CZ186492A3 - Insulin analog, process of its preparation and a pharmaceutical composition containing thereof - Google Patents

Description

Vynález se týká oblasti lidské medicíny a zvláště se týká ošetřování diabetes. Především se vynález týká analogů molekuly lidského inzulínu, způsobu použití takových analogů a farmaceutických prostředků, které analogy lidského inzulínu obsahují

Dosavadní stav techniky

Diabetes mellitus je metabolická porucha, vyznačující.¹ se poruchou lidských tkání se zřetelem na oxidaci uhlohydrátů normální mírou. Nedostatek inzulínu je nejdůležitějším faktorem při diabetickém onemocnění. V průběhu posledních 70 let bylo velkou pomocí pro nemocné diabetes podávání řízeného množství inzulínu. Až do časných 80. let se inzulín, používaný při diabetes, izoloval se zvířecího pankreas, obecně z hovězího nebo vepřového pankreas. Zavedením rekombinantní DNA technologie je. možné produkovat velké množství přirozeného lidského inzulínu a rovněž přírodně se vyskytujících i v přírodě se nevyskytujících analogů lidského inzulínu. Tyto inzulínové analogy mají různé fyzikální a chemické vlastnosti ve srovnání s přírodním lidským inzulínem.

Přírodní lidský inzulín obsahuje hietidinový zbytek v poloze 10 B-řetězce. Nahrazením tohoto zbytku zbytkem kyseliny :asparagové a odstraněním lysinových a threoninových zbytků v poloze 29 a 30 B-řetězce se vytvoří analog Asp/B10/, des /B29-30/ lidského inzulínu, který se agreguje v roztoku.

Ξ překvapením odstranění prolinového zbytku v poloze 28 tohoto analogu k získání Asp/B10/, des/B28-30/ lidského inzulínu vede k molekule, která je stálé, rychle působící a udržovaná v roztoku převážně jako monomer. Kromě toho eliminace threoninového zbytku v poloze 27 B-řetězce Asp/B10/, des/28- 2 30/ lidského inzulínu vytváří Asp/B10/, des/27-30/ lidský inzulín, který je rovněž stálý, rychle působící a monomemí v roztoku.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 vhodně sesítěný na SEQ ID K0s2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž je podle vynálezu Xaa v poloze 21 SEQ ID NO:1 volena 2e souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO ί 2 je volena ze souboru zahrnujícího Asp a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ IE HO: 2 je volena ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

Vynález se tedy týká analogů lidského inzulínu modifikovaných výměnou aminokyseliny 10.nativního lidského inzulínové-, ho řetězce B z histidiňu-na asparagovou kyselinu a odstraněním tripeptidu nebo tetrapeptidů z karboxylového terminu nativního lidského inzulínového B-řetězce. Tyto molekuly se také mohou modifikovat v poloze 21 nativního lidského inzulínového A řetězce v obou polohách 1 a 3 nativního lidského inzulínového B-řetězce, Tyto inzulínové analogy jsou mnohem stálejší a méně náchylné k dimerizaci nebo spontánní asociaci na formy s vyšší molekulovou hmotností, a proto začínají poměrně rychleji působit, přičemž,si uchovávají biologickou účinnost nativního lidského inzulínu.

Vynález se také týká ošetřování hyperglykemie podáváním v případě potřeby nemocným jedincům účinného množství těchto analogů. Vynález se také týká farmaceutických prostředků, obsahujících účinné množství inzulínového analogu podle vynálezu spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými excipienty^..... .......

Nadále se používá následujících výrazů a zkratek:

Aep/B10/, des/B28-30/ BI - á»álog lidského inzulínu, kde histidinový zbytek v poloze 10 B-řetězce nativního lidského inzulínu, je vyměněn zbytkem kyseliny asparagov.é a aminokyselinový zbytek 28 až 30 nativního lidského inzulínového

- 1 B-řetězce je eliminován.

Asp/BlO/, des/B27-3O/ HI - analog lidského inzulínu, kde je histidinový zbytek v poloze 10 B-řetě2ce nativního lidského inzulínu zaměněn za zbytek kyseliny asparagové a aminokyselinové zbytky 27 až 30 B-řětě2ce nativního lidského inzulínu jsou eliminovány.

BHI - biosyntetický lidský inzulín £

Sesitění - vytvoření dišulfidických vazeb mezi cystfinovými zbytky. Vhodně sesítěný nativní lidský inzulín nebo inzulínový analog obsahuje tři disulfidické můstky. První disulfidický můstek je zjištěn mezi cysteinovými zbytky v polohách 6 a 11 A-řetězce. Druhý disulfidický můstek váže cystein v poloze 7 A-řetězce na cystein v poloze 7 B-řetězce. Třetí disulfidický můstek váže cystein v poloze 20 A-řetŠzce na cystein v poloze 19 B-řetězce. 4

SEQ ID NOil - první sekvence následující sekvenci^, která je analogem sekvence A-řetězce lidského inzulínu se .sekvencí Gly Ile Val Glu, Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin

10 15'

Leu Glu Asn Tyr Cys Zaa přičemž Zaa znamená Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser.

SEQ ID NO: 2 - druhá sekvence následující sekvenci, která je analogem sekvence B-řetězce lidského inzulínu se sekvencí

Zaa Val Zaa Gin His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu 1 5 - . 10 .15

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr 20 25 kde znamená Zaa v poloze 1 Phe nebo Asp a Zaa v poloze 3 Asn nebo Asp.

