンアゴニストは配列番号８０６のペプチドを含み、ＰＥＧ鎖は２１位および２４位のアミノ酸残基に共有結合により連結しており、２本のＰＥＧ鎖を合わせた分子量は約５０００〜約２００００ダルトンである。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形態であってよく、または分枝でもよい。一部の実施形態によれば、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約４００００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約２００００〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
上記に記載したグルカゴン関連ペプチドのいずれかは、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９位）内に、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋、またはアルファヘリックスを安定化するアミノ酸を含むようにさらに改変することができる。一部の実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドは、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸での１６、２０、２１、または２４位（またはこれらの組合せ）のアミノ酸置換に加えて、上記に論じたあらゆる１つまたは複数の改変を含む。別の実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドの１６位と２０位とのアミノ酸の側鎖の間に、ラクタムなどの分子内架橋に加えて、上記に論じたあらゆる１つまたは複数の改変を含む。
一部の実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８７７のアミノ酸配列を含み、３位のＸａａは、構造Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸であり、
構造Ｉ
構造ＩＩ
構造ＩＩＩ
式中、Ｒ1はＣ0-3アルキルまたはＣ0-3ヘテロアルキルであり、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1-3アルキルであり、Ｒ3はＣ1-3アルキルであり、Ｒ4はＨまたはＣ1-3アルキルであり、ＸはＮＨ、Ｏ、またはＳであり、ＹはＮＨＲ4、ＳＲ3、またはＯＲ3である。一部の実施形態では、ＸはＮＨであり、またはＹはＮＨＲ4である。一部の実施形態では、Ｒ1はＣ0-2アルキルであり、またはＣ1ヘテロアルキルである。一部の実施形態では、Ｒ2はＮＨＲ4またはＣ1アルキルである。一部の実施形態では、Ｒ4はＨまたはＣ1アルキルである。例示的な実施形態では、構造Ｉの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2−Ｓであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセトアミドエチル−システイン、Ｃ（Ａｃｍ））、Ｒ1はＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3であり（アセチルジアミノブタン酸、Ｄａｂ（Ａｃ））、Ｒ1はＣ0アルキルであり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＮＨＲ4であり、Ｒ4はＨであり（カルバモイルジアミノプロパン酸、Ｄａｐ（尿素））、またはＲ1はＣＨ2−ＣＨ2であり、ＸはＮＨであり、Ｒ2はＣＨ3である（アセチルオルニチン、Ｏｒｎ（Ａｃ））。例示的な実施形態では、構造ＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2であり、ＹはＮＨＲ4であり、Ｒ4はＣＨ3である（メチルグルタミン、Ｑ（Ｍｅ））。例示的な実施形態では、構造ＩＩＩの側鎖を含むアミノ酸を提供し、Ｒ1はＣＨ2であり、Ｒ4はＨである（メチオニン−スルホキシド、Ｍ（Ｏ））。特定の実施形態では、３位のアミノ酸はＤａｂ（Ａｃ）で置換されている。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号８６３、配列番号８６９、配列番号８７１、配列番号８７２、配列番号８７３、および配列番号８７４のアミノ酸配列を含むことができる。
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは配列番号８７７のグルカゴン関連ペプチドの類似体である。具体的な態様では、類似体は、それだけには限定されないが、２８位のＡｓｎの荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２８位のＡｓｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕでの置換、２８位のＡｓｐでの置換、２８位のＧｌｕでの置換、２９位のＴｈｒの荷電アミノ酸での置換、２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、２９位のＡｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓでの置換、２９位のＧｌｕでの置換、２９位の後への荷電アミノ酸１〜３個の挿入、２９位の後へのＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、２９位の後へのＧｌｙ−ＬｙｓまたはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入、ならびにこれらの組合せを含めた、本明細書に記載するアミノ酸改変のいずれかを含む。
ある特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴン関連ペプチドの類似体は、１６、２０、２１、および２４位のうちの１、２、３つ、または全てに、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、配列番号８７７のグルカゴン関連ペプチドの類似体は、１位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸での置換、２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するグルカゴン関連ペプチドの感受性を低減する非天然のアミノ酸での置換、７位のＴｈｒの、ＡｂｕまたはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸での置換、１０位のＴｙｒのＰｈｅまたはＶａｌでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒまたはＡＩＢでの置換、２０位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２１位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、２４位のＧｌｎのＡｌａまたはＡＩＢでの置換、２７位のＭｅｔのＬｅｕまたはＮｌｅでの置換、２７〜２９位のアミノ酸の欠失、２８〜２９位のアミノ酸の欠失、２９位のアミノ酸の欠失、２９位のアミノ酸がＴｈｒまたはＧｌｙである、配列番号８２０のアミノ酸配列のＣ末端への付加、またはこれらの組合せの１つまたは複数を含む。
具体的な実施形態によれば、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号８６２〜８６７および８６９〜８７４のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号８７７を含むグルカゴン関連ペプチドの類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、または２９位のいずれかのアミノ酸に、またはＣ末端アミノ酸で共有結合により連結している、ＰＥＧなどの親水性部分を含む。
ある特定の実施形態では、配列番号８７７を含むグルカゴン関連ペプチドの類似体は、スペーサーを介してもよい、アシル基またはアルキル基に共有結合により結合している側鎖を含むアミノ酸を含み、このアシル基またはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然である。アシル基は、一部の実施形態では、Ｃ４〜Ｃ３０脂肪アシル基である。他の実施形態では、アルキル基はＣ４〜Ｃ３０アルキルである。具体的な態様では、アシル基またはアルキル基は、１０位のアミノ酸の側鎖に共有結合により結合している。一部の実施形態では、７位のアミノ酸はＩｌｅまたはＡｂｕである。
グルカゴンアゴニストは、最高１、２、３、４、または５個のグルカゴンアゴニスト活性を保持するさらなる改変を有してもよい、配列番号８０１〜９１９のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ある特定の実施形態では、グルカゴンアゴニストは、配列番号８５９〜９１９のいずれかのアミノ酸を含む。
クラス２グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に、ならびにその内容が全文において参照によって援用される、国際特許出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４４７号（２００９年６月１６日出願）、米国仮出願第６１／０９０，４４８号、および米国出願第６１／１５１，３４９号に記載されるクラス２グルカゴン関連ペプチドである。クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して以下のセクションにおいて言及する生物学的配列（配列番号１００１〜１２６２）は、国際特許出願第ＰＣＴ ＵＳ２００９／４７４４７号における配列番号１〜２６２に対応する。
活性
天然のグルカゴンは、ＧＩＰ受容体を活性化せず、通常ＧＬＰ−１受容体での天然のＧＬＰ−１の活性の約１％を有する。本明細書に記載する天然のグルカゴン配列に対する改変により、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なグルカゴン活性、天然のＧＩＰ（配列番号１００４）の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なＧＩＰ活性、および／または天然のＧＬＰ−１の活性と等価な、もしくはそれより優れた強力なＧＬＰ−１活性を表し得るクラス２グルカゴン関連ペプチドが生成される。これに関して、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴン／ＧＩＰ共アゴニスト、グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト、ＧＩＰ／ＧＬＰ−１共アゴニスト、またはＧＩＰアゴニストグルカゴン関連ペプチドの１つであってよい。
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、ＧＩＰ受容体活性化活性に対するＥＣ５０を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、グルカゴン受容体活性化に対するＥＣ５０を表す。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、約１００ｎＭ以下、または約７５、５０、２５、１０、８、６、５、４、３、２、もしくは１ｎＭ、もしくはそれ未満の、ＧＬＰ−１受容体活性化に対するＥＣ５０を表す。受容体活性化は、受容体を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞におけるｃＡＭＰ誘導を測定するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイによって、例えば、例７に記載する通り、受容体をコードするＤＮＡ、およびｃＡＭＰ応答性エレメントに連結しているルシフェラーゼ遺伝子を同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３をアッセイすることによって測定することができる。
一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体およびＧＩＰ受容体の両方で活性を表す（「グルカゴン／ＧＩＰ共アゴニスト」）。これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＩＰ受容体に比べて、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を失っている。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０は、グルカゴン受容体でのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、グルカゴン作用強度と約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０を、クラス２グルカゴン関連ペプチドのグルカゴン受容体でのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１活性は、７位のアミノ酸改変、２７−もしくは２８−アミノ酸ペプチドを生じる２７位もしくは２８位のアミノ酸に対するアミノ酸（複数可）Ｃ末端の欠失、またはこれらの組合せなどによって、著しく低減または破壊されている。
別の一態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン、ＧＩＰ、およびＧＬＰ−１受容体で活性を表す（「グルカゴン／ＧＩＰ／ＧＬＰ−１トリアゴニスト」）。これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体に対する天然のグルカゴンの選択性を、ＧＬＰ−１受容体およびＧＩＰ受容体の両方に比べて失っている。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ受容体でのＥＣ５０は、グルカゴン受容体およびＧＬＰ−１受容体でのそれぞれのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１の作用強度と、約５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体でのトリアゴニストのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満である。
さらに別の態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１およびＧＩＰ受容体で活性を表すが、この場合、３位のアミノ酸改変などによって、グルカゴン活性は著しく低減または破壊されている（「ＧＩＰ／ＧＬＰ−１共アゴニスト」）。例えば、この位置の、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）での置換により、グルカゴン活性は低減する。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのグルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０は、ＧＬＰ−１受容体でのＥＣ５０と、約５０倍、４０倍、３０倍、または２０倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度は、そのＧＬＰ−１作用強度と約２５、２０、１５、１０、または５倍未満異なる（高いまたは低い）。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドの、グルカゴン受容体での天然グルカゴンの活性は、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％を超えるが約１０％未満である。一部の実施形態では、ＧＩＰ受容体でのクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０を、ＧＬＰ−１受容体でのクラス２グルカゴン関連ペプチドのＥＣ５０によって除した比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満、および１以上（ｎｏ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ）である。一部の実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＩＰ作用強度を、クラス２グルカゴン関連ペプチドのＧＬＰ−１作用強度と比べた比は、約１００、７５、６０、５０、４０、３０、２０、１５、１０、または５未満、および１以上である。
さらなる一態様では、クラス２グルカゴン関連ペプチドはＧＩＰ受容体で活性を表し、この場合、グルカゴンおよびＧＬＰ−１活性は、３位のＧｌｕの、および７位のＩｌｅのアミノ酸改変などによって、著しく低減または破壊されている（「ＧＩＰアゴニストグルカゴンペプチド」）。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体での、天然のグルカゴンの活性の、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％、０．５％、もしくは１％を超え、しかし約１％、５％、もしくは１０％未満を有する。一部の実施形態では、これらのクラス２グルカゴン関連ペプチドはまた、ＧＬＰ−１受容体での、天然のＧＬＰ−１の活性の、約１０％以下、例えば、約１〜１０％、または約０．１〜１０％、または約０．１％、０．５％、もしくは１％を超え、しかし約１％、５％、もしくは１０％未満を有する。
改変
クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する改変により、ＧＩＰ活性、グルカゴン活性、および／またはＧＬＰ−１活性の増大を表すグルカゴン関連ペプチドを作り出すための、グルカゴン（配列番号１００１）の操作が可能になる。
ＧＩＰ活性に影響を及ぼす改変
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１位のアミノ酸改変によってもたらされる。例えば、１位のＨｉｓを大型の芳香族アミノ酸で置換し、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、アミノ−Ｐｈｅ、ニトロ−Ｐｈｅ、クロロ−Ｐｈｅ、スルホ−Ｐｈｅ、４−ピリジル−Ａｌａ、メチル−Ｔｙｒ、または３−アミノＴｙｒで置換してもよい。１位のＴｙｒを、アミノ酸１２〜２９に対応する領域内のアルファヘリックスの安定化と組み合わせることで、ＧＩＰ受容体およびＧＬＰ−１受容体およびグルカゴン受容体を活性化するクラス２グルカゴン関連ペプチドがもたらされる。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成などにより、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入により安定化することができる。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、２７位および／または２８位の、ならびに２９位でもよいアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、２７位のＭｅｔを大型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ｌｅｕで置換してもよく、２８位のＡｓｎを、小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ａｌａで置換してもよく、２９位のＴｈｒを小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ｇｌｙで置換してもよい。２７〜２９位のＬＡＧでの置換により、これらの位置の天然のＭＮＴ配列に比べてＧＩＰ活性の増大がもたらされる。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１２位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、１２位を、大型の脂肪族無極性アミノ酸で置換し、Ｉｌｅで置換してもよい。ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１７位および／または１８位のアミノ酸改変によってももたらされる。例えば、１７位を極性の残基で置換し、Ｇｌｎで置換してもよく、１８位を、小型の脂肪族アミノ酸で置換し、Ａｌａで置換してもよい。１７位および１８位のＱＡでの置換により、これらの位置の天然のＲＲ配列に比べて、ＧＩＰ活性の増大がもたらされる。
ＧＩＰ受容体での活性の増強は、１２位から２９位までのアミノ酸側鎖の間の分子内架橋の形成を可能にする改変によってももたらされる。例えば、分子内架橋は、ｉ位とｉ＋４位の２つのアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位の間の、またはｋ位とｋ＋７位の間の共有結合によって形成され得る。例示的な実施形態では、架橋は１２位と１６位と、１６位と２０位と、２０位と２４位と、２４位と２８位と、または１７位と２０位との間である。他の実施形態では、塩橋などの非共有結合による相互作用が、これらの位置の正に荷電しているアミノ酸と負に荷電アミノ酸との間に形成し得る。
ＧＩＰ受容体活性を増大する、上記に記載した改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。ＧＩＰ受容体活性を増大する改変の組合せは、単独で採用したこのような改変のいずれかよりも高いＧＩＰ活性をもたらすのが一般的である。
グルカゴン活性に影響を及ぼす改変
一部の実施形態では、グルカゴン作用強度の増強が、天然のグルカゴン（配列番号１００１）の１６位のアミノ酸改変によってももたらされる。非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体に対して、グルカゴン受容体に対するオリジナルの選択性を保持する。
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸改変、例えば、天然に存在する３位のグルタミンの、酸性、塩基性、または疎水性のアミノ酸での置換により、低減することができる。例えば、３位の、グルタミン酸、オルニチン、またはノルロイシンでの置換により、グルカゴン受容体活性は実質的に低減または破壊される。
グルカゴン受容体での活性の維持または増強は、本明細書に記載する通り、３位のＧｌｎをグルタミン類似体で改変することにより実現され得る。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号１２４３〜１２４８、１２５０、１２５１、および１２５３〜１２５６のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
１位および２位のアミノ酸改変により低減されたグルカゴン活性の回復は、グルカゴン関連ペプチドまたはその類似体のＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のアルファヘリックス構造を安定化する改変によりもたらされる。例えば、ｉ位とｉ＋４位の２つのアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位の間の、またはｋ位とｋ＋７位の間の共有結合により、分子内形成を形成することができる。他の実施形態では、塩橋などの非共有結合による相互作用が、これらの位置で正に荷電しているアミノ酸と負に荷電アミノ酸との間に形成され得る。さらに他の実施形態では、１つまたは複数のα，α−二置換アミノ酸が、所望の活性を保持する位置で、このＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）に挿入され、または置換される。例えば、１６、２０、２１、または２４位のうちの１、２、３つ、または全てが、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換される。
ＧＬＰ−１活性に影響を及ぼす改変
ＧＬＰ−１受容体での活性の増強は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルなどの電荷的中性の基で置き換えることによりもたらされる。ＧＬＰ−１受容体の活性の増強は、本明細書にさらに記載する通り、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を、２つのアミノ酸の側鎖間の分子内架橋の形成、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックス構造を安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入などにより、安定化することによってももたらされる。例示的な実施形態では、１２と１６と、１３と１７と、１６と２０と、１７と２１と、２０と２４と、または２４と２８とのアミノ酸対の側鎖（ｉ＝１２、１６、２０、または２４であるアミノ酸対）が相互に連結しており、よってグルカゴンのアルファヘリックスを安定化する。一部の実施形態では、特に架橋がｉ位とｉ＋４位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約８（または約７〜９）原子である。一部の実施形態では、特に架橋がｊ位とｊ＋３位の間である場合、架橋またはリンカーの長さは約６（または約５〜７）原子である。
一部の実施形態では、分子内架橋は、（ａ）１６位の天然に存在するセリンを、グルタミン酸で、または長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、または少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有し、長さ約４（または３〜５）原子の側鎖を有する荷電アミノ酸で置換し、（ｂ）２０位の天然に存在するグルタミンを、荷電している、または水素結合する能力を有するいずれかの側鎖、および長さ少なくとも約５（または約４〜６）原子である側鎖を有する別の親水性アミノ酸、例えば、リシン、シトルリン、アルギニン、もしくはオルニチンで置換することにより形成される。１６位および２０位のこのようなアミノ酸の側鎖は、塩橋を形成することができ、または共有結合により連結することができる。一部の実施形態では、２つのアミノ酸は相互に結合してラクタム環を形成する。
一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分におけるアルファヘリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成により実現される。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成のいずれか１つまたは複数を含み、ペプチド環化の他の手段を、アルファへリックスを安定化するために用いる。
さらに他の実施形態では、１つまたは複数のα，α−二置換アミノ酸が、所望の活性を保持する位置で、このＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）に挿入され、または置換される。例えば、１６、２０、２１、または２４位のうちの１、２、３つ、または全てが、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換される。ＧＬＰ−１受容体の活性の増大は、本明細書に記載する２０位のアミノ酸改変によりもたらされる。ＧＬＰ−１受容体での活性の増大はまた、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）をＣ末端に付加することによりもたらされる。このような類似体におけるＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載する通り、１８、２８、もしくは２９位のアミノ酸、または１８および２９位のアミノ酸を改変することによりさらに増大することができる。ＧＬＰ−１作用強度のさらなる適度な増大は、１０位のアミノ酸を、大型の芳香族アミノ酸残基であり、Ｔｒｐであってもよいように改変することによりもたらされる。ＧＬＰ−１受容体での作用強度は、１８位の天然のアルギニンに対してアラニンを置換することにより、さらに増強することができる。
ＧＬＰ−１受容体での活性の低減は、本明細書に記載する通り、７位のアミノ酸改変などによりもたらされる。
ＧＬＰ−１受容体活性を増大する、クラス２グルカゴン関連ペプチドに関して上記に記載した改変のいずれかを、個々に、または組み合わせて適用することができる。ＧＬＰ−１受容体の活性を増大する改変の組合せは、一般的に、単独で採用したこのような改変のいずれかよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらす。例えば、本発明は、１６位と２０位とのアミノ酸間に共有結合を有してもよい、１６位、２０位、およびＣ末端のカルボン酸基の改変を含むグルカゴン関連ペプチド；１６位およびＣ末端にカルボン酸基の改変を含むグルカゴン関連ペプチド；１６位と２０位とのアミノ酸間に共有結合を有してもよい、１６位および２０位の改変を含むグルカゴン関連ペプチド；ならびに２０位およびＣ末端のカルボン酸基に改変を含むグルカゴン関連ペプチドを提供する。
ＤＰＰ−ＩＶ抵抗性を改善する改変
１位および／または２位の改変は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）の切断に対するペプチドの抵抗性を増大し得る。例えば、１位および／または２位を、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ抵抗性のアミノ酸で置換してもよい。一部の実施形態では、２位のアミノ酸をＮ−メチルアミンで置換する。
２位の改変（例えば、２位のＡＩＢ）および場合により１位の改変（例えば、１位のＤＭＩＡ）は、時には著しく、グルカゴン活性を低減し得、驚くべきことに、グルカゴン活性におけるこの低減は、グルカゴンのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造を、本明細書に記載する通り、２つのアミノ酸側鎖間に共有結合を形成することなどにより、安定化することにより回復することができる。一部の実施形態では、共有結合は、「ｉ」位と「ｉ＋４」位、または「ｊ」位と「ｊ＋３」位のアミノ酸間、例えば、１２位と１６位と、１６位と２０位と、２０位と２４位と、２４位と２８位と、または１７位と２０位との間である。例示的な実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。一部の実施形態では、この共有結合は、本明細書に記載する通り、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。
分解を低減する改変
またさらなる例示的な実施形態では、クラス２グルカゴン関連ペプチドのいずれかは、特に酸性またはアルカリ性バッファー中、配列番号１００１の１５位および／または１６位のアミノ酸を改変して経時的なペプチドの分解を低減することにより、安定性を改善するようにさらに改変することができる。このような改変により、Ａｓｐ１５−Ｓｅｒ１６のペプチド結合の切断が低減する。例示的な実施形態では、１５位のアミノ酸改変は、Ａｓｐの、欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸、もしくはホモシステイン酸での置換である。他の例示的な実施形態では、１６位のアミノ酸改変は、Ｓｅｒの欠失、またはＴｈｒもしくはＡＩＢでの置換である。他の例示的な実施形態では、１６位のＳｅｒを、グルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで置換する。
一部の実施形態では、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基を、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、ペプチドの酸化的分解を防ぐことができる。一部の実施形態では、２７位のＭｅｔを、ロイシン、イソロイシン、またはノルロイシンで置換する。一部の具体的な実施形態では、２７位のＭｅｔをロイシンまたはノルロイシンで置換する。
一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、Ｇｌｎの脱アミドによって生じる分解は低減し得る。一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換する。一部の実施形態では、２０位および／または２４位のＧｌｎを、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはシトルリンで置換する。