Všechny zkratky aminokyselin jsou podle amerického úřadu United States Patent and Trademark Office a jsou uvedeny v 37 C.P.R. §1.822 /b//2//l990/.

Vynález se tedy týká analogů inzulínu vzorce

SEQ ID HO:1 /Gly Ile Val Glu Glu Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin

5 10 15 ;

Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa/ vhodně sesítěných na

SEQ ID H0:2 /Xaa Val Xaa Gin His Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala Leu ='

-1 5 10 15 Í

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr/ Z

25 '· nebo jejich farmaceuticky vhodné soli, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID H0:l /A-řetězec inzulínu/ znamená Asn, Asp, Glu, Gin,

Ala, Gly nebo Ser; Xaa v poloze 1 SEQ ID R0:2 /B-řetězec inzulínu/ znamená Phe nebo Asp; a Xaa v poloze 3 SEQ ID Ε0Ϊ2 znamená Asn nebo Asp. S výhodou Xaa v poloze 21 SEQ ID R0;l znamená Gly, Ala,. Ser nebo Asn. Asparagin je obzvláště výhodnou aminokyselinou v poloze 21. Výhodnou aminokyselinou v poloze 1 SEQ ID K0:2 je Phe a nejvýhodně jším zbytkem v poloze 3 SEQ ID H0:2 je Asn. Obzvláště výhodným podle vynálezu je analog inzulínu, kde Xaa v poloze 21 SEQ ID H0:l je Asn, Xaa v poloze 1

SEQ ID HO:2 je Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID K0:2 je Asn. V nor- \ malizované biochemické terminologii, známé pracovníkům v oboru, je obzvláště výhodným analog lidského inzulínu Asp/BlO/, des /B28-30/.

Vynález se tedy týká analogů lidského inzulínu vzorce

SEQ ID N0:l vhodně sítěného na aminokyseliny 1 až 26 SEQ ID

HO:2 nebo jejich farmaceuticky vhodné soli přičemž. Xaa ý p.oloze.21 SEQ ID H0:l je Asn, Asp, Glu, Gin, Ala,

Gly nebo Ser; Xaa v poloze 1 SEQ ID K0:2 je Phe nebo Asp; a

Xaa v poloze 3 SEQ ID HO:2 je Asn nebo Ašp. S výhodou Xaa v poloze 21 SEQ ID N0;l je Gly, Ala, Ser nebo Asn, přičemž je Asn nejvýhodnější. Výhodnou aminokyselinou v poloze 1 SEQ ID H0:2 je Phe a nejvýhodnější aminokyselinou-v poloze 3 SEQ ID H0:2 je Asn. Obzvláště výhodným je podle vynálezu analog, kde Xaa .

- 5 v poloze 21 SEQ ID N0:l je Asn, Xaa v poloze 1 SEQ IL NO:2 je řhe, Xaa v poloze 3 SEQ IL NO:2 je Asn a SEQ IL NO: 2 končí na zbytku 26. Podle normalizované terminologie v biochemii je uvedeným obzvláště výhodným analogem lidského inzulinu Asp/B10/, des/B27-3O/.

Další analog podle vynálezu má vzorec

SEQ IL N0:l vhodně sesítěný na aminokyseliny 2 až 27 SEQ ID NQ:2 nebo'jeho farmaceuticky vhodná sůl, ..

přičemž Xaa v poloze 21 SEQ IL N0:l je Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser; a Xaa v poloze 3 SEQ IL NO:2 je Asn nebo Asp,

^alší analog podle vynálezu má vzorec

S,EQ ID N0:l vhodně sesítěný na aminokyseliny 2 až 26 SEQ IL N0:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl přičemž Xaa v poloze 21 SEQ IL N0:l je Asn, Asp, Glu, Gin,]

Ala, Gly nebo Ser; a Xaa v poloze 3 SEQ IL NO:2 je Asn nebo Asp. S výhodou Xaa v poloze 21 SEQ IL N0:l je Asn a Xaa v poloze 3 SEQ ID NO:2 je. také Asn. Uvedený analog je znám v normalizované biochemické terminologii jakožto Asp/BlO/, des/Bl/, des/B27-30/ lidského inzulinu.

Analogy inzulinu podle vynálezu mají snížení sklon dimerizovat nebo se jinak samovolně spojovat na formy s vyšší molekulovou hmotností jak v roztoku, který obsahuje zinek tak v roztoku, který je zinku prostý. Analogy jsou proto v roztoku obecně v monomerní formě a po podání začnou rychle působit.

Jak shora uvedeno, týká se vynález také farmaceuticky vhodných solí analogů inzulinu. 3 výhodou jde o· soli zinečnaté, sodné, draselné, hořečnaté nebo vápenaté a o směsi těchto solí.

Analogy inzulinu podle vynálezu se mohou připravovat nejrůznějšími způsoby, známými pro přípravu peptidů, včetně klasického způsobu /v roztoku/, způsobů s pevnou fází, polosyntetických způsobů a nejnovějŠích LNA rekombinantních

- 6 γ

i.

izpůsobů.

Při způsobu, s pevnou fází se aminokyselinová sekvence konstruuje se-kvenciálně z počáteční, nerozpustné C-koncové aminokyseliny na nosiči. Technika způsobu s pevnou fází je popsána J. Stewartem a kol., Solid-Phase Peptide Synthesis /Synthesa peptidu na pevné fázi/ Preeman a Co., San Francisco, 1969.

Obecně se při způsobu s pevnou fází aminokyselina, odpovídající C-koncovému aminokyselinovému zbytku, žádaného peptidu, zakotvuje na nerozpustném pryskyřičném nosiči apaptidový řetězec se pak vytváří na C-koncové aminokyselině na pryskyřičném nosiči. Následně se zavádějí jednotlivé aminokyseliny až do získání žádané sekvence. Nebo se mohou připravovat malé peptidové fragmenty a zavádět se v požadovaném sledu k vytvořená peptidováho řetězce. Peptidový řetězec zůstává vázán na pryskyřici po celou dobu syntézy a po ukončení přípravy se peptidový řetězec od pryskyřice odštěpí.

Peptidový řetězec je vázán na polystyrénovou pryskyřici esterovou vazbou, vytvořenou mezi karboxylovou skupinou Ckoncového podílu a specifickou methylenovou skupinou v pryskyřičné matrici, jakožto místu takového vázání.

Aminokyseliny se kopulují o sobě známými způsoby pracovníkům v oboru pro vytváření peptidových vazeb. Jeden způsob zahrnuje převádíšní aminokyseliny na derivát, pro který je karboxylová skupina citlivější k reakci s volnou N-koncovou aminoskupinou peptidového fragmentu. Například se aminokyselina může převádět na směsný anhydrid reakcí ¹ chráněné/ aminokyseliny s ethylchlorformátem, s fenylchlorformátem, se sek.-butylchlorformátem nebo s isobutylchlorformátem. Nebo _se .aminokyselina může převádět na aktivní ester, například na 2,4,5-tricklorfenylester, na pentachlorfenylester, na pnitrofenylester, na N-hydroxysukdinimidester nebo na ester, . připravený z 1-hydroxybenzotriazolu.

Podle jiného kopulačního způsobu se používá vhodných kopulačních činidel, jako je například N,N^z-dicyklóhexylkárbodiimid /NCC/ nebo N,N^z-dii30propylkarbodiimid /NIC/, ^al ší vhodná kopulační činidla jsou pracovníkům v oboru známa.

ΐ

LS fe 'r

Jsou uvedena také například v publikaci Schroder a lubke,

The Peptides, Academie Press, 1965, kapitola III.

Připomíná se, že χ,-aminoskupina každé použité aminokyseliny při syntéze peptidů musí být chráněna v průběhu kopulační reakce, aby se předcházelo vedlejším reakcím na této reaktivní o(,-amino skupině, Připomíná se také, Že určité aminokyseliny obsahují reaktivní funkční skupiny na vedlejším řetězci /příkladně se uvádějí sulfhydrylová skupina, £-aminoskupina, β- a /-karboxylová skupina, imidazolová skupina, guanidoskupina a hydroxylová skupina/, přičemž se takové funkční skupiny musejí také'chránit.v počátečním a v následujících kppulačních stupních. Vhodné chránící skupiny jsou v oboru známy. Příkladně se uvádí publikace Protective Groups in Organic Chemistry /Chránící skupiny v organické chemii/, M. IScQmie, vyd., Plenům Press, N.Y., 1973 a americký patentový spis číslo 4 617149.

Při volbě určité chránící skupiny se musí dbát některých podmínek. Skupina chránící c( -aminoskupinu musí 1/ dodávat ·„.

OL -aminoskupině inertnost za podmínek .při kopulační reakci,;

2/ musí být snadno odstranitelná po kopulční reakci za podmíl nek, při kterých se neodstraní chránící skupiny vedlejších řetězců a nesmí měnit strukturu peptidového fragmentu a 3/ musí vylučovat možnost racemizace po aktivaci bezprostředně před kopulací. Skupina, chránící vedlejší řetězec,musí 1/ dodávat funkční skupině vedlejšího řetězce inertnost za podmínek při kopulační reakci, 2/ musí být 3tálá za podmínek odstraňování chránící skupiny z fct/-aminoskupiny a 3/ musí být snadno odstranitelná po ukončení žádané sekvence aminokyselin za reakčních podmínek a neměnit strukturu peptidového řetězce.

Pracovníkům v oboru je známo, že chránící skupiny, používané pro přípravu peptidů, mají různou reaktivitu k činidlům, používaným pro jejich odstraňování. Například určité chránící skupiny, například skupina trifenylmethylová a 2/p-bifenylyl/isopropyloxykarb^nylová, jsou velmi labilní a mohou se odštěpovat za mírnýeia^p&dmínek. Jiné chránící skupiny, jako například skupina terč.-butylkarbonylová, terc.-amyloxykarbonylová, adamantyloxykarbonylová a p-methoxybenžyloxy- 8 karbonylová, jsou méně labilní a vyžadují použití mírně silných kyselin, jako je například kyselina trifluoroctové, chlorovodíková nebo bortrifluorid v kyselině octové, pro své odstranění. Ještě jiné chránící ’ skupiny, jako je například skupina benzyloxykarbonylová, halogenbenzyloxykarbonylová, p-nitrobenzyloxykarbonylová, cykloalkyloxykarbonylová a is.o pro pyl oxykarbonylová, jsou ještě méně labilní a vyžadují pro své odstranění použití silnějších kyselin, jako je například fluorovodíková, bromovodíková kyselina nebo bortrifluoracetát v kyselině trifluoroctové.