一部の実施形態では、２１位のＡｓｐを、欠失または置換などにより改変する。このような改変により、Ａｓｐの脱水によって生じる分解を低減して環状スクシンイミド中間体を形成させ、引き続きイソアスパルテートに異性体化してもよい。一部の実施形態では、２１位をＧｌｕ、ホモグルタミン酸、またはホモシステイン酸で置換する。一部の具体的な実施形態では、２１位をＧｌｕで置換する。
アルファヘリックス構造の安定化
クラス２グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９周辺）におけるアルファヘリックス構造の安定化により、ＧＬＰ−１および／またはＧＩＰ活性の増強がもたらされ、１位および／または２位のアミノ酸改変によって低減したグルカゴン活性が回復する。アルファヘリックス構造は、共有結合もしくは非共有結合による分子内架橋の形成、または１２〜２９位周辺のアミノ酸の、アルファヘリックスを安定化するアミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸）での置換および／もしくは挿入などにより安定化することができる。ＧＩＰアゴニストのαへリックス構造の安定化は、本明細書に記載する通りに遂行することができる。
例示的な実施形態
本発明の一部の実施形態によれば、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、（ｂ）類似体のＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９）のアルファヘリックス構造を安定化する改変を有し、（ｃ）１〜１０個（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個）のさらなるアミノ酸改変を有してもよい、配列番号１００１を含む。一部の実施形態では、類似体は、ＧＩＰ受容体での天然のＧＩＰの少なくとも約１％の活性、または本明細書に記載するＧＩＰ受容体でのあらゆる他の活性レベルを表す。
ある特定の実施形態では、アルファヘリックス構造を安定化する改変は、本明細書に記載するいずれかなど、共有結合による分子内架橋などを含めた、分子内架橋を提供または導入するものである。共有結合による分子内架橋は、一部の実施形態では、ラクタム架橋である。これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、「アルファヘリックス構造の安定化」のセクションの下のラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋はｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間の架橋であってよく、式中、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である。ある特定の実施形態では、ラクタム架橋は、１６位と２０位のアミノ酸の間であってよく、この場合、１６位および２０位のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換されており、１６位および２０位のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている。
代替的な実施形態では、アルファヘリックス構造を安定化する改変は、類似体の１６、２０、２１、および２４位（複数可）のうちの１、２、３、または４個のα，α−二置換アミノ酸の導入である。一部の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。ある特定の態様では、α，α−二置換アミノ酸（例えば、ＡＩＢ）は２０位にあり、１６位のアミノ酸は、例えば本明細書に記載する式ＩＶのアミノ酸などの、正に荷電しているアミノ酸で置換されている。式ＩＶのアミノ酸は、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であってよい。
本発明の具体的な態様では、１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、大型の芳香族アミノ酸（例えば、Ｔｙｒ）などのイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換である。
ある特定の態様では、グルカゴンの類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変を含む。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、２９位のＴｈｒは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよく、または前述の２つもしくは３つの組合せであってもよい。具体的な実施形態では、グルカゴンの類似体は、２７位のＬｅｕ、２８位のＡｌａ、および２９位のＧｌｙまたはＴｈｒを含む。
本発明のある特定の実施形態では、グルカゴンの類似体は、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の１〜２１個のアミノ酸の伸長を含む。延長は、例えば、配列番号１０９５または１０９６のアミノ酸配列を含むことができる。さらに、またはあるいは、グルカゴンの類似体は、延長の１〜６個のアミノ酸が正に荷電しているアミノ酸である延長を含むことができる。正に荷電しているアミノ酸は、それだけには限定されないが、Ｌｙｓ、ホモＬｙｓ、Ｏｒｎ、およびＤａｂを含めた式ＩＶのアミノ酸であってよい。
グルカゴンの類似体は、一部の実施形態では、本明細書に記載する通り、アシル化またはアルキル化されている。例えば、アシル基またはアルキル基は、本明細書にさらに記載する通り、スペーサーありまたはなしで、類似体の１０位または４０位で、グルカゴンの類似体に結合していてよい。類似体は、さらにまたはあるいは、本明細書にさらに記載する通り、親水性部分を含むように改変されていてよい。さらに、一部の実施形態では、類似体は、以下の改変：
（ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
（ｂ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている１０位のＴｙｒ、
（ｃ）１０位のＬｙｓに対するアシル基の連結、
（ｄ）ＡｒｇまたはＩｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、
（ｅ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
（ｆ）Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
（ｇ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧＬｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
（ｉ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
（ｊ）Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
（ｋ）Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、
（ｌ）ならびに２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
のあらゆる１つまたは組合せを含む。
例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間の、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７である）、
（ｃ）２７、２８、および２９位の１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変、
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
これらの実施形態の類似体のラクタム架橋は、本明細書に記載するラクタム架橋であってよい。例えば、ラクタム架橋は１６位と２０位とのアミノ酸の間であってよく、この場合、１６位および２０位のアミノ酸の一方がＧｌｕで置換されており、１６位および２０位のアミノ酸の他方がＬｙｓで置換されている。これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１００５〜１０９４のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる。
他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３つ、または全てがα，α−二置換アミノ酸で置換されている、
（ｃ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｄ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
これらの実施形態の類似体のα，α−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めた、あらゆるα，α−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、α，α−二置換アミノ酸はＡＩＢである。ある特定の実施形態では、２０位のアミノ酸は、ＡＩＢなどのα，α−二置換アミノ酸で置換されている。これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６〜１１６９、および１１７３〜１１７８のいずれかのアミノ酸配列を含んでいてよい。
さらに他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）１６位のＳｅｒの、式ＩＶのアミノ酸でのアミノ酸置換：
［式ＩＶ］
（式中、ｎは、１〜１６、または１〜１０、または１〜７、または１〜６、または２〜６であり、Ｒ1およびＲ2の各々は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む）
（ｃ）２０位のＧｌｎの、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換、
（ｄ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、例えば、２７位および／または２８位のアミノ酸改変、ならびに
（ｅ）１〜９個または１〜６個のさらなるアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
これらの実施形態の類似体の式ＩＶのアミノ酸は、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である、式ＩＶのアミノ酸などのあらゆるアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、ｎは２、３、４、または５であり、この場合、アミノ酸はそれぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。
これらの実施形態の類似体のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めたあらゆるアルファ，アルファ−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。これらの実施形態によれば、類似体は、例えば、配列番号１０９９〜１１６５のいずれかのアミノ酸配列を含むことができる
さらに他の例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号１００１）は、
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
（ｂ）伸長の少なくとも１つのアミノ酸がアシル化またはアルキル化されている、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸の伸長
を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である。より具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸はＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。また、一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸の伸長は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘは、あらゆるアミノ酸、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）であり、ＸはＧｌｙ、または小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。
一部の実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有する類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てにアミノ酸改変をさらに含み、例えば、２７位および／または２８位にアミノ酸改変を含む。
上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換であってよい。例えば、１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、大型の芳香族アミノ酸での置換であってよい。一部の実施形態では、大型の芳香族アミノ酸は、Ｔｙｒなどを含めた、本明細書に記載するアミノ酸のいずれかである。
また、上記の例示的な実施形態に関して、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変は、本明細書に記載するこれらの位置の改変のいずれかであってよい。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、および／または２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
上記の例示的な実施形態の類似体は、１〜９個または１〜６個のさらなる、付加的なアミノ酸改変、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、または９個のさらなるアミノ酸改変、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン受容体のいずれかでの活性を増大または低減し、溶解性を改善し、作用の持続時間もしくは循環中の半減期を改善し、作用の開始を遅らせ、または安定性を増大する、本明細書に記載する改変のいずれかをさらに含むことができる。類似体はさらに、例えば、１２位のアミノ酸改変を含み、Ｉｌｅでの置換を含んでもよく、ならびに／または１７位および１８位のアミノ酸改変を含み、１７位のＱおよび１８位のＡでの置換を含んでもよく、ならびに／またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）、または配列番号１０９５もしくは１０９６に対する１つもしくは複数の保存的置換を含む配列のＣ末端への付加を含むことができる。類似体は、以下の改変：
（ｉ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
（ｉｉ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、１０位のＴｙｒ、
（ｉｉｉ）１０位のＬｙｓへのアシル基の連結、
（ｉｖ）Ａｒｇで置換されている１２位のＬｙｓ、
（ｖ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
（ｖｉ）Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
（ｖｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
（ｖｉｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
（ｉｘ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
（ｘ）Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
（ｘｉ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、ならびに
（ｘｉｉ）２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
の１つまたは複数を含むことができる。
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分に共有結合により連結していてよい。一部の実施形態では、類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで親水性部分に共有結合により連結している。ある特定の実施形態では、類似体は、Ｃ末端の伸長（例えば、配列番号１０９５のアミノ酸配列）、および親水性部分を含むアミノ酸の付加を含み、その結果親水性部分は４０位で類似体に共有結合により連結している。
なおさらなる例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体は、以下の改変：
（ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変をさらに含んでもよく、
（ｂ）伸長のアミノ酸の少なくとも１つがアシル化またはアルキル化されている、Ｃ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸伸長、ならびに
（ｄ）最高６個のさらなるアミノ酸改変
をさらに含む、配列番号１２２７、１２２８、１２２９、または１２３０のいずれか１つによるアミノ酸配列を含み、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。一部の態様では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸である。より具体的な実施形態では、式Ｉのアミノ酸は、Ｄａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。また、一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘはあらゆるアミノ酸であり、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）を含み、ＸはＧｌｙまたは小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であってよい。
上記の例示的な実施形態の類似体は、１〜６個のさらなる、付加的なアミノ酸改変、例えば、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、およびグルカゴン受容体のいずれかでの活性を増大または低減し、溶解性を改善し、作用の持続時間もしくは循環中の半減期を改善し、作用の開始を遅らせ、または安定性を増大する、本明細書に記載する改変のいずれかをさらに含むことができる。
ある特定の態様では、上記の例示的な実施形態に記載したグルカゴン類似体は、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てにさらなるアミノ酸改変を含む。これらの位置での改変は、これらの位置に対して本明細書に記載する改変のいずれかであってよい。例えば、配列番号１２２７、１２２８、１２２９、または１２３０に対して、２７位を大型の脂肪族アミノ酸（例えば、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、もしくはノルロイシン）、またはＭｅｔで置換してもよく、２８位を別の小型脂肪族アミノ酸（例えば、ＧｌｙもしくはＡｌａ）またはＡｓｎで置換してもよく、ならびに／あるいは２９位を別の小型脂肪族アミノ酸（例えば、ＡｌａもしくはＧｌｙ）またはＴｈｒで置換してもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
類似体は、以下のさらなる改変：
（ｉ）２位のアミノ酸が、Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸のいずれか１つであり、
（ｉｉ）１０位のアミノ酸がＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌであり、
（ｉｉｉ）１０位のＬｙｓに対するアシル基の連結、
（ｉｖ）１２位のアミノ酸がＩｌｅ、Ｌｙｓ、またはＡｒｇであり、
（ｖ）１６位のアミノ酸が、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、またはＡＩＢのいずれか１つであり、
（ｖｉ）１７位のアミノ酸が、ＧｌｎまたはＡｒｇであり、
（ｖｉｉ）１８位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙのいずれか１つであり、
（ｖｉｉｉ）２０位のアミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、もしくはＡＩＢ、または別のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸のいずれか１つであり、
（ｉｘ）２１位のアミノ酸が、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸のいずれか１つであり、
（ｘ）２３位のアミノ酸が、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
（ｘｉ）２４位のアミノ酸が、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢのいずれか１つであり、
（ｘｉｉ）２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの１つまたは複数の保存的置換
の１つまたは複数をさらに含むことができる。
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
類似体がアシル基またはアルキル基を含む上記の例示的な実施形態では、類似体は、本明細書に記載する通り、アシル基またはアルキル基にスペーサーによって結合していてよい。スペーサーは、例えば、長さ３〜１０原子であってよく、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約１４〜約２８原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
いくつかの非常に具体的な実施形態では、本発明の類似体は、配列番号１０９９〜１１４１、１１４４〜１１６４、１１６６、１１９２〜１２０７、１２０９〜１２２１、および１２２３からなる群から選択される、または配列番号１１６７〜１１６９、１１７３〜１１７８、および１２２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
なおさらなる例示的な実施形態では、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体は、アシル基またはアルキル基（例えば、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基）を含み、アシル基またはアルキル基はスペーサーに結合しており、（ｉ）スペーサーは類似体の１０位のアミノ酸の側鎖に結合しており、または（ｉｉ）類似体はＣ末端から２９位のアミノ酸の１〜２１個のアミノ酸の伸長を含み、スペーサーは、配列番号１００１に対して３７〜４３位の１つに対応するアミノ酸の側鎖に結合しており、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０は約１０ｎＭ以下である。
このような実施形態では、類似体は、（ｉ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、（ｉｉ）２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変、（ｉｉｉ）以下の少なくとも１つ：
（Ａ）類似体は、ｉ位とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖間に、またはｊ位とｊ＋３位のアミノ酸の側鎖間にラクタム架橋を含み、ｉは１２、１３、１６、１７、２０、または２４であり、ｊは１７であり、
（Ｂ）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３つ、または全てがα，α−二置換アミノ酸で置換されており、あるいは
（Ｃ）類似体は、（ｉ）１６位のＳｅｒの式ＩＶのアミノ酸でのアミノ酸置換：
［式ＩＶ］
（式中、
ｎは１から７であり、Ｒ１およびＲ２の各々は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離のアミノ基を含む）、および（ｉｉ）２０位のＧｌｎの、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸でのアミノ酸置換を含み、ならびに（ｉｖ）最高６個のさらなるアミノ酸改変を有する配列番号１００１のアミノ酸配列を含むことができる。
これらの実施形態の類似体のアルファ，アルファ−二置換アミノ酸は、それだけには限定されないが、アミノイソ−酪酸（ＡＩＢ）；メチル、エチル、プロピル、およびｎ−ブチルから選択される同じもしくは異なる基で、またはシクロオクタンもしくはシクロヘプタンで二置換されているアミノ酸（例えば、１−アミノシクロオクタン−１−カルボン酸）を含めた、あらゆるアルファ，アルファ−二置換アミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、アルファ，アルファ−二置換アミノ酸はＡＩＢである。
これらの実施形態の類似体の式ＩＶのアミノ酸は、ｎが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６である、式ＩＶのアミノ酸などのあらゆるアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、ｎは２、３、４、または５であり、この場合、アミノ酸はそれぞれＤａｂ、Ｏｒｎ、Ｌｙｓ、またはホモＬｙｓである。上記の例示的な実施形態のいずれかでは、ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変は、Ｈｉｓの、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸での置換であってよい。
また、上記の例示的な実施形態に関して、２７、２８、および２９位のうちの１、２つ、または全てのアミノ酸改変は、本明細書に記載するこれらの位置の改変のいずれかであってもよい。例えば、２７位のＭｅｔは、大型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｌｅｕで置換されていてもよく、２８位のＡｓｎは、小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ａｌａで置換されていてもよく、および／または２９位のＴｈｒは小型の脂肪族アミノ酸で置換され、Ｇｌｙで置換されていてもよい。あるいは、類似体は、２７位および／または２８位にこのようなアミノ酸改変を含むことができる。
類似体はさらに、例えば、１２位のアミノ酸改変を含み、Ｉｌｅでの置換を含んでもよく、ならびに／または１７位および１８位のアミノ酸改変を含み、１７位のＱおよび１８位のＡでの置換を含んでもよく、ならびに／またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）、または配列番号１０９５もしくは１０９６に対する１つもしくは複数の保存的置換を含む配列のＣ末端への付加を含むことができる。類似体は、以下の改変：
（ｉ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換されている２位のＳｅｒ、
（ｉｉ）Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、またはＶａｌで置換されている、１０位のＴｙｒ、
（ｉｉｉ）１０位のＬｙｓへのアシル基の連結、
（ｉｖ）Ａｒｇで置換されている１２位のＬｙｓ、
（ｖ）Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、またはＡＩＢで置換されている１６位のＳｅｒ、
（ｖｉ）Ｇｌｎで置換されている１７位のＡｒｇ、
（ｖｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙで置換されている１８位のＡｒｇ、
（ｖｉｉｉ）Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｌｙｓ、シトルリン、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、またはＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、
（ｉｘ）Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換されている２１位のＡｓｐ、
（ｘ）Ｉｌｅで置換されている２３位のＶａｌ、
（ｘｉ）Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、ならびに
（ｘｉｉ）２、５、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２４、２７、２８、および２９位のいずれかの保存的置換
の１つまたは複数を含むことができる。
一部の実施形態では、類似体は、（ｉ）から（ｘｉｉ）までの改変の組合せを含む。あるいは、またはさらに、類似体は、３位のアミノ酸改変（例えば、ＧｌｎのＧｌｕでのアミノ酸置換）を含むことができ、類似体はグルカゴン受容体でのグルカゴンの活性の約１％未満を有する。あるいは、またはさらに、類似体は、７位のアミノ酸改変（例えば、Ｔｈｒの、ＡｂｕもしくはＩｌｅなどのヒドロキシル基を欠くアミノ酸でのアミノ酸置換）、２７−もしくは２８−アミノ酸ペプチドを生じる、Ｃ末端から２７位または２８位のアミノ酸のアミノ酸（複数可）の欠失、またはこれらの組合せを含むことができ、類似体は、ＧＬＰ−１受容体でのＧＬＰ−１の活性の約１０％未満を有する。
例示的な実施形態に関して、類似体は親水性部分に共有結合により連結していてよい。一部の実施形態では、類似体は、１６、１７、２０、２１、２４、２９、４０位、またはＣ末端アミノ酸のいずれかで親水性部分に共有結合により連結している。ある特定の実施形態では、類似体は、Ｃ末端の伸長（例えば、配列番号１０９５のアミノ酸配列）、および親水性部分を含むアミノ酸の付加を含み、その結果親水性部分は４０位で類似体に共有結合により連結している。
一部の実施形態では、親水性部分は、類似体のＬｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンに共有結合により連結している。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｏｒｎ、ホモシステイン、またはアセチル−フェニルアラニンは、グルカゴン配列（配列番号１００１）に天然であるアミノ酸であってよく、または配列番号１００１の天然のアミノ酸を置き換えるアミノ酸であってよい。親水性部分がＣｙｓに結合している一部の実施形態では、親水性部分に対する連結は以下の構造を含むことができる。
親水性部分を含む類似体に関して、親水性部分は、本明細書に記載する親水性部分のいずれかであってよい。例えば、「親水性部分の連結」のセクションの下の教示を参照されたい。一部の実施形態では、親水性部分はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、ある特定の実施形態では、約１０００ダルトン〜約４００００ダルトン、例えば、約２００００ダルトン〜約４００００ダルトンの分子量を有する。
類似体がスペーサーによって類似体に結合しているアシル基またはアルキル基を含む、例示的な実施形態では、スペーサーは本明細書に記載するあらゆるスペーサーであってよい。スペーサーは、例えば、長さ３〜１０原子であってよく、例えば、アミノ酸（例えば、６−アミノヘキサン酸、本明細書に記載するあらゆるアミノ酸）、ジペプチド（例えば、Ａｌａ−Ａｌａ、βＡｌａ−βＡｌａ、Ｌｅｕ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、γＧｌｕ−γＧｌｕ）、トリペプチド、または親水性もしくは疎水性の二官能性スペーサーであってよい。ある特定の態様では、スペーサーおよびアシル基またはアルキル基の全長は約１４〜約２８原子である。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーはγ−Ｇｌｕではない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーはγ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕではない。
アシル基またはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基またはアルキル基など、本明細書に記載するあらゆるアシル基またはアルキル基である。アシル基またはアルキル基は、一部の実施形態では、Ｃ４−Ｃ３０脂肪アシル基、例えば、Ｃ１０脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１２脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１４脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１６脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ１８脂肪アシル基またはアルキル基、Ｃ２０アシル基またはアルキル基、またはＣ２２アシル基またはアルキル基、またはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。具体的な実施形態では、アシル基はＣ１２−Ｃ１８脂肪アシル基（例えば、Ｃ１４またはＣ１６脂肪アシル基）である。
一部の実施形態では、類似体のＣ末端から２９位のアミノ酸の約１〜約２１個のアミノ酸の伸長は、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９５）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列を含み、Ｘはあらゆるアミノ酸であり、またはＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７０）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＫ（配列番号１１７１）もしくはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＫ（配列番号１１７２）を含み、ＸはＧｌｙもしくは小型の脂肪族もしくは無極性もしくはわずかに極性のアミノ酸である。一部の実施形態では、約１〜約２１個のアミノ酸は、配列番号１０９５、１０９６、１１７０、１１７１、または１１７２に対して１つまたは複数の保存的置換を含む配列を含んでいてよい。一部の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の３７、３８、３９、４０、４１、４２、または４３位に位置する。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｃ末端が伸長されている類似体の４０位に位置する。ある特定の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、配列番号１００１、１２２７、１２２８、１２２９もしくは１２３０に対して天然であるアミノ酸に共有的に連結されるか、またはそれは置換されたアミノ酸に連結されていてもよい。ある特定の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、配列番号１０９５、１０９６、１１７１または１１７２に対して天然であるアミノ酸に共有的に連結される。
ＧＩＰアゴニストは、ＧＩＰアゴニスト活性を保持する最高１、２、３、４、または５個のさらなる改変を有してもよい、配列番号１００５〜１０９４などのアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチドであってよい。ある特定の実施形態では、ＧＩＰアゴニストは、配列番号１０９９〜１２６２のいずれかのアミノ酸を含む。
クラス３グルカゴン関連ペプチド
ある特定の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書、ならびに国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８（２００９年６月１６日に出願）、２００８年８月２１日に公開された国際特許出願公開第２００８／１０１０１７号ならびに米国仮特許出願第６１／０９０，４１２号および米国特許出願第６１／１７７，４７６号（これらの内容はそれらの全体が参照により組み込まれている）に記載されるクラス３グルカゴン関連ペプチドである。
クラス３グルカゴン関連ペプチドに関連して以下の項目で参照する生物学的配列（配列番号８９〜１０８、１１４〜１２８、および１４６〜６５６）のうちいくつかは、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４７４３８号における配列番号８９〜１０８、１１４〜１２８、および１４６〜６５６に相当する。
活性
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体にて活性の増加を示し、さらなる実施形態では、生物物理学的安定性および／または水溶性の増進を示すペプチドであり得る。さらに、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体についての天然グルカゴンの選択性を喪失しており、よって、これらの２つの受容体の共同アゴニストを表す。クラス３グルカゴン関連ペプチド内の選択されたアミノ酸改変は、グルカゴン受容体よりも、ＧＬＰ−１受容体にてペプチドの相対的活性を制御できる。よって、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体にてより高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト、両方の受容体にてほぼ等しい活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト、またはグルカゴン受容体よりも、ＧＬＰ−１受容体にてより高い活性を有するグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストであり得る。共同アゴニストの後者のカテゴリーは、グルカゴン受容体にてほとんどまたは全く活性を示さないが、天然ＧＬＰ−１と同じまたはよりよい有効性でＧＬＰ−１受容体を活性化する能力をまだ保持するように操作できる。これらの共同アゴニストのいずれも、生物物理学的安定性および／または水溶性の増進を与える改変も含んでよい。
クラス３グルカゴン関連ペプチドの改変を作製して、天然ＧＬＰ−１と比べてＧＬＰ−１受容体にて少なくとも約１％（少なくとも約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％を含む）〜約２００％以上のいずれかの活性を有し、天然グルカゴンと比べてグルカゴン受容体にて少なくとも約１％（約１．５％、２％、５％、７％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％を含む）〜約５００％以上のいずれかの活性を有するグルカゴン関連ペプチドを生成できる。天然グルカゴンのアミノ酸配列は配列番号７０１であり、ＧＬＰ−１（７−３６）アミドのアミノ酸配列は配列番号７０３であり、ＧＬＰ−１（７−３７）酸のアミノ酸配列は配列番号７０４である。
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体もしくはＧＬＰ−１受容体または両方にて活性が増加または減少したグルカゴン関連ペプチドであり得る。クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１受容体よりも、グルカゴン受容体についての選択性が変更されたグルカゴン関連ペプチドであり得る。本明細書に開示するように、改善された溶解性および／または安定性も示す、高い有効性のクラス３グルカゴン関連ペプチドが提供される。
グルカゴン活性に影響する改変
グルカゴン受容体での活性の増加は、天然グルカゴン（配列番号７０１）の１６位のアミノ酸改変によりもたらされる。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン受容体でのペプチドの有効性を増進するようにＨｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ（配列番号７０１）の野生型ペプチドに比べて改変されたグルカゴンアゴニストである。天然グルカゴン（配列番号７０１）の１６位に通常存在するセリンは、検証されたｉｎ ｖｉｔｒｏモデル（例７を参照されたい）におけるｃＡＭＰ合成を刺激するその能力の点でグルカゴンの有効性を増進するように選択酸性アミノ酸で置換できる。より具体的には、この置換は、類似体の有効性をグルカゴン受容体にて少なくとも２倍、４倍、５倍および１０倍までより大きく増進する。この置換は、ＧＬＰ−１受容体での類似体の活性も、天然グルカゴンと比べて少なくとも５倍、１０倍または１５倍増進するが、グルカゴン受容体についての選択性は、ＧＬＰ−１受容体を超えて維持される。
非限定的な例により、このような作用強度の増強は、１６位の天然に存在するセリンをグルタミン酸で、もしくは長さ４原子の側鎖を有する負に荷電している別のアミノ酸で、または代替的にグルタミン、ホモグルタミン酸、もしくはホモシステイン酸のいずれか１つで、もしくは少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ）を含む側鎖を有する荷電アミノ酸で、および約４（または３〜５）原子の長さの側鎖で、置換することによりもたらされ得る。一部の実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、トレオニン、またはグリシンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態によると、天然グルカゴンの１６位のセリン残基は、グルタミン酸、グルタミン、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換され、一部の実施形態では、セリン残基は、グルタミン酸で置換される。
一部の実施形態では、有効性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５のペプチドまたは配列番号９３のグルカゴンアゴニスト類似体を含む。一部の実施形態によると、野生型グルカゴンと比べてグルカゴン受容体にて有効性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドであって、ペプチドが、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７または配列番号９８の配列を含み、グルカゴン関連ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体と比べてグルカゴン受容体についてのその選択性を保持するクラス３グルカゴン関連ペプチドが提供される。一部の実施形態では、グルカゴン受容体についての選択性が増進されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８のペプチドまたはそのグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、カルボキシ末端アミノ酸は、その天然カルボン酸基を保持する。一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ（配列番号９８）の配列を含み、ここで、ペプチドは、例７のｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃＡＭＰアッセイにより測定して、天然グルカゴンと比べて、グルカゴン受容体にておよそ５倍の有効性の増進を示す。
グルカゴン受容体活性は、３位のアミノ酸改変、例えば３位の天然に存在するグルタミンの置換により、低減、維持または増進できる。一部の実施形態では、３位のアミノ酸の酸性、塩基性または疎水性アミノ酸（グルタミン酸、オルニチン、ノルロイシン）での置換がグルカゴン受容体活性を実質的に低減または破壊することが示されている。例えばグルタミン酸、オルニチンまたはノルロイシンで置換された類似体は、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約１０％以下、例えば約１〜１０％もしくは約０．１〜１０％、または約０．１％より大きいが約１０％未満を示すが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。例えば、本明細書に記載する例示的な類似体は、天然グルカゴンの活性の約０．５％、約１％または約７％を有するが、ＧＬＰ−１受容体にてＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示す。特に、グルカゴン類似体、グルカゴンアゴニスト類似体、グルカゴン共同アゴニストおよびグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニスト分子を含む、本明細書に記載するクラス３グルカゴン関連ペプチドのいずれも、３位の改変、例えばＧｌｕで置換されたＧｌｎを有して、グルカゴン受容体についての選択性と比較して、ＧＬＰ−１受容体について高い選択性、例えば１０倍の選択性を有するペプチドを生成するように改変してよい。
別の実施形態では、任意のクラス３グルカゴン関連ペプチドの３位の天然に存在するグルタミンは、グルカゴン受容体での活性を実質的に喪失することなく、そして一部の場合では、本明細書に記載するように、グルカゴン受容体活性を増進して、グルタミン類似体で置換できる。具体的な実施形態では、３位のアミノ酸は、Ｄａｂ（Ａｃ）で置換される。例えば、グルカゴンアゴニストは、配列番号５９５、配列番号６０１、配列番号６０３、配列番号６０４、配列番号６０５および配列番号６０６のアミノ酸配列を含むことができる。
２位の改変（例えば２位のＡＩＢ）および一部の場合では１位の改変がグルカゴン活性を低減し得ることが観察された。グルカゴン活性のこの低減は、例えば本明細書に記載する手段により、例えば「ｉ」位および「ｉ＋４」位、例えば１２位および１６位、１６位および２０位または２０位および２４位のアミノ酸の側鎖の間の共有結合により、グルカゴンのＣ末端部分のアルファへリックスを安定化することにより回復できる。一部の実施形態では、この共有結合は、１６位のグルタミン酸と２０位のリシンとの間のラクタム架橋である。一部の実施形態では、この共有結合は、ラクタム架橋以外の分子内架橋である。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成およびペプチド環化の他の手段の任意の１または複数を含む。
ＧＬＰ−１活性に影響する改変
ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸を、アミドまたはエステルのような電荷中性の基で置き換えることによりもたらされる。一部の実施形態では、これらのクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１０８の配列を含み、ここで、カルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸で見出されるカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。これらのクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方で強い活性を有し、よって、両方の受容体で共同アゴニストとして働く。一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであり、ここで、ペプチドは、配列番号１０８の配列を含み、２８位のアミノ酸は、ＡｓｎまたはＬｙｓであり、２９位のアミノ酸は、Ｔｈｒ−アミドである。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増加は、グルカゴンのＣ末端部分（例えば残基１２〜２９のあたり）でアルファへリックスを安定化する改変によりもたらされる。一部の実施形態では、このような改変は、３個の介在アミノ酸（すなわち「ｉ」位のアミノ酸と「ｉ＋４」位のアミノ酸との間（ここで、ｉは、１２から２５の間の任意の整数である））により分けられた２つのアミノ酸、２つの介在アミノ酸により分けられた２つのアミノ酸、すなわち「ｊ」位のアミノ酸と「ｊ＋３」位のアミノ酸（ここで、ｊは、１２から２７の間の任意の整数である）または６つの介在アミノ酸により分けられた２つのアミノ酸、すなわち「ｋ」位のアミノ酸と「ｋ＋７」位のアミノ酸（ここで、ｋは、１２から２２の間の任意の整数である）の側鎖の間の分子内架橋の形成を許容する。例示的な実施形態では、架橋またはリンカーは、約８（または約７〜９）原子の長さであり、１２位および１６位、または１６位および２０位、または２０位および２４位、または２４位および２８位のアミノ酸の側鎖の間で形成される。２つのアミノ酸側鎖は、非共有結合、例えば水素結合、塩橋の形成のようなイオン相互作用により、または共有結合により互いに連結できる。
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニスト活性を示し、配列番号９９、１０１、１０２および１０３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、側鎖は、互いに共有結合し、一部の実施形態では、２つのアミノ酸は、互いに結合して、ラクタム環を形成する。
一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１０８のグルカゴン関連ペプチド類似体を含み、ここで、ペプチドは、１２位および１６位のアミノ酸の間、または１６位および２０位のアミノ酸の間に形成された分子内ラクタム架橋を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１０８の配列を含み、ここで、分子内ラクタム架橋が、１２位および１６位のアミノ酸の間、１６位および２０位のアミノ酸の間または２０位および２４位のアミノ酸の間に形成され、２９位のアミノ酸が、グリシンであり、配列番号２９の配列が、配列番号１０８のＣ末端アミノ酸と連結している。さらなる実施形態では、２８位のアミノ酸は、アスパラギン酸である。
一部の具体的な実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分におけるアルファへリックス構造の安定化は、ラクタム架橋以外の分子内架橋の形成により達成される。例えば、適切な共有結合形成法は、オレフィンメタセシス、ランチオニンベースの環化、ジスルフィド架橋または改変硫黄含有架橋形成、α，ω−ジアミノアルカンテザーの使用、金属−原子架橋の形成の任意の１または複数を含み、ペプチド環化の他の手段を、アルファへリックスを安定化するために用いる。
さらに、ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、所望の活性を保持する位置に１または複数のα，α二置換されているアミノ酸を意図的に導入することにより、グルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分（アミノ酸１２〜２９のあたり）のアルファへリックスを安定化することにより達成してよい。このようなペプチドは、本明細書において、分子内架橋を欠くペプチドと考えてよい。一部の態様では、アルファへリックスの安定化は、塩橋または共有結合のような分子内架橋を導入することなく、この様式で達成される。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドの１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位または２９位の１、２、３、４つ以上が、α，α二置換されているアミノ酸で置換される。例えば、アミノイソ酪酸（ＡＩＢ）でのクラス３グルカゴン関連ペプチドの１６位の置換は、塩橋またはラクタムの非存在下でＧＬＰ−１活性を増進する。一部の実施形態では、１６位、２０位、２１位または２４位の１、２、３つ以上がＡＩＢで置換される。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増進は、２０位のアミノ酸改変により達成してよい。一部の実施形態では、２０位のグルタミンは、荷電されているかまたは水素結合する能力を有し、少なくとも約５（または約４〜６）原子の長さである別の親水性アミノ酸、例えばリシン、シトルリン、アルギニンまたはオルニチンで置き換えられる。
ＧＬＰ−１受容体での活性の増加は、配列番号７８のＣ末端の伸長を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドにおいて証明される。配列番号７８を含むこのようなクラス３グルカゴン関連ペプチドにおけるＧＬＰ−１活性は、本明細書に記載するように、１８位、２８位もしくは２９位、または１８位および２９位のアミノ酸を改変することによりさらに増加できる。ＧＬＰ−１有効性のさらなる適度な増加は、１０位のアミノ酸をＴｒｐに改変することにより達成してよい。
ＧＬＰ−１受容体活性を増加する改変の組合せは、単独で生じるこのような改変のいずれよりも高いＧＬＰ−１活性をもたらし得る。例えば、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、１６位、２０位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができ、１６位および２０位のアミノ酸の間に共有結合を有してもよいか；１６位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができるか、１６位および２０位に改変を含むことができるか；１６位および２０位に改変を含むことができ、１６位および２０位のアミノ酸の間に共有結合を有してもよいか；または２０位およびＣ末端カルボン酸基に改変を含むことができ；ただし、１２位のアミノ酸がＡｒｇではなくてもよいか；もしくはただし、９位のアミノ酸がＧｌｕではなくてもよい。
溶解性に影響する改変
親水性部分の付加
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持しながら、生理的ｐＨの水溶液中のペプチドの溶解性および安定性を改善するように、さらに改変できる。本明細書で論じる親水性部分は、本明細書でさらに論じるようにしてクラス３グルカゴン関連ペプチドに結合できる。一部の実施形態によると、配列番号９７または配列番号９８を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドの１７位、２１位および２４位での親水性基の導入は、生理的ｐＨの溶液中の高い有効性のグルカゴン類似体の溶解性および安定性を改善することが予想される。このような基の導入は、例えば循環中の半減期の延長により測定されるように、作用の期間も増加する。
一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６および配列番号１０７からなる群から選択される配列を含み、ここで、前記クラス３グルカゴン関連ペプチドの１６位、１７位、２１位または２４位のうちの１つのアミノ酸残基の側鎖は、約５００〜約４０，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有するポリエチレングリコール鎖をさらに含む。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される分子量を有する。別の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの分子量を有する。さらに他の例示的な実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約２０，０００〜約４０，０００ダルトンの分子量を有する。一部の実施形態によると、親水性基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を含む。より具体的には、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号９４または配列番号９５の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、クラス３グルカゴン関連ペプチドの２１位および２４位に存在するアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、クラス３グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、カルボン酸基を有する。一部の実施形態によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。
一部の実施形態によると、ｐｅｇ化クラス３グルカゴン関連ペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドと共有結合した２つ以上のポリエチレングリコール鎖を含み、ここで、グルカゴン鎖の全分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴンアゴニストは、配列番号９３からなるペプチドまたは配列番号９３のグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、２１位および２４位にてアミノ酸残基と共有的に連結し、２つのＰＥＧ鎖の組合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
荷電Ｃ末端
配列番号２０を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドの溶解性は、例えば、配列番号１０８のグルカゴン関連ペプチドのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することによりさらに改善できる。このような荷電アミノ酸は、例えば２８位もしくは２９位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または例えば２７位、２８位もしくは２９位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全てが負に荷電されている。グルカゴン活性をまだ保持できるようなさらなる改変、例えば保存的置換をクラス３グルカゴン関連ペプチドに作製してよい。一部の実施形態では、配列番号１０８のクラス３グルカゴン関連ペプチドの類似体であって、１７位〜２６位の１〜２アミノ酸置換が配列番号１０８と異なり、一部の実施形態では、２０位のアミノ酸置換が配列番号１０８のペプチドと異なる類似体が提供される。
アシル化／アルキル化
一部の実施形態によると、グルカゴン関連ペプチドは、アシルまたはアルキル基、例えばＣ４−Ｃ３０アシルまたはアルキル基を含むように改変される。一部の実施形態では、本発明は、グルカゴン関連ペプチドの１０位のアミノ酸と共有的に連結したアシル基またはアルキル基を含むように改変されたクラス３グルカゴン関連ペプチドを提供する。グルカゴン関連ペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドの１０位のアミノ酸とアシル基またはアルキル基との間にスペーサーをさらに含んでよい。上記のクラス３グルカゴン関連ペプチドのいずれも、２個のアシル基もしくは２個のアルキル基またはそれらの組合せを含んでよい。本発明の具体的な態様では、アシル化クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５３４〜５４４および５４６〜５４９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
Ｃ末端短縮
一部の実施形態では、本明細書に記載するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体での活性および／または有効性に影響することなく、グルカゴンペプチドのＣ末端（すなわち２９位および／または２８位）の１または２個のアミノ酸の短縮または欠失によりさらに改変される。この点で、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載する１または複数の改変を含んでいてもよい、天然グルカゴンペプチド（配列番号１）のアミノ酸１〜２７または１〜２８を含むことができる。一部の実施形態では、短縮されたクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５５０または配列番号５５１を含む。別の実施形態では、短縮されたグルカゴンアゴニストペプチドは、配列番号５５２または配列番号５５３を含む。
Ｃ末端伸長
一部の実施形態によると、本明細書に開示するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのカルボキシ末端に第２のペプチド、例えば配列番号７８、配列番号１１７または配列番号１１８を付加することにより改変される。一部の実施形態では、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号６９からなる群から選択される配列を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、第２のペプチドと結合したペプチドに共有結合し、ここで、第２のペプチドは、配列番号７８、配列番号１１７および配列番号１１８からなる群から選択される配列を含む。さらなる実施形態では、Ｃ末端伸長を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドにおいて、天然グルカゴン関連ペプチドの２９位のトレオニンは、グリシンで置き換えられている。２９位のトレオニンについてグリシン置換を有し、配列番号７８のカルボキシ末端伸長を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７８のカルボキシ末端伸長を含むように改変された天然グルカゴンよりもＧＬＰ−１受容体にて４倍有効である。ＧＬＰ−１受容体での有効性は、１８位の天然アルギニンについてのアラニン置換によりさらに増進できる。
したがって、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１１７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号１１８のカルボキシ末端伸長を有することができる。一部の実施形態によると、配列番号８１または配列番号１０８を含むクラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号１１７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号１１８のアミノ酸配列をさらに含む。より具体的には、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号１１７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号１１８のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２および配列番号１０３からなる群から選択される配列を含む。より具体的には、グルカゴン関連ペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号７８（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）または配列番号７９のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号７２および配列番号１２０からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１２１の配列を含む。
グルカゴン受容体活性を増加または減少し、ＧＬＰ−１受容体活性を増加するクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して上記するいずれの改変も、個別にまたは組合せで用いることができる。例示的な改変は、それらに限定されないが、以下を含む。