Po ukončení žádoucí sekvence peptidu se chráněný peptid musí odštěpit od pryskyřičného nosiče a všechny chránící skupiny se musí odstranit. Reakce odštěpení od nosiče a odstranění chránících skupin se mohou provádět současně nebo postupně. Jestliže je pryskyřičným nosičem chlormethylovaná polystyrénová pryskyřice, vazbou, zakotvující peptid do pryskyřice, je esterová vazba, vytvořená mezi volnou karboxylovou skupinou C-koncového podílu, a jednou z. četných chlormethylových skupin na pryskyřičné matrici. Zakotvující vazba se může rozštěpit reakčními. činidly, o nichž je známo, še štěpí esterovou vazbu a pronikají do pryskyřičné.matrice. Obzvláště vhodným způsobem je zpracování kapalným bezvodým fluorovodíkem. Toto Činidlo nejen odštěpuje peptid od pryskyřice, ale také odstraňuje všechny chránící skupiny.’Proto se zpracováním tímto činidlem dosahuje žádaného úplného odstranění chránících'Skupin z peptidu. Pokud je» žádoucí odštěpit peptid bez odstranění chránících skupin, podrobuje se systém chráněný peptid-pryskyřice methanolyze, čímž se získá chráněný peptid, ve kterém je C-koncová karboxylová skupina methylována. Methylester se pak může hydrolyzovat za mírných, alkalických podmínek, čímž se získá volná C-koncová karboxylová skupina. Chránící skupiny z peptidového řetězce se mohou odstranit zpracováním silnou kyselinou, jako je kapalný' fluorovodík. Obzvláště užitečným způsobem methanolyzy je způsob, který popsal δ. Moore a kol., Peptides, Proč. 5. Amer.

Pept. Symp., M. Goodman a J. Meienhofer, Eds. John Wiley, N.Y.,

1977, str. 518 až 521, -podle kterého se chráněný pe.p.tid-pryskyřice zpracovává methanolem a kyanidem draselným v přítomnosti crown etheru.

- 9 Jiným způsobem odštěpení chráněného peptidu, od pryskyřice je amonolyza nebo zpracování hydrazinem. Popřípadě se získaný

C-koncový amid nebo hydrazid může hydrolyzovat na volnou C-koncovou karboxylovou skupinu a chránící skupiny se pak mohou odště pit o sobě známým způsobem.

Je také známo, že se chránící skupina na N-koncové ct-aminoskupině může s výhodou odstranit před odštěpením nebo zároveň s odštěpením chráněného peptidu od pryskyřičného nosiče.

Setě zce A a B analogů inzulínu podle vynálezu se také mohou. připravovat rekombinantní DNA metodikou. V takovém případě ae připravuje nukleotidová sekvence zakódující žádaný peptid řetězce A a B využitím o sobě známých způsobů.. Tyto způsoby zahrnují obecně přípravu oligonukleotidů 2akodujících jak-, fragϋ Ϊ menty žádané zakodující sekvence ;tek jejich komplementární sekvenci. Oligonukleotidy jsou určeny k překrytí fragmentu 'zakodující sekvence se dvěma fragmenty komplementární sekvence a naopak. Oligonukleotidy se zpárují a.připojí za konečné produkce žádané genové sekvence.

Sekvence se včlení do klonavacího vektoru na místě exprese zakódovaného peptidového produktu. Konstrukce plasmidu, schopného exprese próinaulinu a analogů proinzulinu je popsána:

Chance a kol,, evropský patentový spis číslo 0 383472, zveřejněno 22.8.1990.

Řetězce A a B analogů inzulínu podle vynálezu se mohou také připravovat přes proinzulínovítou prekursorobou molekulu rekombinantním DNA způsobem. Viz Prank a kol., Peptides: SynthesisStructure - Punction, Peoc. Seventh Am. Pept. Symp., Eds. D.

Rich a E. Gross /1931/.

Kombinace jednotlivých řetězců A a B je také možná způsobem, který popsal Chance a kol., Peptides: Synthesis, Structure and Punctioň: Proč. of Seventh American Peptide Symposium /1981/.

Následující příklady praktického provedení způsob podle vynálezu objasňují, nijak jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Asp/BlO/, dés/B27-30/ lidský inzulín

A. Enzymatická semisyntéza

Uvedený analog inzulínu se připravuje enzymatickou semisyntésou /reverzní proteoly2ou/. za použití Asp/BlO/ desoktapeptidu /B23-3O/ lidského inzulínu a syntetického tetrapeptidu Gly-Phe-Phé-Tyr. Tetrapeptíd se připravuje syntézou peptidu v pevné fázi, zatímco Asp/BlO/des-oktapeptidový lidský inzulin se odvozuje od Asp/BlO/ lidského proinsulinu trypsinovou hydrolvtickou reakcí, která odstraňuje sekvenci 23-55. Asp^ÓLC/ proinzulinový analog se připravuje rekombinantni DNA techno- . logií v podstatě způsobem, který popsal Chance a kol., evropská přihláška vynálezu 0 383472, zveřejněná 22.8.1990. Na str. 35 SPO 0 383472 se popisuje nukleotidová spojovníková/ sekvence /ii/, které se používá ke konstrukci plasmidu pRB176 zakóduj ící iíet-Tyr-/~Asp/Bl/, Lys/B2S/, Pro/B29/HPI_7· Asp/B10/ plasmid, používaný k. produkci výchozího materiálu podle vynálezu zahrnuje spojovník podobný spojovníku /ii/ s. výjimkou, že sekvence CGAC zakodující Asp v sekvenci /íi/. je nahraženjsekvencí TTTT zakodující Phe a sekvencfě CAT zakodující His je nahrazena sekvencí GAC k vytvoření plasmidu zakódujícího Asp/B10/, Lys/B28/, Pro/B29/ lidský proinzulin. Nadbytek genetického kódu a znalosti pracovníků v oboru umožňují vytvoření četných substitucí pro konstrukci plasmidu zákodujícího Asp/B10/ lidský proinzulin.

Asp/B10/ des-oktapeptidový lidský inzulin se připravuje tímto způsobem: 700 ml /9,8 g/ vlásenkového Asp/BlO/ lidského proinzulinu v glycinovém pufru o hodnotě pH 2,5, se upraví na hodnotu pH 10,2 přidáním 25 ml ' hydroxidu- amonného zamíchání. Hodnota pH se pak rychle upraví na 9,10 přidáním 20 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Do tohoto roztoku se přidá 7 ml chloridu vápenatého jakožto roztoku ve vodě /14,7 mg/ml/ a pak 7Q ml 14 mg/ml roztoku vepřového, trypsinu ve vodě za poměru enzymu k substrátu hmotnostně 1 : 10. Tryp-.

- 11 sinová hydrolytiché reakční směs se dobře promíchá a pak se uloží při teplotě 25 °C na dobu 17 hodin, načež se reakce ukončí přidáním 160 ml ledové kyseliny octové k dosažení konečné hodnoty pH 3,09. Pak se přidá 105 ml acetonitrilu.

Pro izolaci a čištění rezultujíčího Asp/B10/ des-oktapeptidového lidského insulinu se triptický roztok čerpá na 5,5 x 30 cm HPLC sloupecyVydac při teplotě 25 °C. Pro tuto chromátografii se připraví dva pufry: pufr A sestávající z 10 dílů acetonitrilu a 90 dílů 0,5$ roztoku TPA /kys&Lina trifluor octová/· a pufr 3, sestávající s 50 dílů acetonitrilu a 50 dílů 0,5$ roztoku TPA. Po krátkém promytí pufrem A se čerpá lineární gradient 0 až 20 $ pufru B sloupcem rychlostí 2,4 ml/min. po dobu 16 hodin a pak lineární gradient 20 až 70 $ pufru B rychlostí 8 ml/min po dobu 8 hodin. Hlavní pík, obsahující Asp/B10/ des-oktapeptid lidského inzulinu eluuje' přibližně při koncentraci pufru B 50 $. Frakce, obsahující obsažený materiál na základě analytické HPLC s reverzní fází se kombinuje a lyofilizuje. Konečný hmotnostní zisk je 5,5 g s čistotou HPLO 93$. Autenticita Asp/B10/ desoktapeptidu? /B23-3O/ lidského insulinu se ověřuje aminokyselinovou analýzou, hmotovou spektroskopií a analýzou koncové BHg.

Pro přípravu žádaného analogu inzulínu se smísí 545 mg Asp/B10/ des-oktapeptidu lidského inzulinu a 300 mg' syntetického tetrapeptidu Gly-Phe-Phe-Tyr v 15 ml roztoku obsahujícího jeden díl dimethylsulfoxidu, dva díly 1,4-butandiolu a jeden díl 0,35 M tris pufru při teplotě 37 °C /hodnota pH nenastavena/. Přidá se vepřový trypsin /85 mg/. Roztok se dobře promíchá a příležitostně se míchá po dobu 360 minut při teplotě 37 °G* Bílkoviny se vysráŽejí studeným acetonem, promyjí se diethyletherem, vysuší se proudem dusíku a nakonec se rozpustí v 75 ml 6 lí systému guanidin-chlorovodík /v 0,01 N kyselině chlorovodíkové/.

Tento čirý vzorek roztoku se gelově filtruje na 5 x 200 cm sloupci Sephadexu G-50 /Superfine/ a eluuje se 1 M kyselinou octovou při teplotě íf °C. Výrok se monitoruje při

276 nm a reverzní fázovou HPLC. Frakce, obsahující žádaný

- 12 produkt se spojí /přibližně 275 ml/, zředí se na 500 ml vodou, | čerpají se na 21 x.25O mm C-8 Zorbaxový sloupec a produkty se eluují acetonitrilovým gradientem v 0,1 M fosforečnanu sodném, / hodnota pH pufru je 2· - I

Vhodné frakce, obsahující žádaný inzulínový analog, jak í se stanoví analyticky HPLC, se spojí, zředí se čtyřikrát vo- ;

dou a čerpají se na 25 x 300 mm sloupec C-18 Vydaču. Cdsolená bílkovina se eluuje acetonitrilovým gradientem v 0,5^ roztoku ·> 4 kyseliny trifluoroctové. Frakce, obsahující vyčištěný inzuli- V ) nový analog, se spojí a lyofilizují se, čímž se získá 22 mg produktu. Struktura se ověřuje hmotovou spektroskopií zs bom- - s bardování rychlými atomy /Past Atom Bombardment Kase Spectro- Ϊ scopy - FAB/íěs/ a aminokyselinovou analýzou. Výsledky FAB/iSS <

udávají molekulovou hmotnost 5356,3 /teoretická hodnota je 5358,0/. Aminokyselinové složení je, jak následuje, na bází g asparagové kyseliny jakožto molární jednotky /teoretická množ- ?