（Ａ）例えば天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することによる、溶解性の改善。このような荷電アミノ酸は、例えば２８位もしくは２９位にて天然アミノ酸を荷電アミノ酸で置換することにより、または２７位、２８位もしくは２９位の後へ荷電アミノ酸を付加することにより導入できる。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。他の実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、正に荷電されている。このような改変は、溶解性を増加し、例えば、約５．５から８の間の与えられたｐＨ、例えばｐＨ７にて、２５℃にて２４時間後に測定した場合に、天然グルカゴンと比べて少なくとも２倍、５倍、１０倍、１５倍、２５倍、３０倍以上大きい溶解性をもたらす。
（Ｂ）本明細書に記載するように、ポリエチレングリコール鎖のような親水性部分を例えばペプチドの１６位、１７位、２０位、２１位、２４位もしくは２９位またはＣ末端アミノ酸に付加することによる、溶解性および作用の期間または循環中の半減期の増加。
（Ｃ）例えば欠失、またはグルタミン酸、ホモグルタミン酸、システイン酸もしくはホモシステイン酸での置換による１５位のアスパラギン酸の改変による、安定性の増加。このような改変は、５．５〜８の範囲内のｐＨにて、特に酸性またはアルカリ性の緩衝液中での分解または切断を低減でき、例えば、２５℃にて２４時間後に元のペプチドの少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を保持する。
（Ｄ）例えばロイシンまたはノルロイシンでの置換による２７位のメチオニンの改変による、安定性の増加。このような改変は、酸化分解を低減できる。安定性は、２０位または２４位のＧｌｎの改変により、例えばＳｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｌａまたはＡＩＢでの置換により増加することもできる。このような改変は、Ｇｌｎの脱アミドにより生じる分解を低減できる。安定性は、２１位のＡｓｐの改変により、例えばＧｌｕでの置換により増加できる。このような改変は、Ａｓｐが脱水して環状スクシンイミド中間体を形成した後にイソアスパルテートに異性化することにより生じる分解を低減できる。
（Ｅ）２位のアミノ酸の、Ｎ−メチル−アラニンでの改変を含む、１位または２位のアミノ酸の、本明細書に記載するＤＰＰ−ＩＶ耐性アミノ酸での改変による、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）切断に対する耐性の増加。
（Ｆ）活性に影響しない保存的もしくは非保存的置換、付加または欠失、例えば２位、５位、７位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位、２７位、２８位もしくは２９位の１もしくは複数での保存的置換、２７位、２８位もしくは２９位の１もしくは複数での欠失、またはＣ末端カルボン酸基の代わりのＣ末端アミドもしくはエステルと組み合わせてもよい、アミノ酸２９の欠失。
（Ｇ）本明細書に記載するようなＣ末端伸長の付加。
（Ｈ）例えば本明細書に記載するようなグルカゴン関連ペプチドのアシル化またはアルキル化による、循環中の半減期の増加および／または作用の期間の延長および／または作用の開始の遅延。
（Ｉ）本明細書に記載するようなホモ二量体化またはヘテロ二量体化。
他の改変は、１位のＨｉｓの、大きい芳香族アミノ酸（例えばＴｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐまたはアミノ−Ｐｈｅ）での置換、２位のＳｅｒのＡｌａでの置換、１０位のＴｙｒの、ＶａｌまたはＰｈｅでの置換、１２位のＬｙｓのＡｒｇでの置換、１５位のＡｓｐのＧｌｕでの置換、１６位のＳｅｒのＴｈｒまたはＡＩＢでの置換を含む。
１位のＨｉｓの、大きい芳香族アミノ酸（例えばＴｙｒ）での非保存的置換を含む、ＧＬＰ−１活性を有するクラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１活性を保持でき、ただし、アルファへリックスは分子内架橋、例えば本明細書に記載するものにより安定化される。
コンジュゲートおよび融合体
クラス３グルカゴン関連ペプチドは、コンジュゲート部分と連結でき、共有結合またはリンカーを用いてもよい。クラス３グルカゴン関連ペプチドは、融合ペプチドまたはタンパク質の一部分であることができ、ここで、第２のペプチドまたはポリペプチドは、クラス３グルカゴン関連ペプチドの末端、例えばカルボキシ末端に融合されている。より具体的には、融合クラス３グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と連結した配列番号７８（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号１１７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号１１８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列をさらに含む、配列番号７２、配列番号９７または配列番号９８のグルカゴンアゴニストを含んでよい。一部の実施形態では、配列番号７８（ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ）、配列番号１１７（ＫＲＮＲＮＮＩＡ）または配列番号１１８（ＫＲＮＲ）のアミノ酸配列は、ペプチド結合によりクラス３グルカゴン関連ペプチドのアミノ酸２９と結合する。出願人らは、エキセンジン−４のＣ末端伸長ペプチド（例えば配列番号７８または配列番号７９）を含むクラス３グルカゴン関連ペプチド融合ペプチドにおいて、２９位での天然トレオニン残基のグリシンでの置換がＧＬＰ−１受容体活性を劇的に増加することを発見した。このアミノ酸置換は、ＧＬＰ−１受容体についてのグルカゴン類似体の親和性を増進するためのクラス３グルカゴン関連ペプチドに関して本明細書に開示する他の改変と共に用いることができる。例えば、Ｔ２９Ｇ置換は、Ｓ１６ＥおよびＮ２０Ｋアミノ酸置換と組み合わせることができ、アミノ酸１６と２０の間のラクタム架橋と組み合わせてもよく、本明細書に記載するようなＰＥＧ鎖の付加と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１２１の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン融合ペプチドのクラス３グルカゴン関連ペプチド部分は、配列番号７２、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２および配列番号９３からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、１７位、２１位、２４位もしくはＣ末端アミノ酸、または２１位および２４位の両方に存在する場合、５００〜４０，０００ダルトンの範囲から選択される。より具体的には、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドセグメントは、配列番号９５、配列番号９６および配列番号１２２からなる群から選択され、ここで、ＰＥＧ鎖は、５００〜５，０００の範囲から選択される。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７２および配列番号８０の配列を含む融合ペプチドであり、ここで、配列番号８０のペプチドは、配列番号７２のカルボキシ末端と連結している。
一部の実施形態によると、配列番号９８のクラス３グルカゴン関連ペプチドのさらなる化学改変は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体での相対活性が本質的に等しくなる点までのＧＬＰ−１受容体の有効性の増加を授ける。したがって、一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、天然アミノ酸に存在するカルボン酸基の代わりにアミド基を含む末端アミノ酸を含む。グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体それぞれでのクラス３グルカゴン関連ペプチドの相対活性は、グルカゴン受容体にて天然グルカゴンの活性の約４０％〜約５００％以上およびＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の約２０％〜約２００％以上、例えばＧＬＰ−１受容体でのグルカゴンの通常の活性と比べて５０倍、１００倍以上の増加を示す類似体を生成するようなクラス３グルカゴン関連ペプチドに対するさらなる改変により調整できる。
例示的な実施形態
一部の実施形態によると、配列番号７２の配列を含むグルカゴン類似体であって、前記類似体が、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位、２４位、２７位、２８位および２９位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号７２と異なり、前記グルカゴン関連ペプチドが、ＧＬＰ−１受容体にて天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を示すグルカゴン類似体が提供される。
一部の実施形態によると、配列：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８１）（ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位または２８位のいずれかは、Ｌｙｓである）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号８１の配列を含み、ここで、２８位のアミノ酸は、アスパラギン酸であり、２９位のアミノ酸は、グルタミン酸である。別の実施形態では、２８位のアミノ酸は、天然アスパラギンであり、２９位のアミノ酸は、グリシンであり、配列番号７９または配列番号８０のアミノ酸配列は、配列番号８１のカルボキシ末端と共有的に連結している。
一部の実施形態では、配列番号８１の配列を含む共同アゴニストであって、さらなる酸性アミノ酸がペプチドのカルボキシ末端に付加されている共同アゴニストが提供される。さらなる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。一部の実施形態では、グルカゴン類似体は、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７および配列番号８８からなる群から選択される配列を含む。
一部の実施形態によると、配列番号８１のグルカゴン関連ペプチド類似体であって、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位および２７位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号８１と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリシンであるかまたはラクタム架橋が２４位のアミノ酸と２０位または２８位のいずれかのアミノ酸との間に形成されるグルカゴンペプチド類似体が提供される。一部の実施形態によると、類似体は、１位、２位、３位、２１位および２７位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号８１と異なる。一部の実施形態では、配列番号８１のグルカゴンペプチド類似体は、１位、２位、３位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位および２７位から選択される１〜２アミノ酸が、または一部の実施形態では、単一アミノ酸が該配列と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位がリシンであるかまたはラクタム架橋が２４位のアミノ酸と２０位または２８位のいずれかのアミノ酸との間に形成される。
別の実施形態によると、配列ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８３）（ここで、３位のＸａａは、Ｇｌｕ、ＯｒｎまたはＮｌｅからなるアミノ酸の群から選択され、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒ、Ｇｌｙまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号７８または配列番号７９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである）を含む比較的選択的なＧＬＰ−１受容体アゴニストが提供される。一部の実施形態では、３位のアミノ酸は、グルタミン酸である。一部の実施形態では、２８位および／または２９位で置換する酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
一部の実施形態では、共同アゴニストペプチドを含むグルカゴン関連ペプチドは、ペプチドのカルボキシ末端に付加されたさらなる酸性アミノ酸をさらに含む配列番号８１の配列を含む。さらなる実施形態では、グルカゴン類似体のカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミドを有する。
一部の実施形態によると：
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号８１）（ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位のＸａａは、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、ＡｓｐまたはＬｙｓであり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ２であり、２９位のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ２、配列番号７８または配列番号７９であるが、但し、１６位がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである）からなる群から選択される改変グルカゴン関連ペプチドを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ２であり、１５位のＸａａは、Ａｓｐであり、１６位のＸａａは、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸およびホモシステイン酸からなるアミノ酸の群から選択され、２０位および２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒである。一部の実施形態では、１５位および１６位のＸａａは、それぞれＧｌｕであり、２０位および２４位のＸａａは、それぞれＧｌｎであり、２８位のＸａａは、ＡｓｎまたはＡｓｐであり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒであり、Ｒは、ＣＯＮＨ２である。
天然グルカゴンペプチドのある特定の位置は、親のペプチドの活性の少なくともいくらかを保持したまま改変できることが報告されている。したがって、出願人らは、配列番号９９のペプチドの２位、５位、７位、１０位、１１位、１２位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２４位、２７位、２８位または２９位に位置するアミノ酸の１または複数を、天然グルカゴンペプチドに存在するものとは異なるアミノ酸で置換して、グルカゴン受容体での活性をまだ保持できると予想する。一部の実施形態では、天然ペプチドの２７位に存在するメチオニン残基をロイシンまたはノルロイシンに変更して、ペプチドの酸化分解を妨げる。別の実施形態では、２０位のアミノ酸をＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎもしくはシトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｅｎｅ）で置換し、かつ／または２１位をＧｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸で置換する。
一部の実施形態では、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２１位、２７位、２８位または２９位から選択される１〜６アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なるが、但し、１６位のアミノ酸がセリンである場合、２０位はＬｙｓであるか、または１６位がセリンである場合、２４位はＧｌｕであり、２０位もしくは２８位のいずれかはＬｙｓである配列番号１０８のグルカゴン類似体が提供される。別の実施形態によると、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位、２８位または２９位から選択される１〜３アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なる配列番号１０８のグルカゴン類似体が提供される。別の実施形態では、類似体の１位、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位または２１位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なり、さらなる実施形態では、１〜２の異なるアミノ酸が、天然グルカゴン配列（配列番号７０１）に存在するアミノ酸と比べて保存的アミノ酸置換を示す、配列番号９６、配列番号９７または配列番号９９のグルカゴン類似体が提供される。一部の実施形態では、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位または２９位から選択される位置に１、２または３個のアミノ酸置換をさらに含む配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２または配列番号１０３のグルカゴンペプチドが提供される。一部の実施形態では、２位、５位、７位、１０位、１１位、１３位、１４位、１６位、１７位、１８位、１９位、２０位、２１位、２７位または２９位の置換は、保存的アミノ酸置換である。
一部の実施形態によると、配列番号８１の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントのそれぞれ１６位、１７位、１８位、２０位、２１位、２３位、２４位、２７位、２８位および２９位から選択される１〜１０アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態によると、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３、Ａｌａ２４、Ｖａｌ２７およびＧｌｙ２９からなる群から選択される１または複数のアミノ酸置換が配列番号８１と異なる配列番号８１の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、配列番号８１の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントの１７〜２６位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態によると、Ｇｌｎ１７、Ａｌａ１８、Ｇｌｕ２１、Ｉｌｅ２３およびＡｌａ２４からなる群から選択されるアミノ酸置換が配列番号８１と異なる配列番号８１の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、１８位のアミノ酸置換が配列番号８１と異なり、置換アミノ酸が、Ａｌａ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＧｌｙからなる群から選択される、配列番号８１の配列のバリアントが提供される。一部の実施形態によると、１８位のＡｌａのアミノ酸置換が配列番号８１と異なる配列番号８１の配列のバリアントが提供される。このような変動は、配列番号７２に包含される。別の実施形態では、配列番号８１の配列のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントの１７〜２２位から選択される１〜２アミノ酸が配列番号７０１の対応するアミノ酸と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供され、さらなる実施形態では、２０位および２１位の１または２のアミノ酸置換が配列番号８１と異なる配列番号８１のバリアントが提供される。
一部の実施形態によると、配列：
ＮＨ２−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１２３）（ここで、１５位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、１６位のＸａａは、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２０位のＸａａは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンであり、２１位のＸａａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ホモグルタミン酸またはホモシステイン酸であり、２４位のＸａａは、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、２８位のＸａａは、Ａｓｎ、Ｌｙｓまたは酸性アミノ酸であり、２９位のＸａａは、Ｔｈｒまたは酸性アミノ酸であり、Ｒは、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である）を含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ2である。一部の実施形態によると、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１１４、配列番号１１５または配列番号１１６のバリアントを含むグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストであって、バリアントが、２０位のアミノ酸置換が前記配列と異なるグルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、２０位についてＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎまたはシトルリンからなる群から選択される。
一部の実施形態では、配列番号８２の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、類似体が、２位にセリン以外のアミノ酸を有することが配列番号８２と異なるグルカゴンアゴニストが提供される。一部の実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸、Ｄ−アラニンで置換され、一部の実施形態では、セリン残基は、アミノイソ酪酸で置換される。このような改変は、親の化合物の固有の有効性を保持しながら（例えば親の化合物の有効性の少なくとも７５、８０、８５、９０、９５％以上）ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断を抑制する。一部の実施形態では、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することにより、類似体の溶解性が増加する。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８位もしくは２９位の天然アミノ酸を置換する酸性アミノ酸、または配列番号８２のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示するグルカゴン類似体は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性を低減するために、１位または２位にてさらに改変される。一部の実施形態では、２位の置換が親の分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）の低減を示す配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２または配列番号１０３のグルカゴン類似体が提供される。より具体的には、一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、バリン、アミノｎ−酪酸、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、Ｄ−アラニン、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。別の実施形態では、類似体ペプチドの２位は、Ｄ−セリン、グリシン、Ｎ−メチルセリンおよびアミノイソ酪酸からなる群から選択されるアミノ酸で置換される。一部の実施形態では、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリンでない。一部の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１２７または配列番号１２８の配列を含む。
一部の実施形態では、１位の置換が親の分子と異なり、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性（すなわち耐性）の低減を示す配列番号９７、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２または配列番号１０３のグルカゴン類似体が提供される。より具体的には、類似体ペプチドの１位は、Ｄ−ヒスチジン、アルファ，アルファ−ジメチルイミダゾール酢酸（ＤＭＩＡ）、Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、イミダゾール酢酸、デサミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジンおよびホモヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸で置換される。別の実施形態では、配列番号８２の類似体ペプチドを含むグルカゴンアゴニストであって、類似体が、１位にヒスチジン以外のアミノ酸を有することが配列番号８２と異なるグルカゴンアゴニストが提供される。一部の実施形態では、天然グルカゴンのＣ末端部分、好ましくは２７位に対してＣ末端の位置に１、２、３個以上の荷電アミノ酸を導入することにより、類似体の溶解性が増加する。例示的な実施形態では、荷電アミノ酸の１、２、３個または全ては、負に荷電されている。別の実施形態では、類似体は、２８位もしくは２９位の天然アミノ酸を置換する酸性アミノ酸、または配列番号８２のペプチドのカルボキシ末端に付加された酸性アミノ酸をさらに含む。一部の実施形態では、酸性アミノ酸は、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、１アミノ酸、または配列番号７８、配列番号１１７および配列番号１１８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長をさらに含む配列番号１０８の配列を含む。単一アミノ酸が配列番号１０８のカルボキシ末端に付加される実施形態では、アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸の１個から典型的に選択され、一部の実施形態では、さらなるカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、さらなるアミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択される。
代替の実施形態では、ペプチドが、グルタミン酸残基およびリシン残基の側鎖の間に形成された少なくとも１つのラクタム環を含み、グルタミン酸残基とリシン残基とが、３アミノ酸離れている、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、ラクタム保有グルカゴンペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。より具体的には、一部の実施形態では、
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１０９）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１１０）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１１１）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−Ｒ（配列番号１１２）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１０４）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１０５）
ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｒ（配列番号１０６）
（ここで、２８位のＸａａ＝ＡｓｐまたはＡｓｎ、２９位のＸａａは、ＴｈｒまたはＧｌｙであり、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシン、配列番号７８、配列番号１１７および配列番号１１８からなる群から選択され、ラクタム架橋は、配列番号１０９について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間、配列番号１１０について１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間、配列番号１１１について２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号１１２について２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、配列番号１０４について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間および２０位のＬｙｓと２４位のＧｌｕの間、配列番号１０５について１２位のＬｙｓと１６位のＧｌｕの間および２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間、ならびに配列番号１０６について１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間および２４位のＧｌｕと２８位のＬｙｓの間に形成される）からなる群から選択される改変グルカゴンペプチドを含むグルカゴンおよびＧＬＰ−１共同アゴニストが提供される。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ2、グルタミン酸、アスパラギン酸、グリシンからなる群から選択され、２８位のアミノ酸は、Ａｓｎであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。一部の実施形態では、Ｒは、ＣＯＮＨ2であり、２８位のアミノ酸は、Ａｓｎであり、２９位のアミノ酸は、トレオニンである。別の実施形態では、Ｒは、配列番号７８、配列番号７９および配列番号８０からなる群から選択され、２９位のアミノ酸は、グリシンである。
さらなる実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５および配列番号１０６からなる群から選択され、ここで、ペプチドは、１アミノ酸、または配列番号７８、配列番号１１７および配列番号１１８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長をさらに含む。一部の実施形態では、末端伸長は、配列番号７８、配列番号７９または配列番号８０の配列を含み、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７２の配列を含む。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号８１の配列を含み、ここで、１６位のアミノ酸は、グルタミン酸であり、２０位のアミノ酸は、リシンであり、２８位のアミノ酸は、アスパラギンであり、配列番号７８または配列番号７９のアミノ酸配列は、配列番号８１のカルボキシ末端と連結されている。
単一アミノ酸が配列番号１０８のカルボキシ末端に付加される実施形態では、アミノ酸は、２０個の一般的なアミノ酸の１個から典型的に選択され、一部の実施形態では、アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、さらなるアミノ酸は、グルタミン酸およびアスパラギン酸およびグリシンからなる群から選択される。グルカゴンアゴニスト類似体がカルボキシ末端伸長をさらに含む実施形態では、伸長のカルボキシ末端アミノ酸は、一部の実施形態では、カルボン酸ではなくアミド基またはエステル基で終結する。
別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列：ＮＨ2−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｘａａ−ＣＯＮＨ2（配列番号１０７）（ここで、３０位のＸａａは、任意のアミノ酸を表す）を含む。一部の実施形態では、Ｘａａは、２０個の一般的なアミノ酸の１個から選択され、一部の実施形態では、アミノ酸は、グルタミン酸、アスパラギン酸またはグリシンである。このペプチドの溶解性は、配列番号１０７の１７位、２１位、２４位または３０位のアミノ酸の側鎖にＰＥＧ鎖を共有的に連結することにより、さらに改善できる。さらなる実施形態では、ペプチドは、配列番号７８、配列番号１１７および配列番号１１８からなる群から選択されるペプチドのさらなるカルボキシ末端伸長を含む。一部の実施形態によると、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号１２９、配列番号１３０および配列番号１３１の配列を含む。
配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号１２１のグルカゴンの内部のさらなる部位特異的改変を行って、様々な程度のＧＬＰ−１アゴニズムを有する一連のグルカゴンアゴニストを得ることができる。したがって、各受容体にて本質的に同一のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を有するペプチドを調製して、特徴決定した。同様に、２つの受容体のそれぞれで１０倍選択的に有効性が増進したペプチドを同定して、特徴決定した。上記のように、１６位のセリン残基のグルタミン酸への置換は、グルカゴンおよびＧＬＰ−１受容体の両方での天然グルカゴンの有効性を増進するが、グルカゴン受容体についておよそ１０倍の選択性を維持する。さらに、３位の天然グルタミンのグルタミン酸（配列番号１２８）への置換により、ＧＬＰ−１受容体についておよそ１０倍の選択性を示すグルカゴン類似体が得られる。
グルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストペプチドの溶解性は、ペプチドの１６位、１７位、２１位および２４位での親水性基の導入により、またはグルカゴン／ＧＬＰ−１共同アゴニストペプチドのカルボキシ末端での単一改変アミノ酸（すなわち親水性基を含むように改変されたアミノ酸）の付加により、天然グルカゴンと比べて高い生物活性を保持しながら、生理的ｐＨの水溶液中でさらに増進できる。一部の実施形態によると、親水性基は、ポリエチレン（ＰＥＧ）鎖を含む。より具体的には、一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５または配列番号１０６の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１６位、１７位、２１位、２４位、２９位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結しているが、但し、ペプチドが配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７位、２１位または２４位のアミノ酸残基と共有結合し、ペプチドが配列番号１０２または配列番号１０３を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１６位、１７位または２１位のアミノ酸残基と共有結合し、ペプチドが配列番号１０４、配列番号１０５または配列番号１０６を含む場合、ポリエチレングリコール鎖は、１７位または２１位のアミノ酸残基と共有結合する。
一部の実施形態では、グルカゴンペプチドは、配列番号９９、配列番号１００または配列番号１０１の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７位、２１位、２４位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結し、ペプチドのカルボキシ末端アミノ酸は、天然アミノ酸のカルボン酸基の代わりにアミド基を有する。一部の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストペプチドは、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６および配列番号１０７からなる群から選択される配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの配列番号１００、配列番号１０１および配列番号１０７の１７位、２１位もしくは２４位、または配列番号１０２および配列番号１０３の１６位、１７位もしくは２１位、または配列番号１０４、配列番号１０５および配列番号１０６の１７位もしくは２１位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結している。別の実施形態では、グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストペプチドは、配列番号９９または配列番号１０７の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴンペプチドの１７位、２１位もしくは２４位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結している。
一部の実施形態では、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６および配列番号１０７からなる群から選択されるグルカゴンペプチドは、グルカゴンペプチドの１７位または２１位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結したＰＥＧ鎖を含むようにさらに改変される。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴン／ＧＬＰ−１受容体共同アゴニストは、配列番号７８、配列番号１１７または配列番号７９の配列をさらに含む。
別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７２または配列番号１２０のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号７８、配列番号７９または配列番号８０のＣ末端伸長をさらに含み、ペプチドの１７位、１８位、２１位、２４位もしくは２９位のアミノ酸の側鎖またはＣ末端アミノ酸と共有的に連結したＰＥＧ鎖をさらに含んでもよい配列番号７２または配列番号１２０の配列を含む。別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７２または配列番号１２０の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴン関連ペプチドの２１位または２４位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、ペプチドは、配列番号７８または配列番号７９のＣ末端伸長をさらに含む。
別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号７２または配列番号８１または配列番号８２の配列を含み、ここで、さらなるアミノ酸は、配列番号８１または配列番号８２のカルボキシ末端に付加され、ＰＥＧ鎖は、付加されたアミノ酸の側鎖と共有的に連結している。さらなる実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴン類似体は、配列番号８１または配列番号８２のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号７８または配列番号７９のＣ末端伸長をさらに含む。別の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１０７の配列を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、グルカゴン関連ペプチドの３０位のアミノ酸の側鎖と共有的に連結し、ペプチドは、配列番号１０７のＣ末端アミノ酸と連結した配列番号７８または配列番号７９のＣ末端伸長をさらに含む。
ポリエチレングリコール鎖は、直鎖の形であってよいか、または分岐状であってよい。一部の実施形態によると、ポリエチレングリコール鎖は、約５００〜約１０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１，０００〜約５，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。代替の実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、約１０，０００〜約２０，０００ダルトンの範囲から選択される平均分子量を有する。一部の実施形態によると、ｐｅｇ化グルカゴン関連ペプチドは、グルカゴン関連ペプチドと共有的に結合した２個以上のポリエチレングリコール鎖を含み、ここで、グルカゴン鎖の全分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。一部の実施形態では、ｐｅｇ化グルカゴンアゴニストは、配列番号９３からなるペプチドまたは配列番号９３のグルカゴンアゴニスト類似体を含み、ここで、ＰＥＧ鎖は、２１位および２４位にてアミノ酸残基と共有的に連結し、２つのＰＥＧ鎖の組合わせた分子量は、約１，０００〜約５，０００ダルトンである。
ある特定の例示的な実施形態では、グルカゴンペプチドは、１０個までのアミノ酸改変を有する配列番号７０１のアミノ酸配列を含み、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含む。一部の実施形態では、１０位のアミノ酸は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸でアシル化またはアルキル化されている。ある特定の態様では、１０位のアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシル基またはアルキル基を含む。
ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含むグルカゴンペプチドは、安定化されたアルファへリックスを含む。したがって、ある特定の態様では、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基と、ｉ位のアミノ酸およびｉ＋４位のアミノ酸（ここで、ｉは、１２、１６、２０または２４である）の側鎖の間に分子内架橋、例えば共有的分子内架橋（例えばラクタム架橋）とを含む。あるいはまたはさらに、グルカゴンペプチドは、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基を含み、グルカゴンペプチドの１６位、２０位、２１位および／または２４位の１、２、３個以上は、α，α二置換されているアミノ酸、例えばＡＩＢで置換されている。一部の場合では、非天然グルカゴンペプチドは、１６位にてＧｌｕおよび２０位にてＬｙｓを含み、ラクタム架橋が、ＧｌｕとＬｙｓを連結してもよく、グルカゴンペプチドが、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅおよび２４位のＡｌａからなる群から選択される１または複数の改変をさらに含んでもよい。
また、グルカゴン関連ペプチドがアシル化またはアルキル化されたアミノ酸を１０位に含む任意の実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドをさらに含むことができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載するアシルまたはアルキル基を含むグルカゴン関連ペプチドは、１位、２位または１位および２位にアミノ酸置換をさらに含み、ここで、アミノ酸置換は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。ある特定の具体的な実施形態では、グルカゴン関連ペプチドは、本明細書に記載するように１０位のアミノ酸がアシル化またはアルキル化された配列番号７２を含むものである。これらの実施形態のアシルまたはアルキル基は、本明細書に記載する任意のアシルまたはアルキル基であってよい。例えば、アシル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ８−Ｃ２４）脂肪酸アシル基であってよく、アルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ８−Ｃ２４）アルキル基であってよい。
アシルまたはアルキル基と結合したアミノ酸は、本明細書に記載する任意のアミノ酸、例えば式Ｉ（例えばＬｙｓ）、式ＩＩおよび式ＩＩＩのいずれかのアミノ酸であってよい。
一部の実施形態では、アシル基またはアルキル基は、１０位のアミノ酸に直接結合する。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えば３〜１０原子の長さであるスペーサー、例えばアミノ酸またはジペプチドを介して１０位のアミノ酸に結合する。アシルまたはアルキル基の結合の目的のために適切なスペーサーは、本明細書に記載する。
ある特定の態様では、グルカゴン類似体は、少なくとも１個のアミノ酸改変であって１５個までのアミノ酸改変（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個のアミノ酸改変）、または１０個までのアミノ酸改変を含む。ある特定の実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸改変および１０個までのアミノ酸改変を含む類似体は、保存的アミノ酸改変を表す。保存的アミノ酸改変は、本明細書に記載する。
したがって、一部の態様では、グルカゴン類似体は、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅおよび２４位のＡｌａもしくはＣｙｓまたはそれらの保存的アミノ酸置換の１または複数を有する配列番号７０１のアミノ酸配列を含む。一部の態様では、類似体は、Ｃ末端アルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミドを含む。ある特定の実施形態では、類似体は、１位、２位または１位および２位のアミノ酸置換を含み、該置換は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を達成する。適切なアミノ酸置換は、本明細書に記載する。例えば、１位のＤＭＩＡおよび／または２位のｄ−ＳｅｒもしくはＡＩＢである。一部の実施形態では、２位のアミノ酸は、Ｄ−セリンでない。
さらに、またはあるいは、類似体は、（ａ）Ａｌａで置換されている２位のＳｅｒ、（ｂ）Ｇｌｕまたはグルタミン類似体で置換されている３位のＧｌｎ、（３）Ｉｌｅで置換されている７位のＴｈｒ、（ｄ）Ｔｒｐ、または天然に存在するアミノ酸に非天然であるアシル基もしくはアルキル基を含むアミノ酸で置換されている１０位のＴｙｒ、（ｅ）Ｉｌｅで置換されている１２位のＬｙｓ、（ｆ）Ｇｌｕで置換されている１５位のＡｓｐ、（ｇ）Ｇｌｕで置換されている１６位のＳｅｒ、（ｈ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２０位のＧｌｎ、（ｉ）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡＩＢで置換されている２４位のＧｌｎ、（ｊ）ＬｅｕまたはＮｌｅで置換されている２７位のＭｅｔ、（ｋ）荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＡｓｎ、および（ｌ）Ｇｌｙまたは荷電アミノ酸で置換され、ＡｓｐまたはＧｌｕで置換されていてもよい２９位のＴｈｒの１つまたは組み合わせを含むことができる。ある特定の態様では、類似体は、配列番号６５７〜６６９のいずれかのアミノ酸配列を含む。
ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体に関して、類似体は、１〜２１アミノ酸（例えば５〜１９、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長を含む。類似体の伸長は、伸長が１〜２１アミノ酸であれば、任意のアミノ酸配列を含んでよい。一部の態様では、伸長は、７〜１５アミノ酸であり、他の態様では、伸長は、９〜１２アミノ酸である。一部の実施形態では、伸長は、（ｉ）配列番号７８もしくは６７４のアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号７８もしくは６７４のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％）を有するアミノ酸配列、または（ｉｉｉ）１もしくは複数の保存的アミノ酸改変を有する（ｉ）もしくは（ｉｉ）のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、伸長のアミノ酸の少なくとも１つは、アシル化またはアルキル化されている。アシルまたはアルキル基を含むアミノ酸は、類似体の伸長のいずれの位置にあってもよい。ある特定の実施形態では、伸長のアシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の３７位、３８位、３９位、４０位、４１位または４２位（配列番号７０１のナンバリングによる）の１つにある。ある特定の実施形態では、アシル化またはアルキル化アミノ酸は、類似体の４０位にある。
例示的な実施形態では、アシルまたはアルキル基は、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基である。例えば、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）脂肪酸アシル基またはＣ４−Ｃ３０（例えばＣ１２−Ｃ１８）アルキルであってよい。アシルまたはアルキル基は、本明細書で論じるもののいずれかであってよい。
一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、アミノ酸に直接、例えばアミノ酸の側鎖を介して結合する。他の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー（例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサー）を介してアミノ酸に結合する。ある特定の態様では、スペーサーは、３〜１０原子の長さである。一部の実施形態では、アミノ酸スペーサーは、γ−Ｇｌｕでない。一部の実施形態では、ジペプチドスペーサーは、γ−Ｇｌｕ−γ−Ｇｌｕでない。
また、例示的な実施形態では、アシル基またはアルキル基が結合しているアミノ酸は、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩのアミノ酸などを含めた、本明細書に記載するもののいずれかであってよい。アシル化またはアルキル化されているアミノ酸は、Ｌｙｓなどであってよい。アシル基またはアルキル基を含む適切なアミノ酸、ならびに適切なアシル基、およびアルキル基は本明細書に記載するものである。例えば、「アシル化およびアルキル化」の表題のセクションの下の教示を参照されたい。
他の実施形態では、伸長のアミノ酸１〜６個（例えば、アミノ酸１〜２個、１〜３個、１〜４個、１〜５個）は、正に荷電しているアミノ酸、例えばＬｙｓなどの式ＩＶのアミノ酸である。本明細書で使用する「正に荷電しているアミノ酸」の語は、生理学的ｐＨでその側鎖の原子上に正の電荷を含む、天然に存在し、または天然に存在しない、あらゆるアミノ酸を意味する。ある特定の態様では、正に荷電しているアミノ酸は、３７、３８、３９、４０、４１、４２、および４３位のいずれかに位置する。特定の実施形態では、正に荷電しているアミノ酸は４０位に位置する。他の場合では、伸長は、本明細書に記載するようにアシル化またはアルキル化され、本明細書に記載するように１〜６個の正荷電アミノ酸を含む。
さらに他の実施形態では、ＧＩＰ受容体にてアゴニスト活性を示す類似体は、（ｉ）少なくとも１個のアミノ酸改変を有する配列番号７０１と、（ｉｉ）類似体の２９位のアミノ酸に対してＣ末端に１〜２１アミノ酸（例えば５〜１８、７〜１５、９〜１２アミノ酸）の伸長と、（ｉｉｉ）Ｃ末端伸長の外側（例えば１〜２９位のいずれか）にある、天然に存在するアミノ酸に対して非天然であるアシルまたはアルキル基を含むアミノ酸とを含む。一部の実施形態では、類似体は、１０位にアシル化またはアルキル化アミノ酸を含む。特定の態様では、アシルまたはアルキル基は、Ｃ４−Ｃ３０脂肪酸アシルまたはＣ４−Ｃ３０アルキル基である。一部の実施形態では、アシルまたはアルキル基は、スペーサー、例えばアミノ酸、ジペプチド、トリペプチド、親水性二官能性スペーサー、疎水性二官能性スペーサーを介して結合している。ある特定の態様では、類似体は、１６位のＧｌｕと２０位のＬｙｓの間の塩橋、または１６位、２０位、２１位および２４位の任意の１、２、３個以上のアルファ，アルファ二置換されているアミノ酸のようなアルファへリックスを安定化するアミノ酸改変を含む。具体的な態様では、類似体は、ＤＰＰ−ＩＶプロテアーゼ耐性を与えるアミノ酸改変、例えば１位にてＤＭＩＡ、２位にてＡＩＢをさらに含む。さらなるアミノ酸改変を含む類似体は、本明細書に包含される。一実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号６５７〜６６９のいずれかの構造を含む。
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、以下の改変：２位のＡＩＢ、３位のＧｌｕ、１０位のＬｙｓ、１６位のＧｌｕ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＬｙｓ、２１位のＧｌｕ、２３位のＩｌｅ、２４位のＡｌａを含む天然グルカゴンのアミノ酸配列（配列番号７０１）を含み、ここで、１０位のＬｙｓは、Ｃ１４またはＣ１６脂肪酸でアシル化され、Ｃ末端カルボキシレートは、アミドで置き換えられている。具体的な実施形態では、このクラス３グルカゴン関連ペプチドは、そのＮ末端アミノ酸を介してジペプチドＤ−Ｌｙｓ−サルコシンに結合する。
一部の実施形態によると、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニストおよび／またはグルカゴンアゴニスト活性を保持する１、２、３、４または５個までのさらなる改変を有してもよい配列番号５１４、５１７〜５３４または５５４のいずれかのアミノ酸配列を含むか、該アミノ酸配列から本質的になるか、または該アミノ酸配列からなる。ある特定の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号５６２〜６８４および１７０１〜１７７６のいずれかのアミノ酸を含む。一部の実施形態では、クラス３グルカゴン関連ペプチドは、配列番号１８０１〜１９０８のいずれかのアミノ酸配列を含む。
開示されるインクレチン−インスリンペプチドコンジュゲートは、体重を減少させる、または体重増加を防止するための使用などの、インスリンペプチドまたはグルカゴン関連ペプチドについて以前に記載されたあらゆる使用にとって好適であると考えられる。したがって、本明細書に記載のインクレチン−インスリンコンジュゲートを使用して、高血糖を処置する、または高血糖値をもたらす他の代謝性疾患を処置することができる。したがって、本発明は、高血糖値に罹患している患者の処置における使用のための、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を包含する。一実施形態によれば、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートを使用して処置される患者は家畜であり、別の実施形態では、処置される患者はヒトである。
本開示にしたがって高血糖を処置する１つの方法は、本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートを、静脈内、腹腔内、皮下もしくは筋肉内などの非経口、髄腔内、経皮、直腸、経口、経鼻または吸入などの、任意の標準的な投与経路を使用して患者に投与するステップを含む。一実施形態では、組成物は、皮下的または筋肉内的に投与される。一実施形態では、組成物は、非経口的に投与され、インクレチン−インスリンコンジュゲートは、注射筒の中に予め包装される。
本明細書に開示されるインクレチン−インスリンコンジュゲートを単独で、または他の抗糖尿病剤と組み合わせて投与してもよい。当分野において公知の、または治験中の抗糖尿病薬としては、天然インスリン、天然グルカゴンおよびその機能的類似体、スルホニル尿素、例えば、トルブタミド（Ｏｒｉｎａｓｅ）、アセトヘキサミド（Ｄｙｍｅｌｏｒ）、トラザミド（Ｔｏｌｉｎａｓｅ）、クロルプロパミド（Ｄｉａｂｉｎｅｓｅ）、グリピジド（Ｇｌｕｃｏｔｒｏｌ）、グリブリド（Ｄｉａｂｅｔａ、Ｍｉｃｒｏｎａｓｅ、Ｇｌｙｎａｓｅ）、グリメピリド（Ａｍａｒｙｌ）またはグリクラジド（Ｄｉａｍｉｃｒｏｎ）；メグリチニド、例えば、レパグリニド（Ｐｒａｎｄｉｎ）またはナテグリニド（Ｓｔａｒｌｉｘ）；ビグアナイド、例えば、メトホルミン（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ）またはフェンホルミン；チアゾリジンジオン、例えば、ロシグリタゾン（Ａｖａｎｄｉａ）、ピオグリタゾン（Ａｃｔｏｓ）もしくはトログリタゾン（Ｒｅｚｕｌｉｎ）または他のＰＰＡＲγインヒビター；炭水化物の消化を阻害するアルファグルコシダーゼインヒビター、例えば、ミグリトール（Ｇｌｙｓｅｔ）、アカルボース（Ｐｒｅｃｏｓｅ／Ｇｌｕｃｏｂａｙ）、エクセナチド（Ｂｙｅｔｔａ）またはプラムリンチド；ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）インヒビター、例えば、ビルダグリプチン、シタグリプチン；ＳＧＬＴ（ナトリウム依存性グルコース輸送体１）インヒビター；またはＦＢＰアーゼ（フルクトース１，６−ビスホスファターゼ）インヒビターが挙げられる。
本明細書に開示のインクレチン−インスリンコンジュゲートを含む医薬組成物は、標準的な薬学的に許容される担体および当業者に公知の投与経路を使用して製剤化でき、患者に投与することができる。したがって、本開示はまた、薬学的に許容される担体と共に、本明細書に開示される１もしくは複数のインクレチン−インスリンコンジュゲート、またはその薬学的に許容される塩を含む医薬組成物も包含する。一実施形態では、医薬組成物は、リン酸緩衝系中で約４．０〜約７．０のｐＨで１ｍｇ／ｍｌ濃度のインクレチン−インスリンコンジュゲートを含む。医薬組成物は、唯一の薬学的に活性な成分としてインクレチン−インスリンコンジュゲートを含んでもよいか、またはインクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドを１もしくは複数のさらなる活性薬剤と組み合わせることができる。
本明細書に記載される全ての治療方法、医薬組成物、キットおよび他の同様の実施形態は、インクレチン−インスリンコンジュゲートペプチドがその全ての薬学的に許容される塩を含むことを企図する。
一実施形態では、キットは、インクレチン−インスリンコンジュゲートを患者に投与するためのデバイスと共に提供される。キットは、様々な容器、例えば、バイアル、チューブ、ボトルなどをさらに含んでもよい。好ましくは、キットは、使用のための指示書も含む。一実施形態によれば、キットのデバイスは、組成物がエアロゾルデバイス内に予め包装されるエアロゾル分注デバイスである。別の実施形態では、キットは注射筒と針とを含み、一実施形態では、インクレチン−インスリンコンジュゲート組成物は、注射筒内に予め包装される。
本発明の化合物を、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技術、またはペプチドおよび融合タンパク質を調製する他の任意の方法により調製することができる。ある特定の非天然アミノ酸を標準的な組換えＤＮＡ技術によって発現させることはできないが、その調製のための技術は当業界で公知である。非ペプチド部分を包含する本発明の化合物を、適用可能な場合、標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成することができる。
インクレチンまたはインスリン受容体活性を増加または減少させる上記のインクレチンペプチドまたはインスリンペプチドに対する任意の改変を、個別に、または組み合わせて適用することができる。さらに、本明細書に開示されるそれぞれの直鎖スペーサーを、任意のインクレチンまたはインスリンと組み合わせて使用して、本開示によるインクレリンを形成させることができる。また、上記の任意の改変を、溶解度および／または安定性および／または作用持続時間の増大などの他の所望の特性を付与する他の改変と組み合わせることもできる。
（例１）
インスリンＡおよびＢ鎖の合成
インスリンＡおよびＢ鎖を、Ｂｏｃ化学を使用して４−メチルベンズヒドリル（ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｈｙｒｙｌ）アミン（ＭＢＨＡ）樹脂または４−ヒドロキシメチル−フェニルアセタミドメチル（ＰＡＭ）樹脂上で合成した。０℃で１時間、ＨＦ／ｐ−クレゾール９５：５を使用して、ペプチドを樹脂から切断した。ＨＦ除去およびエーテル沈降の後、ペプチドを５０％水性酢酸中に溶解し、凍結乾燥した。あるいは、ペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を使用して合成した。室温で２時間、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）／Ｈ2Ｏ（９５：２．５：２．５）を使用してペプチドを樹脂から切断した。過剰量のジエチルエーテルの添加によりペプチドを沈降させ、ペレットを水性酸性バッファー中で可溶化した。ＲＰ−ＨＰＬＣによりペプチドの品質をモニタリングし、質量分析（ＥＳＩまたはＭＡＬＤＩ）により確認した。
インスリンＡ鎖を、アセタミドメチルＡ−（ＳＨ）7（Ａｃｍ）6,11,20として保護されたアミノ酸７の単一の遊離システインおよび他の全てのシステインを用いて合成した。インスリンＢ鎖を、アセタミドメチルＢ−（ＳＨ）7（Ａｃｍ）19として保護された７位の単一の遊離システインおよび他のシステインを用いて合成した。粗ペプチドを、従来のＲＰ−ＨＰＬＣにより精製した。
合成されたＡおよびＢ鎖を、開示が参照により本明細書に援用されるＵＳ−２０１１−０２５７０７６に以前に開示されたその天然のジスルフィド結合連結により互いに連結した。それぞれのＢ鎖を、ＤＭＦまたはＤＭＳＯ中への溶解によってＣｙｓ７−Ｎｐｙｓ誘導体に活性化し、室温で、１：１のモル比で２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（Ｎｐｙｓ）と反応させた。活性化を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングし、生成物をＥＳＩ−ＭＳにより確認した。
最初のＢ７−Ａ７ジスルフィド結合を、１０ｍｇ／ｍｌの総ペプチド濃度への１：１のモル比でのそれぞれのＡ−（ＳＨ）7（Ａｃｍ）6,11,20およびＢ−（Ｎｐｙｓ）7（Ａｃｍ）19の溶解により形成させた。鎖組合せ反応が完了した時、混合物を５０％水性酢酸の濃度に希釈した。最後の２個のジスルフィド結合を、ヨウ素の添加によって同時に形成させた。４０倍モル過剰のヨウ素を溶液に添加し、混合物をさらなる時間にわたって室温で撹拌した。水性アスコルビン酸溶液の添加により、反応を終結させた。混合物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、最終化合物をＭＡＬＤＩ−ＭＳによって確認した。表１中のデータに示されるように、本手順にしたがって調製される合成インスリンは、インスリン受容体結合について精製されたインスリンと比較しても遜色がない。
また、改変されたアミノ酸（Ａ１９位の４−アミノフェニルアラニンなど）を含むインスリンペプチドを、例えば、米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号に教示されたシステムなどの、非コードアミノ酸のタンパク質への組み込みを可能にするシステムを使用してｉｎ ｖｉｖｏで合成することもできる。
表１:天然のインスリンと比較した、合成されたインスリンの活性
（例２）
還元的アルキル化によるアミン基（Ｎ−末端およびリシン）のペグ化
ａ．合成