ství aminokyselin v. závorce/: Asp 4,00 /4/$ Thr, 1,00 /1/; í

Ser 2,50 /3/; Glu 6,90 /7/; Gly 3,92 /4/; Ala 1,01 /1/,·

1/2 Cys 4,9.2 /6/i Val 3,55 /4/5 Ile 1,73 /2/; Leu 6,03 /6/; |

Tyr 3,70 /4/; Phe 2,86 /5/, His 1,31 /1/; Arg 1,00 /1/. j jj

-B. Kombinace řetězce *

1. Příprava Asp/B10/,. des/B27-30/ lidského inzulínu -í

B-řetězec

Použije se peptidového^syhtetizeru Applied Biosystems t

43OA /včetně sofťwerové revi^l»4/ pro přípravu surovéha pep- | tidglové pryskyřice. Použije se 0,5 milimol /mmol/ výchozí ijí pevné fáze pryskyřice /t-BOC-Thr /Bsl/ OCHg Pam pryskyřice/ ’ _T | /0,61 mmol/g x 91 g/. Všechny použité aminokyseliny jsou chré- . £ něny BOC a s výjimkou kyseliny glutamové, asparagové a &isti- ,, $

- dinu- se všechny používají jak jsou-získány/-to je v zásob- niku z aparatury Applied Eiosystems, lne.; každý zásobník ob- £ sáhuje přibližně 2 mmol chráněné aminokyseliny/. Kyselina ΐ glutamová, kyselina asparagové a histidin jsou získány z obchodních'zdrojů a jsou převedeny jako takové do zásobníku, .

přičemž každý zásobník obsahuje přibližně 2 mmol. Žádané chrá- ;

něné .aminokyseliny..Surové peptidylové pryskyřice se usuší.' i'

- 13 ve vakuu při teplotě místnosti v průběhu 5 hodin a její hmot* nost se porovná s výchozí hmotností k zajištění rozumného hmot· ncstního přírůstků. Malá část vzorku se analyzuje se zřetelem na aminokyseliny ke zjištění, že jsou žádané aminokyseliny přidány ve správných podílech.

Peptid s.e odštěpí cd peptidylové pryskyřice a chránící skupiny s vedlejšího řetězce se odstraní mícháním po dobu přibližně jedné hodiny při teplotě 0 °C v roztoku 10 dílů /objem/ hmotnost/ fluorovodíku /obsahujícího objemově 5 p-thiokresolu a 5 λ m-kresolu/ na 1 díl peptidylové pryskyřice. Po odstranění většiny fluorovodíku ve vakuu se peptid vysráží v ethyletheru. Po několikerém promytí ethyletherem se provede vakuová filtrace a peptid se rozpustí v přibližně 200 ml syšté mu 8 M gnanidin - chlorovodík o hodnotě pH 11, obsahujícím'

0,1 M tris, 35 mg/ml siřičitanu sodného a 25 mg/ml íla^S^Og. Hodnota pH roztoku se.upraví na 8,8 5 K roztokem hydroxidu' sodného a roztok se intenzivně míchá po dobu tří hodin při teplotě místnosti.

Získaný S-sulfonovaný peptidový roztok se vnese na 5 i 215 cm sloupec Sephadexu G-25 /'brubý y p^i teplotě místnosti. Vzorek se eluuje 21 ml/min při teplotě místnosti za použití 50 mM hydrogenuhličitanu amonného. Výtok se monitoruje při 276 nm , žádaný výtok se spojí, .1000 ml, zmrazí se a lyofilizuje se.

2. Kombinace Asp/BlO/ des/B27-30/ lidského inzulínového

B-řetězce □ lidským inzulínovým A-řetězcem

Řetězce A a B se kombinují způsobem, který popsal Chance a kol. /jak shora uvedeno/ za použití rekombinantním způsobem produkovaného A řetězce, jak popsáno v evropském spise EPO 0 383472. V bance se míchá 2,27 g S-sulfonátu A-řetězce odvozeného DliA rekombinantně a 511 mg syntetického S-sulfonátu Asp/BlO/ des/27-30/a rozpustí se ve 245 ml 0,1 M glycinu při teplotě okolí. Hodnota pH roztoku se nastaví na 10,5 5N roztokem hydroxidu sodného a ochladí se na teplotu 4 °C. Připraví se roztok dithiothreitolu /Dli/ o koncentraci 15,5 mg/ml v 0,1 M glycinovém pufru při teplotě okolí, hodnota

- 14 !

ι pH se nastaví na 10,5 5H roztokem hydroxidu, sodného a pak se ochladí na teplotu 4 °C.

Rychle se přidá 18,5 ml roztoku DTT do roztoku směsi S-sulfonátů A-řetěžce a B-řetězce /SH/SSO“^ - 1,0/. EeakČní roztok se míchá při teplotě 4 °C v í3irlenmeyerově bance o obsahu 500 ml po dobu 26 hodin. Přidá se kyselina fosforečná /5,7 ml/, hodnota pH reakční směsi se sníží na 2,9.