１：２：３０のモル比の、インスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−アルデヒド、およびＮａＢＨ3ＣＮを、４．１〜４．４のｐＨの酢酸バッファー中に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ2ＣＯ3から構成されていた。インスリンペプチド濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応は、室温で６時間にわたって起こる。反応の程度を、ＲＰ−ＨＰＬＣによりモニタリングしたところ、反応の収率は約５０％であった。
ｂ．精製
反応混合物を、０．１％ＴＦＡを用いて２〜５倍希釈し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに適用した。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流量１０ｍｌ／分；Ａバッファー、水中の１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂバッファー、ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ；０〜４０％からの線形勾配Ｂ％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体は、約３５％のバッファーＢで溶出された。所望の化合物を、亜硫酸分解（ｓｕｌｆｔｏｌｙｓｉｓ）またはトリプシン分解による化学的改変後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検証した。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドアシル化によるアミン基（Ｎ末端およびリシン）のペグ化
ａ．合成
インスリン（またはインスリン類似体）を、ｍＰＥＧ２０ｋ−ＮＨＳと共に、０．１Ｎビシンバッファー（ｐＨ８．０）中に、１：１のモル比で溶解した。インスリンペプチド濃度は、約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応の進行を、ＨＰＬＣによってモニタリングした。反応の収率は、室温で２時間後に約９０％である。
ｂ．精製
反応混合物を、２〜５倍希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣにロードした。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流量１０ｍｌ／分；Ａバッファー、水中の１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂバッファー、ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ；０〜４０％からの線形勾配Ｂ％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体は、約３５％のＢで収集された。所望の化合物を、亜硫酸分解またはトリプシン分解による化学的改変後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検証した。
フェニルアラニンの芳香環上のアセチル基の還元的アミノ化されたペグ化
ａ．合成
１：２：２０のモル比のインスリン（またはインスリン類似体）、ｍＰＥＧ２０ｋ−ヒドラジド、およびＮａＢＨ3ＣＮを、酢酸バッファー（４．１〜４．４のｐＨ）中に溶解した。反応溶液は、０．１Ｎ ＮａＣｌ、０．２Ｎ酢酸および０．１Ｎ Ｎａ2ＣＯ3から構成されていた。インスリンまたはインスリン類似体の濃度は、室温で２４時間にわたって約０．５ｍｇ／ｍｌであった。反応プロセスを、ＨＰＬＣによりモニタリングした。反応物の変換は、約５０％（ＨＰＬＣにより算出）であった。
ｂ．精製
反応混合物を２〜５倍希釈し、ＲＰ−ＨＰＬＣにロードした。ＨＰＬＣ条件：Ｃ４カラム；流量１０ｍｌ／分；Ａバッファー、水中の１０％ＡＣＮおよび０．１％ＴＦＡ；Ｂバッファー、ＡＣＮ中の０．１％ＴＦＡ；０〜４０％からの線形勾配Ｂ％（０〜８０分）；ＰＥＧ−インスリンまたは類似体は、約３５％のＢで収集された。所望の化合物を、亜硫酸分解またはトリプシン分解による化学的改変後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって検証した。
（例３）
インクレチンの一般的な合成プロトコール：
グルカゴン類似体を、改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ ４３０ Ａペプチド合成装置上で、０．２ｍｍｏｌのＢｏｃ Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）Ｐａｍ樹脂から出発するＨＢＴＵ活性化「Ｆａｓｔ Ｂｏｃ」シングルカップリングを使用して合成した。Ｂｏｃアミノ酸およびＨＢＴＵは、Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ）から取得した。使用した側鎖保護基は、Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｍ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｈｒ（ＯＢｚｌ）、Ｔｙｒ（２Ｂｒ−Ｚ）、およびＴｒｐ（ＣＨＯ）であった。Ｎ末端Ｈｉｓ上の側鎖保護基は、Ｂｏｃであった。
それぞれの完了したペプチジル樹脂を、ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液で処理して、トリプトファンからホルミル基を除去した。液体フッ化水素切断を、ｐ−クレゾールおよびジメチルスルフィドの存在下で実施した。切断を、ＨＦ装置（Ｐｅｎｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ）を使用して氷浴中で１時間実行した。ＨＦの蒸発後、残留物をジエチルエーテル中に懸濁し、固体材料を濾過した。それぞれのペプチドを、３０〜７０ｍｌの水性酢酸中に抽出し、希釈したアリコートを、ＨＰＬＣ［Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｇｏｌｄ、０．４６ｘ５ｃｍ Ｚｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５℃、２１４ｎｍ、Ａバッファー＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／９０％アセトニトリル、１０分にわたる１０％〜８０％のＢの勾配］により分析した。
２１４ｎｍでＵＶをモニタリングし、５分の画分を収集しながら、２．２ｘ２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８カラム上でのＦＰＬＣ上で精製を行った。均一な画分を合わせ、凍結乾燥したところ、９５％を超える生成物純度が得られた。正確な分子質量および純度を、ＭＡＬＤＩ−質量分析を使用して確認した。
（例４）
一般的なインクレチンペグ化プロトコール：（Ｃｙｓ−マレイミド）
典型的には、グルカゴンＣｙｓ類似体を、リン酸緩衝生理食塩水（５〜１０ｍｇ／ｍｌ）中に溶解し、０．０１Ｍエチレンジアミン四酢酸を添加する（全量の１０〜１５％）。過剰（２倍量）のマレイミドメトキシＰＥＧ試薬（Ｎｅｋｔａｒ）を添加し、ＨＰＬＣによって反応の進行をモニタリングしながら、反応物を室温で撹拌する。８〜２４時間後、反応混合物を酸性化し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリル勾配を使用する精製のために分取逆相カラム上にロードする。適切な画分を合わせ、凍結乾燥して、所望のペグ化された類似体を得る。
（例５）
グルカゴン−Ｃｅｘおよび他のＣ末端伸長類似体の合成
２８５ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、６０ｍｌの反応容器に入れ、以下の配列を入力し、ＦａｓｔＢｏｃ ＨＢＴＵ活性化シングルカップリングを使用して改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置上で実行した。
ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９４８）。以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｃｙｓ（ｐＭｅＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ）、Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）、Ｌｙｓ（２Ｃｌ−Ｚ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、およびＴｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。完了したペプチジル樹脂を、２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｔｒｐホルミル保護を除去した後、ＨＦ反応容器に移し、減圧下で乾燥した。１．０ｍｌのｐ−クレゾールおよび０．５ｍｌのジメチルスルフィドを、磁気撹拌棒と共に添加した。容器を、ＨＦ装置（Ｐｅｎｎｉｓｕｌａ Ｌａｂｓ）に結合し、ドライアイス／メタノール浴中で冷却し、排出させ、約１０ｍｌの液体フッ化水素を凝集させた。反応物を氷浴中で１時間撹拌した後、ＨＦを減圧下で除去した。残留物をエチルエーテル中に懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、５０ｍｌの水性酢酸中にペプチドを抽出した。分析的ＨＰＬＣを、切断抽出物のアリコート上で実行した［０．４６ｘ５ｃｍのＺｏｒｂａｘ Ｃ８、１ｍｌ／分、４５℃、２１４ｎｍ、０．１％ＴＦＡのＡバッファー、０．１％ＴＦＡ／９０％ＡＣＮのＢバッファー、勾配＝１０分にわたる１０％Ｂ〜８０％Ｂ］。抽出物を、２．２ｘ２５ｃｍのＫｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８分取逆相カラム上にロードし、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＦＰＬＣシステムを使用する溶出のためにアセトニトリル勾配を実行した。２１４ｎｍ（２．０Ａ）でＵＶをモニタリングしながら、５分の画分を収集した。Ａ＝０．１％ＴＦＡ、Ｂ＝０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル。勾配＝４５０分にわたる３０％Ｂ〜１００％Ｂ。画分５８〜６５を合わせ、凍結し、凍結乾燥したところ、１９８．１ｍｇが得られた。
生成物のＨＰＬＣ分析により、９５％を超える純度が示された。ＭＡＬＤＩ質量分析により、Ｃ末端アミドとしての生成物と共に４３１６．７の所望の理論質量の存在が示された。オキシントモジュリンおよびオキシントモジュリン−ＫＲＮＲを、大まかにロードされたＰＡＭ−樹脂から出発してＣ末端カルボン酸として同様に調製した。
（例６）
グルカゴンラクタムの合成
２８５ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）のメトキシベンズヒドリルアミン樹脂（Ｍｉｄｗｅｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、６０ｍｌの反応容器に入れ、以下の配列を、Ｂｏｃ ＤＥＰＢＴ活性化シングルカップリングを使用して改良型Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置上で集合させた：ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ−ＮＨ２（１２−１６ラクタム；配列番号１００）。
以下の側鎖保護基を使用した：Ａｒｇ（Ｔｏｓ）、Ａｓｐ（ＯｃＨｘ）、Ａｓｎ（Ｘａｎ）、Ｇｌｕ（ＯＦｍ）、Ｈｉｓ（ＢＯＭ）、Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）。ラクタムを１６〜２０、２０〜２４、または２４〜２８から構築した場合、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）を１２位で使用した。完了したペプチジル樹脂を、回転させながら１時間にわたって２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドで処理して、Ｌｓｙ１２およびＧｌｕ１６からＴｒｐホルミル基ならびにＦｍｏｃおよびＯＦｍ保護を除去した。陽性ニンヒドリン試験による除去の確認の際に、樹脂をジメチルホルムアミド、次いでジクロロメタンで洗浄した後、ジメチルホルムアミドで再度洗浄した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中の５２０ｍｇ（１ｍｍｏｌ）のベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸（ＰｙＢＯＰ）で処理した。反応を８〜１０時間進行させ、陰性ニンヒドリン反応によって環化を確認した。樹脂をジメチルホルムアミド、次いで、ジクロロメタンで洗浄した後、トリフルオロ酢酸で１０分間処理した。Ｂｏｃ基の除去を、陽性ニンヒドリン反応によって確認した。樹脂を、ジメチルホルムアミドおよびジクロロメタンで洗浄し、乾燥した後、フッ化水素酸（ＨＦ）反応容器に移した。５００μＬのｐ−クレゾールを、磁気撹拌棒と共に添加した。容器をＨＦ装置（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ）に結合し、ドライアイス／メタノール浴中で冷却し、排出させ、約１０ｍＬの液体フッ化水素酸を容器中に凝集させた。反応物を氷浴中で１時間にわたって撹拌した後、ＨＦを減圧下で除去した。残留物をエチルエーテル中に懸濁し、固体を濾過し、エーテルで洗浄し、１５０ｍＬの２０％アセトニトリル／１％酢酸を使用してペプチドを可溶化した。
粗い可溶化されたペプチドの分析的ＨＰＬＣ分析を、以下の条件下で行った［４．６Ｘ３０ｍｍ Ｘｔｅｒｒａ Ｃ８、１．５０ｍＬ／分、２２０ｎｍ、Ａバッファー、０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮ、Ｂバッファー、０．１％ＴＦＡ／１００％ＡＣＮ、勾配、１５分にわたる５〜９５％のＢ］。抽出物を水で２倍希釈し、２．２Ｘ２５ｃｍのＶｙｄａｃ Ｃ４分取逆相カラム上にロードし、Ｗａｔｅｒｓ ＨＰＬＣシステム上でのアセトニトリル勾配（０．１％ＴＦＡ／１０％ＡＣＮのＡバッファー、０．１％ＴＦＡ／１０％ＣＡＮのＢバッファーおよび１５．００ｍｌ／分の流量で１２０分にわたる０〜１００％のＢの勾配）を使用して溶出した。精製されたペプチドのＨＰＬＣ分析により、９５％を超える純度が示され、電子スプレーイオン化質量分析により、１２〜１６ラクタムについて３５０６Ｄａの分子量が確認された。１６〜２０、２０〜２４、および２４〜２８からのラクタムを同様に調製した。
（例７）
アシル化および／またはＰＥＧ化されたペプチドの調製
アシル化および／またはＰＥＧ化されたペプチドを、以下のように調製する。ＣＳ Ｂｉｏ ４８８６ペプチド合成装置またはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成装置のいずれかを用いて、固相支持体樹脂上でペプチドを合成する。ｉｎ ｓｉｔｕ中和化学を、Schnolzer et al., Int. J. Peptide Protein Res. 40: 180-193 (1992)で説明されたようにして使用する。アシル化されたペプチドについて、アシル化される標的アミノ酸残基（例えば、１０位）を、Ｎε−ＦＭＯＣリシン残基で置換する。完了したＮ末端ＢＯＣ保護されたペプチドの、ＤＭＦ中の２０％ピペリジンによる３０分間の処理により、ＦＭＯＣ／ホルミル基が除去される。１０倍モル過剰のＦＭＯＣ保護されたスペーサーアミノ酸（例えば、ＦＭＯＣ−（Ｎ−ＢＯＣ）−トリプトファン−ＯＨ）またはアシル鎖（例えば、Ｃ１７−ＣＯＯＨ）と、ＰｙＢＯＰまたはＤＥＰＢＴカップリング試薬とをＤＭＦ／ＤＩＥＡ中でカップリングすることにより、遊離ε−アミノＬｙｓ残基へのカップリングを達成する。その後、スペーサーアミノ酸のＦＭＯＣ基を除去した後、アシル鎖とのカップリングを繰り返す。１００％ＴＦＡによる最後の処理は、側鎖保護基およびＮ末端ＢＯＣ基の除去をもたらす。ペプチド樹脂を、５％ＤＩＥＡ／ＤＭＦで中和し、乾燥した後、０℃で１時間、９５：５のＨＦ／ｐ−クレゾールを使用して支持体から切断する。エーテル抽出の後、５％ＨＯＡｃ溶液を使用して、粗ペプチドを溶媒和する。次いで、溶液の試料を検証して、ＥＳＩ−ＭＳにより正確な分子量のペプチドを含有させる。正確なペプチドを、１００％ＣＨ３ＣＮ中の１０％ＣＨ３ＣＮ／０．１％ＴＦＡ〜０．１％ＴＦＡの線形勾配を使用するＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。Ｖｙｄａｃ Ｃ１８ ２２ｍｍ×２５０ｍｍのタンパク質カラムを、精製のために使用する。アシル化されたペプチド類似体は一般に、２０：８０のバッファー比により溶出を完了する。部分を一緒にプールし、分析的ＲＰ−ＨＰＬＣ上で純度についてチェックする。純粋な画分を凍結乾燥して、白色の固体ペプチドを得る。
ペプチドがラクタム架橋およびアシル化される標的残基を含む場合、ペプチド骨格へのそのアミノ酸の付加の際に上記のようにアシル化を実行する。
ペプチドのペグ化のために、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Ｃｈｉｒｏｔｅｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．）を、透明な溶液中にペプチドとＰＥＧの両方を溶解させるのに必要とされる最少量の溶媒（一般に、２〜３ｍｇのペプチドを使用する反応については２ｍＬ未満）を使用して、７Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー中のモル当量のペプチドと反応させる。室温での激しい撹拌を４〜６時間開始し、反応を分析的ＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。ＰＥＧ化された生成物は、保持時間が減少した出発材料と異なると考えられる。初期のペプチド精製について使用されたものと同様の条件を用いて、Ｖｙｄａｃ Ｃ４カラム上で精製を実施する。溶出は、典型的には、５０：５０のバッファー比あたりで起こる。純粋なＰＥＧ化されたペプチドの画分を収集し、凍結乾燥する。
ペプチドを、例１６において上記のように生物活性についてアッセイする。アシル化されたペプチドは、ＧＬＰ−１受容体で効力の増大を示し得る。トリプトファンスペーサーの含有は、グルカゴン受容体でのより良好な効力を提供し得る。
アシル化はペプチドの半減期を数時間またはそれ以上延長させることができるが、数十ｋＤ範囲で反復するＰＥＧ化はさらに長く延長させることができる。両方の型の改変を含むペプチドを調製する。これらのペプチドは、循環中で長い半減期、ならびにＤＰＰ−ＩＶおよび他のプロテアーゼに対する耐性を示すと予想される。
（例８）
グルカゴン受容体結合アッセイ
グルカゴン受容体に対するペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイにおいて測定した。シンチレーション近接アッセイバッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）中で作製されたペプチドの連続３倍希釈液を、９６ウェルの白色／透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中で、０．０５ｎＭの（３−［125Ｉ］−ヨードチロシル）Ｔｙｒ１０グルカゴン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、１〜６マイクログラム／ウェル、ヒトグルカゴン受容体を過剰発現する細胞から調製された細胞膜断片、および１ｍｇ／ウェルのポリエチレンイミン処理された小麦胚芽アグルチニンＡ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と混合した。回転式振盪器上、８００ｒｐｍで５分間振盪する際に、プレートを室温で１２時間インキュベートした後、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）上で読み取った。非特異的に結合した（ＮＳＢ）放射活性を、試験試料中での最も高い濃度よりも４倍高い「冷」天然リガンド濃度を有するウェル中で測定し、総結合放射活性を、競合剤を含まないウェル中で検出した。特異的結合パーセントを、以下のように算出した：特異的結合％＝（（結合−ＮＳＢ）／（総結合−ＮＳＢ））Ｘ１００。ＩＣ50値を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用することにより決定した。
（例９）
機能アッセイ−ｃＡＭＰ合成
ｃＡＭＰを誘導するグルカゴン類似体の能力を、蛍ルシフェラーゼに基づく受容体アッセイにおいて測定した。受容体（グルカゴン受容体、ＧＬＰ−１受容体またはＧＩＰ受容体）およびｃＡＭＰ応答エレメントに連結されたルシフェラーゼ遺伝子を同時トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、０．２５％ウシ成長血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で１６時間培養することにより血清枯渇させた後、グルカゴン、ＧＬＰ−１、ＧＩＰまたは新規グルカゴン類似体のいずれかの連続希釈液と共に、９６ウェルのポリ−Ｄ−リシン被覆「Ｂｉｏｃｏａｔ」プレート（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中、３７℃、５％ＣＯ2で５時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、１００マイクロリットルのＬｕｃＬｉｔｅ発光基質試薬（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を各ウェルに添加した。プレートを簡単に振盪し、暗室中で１０分間インキュベートし、光出力をＭｉｃｒｏＢｅｔａ−１４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）上で測定した。５０％有効濃度を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用することにより算出した。
（例１０）
インスリン受容体結合アッセイ：
インスリンまたはＩＧＦ−１受容体に対するそれぞれのペプチドの親和性を、シンチレーション近接アッセイ技術を使用する競合結合アッセイにおいて測定した。ペプチドの連続３倍希釈液を、Ｔｒｉｓ−Ｃｌバッファー（０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％ｗ／ｖウシ血清アルブミン）中で作製し、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中で、０．０５ｎＭの（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）Ａ ＴｙｒＡ１４インスリンまたは（３−［１２５Ｉ］−ヨードチロシル）ＩＧＦ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と混合した。ヒトインスリンまたはＩＧＦ−１受容体を過剰発現する細胞から調製された細胞膜断片の１〜６マイクログラムのアリコートを、各ウェルに供し、０．２５ｍｇ／ウェルのポリエチレンイミン処理された小麦胚芽アグルチニンＡ型シンチレーション近接アッセイビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を添加した。８００ｒｐｍで５分間振盪した後、プレートを室温で１２時間インキュベートし、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ１４５０液体シンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）を用いて放射活性を測定した。非特異的に結合した（ＮＳＢ）放射活性を、試験試料中での最も高い濃度よりも４倍過剰濃度「冷」天然リガンドを有するウェル中で測定した。総結合放射活性を、競合剤を含まないウェル中で検出した。特異的結合パーセントを、以下のように算出した：特異的結合％＝（結合−ＮＳＢ／総結合−ＮＳＢ）Ｘ１００。ＩＣ50値を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用することにより決定した。
（例１１）
インスリン受容体リン酸化アッセイ：
インスリンまたはインスリン類似体の受容体リン酸化を測定するために、受容体をトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を、９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ ＃３５９６，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に播種し、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび０．２５％ウシ成長血清（ＨｙＣｌｏｎｅ ＳＨ３０５４１，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃、５％ＣＯ2および９０％湿度で１６〜２０時間培養した。インスリンまたはインスリン類似体の連続希釈液を、０．５％ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＃１００３５０，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加したＤＭＥＭ中で調製し、接着した細胞を含むウェルに添加した。５％ＣＯ2を含む加湿雰囲気中、３７℃で１５分間インキュベートした後、細胞を室温で２０分間、５％パラホルムアルデヒドで固定し、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４で２回洗浄し、ＰＢＳ中の２％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。次いで、プレートを３回洗浄し、製造業者の推奨にしたがって２％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ中で再構成させたホスホチロシンに対する西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃１６−１０５，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）を充填した。室温で３時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、０．１ｍｌのＴＭＢ単一溶液基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，＃００−２０２３，Ｃａｒｌｄｂａｄ，ＣＡ）を各ウェルに添加した。０．０５ｍｌの１Ｎ ＨＣｌを添加することにより、５分後に発色を停止させた。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ ＭＣＣ３４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上で測定した。吸光度対ペプチド濃度用量応答曲線をプロットし、ＥＣ50値を、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ，Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を使用することにより決定した。
（例１２）
インクレチン−インスリン融合物（インクレリン）のための合成手順
図４Ａに示されるスキーム１は、アルデヒドリンカーの合成のための手順を提供する。反応は、トリフェニルメチルチオールのアクロレインへの１ステップＭｉｃｈａｅｌ付加を含む（Org. Biomol. Chem. 2011, 9, 3825を参照されたい）。反応は、８５〜９０％の収率で進行し、生成物は溶媒蒸発、次いで、ヘキサンを用いた磨砕により回収される。次いで、材料は、酢酸エチル／ヘキサンから再結晶化され、室温での保存にとって安定である。
リンカーを用いるＢ鎖Ｎ末端の位置選択的改変（Chem. Biol. Drug. Des. 2007.69.132）を、ｐＨ４．０の酢酸ナトリウムバッファー中、酸性条件下で行い、インスリンの濃度は１ｍｇ／ｍｌであるが、それよりかなり高い濃度で実行してもよい（スキーム２；図４Ｂ）。還元的アミノ化は、１．５〜２．０倍過剰のアルデヒドおよび３０倍モル過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムを使用する。反応物を一晩撹拌し、ＨＰＬＣによりモニタリングする。過剰のアルデヒドを消費させるためにグリシンの添加により反応を停止させる。生成物を分取ＨＰＬＣにより回収すれば、６０％の所望の異性体収率が得られる。
スキーム２から得られる生成物を、２％トリイソプロピルシラン、２％Ｈ2Ｏを含有する生のＴＦＡ中に５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のインスリン誘導体で溶解することにより、スキーム３（図４Ｃ）に示される脱トリチル化（ｄｅｔｒｉｔｉｌｌａｔｉｏｎ）を達成する。脱トリチル化された材料を、エーテル沈降により回収し、遠心分離すれば、９５％を超える収率が得られる。
２−チオピリジル活性化インクレチン（ＧＬＰ−１、ＧＩＰまたはコアゴニスト）とのコンジュゲーションを、２つの固体を合わせ、２０ｍｇ／ｍｌの総ペプチド濃度で６Ｍグアニジン、ｐＨ６．０中に同時に溶解することにより達成する。反応は３０〜６０分で完了し、生成物は分取ＨＰＬＣにより回収される（スキーム４；図４Ｄ）。
合成手順
Ｔｒｔ−Ｓ−（ＣＨ2）2ＣＨＯ（Ｓ−トリチル−３−チオプロピオンアルデヒド）1の合成
トリフェニルメタンチオール（Ｔｒｔ−ＳＨ）２．０ｍｍｏｌ（５５３ｍｇ）を、４．０ｍｌの乾燥塩化メチレン中に溶解し、３．０ｍｍｏｌ（４１８μＬ）のトリエチルアミンをアクロレイン、２．０ｍｍｏｌ（１３４μｌ）と共に添加し、反応物を室温で２時間撹拌した。反応を薄層クロマトグラフィー（シリカゲル、ｎ−ヘキサン／塩化メチレン３：１）によりモニタリングしたところ、反応はこの時点で完了したことが示された。減圧下で溶媒を除去し、残留物をｎ−ヘキサンで磨砕した。粗固体を酢酸エチル／ヘキサンの混合物から再結晶化したところ、５３０ｍｇ、８０％の収率が得られた。
ＨＳ−（ＣＨ2）3−ＰｈｅＢ１−ヒトインスリン2の合成
４１．３μｍｏｌ（２４０ｍｇ）のヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）を、２０ｍＭ ＮａＯＡｃを含有するバッファー、ｐＨ４．０に調整した２００ｍＭ ＮａＣｌバッファー中に溶解した。１．０ｍｌのＮＭＰ中の１００μｍｏｌ（３３ｍｇ）のＳ−トリチル−３−チオプロピオンアルデヒドを、１．２μｍｏｌ（７５ｍｇ）のＮａＣＮＢＨ３と共に溶液に添加した。反応物を室温で撹拌した。０．４ｍｌのＮＭＰ中のさらに４０μｍｏｌのアルデヒドを６．０時間後に添加し、反応を一晩進行させた。ＬＣ／ＭＳ分析により、ほんの少量（５％未満）の非改変インスリンが残存していることが示された。反応混合物を遠心分離し、ペレットをアセトニトリル／Ｈ２Ｏ中に溶解し、Ｌｕｎａ Ｃ８（２）２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ分取ＨＰＬＣカラム上に吸着させ、９０分にわたる線形１０〜５５％勾配で溶出させた。バッファーＡ：１０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、バッファーＢ：ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：１５ｍｌ／分、２２０ｎｍでモニタリング。選択した画分をプールし、凍結乾燥したところ、１４４ｍｇ、約６０％のＴｒｔ−Ｓ−（ＣＨ2）3−ＰｈｅＢ１−ヒトインスリンが得られた。２％トリイソプロピルシラン、２％水を含有する２０ｍｌのＴＦＡで２０分間、１００ｍｇの保護された誘導体を処理した後、ジエチルエーテルで沈降させ、凍結乾燥することによってトリチル基を除去したところ、９５％収率のＨＳ−（ＣＨ2）3−ＰｈｅＢ１−ヒトインスリンが得られた。
ＧＬＰ−１／ＧＩＰ／ＧＬＣＧペプチド（インクレチン成分）の合成
１０倍過剰のアミノ酸およびＤＩＣ／６−Ｃｌ−ＨＯＢｔ活性化を使用するＲｉｎｋ ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（供給源）樹脂から出発してＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３Ａ合成装置上、０．１ｍｍｏｌスケールの標準的なＦｍｏｃ／ｔＢｕ−法を使用して、インクレチンペプチドを合成した。以下の側鎖保護基スキームを使用した：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕｔ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）。ペプチジル樹脂を、５．０ｍｌのＤＭＦ中の１０倍過剰のＦｍｏｃＨｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、ＤＥＰＢＴおよび２０倍過剰のＤＩＥＡで９０分間処理することにより、Ｎ末端Ｈｉｓカップリングを達成した。ＤＭＦ中の２０％ピペリジンの２回の２０分間の処理により、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去した。樹脂からの切断および活性化された２−ジチオピリジル活性化型への同時的変換を、１００μｌのトリイソプロピルシラン、１００μｌの水および２０当量の２−アルドリチオール試薬を含有する５ｍｌのＴＦＡ中に２．０時間懸濁することにより達成した。切断されたペプチドを沈降させ、ジエチルエーテルで洗浄し、１％酢酸を含有する２０％水性アセトニトリル中に溶解し、分取クロマトグラフィーにより精製した。電子スプレーイオン化またはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によりペプチド分子量を確認し、直接凍結乾燥したか、または逆相クロマトグラフィーにより精製した。
ＧＬＰ−１／ＧＩＰ／ＧＬＣＧペプチドとＨＳ−（ＣＨ2）3−ＰｈｅＢ１−ヒトインスリンの連結
３．０μｍｏｌ（１７．７ｍｇ）のＨＳ−（ＣＨ2）3−ＰｈｅＢ１−ヒトインスリンと、３．０μｍｏｌ（１３．５ｍｇ）の２−チオピリジルインクレチンとを小さいバイアルに入れ、ｐＨ６．０に調整した１．５ｍｌの６．０Ｍグアニジンバッファー中に溶解した。反応物を１時間撹拌し、２％水性ＡｃＯＨで希釈し、分取ＨＰＬＣにより精製したところ、凍結乾燥後に５０％の連結された材料が得られた。ＨＰＬＣ条件：Ｌｕｎａ Ｃ８（２）２５０ｍｍ×２１．２ｍｍ分取ＨＰＬＣカラムおよび９０分にわたる線形１０〜５５％勾配を用いる溶出。バッファーＡ：１０％ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、バッファーＢ：ＡＣＮ／０．１％ＴＦＡ、流量：１５ｍｌ／分、２２０ｎｍでモニタリング。
（例１３）
本開示によるインクレチン−インスリンコンジュゲート（インクレリン）を、本質的には例１〜７および１２に記載のように合成し、ＧＬＰ−１受容体、ＧＩＰおよびインスリン受容体のそれぞれにおけるアゴニスト活性について、本質的には例８〜１１に記載のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。Ｂ鎖のＮ末端を、アルキルチオール基を含むように誘導体化し、インクレチンは、２つのペプチドを連結するためのジスルフィド結合を可能にするためにシステインアミノ酸が付加されている。省略形Ｃ（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−Ｂ１インスリンは、アルキルチオール基を用いてＢ鎖のＮ末端で誘導体化された天然の二本鎖ヒトインスリンを表す。省略形Ｃ（Ｓ−Ｓ）−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｂ1Ｄｅｓｄｉは、アルキルチオール基を用いてＢ鎖のＮ末端で誘導体化され、Ｂ２８およびＢ３０残基が欠失し、Ｂ２９がアミド結合を介してＡ鎖のＮ末端に直接連結された天然のヒトインスリンを表す（この一本鎖類似体はインスリン受容体では不活性であるが、Ｂ２９ Ｌｙｓアミド結合はトリプシンによる切断またはＬｙｓ Ｃ切断を受けやすく、二本鎖構造および完全なインスリン活性を回復する）。かくして、酵素活性がなければ、Ｄｅｓｄｉインスリン類似体を含むインクレリンは、関連するインクレチン活性しか示さず、インスリン受容体で活性を示さない。
ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）、ＧＩＰおよびインスリン受容体のそれぞれにおけるアゴニスト活性受容体（ＧＩＰＲ）およびインスリン受容体（ＩＲ−Ｂ）でのＥＣ５０を、表４に提供する。表４中に示される省略形の脂質化された基と関連する構造は以下の通りである。
「Ｂ」＝Ｌｙｓ（ミニＰＥＧ）2−ｇＧｌｕ−Ｃ１８二酸
「Ｏ」＝Ｌｙｓ（γＧｌｕ−Ｃ１６二酸）
「Ｚ」＝Ｌｙｓ（γＧｌｕ−Ｃ１４）
「Ｕ」＝Ｌｙｓ（ｇＧｌｕ−Ｃ１６）
「Ｕ２」＝Ｌｙｓ（ｇＧｌｕ−Ｃ１８）
「Ｕ３」＝Ｌｙｓ（ｇＧｌｕ−Ｃ２０）
表４：








（例１４）
モデルジペプチド切断の速度の決定（ＰＢＳ中）
特異的ヘキサペプチド（ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ2；配列番号２０３６）を、ジペプチドＮ末端伸長の切断速度を試験することができるモデルペプチドとして使用した。ジペプチド伸長モデルペプチドを、Ｂｏｃ保護されたサルコシンから調製し、モデルペプチド結合樹脂にリシンを連続的に付加して、ペプチドＡ（Ｌｙｓ−Ｓａｒ−ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ2；配列番号２０３６）を生成した。ペプチドＡを、ＨＦにより切断し、分取ＨＰＬＣにより精製した。
切断速度を、それぞれのプロペプチドについて決定した。プロペプチドおよびモデル親ペプチドの濃度を、そのそれぞれのピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数を、様々な時間間隔でのプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定した。このプロットの勾配は、速度定数「ｋ」を提供する。様々なプロドラッグの切断に関する半減期を、式ｔ1/2＝０．６９３／ｋを使用して算出した。Ｌｙｓ−Ｓａｒ伸長物の、このモデルペプチドＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ2（配列番号２０３６）への半減期は、１４．０時間であると決定された。
（例１５）
オールｄアイソフォームモデルペプチドを用いて決定された血漿中のジペプチド切断半減期の速度
さらなるモデルヘキサペプチド（ｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ2；配列番号２１）を使用して、血漿中でのジペプチド切断の速度を決定した。各アミノ酸のｄ異性体を使用して、プロドラッグ伸長物を除くモデルペプチドの酵素的切断を防止した。このモデルｄ異性体ヘキサペプチドを、ｌ異性体と同様の様式で合成した。サルコシンおよびリシンを、ペプチドＡについて以前に報告されたようにＮ末端に連続的に付加して、ペプチドＢ（ｄＬｙｓ−ｄＳａｒ−ｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ2；配列番号５９）を調製した。
切断の速度を、それぞれのプロペプチドについて決定した。プロペプチドとモデル親ペプチドの濃度を、そのそれぞれのピーク面積によって決定した。プロドラッグの一次解離速度定数を、様々な時間間隔でのプロドラッグの濃度の対数をプロットすることによって決定した。このプロットの勾配は、速度定数「ｋ」を提供する。Ｌｙｓ−Ｓａｒ伸長物の、このモデルペプチドｄＨｄＴｄＲＧｄＴｄＦ−ＮＨ2（配列番号２１）への半減期は、１８．６時間であると決定された。
（例１６）
モデルヘキサペプチド（ＨＳＲＧＴＦ−ＮＨ2；配列番号２０３６）に連結されたさらなるジペプチドに関する切断の速度を、例５に記載の手順を使用して決定した。これらの実験で得られた結果を、表２および表３に提示する。
表２：
表３：
さらに、ジペプチドエレメントが、ＩＧＦ１ＹＬのＡ１９に存在する４−アミノ−フェニルアラニン残基を介してアミド結合により連結された、ＩＧＦ１ＹＬインスリン類似体の様々なプロドラッグ誘導体を調製した。例５の手順を使用したこれらの化合物のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析により、これらの化合物の活性が、ＰＢＳバッファーまたは２０％血漿中でインキュベートされる時間と共に増大することが示される。さらに、ＩＧＦ類似体プロドラッグＭＩＵ３０：Ａ１（ａＦ１９−ｄＬｙｓ（Ａｃ），Ｓａｒ）（Ａ１９ ４−アミノＰｈｅを介して、およびアミド結合により連結されたジペプチド）のｉｎ ｖｉｔｒｏでの活性を、２０％血漿中で長時間（１時間、３時間、６時間、９時間および１０．５時間）インキュベートした天然インスリンと比較したインスリン受容体結合について測定した。表３Ａは、２０％血漿／ＰＢＳ中、３７℃で長時間インキュベートした相対インスリン受容体結合を比較する。表３Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、表３Ｂのｉｎ ｖｉｔｒｏリン酸化アッセイにおいて提示されるデータによって示されるように、プロドラッグ形態が活性型ＩＧＦ１ＹＬペプチドに変換されるにつれて、時間と共にＡ１９ ＩＧＦプロドラッグ誘導体試料から活性の増加が回復する。
表３Ａ：
表３Ｂ：
インスリン類似体ＭＩＵ−３０ａ：Ｂ１（Ｙ１６，Ｌ１７，Ｙ２５）２９ａ：Ａ１（ｄＬｙｓ（Ａｃ），Ｓａｒ−ａＦ１９）（Ａ１９ ４−アミノＰｈｅを介して、およびアミド結合により連結されたジペプチド）を投与したＣ５７／Ｂｌｋマウスを使用するｉｎ ｖｉｖｏグルコース負荷試験において、ＭＩＵ３０を、２０％血漿を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶解し、３７℃で４８時間インキュベートした（「ＭＩＵ−３０ｃ」を生成する）。０時間（ＭＩＵ３０ａ）および４８時間（ＭＩＵ３０ｃ）インキュベートした試料を引き出し、９０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび２７０ｎｍｏｌ／ｋｇでＣ５７ブラックマウスに注射して、グルコース低下を測定した（インスリン耐性試験）。図８Ａにおいて、８時間までの様々な時間でのＭＩＵ３０ａおよびＭＩＵ３０ｃのグルコース低下プロファイルを示す。親化合物は低い効力を有するが、２０％血漿中で４８時間インキュベートした後（「ＭＩＵ−３０ｃ」を生成する）、効力は増大する（図８Ａを参照されたい）。図８Ｂにおいて、ビヒクルと比較したＭＩＵ３０ａおよびＭＩＵ３０ｃの総血糖を、曲線下面積（ＡＵＣ）の差異として報告する。９０ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＭＩＵ３０ａは、グルコースのわずかな変化を示すが、ＭＩＵ３０ｃはかなり大きな低下を引き起こす。２７０ｎｍｏｌ／ｋｇで、ＭＩＵ３０ａとＭＩＵ３０ｃは両方とも、グルコース低下を示すが、後者の試料は有意により高い低血糖効力を有する。まとめると、プロドラッグ形態のインスリン類似体ＭＩＵ３０は、生理的条件下での親インスリン類似体へのｅｘ ｖｉｖｏでの変換の前に注射された場合、見かけ上より低いグルコース低下効力を示す。これらのｉｎ ｖｉｖｏでの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分析と一致している。プロドラッグの半減期は、約２０時間と見積もられる。
（例１７）
プロドラッグ形態のＩＧＦＢ１７Ｂ１７誘導体ペプチドからのジペプチド切断
様々なＩＧＦ−１ペプチドからの（ｐＮＨ２−Ｐｈｅ）アミド結合したジペプチドＡｉｂＰｒｏの切断を測定して、ジペプチド切断に対するペプチド配列またはヘテロ二本鎖の影響を決定した。試験したペプチドに関する結果を、表１１に示し、データは、ＩＧＦ１−Ａ鎖が単独でＩＧＦ１ Ｂ：Ａ（ＹＬ）B16,17ペプチドのプロドラッグ半減期の試験のための良好なモデルであることを示している。
表１１：
ジスルフィド結合したＡ鎖とＢ鎖の構築物（ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹB16ＬB17）と比較したＩＧＦ Ａ鎖のプロドラッグ誘導体の比較により、２つの化合物がプロドラッグ形態について類似する半減期を有することが示された。したがって、ＩＧＦ１Ａ鎖は単独で、ＩＧＦ１ Ｂ：Ａ（ＹB16ＬB17）に関するプロドラッグ半減期の試験のための良好なモデルであると決定された。ＡｉｂＡｌａ誘導体は切断せず、かくして、プロドラッグではないが、改変がインスリン類似体ＩＧＦ１ Ａ：Ｂ（ＹB16ＬB17）（ｐ−ＮＨ2−Ｆ）A19アミドを不活化することができることを示すのに役立つ。簡単にするために、プロドラッグの半減期を、Ｂ鎖の非存在下、ＩＧＦ１ Ａ鎖のみを使用して決定した。各プロペプチドの半減期を、例５に記載のように決定した。データを、表１２に提示する。
表１２：
データは、ジペプチドプロドラッグエレメント上の置換基を変化させることにより、そのプロドラッグの半減期を２時間から１００時間を超えるまで変化させることができることを示している。
ＩＧＦ１−Ａ（ｐＮＨ２−Ｆ）19ベースペプチドを使用し、Ａ１９位で４−アミノフェニルアラニンを介して連結されたジペプチドプロドラッグエレメントのアミノ酸組成を変化させることにより、さらなるプロドラッグ誘導体ペプチドを調製した。ジペプチド半減期を、ＰＢＳおよび２０％血漿／ＰＢＳ（すなわち、血清酵素の存在下）の両方において異なる構築物について測定した。結果を、表１３に提供する。その結果は、試験した４つのペプチドのうちの３つが血清酵素によって影響されなかったことを示す。
（例１８）
一本鎖インスリン類似体の生合成および精製
ＩＧＦ−ＩＣ鎖により連結された天然インスリンＢおよびＡ鎖を含むインスリン−ＩＧＦ−Ｉミニ遺伝子（Ｂ0−Ｃ1−Ａ0）を、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中での組換えタンパク質の構成的発現および精製のために、ＧＡＰプロモーター（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター）の下で発現ベクターｐＧＡＰＺαＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）中にクローニングした。ミニ遺伝子を、組換えタンパク質の培地中への分泌のためのＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのα−接合因子リーダーシグナルをコードするＮ末端ペプチドに融合した。ミニ遺伝子と、リーダーα−接合因子配列との間のＫｅｘ２切断部位を使用して、天然アミノ末端を有するミニ遺伝子の分泌のためにリーダー配列を切断した。単一部位アラニン突然変異を、Ｂ0−Ｃ1−Ａ0ミニ遺伝子の１（Ｇ１Ａ）、２（Ｙ２Ａ）、３（Ｇ３Ａ）、４（Ｓ４Ａ）、５（Ｓ５Ａ）、６（Ｓ６Ａ）、７（Ｒ７Ａ）、８（Ｒ８Ａ）、１０（Ｐ１０Ａ）、１１（Ｑ１１Ａ）、および１２（Ｔ１２Ａ）位でＣペプチド中に導入した。
Ｂ0−Ｃ1−Ａ0を含むミニ遺伝子、１１個のアラニン突然変異体、および他の選択誘導体を、エレクトロポレーションによりＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母中に形質転換した。陽性の形質転換体を、最少メタノールプレート上で選択し、それぞれのＰｉｃｈｉａ単離物のゲノム調製物を実施し、酵母ゲノム中への構築物の組み込みをＰＣＲにより確認した。８３３塩基対のＰＣＲ産物が、アガロースＤＮＡゲル上で可視化された。インスリン類似体を、対応する酵母株の発酵によって生成した。酵母細胞を、５００ｍｌのＢｅｃｋｍａｎ遠心管中、５Ｋで２０分間の遠心分離によってペレット化し、その後のタンパク質精製のために培地を保持した。
増殖培地上清を、０．２μｍ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターを通して濾過した。アセトニトリル（ＡＣＮ）を、２０％の最終容量となるように上清に添加した。上清を、２０％水性ＡＣＮで予め平衡化させた、ＳｉｇｍａからのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ７ＨＰ樹脂上で精製した。次いで、樹脂を、３０ｍｌの２０％水性ＡＣＮで２回リンスし、０．１％ＴＦＡを含有する３０％水性ＡＣＮを用いて、夾雑物を除去した。部分的に精製されたインスリン類似体を、０．１％ＴＦＡを含有する５４％水性ＡＣＮを用いてカラムから溶出させ、凍結乾燥した。凍結乾燥された試料を、０．０２５Ｍ ＮＨ3ＨＣＯ3 ｐＨ８中に再懸濁し、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（１０μｍ粒径、３００Å孔径）上で精製した。２０〜６０％の水性ＡＣＮの線形勾配を使用して、カラムからタンパク質を溶出させた。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ陽性画分をプールし、その後の凍結乾燥のために使い捨てのシンチレーションバイアルに移した。次いで、凍結乾燥された試料を、０．１％ＴＦＡを含有する２０％水性ＡＣＮ中に再懸濁し、Ｌｕｎａ Ｃ１８カラム（１０μｍ粒径、３００Å孔径）上で精製した。０．１％ＴＦＡを含む１８〜５４％の水性ＡＣＮの線形勾配を使用して、カラムからタンパク質を溶出させた。タンパク質の溶出を、２８０ｎｍの吸光度でモニタリングした。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ陽性画分を、Ｃ８分析カラムにより分析して、純度を確保した。
Ｂ0−Ｃ1−Ａ0類似体は、インスリン受容体アイソフォームとＩＧＦ−１受容体の両方で同等に有効である効力を示した。２位のチロシンのアラニンへの突然変異またはＣ９−１２の欠失による８アミノ酸へのＣ−ペプチドの短縮は、ＩＧＦ−１受容体活性の有意な減少によるインスリン作用の特異性の選択的増強をもたらした。表１４Ａおよび１４Ｂに提供されるデータを参照されたい。
表１４Ａ：
表１４Ｂ：
多くのインスリン選択的類似体は、本発明者らがＣ−ペプチドの最後の４残基を失っていたものであり、Ｃ−ペプチドの２つの位置にアラニン突然変異を有していたものであるか、またはその２つの変化の組合せであった。
表１３：
（例１９）
インスリン耐性試験
単回投与
６〜８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを、２３℃、一定湿度、および１２時間の明暗周期で維持した。選択されたペプチドの急性ｉｎ ｖｉｖｏ効果を、生理的に緩衝化された塩水またはビヒクル対照中に溶解したペプチドを、正常または糖尿病マウスに皮下注射することによって評価した。血糖を、ペプチドの投与後２４時間の経過を通して様々な時点で測定した。それぞれのマウス群は、１群あたり８匹のマウスを含んでいた。平均体重は約２５ｇであった。ストレプトゾトシンの投与により、マウスを糖尿病にした。
連続投与
ペプチドまたはビヒクル対照の毎日反復皮下投与を、５日〜２週間の期間にわたってマウスに投与した。肥満マウスには糖尿病発生食を与え、マウスは水への自由なアクセスを得て、脂肪由来の５８％のカロリーを含む高脂肪食（ＨＦＤ）（Ｄ１２３３１；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を裁量で供給し、各マウス群は、１群あたり８匹の動物を含んでいた。平均体重は約５０ｇであり、マウスは約６カ月齢のオスであった。体重および食物摂取を、ペプチドまたはビヒクル対照をマウスに投与した日に測定した。空腹時血糖値を、反復的に測定した。
（例２０）
カニクイザルにおける段階的グルコース輸注のための手順
１２匹の非ナイーブなオスのサルをコロニーから選択し、１匹ずつ飼育し、標準的な固形飼料（Ｈａｒｌａｎ）および水に自由にアクセスさせながら２２℃で標準的な１２：１２時間の明暗周期で維持し、一致した体重（４ｋｇ）にしたがって３つの異なる処置群（ｎ＝４）にグループ化した。段階的デキストロース輸注の２４時間前に、サルに、単回皮下注射によって塩水またはペプチドのいずれかを投与した。全ての試験群に由来するサルを１６時間絶食させた後、段階的デキストロース輸注を開始した。デキストロース輸注の３０分前に、サルをテラゾール（筋肉内、７ｍｇ／ｋｇ）で沈静化させ、デキストロース輸注のための静脈内カテーテルを、橈側皮静脈に入れた。ベースライン血液試料を、デキストロースの輸注の２０、１０、および０分前に、大腿動脈または静脈から取得した。０分で、１分あたり５ｍｇ／ｋｇのデキストロース溶液の輸注を開始し、１０および２０分後に血液を採取した。２０分の血液試料を採取した直後に、デキストロース輸注速度を１分あたり１０ｍｇ／ｋｇに増加させ、その速度での輸注の１０および２０分後に再度、血液試料を採取した。４０分の血液試料を採取した直後、デキストロース輸注速度を１分あたり２５ｍｇ／ｋｇに増加させ、その速度での輸注の１０および２０分後に血液を採取した。
血液を、ＥＤＴＡ−およびアプロチニン−含有（２５０カリクレイン阻害単位／ｍｌ）チューブ中に採取した。グルコース、インスリン、およびＣ−ペプチドを、上記の血液試料のそれぞれから調製された血漿中で測定した。血漿試料をＭｉｌｌｉｐｏｒｅに提供して、化合物濃度を測定した。常磁性粒子、化学発光イムノアッセイ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｃｃｅｓｓ ２）によってインスリンを測定し、ヘキソキナーゼ法（Ｒｏｃｈｅ Ｈｉｔａｃｈｉ ９１７）によってグルコースを測定した。実験の結果を、図３５Ａおよび図３５Ｂに提供する。
ブタ試験のための手順
動物を、試験の前に１２時間にわたって絶食させた。ポートにアクセスした後、手持ち式血糖値測定器を用いて血糖を測定した。全ての動物について同じ血糖値測定器を使用して、２つの読取り値を取って、値が一貫していることを確保した。動物を、グルコースレベルによって無作為化して、群間での均衡のとれた分布を達成した。それぞれの特定の時点で、約３ｍＬの全血を、抗凝固剤としてのＫ３ＥＤＴＡおよび１００μｇ／ｍＬのアプロチニンを含有する採血管に採取し、採取の直後に氷浴上に置いた。全血試料を、採取の３０分以内に遠心分離し、少なくとも０．５ｍＬの血漿を取得し、インスリンＰＫ（ＥＬＩＳＡに基づくアッセイ）などの将来の分析のために保存した。３ｍＬ全血試料の小部分（採血管に入れる前）を使用して、採取の直後に手持ち式の血糖値測定器を使用して血糖をチェックした。実験の結果を、図３６および図３７に提供する。

Claims (44)

  1. インクレチンペプチド、および
    インスリンアゴニストペプチド
    を含むインクレチン−インスリンコンジュゲートであって、インクレチンペプチドが５〜１０個の原子の直鎖スペーサーによりインスリンペプチドに連結され、スペーサーが、スペーサー直鎖の主鎖内にジスルフィド、チオエーテル、チオエーテルスルホキシド、オキシム、ヒドラゾン、セレン、ジセレン、アルキル、アルケン結合を含み、前記直鎖スペーサーが、インクレチンペプチドのカルボキシ末端を、Ｂ鎖のＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ２２、Ｂ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミン、または一本鎖インスリン類似体のＡ鎖とＢ鎖とを連結する連結部分の任意の位置のアミノ酸の側鎖に結合させる、インクレチン−インスリンコンジュゲート。
  2. インクレチンペプチドのカルボキシ末端が、インスリンペプチドのＢ鎖のアミノ末端に共有結合により連結している、請求項１に記載のコンジュゲート。
  3. 直鎖スペーサーが、式Ｉの一般構造を含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
    （式中、
    Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣ1−Ｃ3アルキルからなる群から独立に選択され、
    Ｙは、Ｃ、Ｓ、Ｓｅ、またはＳ＝Ｏであり、
    Ｚは、Ｃ、Ｓｅ、Ｓ、Ｓ（Ｃ1−Ｃ3）（Ｃ5−Ｃ6アリール）であり、またはＹと組み合わせたＺは、−Ｏ−Ｎ＝、もしくは１，２，３トリアゾールであり、
    ｎは、０または１であり、
    ｍは、１、２または３であるが、但し、ＹがＳ＝Ｏである場合、ＺはＣである）
  4. Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が、ＨおよびＣＨからなる群から独立に選択され、
    ＹがＣ、Ｓ、またはＳｅであり、
    ＺがＳｅまたはＳであり、
    ｎが０または１であり、
    ｍが１、２または３である、
    請求項３に記載のコンジュゲート。
  5. 直鎖スペーサーが、式ＩＩの一般構造を含む、請求項４に記載のコンジュゲート。
    （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、ＨおよびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ならびにｍは１、２または３である）
  6. Ｒ2およびＲ3がＨであり、
    Ｒ1およびＲ4が独立にＨまたはＣＨ3であり、
    ｎが０または１であり、
    ｍが１または２である、請求項５に記載のコンジュゲート。
  7. 直鎖スペーサーが、式ＩＶの一般構造を含む、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
    （式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3である）
  8. Ｒ3がＨである、請求項７に記載のコンジュゲート。
  9. インスリンペプチドがＢ鎖とＡ鎖とを含む二本鎖インスリン類似体であり、前記Ｂ鎖がジスルフィド結合により前記Ａ鎖に連結される、請求項１から８までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  10. インスリンペプチドが一本鎖インスリン類似体である、請求項１から８までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  11. インクレチンペプチドが、
    Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＸ10ＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号２０３７）および
    Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＩＹＬＤＫＱＡＡＸ20ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＸ40（配列番号２０３８）
    （式中、
    Ｘ1は、ＨｉｓまたはＴｙｒであり、
    Ｘ2は、アミノイソ酪酸であり、
    Ｘ10は、ガンマＧｌｕリンカーを介してもよいＣ16−Ｃ20アルキル基でアシル化されたＬｙｓであり、
    Ｘ20は、アミノイソ酪酸であり、
    Ｘ40は、ガンマＧｌｕリンカーを介してもよいＣ16−Ｃ20アルキル基でアシル化されたＬｙｓである）
    からなる群から選択される、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  12. インクレチンペプチドが、
    （ｉ）１〜３個のアミノ酸改変を有するアミノ酸配列：
    Ｘ１−Ｘ２−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｚ1（配列番号８３９）
    であって、
    Ｘ１および／またはＸ２が、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然（配列番号７０１と比較して）アミノ酸であり、
    Ｚ1が、Ａｓｎ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨ、およびＹ−ＣＯＯＨからなる群から選択され、Ｙが、１〜２個のアミノ酸であり、さらに、
    （１）ラクタム架橋が、ｉ位のアミノ酸とｉ＋４位のアミノ酸の側鎖を接続し、ｉが１２、１６、２０もしくは２４であり、または
    （２）インクレチンペプチドの１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、もしくは全部が、α，α−二置換アミノ酸で置換されており、
    前記インクレチンペプチドがグルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
    （ｉｉ）配列番号７０１のアミノ酸配列であって、
    ２８位のＡｓｎの、荷電アミノ酸での置換、
    ２８位のＡｓｎの、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
    ２８位の、Ａｓｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕでの置換、
    ２８位の、Ｇｌｕでの置換、
    ２９位のＴｈｒの、荷電アミノ酸での置換、
    ２９位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、システイン酸、およびホモシステイン酸からなる群から選択される荷電アミノ酸での置換、
    ２９位の、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、またはＬｙｓでの置換、
    ２９位の、Ｇｌｕでの置換、
    ２９位の後への、１〜３個の荷電アミノ酸の挿入、
    ２９位の後への、ＧｌｕまたはＬｙｓの挿入、
    ２９位の後への、Ｇｌｙ−ＬｙｓもしくはＬｙｓ−Ｌｙｓの挿入；またはこれらの組合せ
    からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸改変、
    ならびにグループＡもしくはグループＢ、またはこれらの組合せから選択される少なくとも１つのアミノ酸改変を含むように改変され、
    グループＡは、１６位のＳｅｒの、ＴｈｒまたはＡＩＢでの置換からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
    グループＢは、
    １位のＨｉｓの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
    ２位のＳｅｒの、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）による切断に対するインクレチンペプチドの感受性を低減する非天然アミノ酸での置換、
    １０位のＴｙｒの、ＰｈｅもしくはＶａｌでの置換、
    １２位のＬｙｓの、Ａｒｇでの置換、
    ２０位のＧｌｎの、ＡｌａもしくはＡＩＢでの置換、
    ２１位のＡｓｐの、Ｇｌｕでの置換、
    ２４位のＧｌｎの、ＡｌａもしくはＡＩＢでの置換、
    ２７位のＭｅｔの、ＬｅｕもしくはＮｌｅでの置換、
    またはこれらの組合せ
    からなる群から選択されるアミノ酸改変であり、
    前記インクレチンペプチドが、グルカゴンアゴニスト活性を有する、アミノ酸配列、
    （ｉｉｉ）配列番号７０１のインクレチンペプチドであって、
    （ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位のアミノ酸改変、
    （ｂ）（１）ｉ位とｉ＋４位とのアミノ酸側鎖間の、もしくはｊ位とｊ＋３位とのアミノ酸側鎖間のラクタム架橋（ここで、ｉは１２、１３、１６、１７、２０もしくは２４であり、ｊは１７である）、または
    （２）類似体の１６、２０、２１、および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、もしくは全部の、α，α−二置換アミノ酸での置換、
    （ｃ）２７、２８および２９位のうちの１、２個または全部のアミノ酸改変、ならびに
    （ｄ）１〜６個のさらなるアミノ酸改変
    を含むように改変され、ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、インクレチンペプチド、
    （ｉｖ）配列番号１の配列であって、
    （ｉ）Ｃ4−Ｃ30脂肪酸でアシル化またはアルキル化された１０位のアミノ酸、および
    （ｉｉ）１６位のＡＩＢ
    を含む、配列、
    （ｖ）１６、２０、２１、および／または２４位の、ＡＩＢでの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む１０個以下のアミノ酸改変、ならびにジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断に対する感受性の低減をもたらす１位および／または２位のアミノ酸改変が配列番号７０１と異なるアミノ酸であって、前記インクレチンペプチドが、ＧＬＰ−１受容体の天然ＧＬＰ−１の活性の少なくとも２０％を表す、アミノ酸、
    （ｖｉ）２９位のアミノ酸のＣ末端にＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９５）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり、グリシンであってもよい）をさらに含む、（ｉ）〜（ｖ）のいずれかに記載の類似体、ならびに