Získaná vysrážená směs se zředí milli-Q vedou a acetonitrilem a čistí se reverzní fázovou HPLC /za použití 50 x 300 mm sloupce Vydac C-18 eluovaného při teplotě místnosti,

2,6 ml/min, za použití lineárního gradientu vzrůstajícího obsahu acetonitrilu v 0,1 55 dihydrogenfosforečnanu Rodného, hodnota pH 2,3/. Výtok se monitoruje při 280 nm. Vybrané frakce se zkoušejí analytickou HPLC. Žádané frakce se spojí /405 ml/, zředí se 400 ml milli-Q vodou, 'smísí se s 1,2 g íí^S^Og, hodnota pH se nastaví na 7 5N roztokem hydroxidu sodného a dále se Čistí reverzní fázovou HPLC /za použití 21 x 250 mm sloupce DuPont Zorbax C-8 při teplotě místnosti, 2,0.ml/min a za lineárního gradientu zvyšující se koncentrace acetonitrilu v 0,1 M monohydrogenfosforečnaau amonné‘,nr/. Výtok se monitoruje při 280 nm. Vybrané frakce se zkoušejí analytickou HPLC. Žádané frakce se spojí, hodnota pH se nastaví kyselinou fosforečnou na 2,3 a roztok se vnese na sloupec Vydac C-18 /HPLC/ /21 x 250 mm/ a eluuje se lineárním gradientem vzrůstající koncentrace acetonitrilu v 0,5$ vodném roztoku.TFA. Eluent se monitoruje při 280 nm. Vybrané frakce se zkoušejí analytickou HPLC. Vhodné frakce se spojí a lyofílizují se, čímž se dosáhne výtěžku 135 ing inzulínového analogu o čistotě vyšší než 91 $ podle reverzní fázové HPLC. Struktura se ověřuje EAB/EíS. a analýzou na aminokyseliny. Z šetření ΒΑΒ/MS vyplývá molekulová hmotnost 5358,5 /teorie 5-358,0/·. Aminokyselinové složení je na základě kyseliny asparágové jakožto molární jednotky následující /teoretická množství aminokyseliny jsou v závorkách/: Asp 4,00 /4/i Thr 0,98 /1/; Ser 2,72 /3/i Glu 7,14 /7/; Gly 3,93/4/, Ala 0,98 /l/j 1/2 Cys 5,44 /6/; Val 3,44 /4/; Ile 1,51 /2/í Leu 6,14 /6/; ^yr 3,86 /4/i Phe 2,88 /3/i His 1,09 /1/; Arg 0,97 /1/. ' ‘i }’:·.

K-ť '··;«·.

ý k

£ •Λ £

A* ;· ·

- 15 Příklad 2

Asp/BlO/, des/B28-3C/ lidský inzulín

Uvedený analog inzulinu se připravuje enzymatickou semi-r syntézou /reverzní proteolyza/ jako podle příkladu 1 za použití Asp/BlO/ des-oktapeptidu /B23-3Ó/ lidského inzulinu a syntetického pentapeptidu Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr, Pentapeptid še připravuje peptidovou syntézou sa použití pevné fáze, zatímco Asp/BlO/ des-cktapeptidový lidský inzulin se odvozuje od Asp/BlO/ lidského proinzulinu trypsinovou hydrolytickou reakcí, která odstraňuje sekvenci 23-65, jak popsáno v příkladu 1.

Pro přípravu žádaného analogu inzulínu se smísí 765 mg Asp/BlO/ des-oktapeptidového lidského inzulinu a 500 mg syntetického pentapeptidu Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr ve 21 ml roztoku, obsahujícím jeden díl dimethylsulfoxidu, dva díly,1,4-butandiolu a jeden díl 0,35 M tris pufru při hodnotě teploty 37 °C /hodnota pH nenastavena/. Přidá se vepřový trypsin /127 mg/. Roztok se dobře prcmísí a příležitostně se míchá po dobu 240 minut při teplotě 37 °C. Bílkoviny se vysráží studeným acetonem, promyjí se diethyletherem, vysuší se proudem dusíku a nakonec se rozpustí v 50 ml systému 6 M guanidin-chlorovodík /připraveném za použití 0,01 N kyseliny chlorovodíkové/. Tento Čirý vzorek roztoku se podrobuje gelové filtraci na5 x 200 cm sloupci Sephadexu'G-50 /Superfine/ za eluování L M kyselinou octovou při teplotě 4 °C. Výtok se monitoruje při 276 um a reverzní fázovou HPLC. Frakce, obsahující žádaný produkt, se spojí /přibližně 250 ml/, zředí se na 500 ml vodou, přečerpají se na 21 z 250 mm sloupec C-8 Zorbax a produkty se eluují acetonitrilovým gradientem v 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného při hodnotě pB 2, Spoji se vhodné frakce, obsahující žádaný analog inzulinu podle stanovení analytickou HPLC, zředí se pět krát vodou /400 ml/ a čerpají se na sloupec 25 x 300 mm C-18 Vydac. Odsolená bílkovina se eluuje acetonitrilovým gradientem v 0,5$ kyselině trifluoroctové. Frakce, obsahující vyčištěný analog inzulinu, se spojí a lyofilizuji se, čímž se získá 47 mg produktu. Struktura se ověřuje FAB/ičS a aminokyselinovou analýzou. Z šetření FAB/Ms vyplývá molekulová hmotnost 5455,2 /teorie 5459,1/· Aminokyselinové složení