    （ｖｉｉ）以下のアミノ酸改変：１位のＴｙｒ、２位のＡＩＢ、１０位のＬｙｓ（ここで、Ｌｙｓはγ−Ｇｌｕ−γ−ＧｌｕジペプチドスペーサーによりＣ１６脂肪アシル基に共有結合する）、１２位のＩｌｅ、１６位のＬｙｓ、１７位のＧｌｎ、１８位のＡｌａ、２０位のＡＩＢ、２１位のＧｌｕ、２４位のＡｓｎ、２７位のＬｅｕ、２８位のＡｌａ、２９位のＧｌｙを有する配列番号１のアミノ酸、次いで、２９位のアミノ酸への配列番号９５のアミノ酸のＣ末端、およびＣ末端のアルファカルボキシレートの代わりにＣ末端アミド
    を含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  13. 前記インスリンペプチドが、Ａ鎖とＢ鎖とを含み、前記Ａ鎖が、配列ＧＩＶＸ4Ｘ5ＣＣＸ8Ｘ9Ｘ10ＣＸ12ＬＸ14Ｘ15ＬＸ17Ｘ18ＹＣＸ21−Ｒ13（配列番号１９）を含み、前記Ｂ鎖が、配列：Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）を含み、
    式中、
    Ｘ4が、グルタミン酸またはアスパラギン酸であり、
    Ｘ5が、グルタミンまたはグルタミン酸であり、
    Ｘ8が、ヒスチジン、トレオニンまたはフェニルアラニンであり、
    Ｘ9が、セリン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
    Ｘ10が、イソロイシンまたはセリンであり、
    Ｘ12が、セリンまたはアスパラギン酸であり、
    Ｘ14が、チロシン、アルギニン、リシン、オルニチンまたはアラニンであり、
    Ｘ15が、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、アラニン、リシン、オルニチンまたはロイシンであり、
    Ｘ17が、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、リシン、オルニチンまたはグルタミンであり、
    Ｘ18が、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはトレオニンであり、
    Ｘ21が、アラニン、グリシン、セリン、バリン、トレオニン、イソロイシン、ロイシン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジン、トリプトファン、チロシン、およびメチオニンからなる群から選択され、
    Ｘ25が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
    Ｘ29が、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
    Ｘ30が、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
    Ｘ33が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
    Ｘ34が、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
    Ｘ41が、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
    Ｘ42が、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
    Ｘ45が、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
    Ｒ22が、ＡＹＲＰＳＥ（配列番号１４）、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＰＧＰＥ（配列番号１１）、グリシン−プロリン−グルタミン酸トリペプチド、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、プロリン−グルタミン酸ジペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミン、グルタミン酸およびＮ末端アミンからなる群から選択され、
    Ｒ13が、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である、
    請求項１２に記載のコンジュゲート。
  14. 前記Ａ鎖が、配列ＧＩＶＥＱＣＣＸ8Ｘ9ＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21−Ｒ13（配列番号７３）を含み、前記Ｂ鎖が、配列Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45（配列番号２０）を含み、
    Ｘ8が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
    Ｘ9が、セリン、リシン、またはアラニンであり、
    Ｘ21が、アラニン、グリシンまたはアスパラギンであり、
    Ｘ25が、ヒスチジンまたはトレオニンであり、
    Ｘ29が、アラニン、グリシンおよびセリンからなる群から選択され、
    Ｘ30が、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホモシステイン酸およびシステイン酸からなる群から選択され、
    Ｘ33が、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群から選択され、
    Ｘ34が、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択され、
    Ｘ41が、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアスパラギンからなる群から選択され、
    Ｘ42が、アラニン、オルニチン、リシンおよびアルギニンからなる群から選択され、
    Ｘ45が、チロシンまたはフェニルアラニンであり、
    Ｒ22が、ＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、バリン−アスパラギン−グルタミントリペプチド、アスパラギン−グルタミンジペプチド、グルタミンおよびＮ末端アミンからなる群から選択され、
    Ｒ13が、ＣＯＯＨまたはＣＯＮＨ2である、
    請求項１３に記載のコンジュゲート。
  15. 前記Ｂ鎖が、配列Ｒ22−Ｘ25ＬＣＧＸ29Ｘ30ＬＶＸ33Ｘ34ＬＹＬＶＣＧＸ41Ｘ42ＧＦＸ45ＹＴ−Ｚ1−Ｂ1（配列番号１４２）を含み、
    Ｚ1が、アスパラギン酸−リシン、リシン−プロリン、およびプロリン−リシンからなる群から選択されるジペプチドであり、
    Ｂ1が、トレオニン、アラニンまたはトレオニン−アルギニン−アルギニントリペプチドからなる群から選択される、
    請求項１３に記載のコンジュゲート。
  16. 前記インスリンペプチドが、
    ＧＩＶＥＱＣＣＸ8ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21（配列番号３）のＡ鎖配列、および
    Ｒ22−ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ45（配列番号１５）のＢ鎖配列
    を含み、
    Ｂ鎖が、ジスルフィド結合によりＡ鎖に連結され、
    Ｒ22が、結合であるか、またはＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＶＮＱ、ＮＱおよびＱからなる群から選択される１〜４個のアミノ酸配列であり、
    Ｘ8が、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
    Ｘ21が、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
    Ｘ45が、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである、
    請求項１１に記載のコンジュゲート。
  17. インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、以下の一般構造を含む、請求項１６に記載のコンジュゲート。
    （式中、直鎖スペーサーのシステインアミノ酸は、アミド結合によりインクレチンのカルボキシ末端に連結され、Ｑ1はインスリンＢ鎖のＮ末端である）
  18. インスリンペプチドが、
    ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列、ならびに
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）および
    ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）
    からなる群から選択されるＢ鎖配列
    を含む、請求項１７に記載のコンジュゲート。
  19. インクレチンペプチドのＣ末端アミノ酸が、Ｂ鎖のＮ末端アルファアミンで前記直鎖スペーサーによりインスリンペプチドに共有結合により連結し、
    前記インスリンペプチドが、
    ＧＩＶＥＱＣＣＸ8ＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＸ21（配列番号３）のＡ鎖配列、および
    Ｒ22−ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＸ45（配列番号１５）のＢ鎖配列
    （式中、
    Ｒ22は、結合であるか、またはＦＶＮＱ（配列番号１２）、ＦＶＫＱ（配列番号８）、ＶＮＱ、ＮＱおよびＱからなる群から選択される１〜４個のアミノ酸配列であり、
    Ｘ8は、トレオニンおよびヒスチジンからなる群から選択され、
    Ｘ21は、アスパラギン、リシン、グリシン、アラニンからなる群から選択され、
    Ｘ45は、ヒスチジン、チロシンまたはフェニルアラニンである）
    を含み、Ｂ鎖は、ジスルフィド結合によりＡ鎖に連結されており、ならびに
    前記インクレチンペプチドが、
    配列Ｘ80Ｘ81Ｘ82ＧＴＦＴＳＤＹＳＸ83ＹＬＸ84Ｘ85Ｘ86Ｘ87ＡＸ88Ｘ89ＦＸ90Ｘ91ＷＬＸ92Ｘ93Ｘ94−Ｚ1（配列番号１９２８）
    （式中、Ｘ80は、Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
    Ｘ81は、Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニンおよびＤ−アラニンであり、
    Ｘ82は、ＧｌｎまたはＧｌｕであり、
    Ｘ83は、ＬｙｓまたはＩｌｅであり、
    Ｘ84は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
    Ｘ85は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＳｅｒまたはＧｌｕであり、
    Ｘ86は、ＡｒｇまたはＧｌｎであり、
    Ｘ87は、ＡｌａまたはＡｒｇであり、
    Ｘ88は、アミノイソ酪酸、ＧｌｎまたはＬｙｓであり、
    Ｘ89は、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、
    Ｘ90は、ＶａｌまたはＩｌｅであり、
    Ｘ91は、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＡｌａであり、
    Ｘ92は、Ｌｅｕ、ＶａｌまたはＭｅｔであり、
    Ｘ93は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ ＡｓｎまたはＡｌａであり、
    Ｘ94は、ＧｌｙまたはＴｈｒであり、ならびにＺ1は、−ＣＯＯＨ、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）、ＫＲＮＲＮＮＩＡ（配列番号８２１）およびＫＲＮＲ（配列番号８２２）からなる群から選択される）
    を含む、
    請求項１から８までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  20. Ｘ80がＨｉｓまたはＴｙｒであり、
    Ｘ86がアミノイソ酪酸であり、
    Ｚ1がＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）である、
    請求項１９に記載のコンジュゲート。
  21. 前記インクレチンペプチドが、
    Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７５６）、
    Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３１）、
    Ｈ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３２）、
    ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３３）、および
    ＹａｉｂＥＧＴＦＩＳＤＹＳＩＹＬＤＲＱＡＡａｉｂＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３４）
    からなる群から選択されるペプチドであり、
    インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、式ＩＩ
    （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０または１であり、ｍは１、２または３である）
    の一般構造を含み、
    前記インスリンペプチドが、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）
    ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）
    ＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）からなる群から選択されるＢ鎖配列とを含む、
    請求項１９に記載のコンジュゲート。
  22. インクレチンをインスリンペプチドに結合させる前記直鎖スペーサーが、式ＩＩの一般構造を含む、請求項１９から２１までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
    （式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、Ｈ、およびＣＨ3からなる群から独立に選択され、ｎは０であり、ｍは２である）
  23. 前記インクレチンペプチドが、配列：
    Ｙ（ａｉｂ）ＥＧＴＦＴＳＤＹＳＩＹＬＤＫＱＡＡ（ａｉｂ）ＥＦＶＮＷＬＬＡＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号７５６）、または
    Ｈ（ａｉｂ）ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＡＡＱＤＦＶＱＷＬＬＤＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１９３１）を含み、
    前記インスリンペプチドが、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩＣＳＬＹＱＬＥＮＹＣＮ−Ｒ13（配列番号１）のＡ鎖配列と、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＰＫＴ（配列番号２）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＫＰＴ（配列番号９）、ＦＶＮＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＤＫＴ（配列番号５）、およびＦＶＫＱＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴＥＫＴ（配列番号６）からなる群から選択されるＢ鎖配列とを含む、
    請求項１から１０までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  24. ｉ）インクレチンペプチドの１０、１６、２０、３０および４０位から選択される位置、またはインスリンペプチドのＢ２４、Ｂ２８もしくはＢ２９位の１個または２個のアミノ酸の側鎖が、非天然アルキルまたはアシル基をさらに含む、あるいは
    ｉｉ）インクレチンペプチドの２４、３０もしくは４０位から選択される位置、またはインスリンペプチドのＢ２４、Ｂ２８もしくはＢ２９位の１個または２個のアミノ酸の側鎖が、親水性部分に連結され、前記親水性部分がポリエチレングリコールであってもよい、あるいは
    ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との組合せ
    である、請求項１から１０まで、１２から１５まで、および１９から２３までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  25. ｉ）１０または４０位のアミノ酸の側鎖が、非天然アルキルまたはアシル基をさらに含むか、あるいは
    ｉｉ）インクレチンペプチドの２４もしくは４０位、またはインスリンペプチドのＢ２８もしくはＢ２９位のアミノ酸の側鎖が、親水性部分に連結され、前記親水性部分がポリエチレングリコールであってもよいか、あるいは
    ｉｉｉ）ｉ）とｉｉ）との組合せ
    である、請求項２４に記載のコンジュゲート。
  26. アシル基またはアルキル基が、インクレチンペプチドの１０位のアミノ酸の側鎖に連結される、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. インクレチンペプチドが、式Ｉ
    （式中、ｎ＝１〜４である）
    のアミノ酸による１０位でのアミノ酸置換を含み、式Ｉのアミノ酸の側鎖がアシル基またはアルキル基に共有結合により連結している、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. 請求項１から２７までのいずれか１項に記載のコンジュゲートのプロドラッグ誘導体であって、構造：
    の一般構造を有するプロドラッグペプチドエレメントが、インスリンＡ鎖のＮ末端に連結される、プロドラッグ誘導体。
    （式中、
    Ｒ1は、（Ｃ1−Ｃ6アルキル）ＮＨ−Ｒ9または（Ｃ1−Ｃ6アルキル）ＮＨ−Ｓ1−Ｒ9であり、
    Ｒ2は、ＨまたはＣ1−Ｃ6アルキルであり、
    Ｒ3は、Ｃ1−Ｃ4アルキル、Ｃ3−Ｃ8アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ4−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）からなる群から選択されるか、またはＲ4およびＲ3はこれらが結合している原子と一緒になって、４、５または６員の複素環を形成し、
    Ｒ4およびＲ8は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ2−Ｃ3アルキル）ＳＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6シクロアルキル）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）、およびＣ1−Ｃ12アルキル（Ｗ1）Ｃ1−Ｃ12アルキルからなる群から独立に選択され、Ｗ1は、Ｎ、ＳおよびＯからなる群から選択されるヘテロ原子であるか、またはＲ4およびＲ8は、これらが結合している原子と一緒になって、Ｃ3−Ｃ6シクロアルキルを形成し、
    Ｒ10、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は、Ｈ、ＣＨ3、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＣＯＯＨ、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ4アルキル）ＮＨＣ（ＮＨ2 +）ＮＨ2およびＣＨ2（Ｃ3−Ｎ2複素環）からなる群から独立に選択され、
    Ｒ5は、ＮＨＲ6またはＯＨであり、
    Ｒ6は、Ｈ、またはＣ1−Ｃ8アルキルであり、
    Ｒ7は、Ｈ、ＯＨ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、Ｃ2−Ｃ18アルケニル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＮＨ2、および（Ｃ0−Ｃ4アルキル）ＯＨからなる群から選択され、
    Ｒ9は、Ｃ20−Ｃ30アシルからなる群から選択され、
    Ｓ1は、結合であるか、または１〜６個のアミノ酸からなるスペーサーであり、前記スペーサーは、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン酸、アルギニンおよびリシンからなる群から選択される１つまたは複数の荷電アミノ酸を含む）
  29. インスリンペプチドが一本鎖インスリンであり、Ｂ鎖とＡ鎖とを結合させるペプチドリンカーが、ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＲ（配列番号１９２２）、ＳＳＳＳＲＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＫ（配列番号１９２３）、ＧＡＧＳＳＳＸ57Ｘ58（配列番号７６）、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号６１）およびＧＹＧＳＳＳＸ57Ｘ58ＡＰＱＴ（配列番号７７）からなる群から選択され、
    Ｘ57およびＸ58が独立にアルギニン、リシンまたはオルニチンである、
    請求項１から２７までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  30. ペプチドリンカーが、ＧＹＧＳＳＳＲＲ（配列番号６１）およびＧＡＧＳＳＳＲＲ（配列番号１９２５）からなる群から選択される、請求項２９に記載のコンジュゲート。
  31. インクレチンペプチドが、配列Ｘ1Ｘ2ＥＧＴＦＴＳＤＸ6ＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫ−Ｒ4（配列番号１９３６）、またはＸ1Ｘ2ＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＸ5ＡＫＤＦＶＸ3ＷＬＭＮ−Ｒ4（配列番号１９３７）
    を含み、
    Ｘ1＝Ｈｉｓ、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノヒスチジン、ヒドロキシル−ヒスチジン、アセチル−ヒスチジン、ホモ−ヒスチジンまたはアルファ、アルファ−ジメチルイミジアゾール酢酸（ＤＭＩＡ）Ｎ−メチルヒスチジン、アルファ−メチルヒスチジン、またはイミダゾール酢酸であり、
    Ｘ2＝Ｓｅｒ、Ｄ−セリン、Ａｌａ、Ｖａｌ、グリシン、Ｎ−メチルセリンまたはアミノイソ酪酸（ＡＩＢ）、Ｎ−メチルアラニンまたはＤ−アラニンであり、
    Ｘ3＝Ａｌａ、ＧｌｎまたはＣｙｓ−ＰＥＧであり、
    Ｒ4＝Ｔｈｒ−ＣＯＮＨ2またはＣｙｓ−ＰＥＧまたはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号５１５）、ＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣＫ（ｒＥＣ１６）Ｃ（配列番号１９３５）であり、
    Ｘ5＝ＡｌａまたはＡｒｇであり、
    Ｘ6＝バリン、チロシンまたはＫ（ｒＥＣ１６）Ｃであり、
    Ｘ3がＣｙｓ−ＰＥＧである場合、Ｘ4はＣｙｓ−ＰＥＧまたはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳＣ−ＰＥＧ（配列番号５１６）ではなく、Ｘ2＝Ｓｅｒである場合、Ｘ1はＨｉｓではない、
    請求項１から１１までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  32. 前記インクレチンペプチドのカルボキシ末端に連結された、配列番号７８、７９および８０からなる群から選択されるペプチドをさらに含む、請求項１から３１までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  33. インクレチンペプチドが、ＧＩＰアゴニスト活性を有するグルカゴンの類似体（配列番号７０１）を含み、前記類似体が、以下の改変：
    （ａ）ＧＩＰアゴニスト活性を付与する１位でのアミノ酸改変であって、１位のアミノ酸がイミダゾール側鎖を欠くアミノ酸であってもよい、アミノ酸改変、
    （ｂ）１６位のＳｅｒの、式ＩＶのアミノ酸でのアミノ酸置換
    ［式ＩＶ］
    （式中、ｎは１〜７であり、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ、Ｈ、Ｃ1−Ｃ18アルキル、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＯＨ、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＮＨ2、（Ｃ1−Ｃ18アルキル）ＳＨ、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ2−Ｃ5複素環）、（Ｃ0−Ｃ4アルキル）（Ｃ6−Ｃ10アリール）Ｒ7、および（Ｃ1−Ｃ4アルキル）（Ｃ3−Ｃ9ヘテロアリール）からなる群から独立に選択され、Ｒ7はＨまたはＯＨであり、式ＩＶのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含み、式ＩＶのアミノ酸は、ホモＬｙｓ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、または２，４−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）であってもよい）
    （ｃ）類似体の１６、２０、２１および２４位のアミノ酸のうちの１、２、３個、または全部の、α，α−二置換アミノ酸での置換、
    （ｄ）２７、２８および２９位のうちの１、２個または全部におけるアミノ酸改変、ならびに
    （ｅ）グルカゴン配列（配列番号７０１）と比較して１〜９個のさらなるアミノ酸改変
    のうちの１つまたは複数を含み、
    ＧＩＰ受容体活性化に関する類似体のＥＣ５０が約１０ｎＭ以下である、
    請求項１から１０までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  34. インクレチンペプチドが、以下の改変：（ａ）１位のアミノ酸が、大きい芳香族アミノ酸であり、Ｔｙｒであってもよいこと、および（ｂ）（ｉ）２７位のＭｅｔが、大きい脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｌｅｕで置換されていてもよいこと、（ｉｉ）２８位のＡｓｎが、小さい脂肪族アミノ酸で置換されており、Ａｌａで置換されていてもよいこと、もしくは（ｉｉｉ）２９位のＴｈｒが、小さい脂肪族アミノ酸で置換されており、Ｇｌｙで置換されていてもよいこと、を含むか、または類似体が（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の組合せを含む、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. インクレチンペプチドが、２９位のアミノ酸に対してＣ末端に位置する位置で前記ペプチドに連結された、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）またはＸＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号９６）のアミノ酸配列（式中、Ｘが任意のアミノ酸であり、Ｇｌｙであってもよい）をさらに含む、請求項３３または３４に記載のコンジュゲート。
  36. インクレチンペプチドが、以下の改変：
    （ａ）Ｄ−Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｎ−メチル−Ｓｅｒ、ＡＩＢ、Ｖａｌ、またはα−アミノ−Ｎ−酪酸で置換された２位のＳｅｒ、
    （ｂ）Ｇｌｕで置換された３位のＧｌｎ、
    （ｃ）１０位のアミノ酸Ｔｙｒの、アシル基またはアルキル基に共有結合により連結している側鎖を含む、式Ｉ
    （式中、ｎ＝１〜４である）
    のアミノ酸であってもよい、アミノ酸での置換、
    （ｄ）類似体のＣ末端アミノ酸でアシル基またはアルキル基に共有結合により連結している側鎖を含む、式Ｉのアミノ酸であってもよい、アミノ酸の付加、
    （ｅ）Ｉｌｅで置換された１２位のＬｙｓ、
    （ｆ）Ｇｌｎで置換された１７位のＡｒｇ、
    （ｇ）Ａｌａで置換された１８位のＡｒｇ、
    （ｈ）Ｇｌｕで置換された２１位のＡｓｐ、
    （ｉ）Ａｓｎで置換された２４位のＧｌｎ、および
    （ｊ）Ｃ末端アミノ酸のカルボン酸の、アミドであってもよい電荷中性基による置き換え
    のうちの１つまたは複数をさらに含む、請求項３３から３５までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  37. インクレチンペプチドが、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＲＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ（配列番号７００）、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号７０３）、ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＣＷＬＶＫＧＲ（配列番号７１７）ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号７０１）またはＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＥＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ（配列番号６９９）の配列を含み、配列番号７０３、配列番号７１７、配列番号７０１または配列番号６９９のいずれかが、ＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号８２０）またはＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１０９６）のアミノ酸配列の末端伸長をさらに含んでもよい、請求項１から１０までのいずれか１項に記載のコンジュゲート。
  38. 構造Ｕ−Ｊをさらに含み、
    Ｕがアミノ酸またはヒドロキシ酸であり、
    Ｊが、Ｊのカルボキシル部分とコンジュゲートのアミンとの間のアミド結合を介して前記コンジュゲートに連結されたＮ−アルキル化アミノ酸であり、コンジュゲートからのＵ−Ｊの化学切断半減期（ｔ1/2）が、生理的条件下、ＰＢＳ中で少なくとも約１時間〜約１週間である、
    請求項１から２７まで、または２９から３４までのいずれか１項に記載のコンジュゲートの誘導体。
  39. Ｕ−Ｊのアミノ酸側鎖に共有結合により連結しているアシル基またはアルキル基をさらに含む、請求項３８に記載のコンジュゲート。
  40. 前記アシル基またはアルキル基が、天然グルカゴン（配列番号７０１）の１０位に対応するインクレチンペプチドの位置、またはインスリンペプチドのＢ１、Ｂ３、Ｂ２８、もしくはＢ２９から選択される１つもしくは複数の位置、または構造Ｕ−Ｊのアミノ酸の側鎖に共有結合により連結している、請求項３９に記載のコンジュゲート。
  41. ２つのインクレチン−インスリンコンジュゲート間で形成される二量体であって、第１および第２のインクレチン−インスリンコンジュゲートが、請求項１から４０までのいずれか１項に記載のコンジュゲートから独立に選択される、二量体。
  42. 請求項１から４１までのいずれか１項に記載のコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
  43. 請求項４２に記載の医薬組成物、および前記組成物を患者に投与するためのデバイスを含む、インスリンアゴニスト／インクレチンコンジュゲートを、それを必要とする患者に投与するためのキット。
  44. 糖尿病の処置のための、請求項４２に記載の組成物、または薬学的に許容されるその塩のコンジュゲートの使用。
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