- 16 <2 δ

•7 je na základě kyseliny asparagové jakožto molární jednotky ná- | sledující /teoretická množství aminokyseliny jsou v závorkách/: 3

Asp 4,00 /4/} Thr 1,86 /2/; Ser 2,56 /3/; Glu 7,03 /7/; Gly |

4,01 /4/i Ala i,07 A/í 1/2 Cys 5,36 /6/j Val 3,76 /4/í Ile |

1,85 /2/í Leu 6,14 /6/f Tyr 3,80 /4/; Phe 2,94 /3/, Eis 1,15 í /1/; Arg 0,96 /1/. , J

Příklad 3 | ·* Y V Nj

Stabilita- roztoku ' í

Provádí se degradační analýza inkubóváním vzorku inzuli- &

nu nebo analogů inzulínu při teplotě 50 °C, sa koncentrací / přibližně 3,5 mg/ml.v 0,1 M roztoku fosforečnanu.sodného .při % hodnotě pH 7,4 /pokud nebude uvedeno jinak/ v 0,25$ kresolu a |

1,6$ glycerolu. Za měnění.doby, podílů inkubační. směsi se £

v.

rychle ochlazuje 10 násobným nadbytkem systému 6 Isí guanidin- £ chlorovodík, 0,1 M fosforečnanem sodným, hodnota pH 3,0, tep- $ lotě 23 °C až do analyzy HPLC exkluze. Ochlazená inkubační $ reakční směs se skladuje při teplotě 5 °C až po dobu dvou týd- | nů beze změny HPLC exkluzních vlastností /HPLC size-exclu- í;

sion properties/. HPLC exkluzní analýza /HPLC size-exclu- $ sion analysis*/ s^e provádí za použití sloupce DuPont Sorbax |

GP-250 /50 yul injekce/ s 6 M GdnfíCl, 0,1 lí fosforečnanem sod- J ným jakožto elučním roztokem /průtoková rychlost 1 ml/min, | teplota 23 °C a detekce při 278 nm/. Stanovuje se rychlost í odbourání monomeru ze smyčky log plochy monomerního píku versus doba a poločas /t 1/2/ odbourání se stanoví ze vztahu: $ t l/2 - 0,693 ♦ rychlost. Výsledky jsou uvedeny v tabulce I. . $

- 17 Tabulka I Stabilita roztoku Molekula

BHI + zinek

Asp/BlO/, des /B27-30/HI des/B29-30/HI

Asp/BlO/, des/B30/HI des /B27-30/HI

Asp/BlO/, des/B28-30/HI

Asp/KLO/HI des/B28-30/HI des/B30/HI

BHI /prostý zinku/ des/B26-30/HI

Asn/BlO/, des/B26-3O/HI t 1/2 monomeru /dny při 50 °C +/- 10 pH 7,4 pH 6,1

49 49 46

193

32 24 ’ IN³ '»

IN^{3 3} sloučeniny nezůstávají v roztoku v průběhu celé zkoušky

Příklad 4 ϊ

Rovnovážná denaturace

Zkoušky rovnovážné denaturace se provádějí způsobem, který popsal Brems a kol., 1990, Biochemistry 29, str. 92.89 až 9293· Bílkovinové zásobní roztoky se připraví o koncentraci přibližně 10 mg/ml inzulínu nebo analogu inzulínu, 20 mM HEPES, hodnota pH 7,5, 20$ /objem/objem/ ethanol a 1 mM EDTA_ s GdnHCl nebo bez GdnHCl.. Zásobní roztoky denaturantu se připraví s přibližně 7 M GdnHCl, 20 mM Hepes, hodnota pH -7...5..^20^^/0^^ βτη/ο.ΐΊ.Τ6πΐ-/»6.±ΗΗ·ηο1η»_;&^.1_ΡΐΜ_ΕΡ_:ΤΑ—. naturaČní vzorky smíšením různého množství bílkoviny a aenaturačních zásobních roztoků a roztoku 20 mM HEPES, hodnota pH 7»5» 20$ /objem/objem/ ethanol a 1 mM EDTA, čímž se získá Žádaná koncentrace denaturantu. Stanoví se koncentrace GdnHCl refraktometricky za použití refraktometru Abbe-3D·

Bílkovinové zásobní roztoky se přidají- ' po přípravě denaturačních vzorků se mírně promísí kroužením. GdnHCl má

- 18 maximum.rozpustnosti přibližně 7 H ve vodných roztocích 20$ ethanolu, proto se vzorky s větší koncentrací než 7 M připravují ze zásobního roztoku GdnHCl přibližně 8 M, který neobsahuje ethanol. Měření cirkulámího dichroismu se provádí při teplotě 23 °C za použití spektrofotomeru Aviv 62 D. Výsledky jsou uvedeny v.tabulce II a v tabulce III.

Tabulka II

Rovnovážná denaturace

Delta G /+/“ 6 $/

1. Asp/BlO/, des/B27-30/HI	6,2
2. Asp/BlO/, .des/B29-3O/HI	6,0
3. Asp/BlO/,. des/B26-30/EI	5,8
4. Asp/E10/, des/B30/KI	5,5
5. Asp/BlO/, des/B28-30/HI	5,4
6. Asp/B10/HI	5,1
7. BEI /prostý zinku/	5,1
8. Asp/BlO/, des/B23-30/HI	5,1
9. des/B26-30/HI	5,0
10. des/B30/HI	4,6
11. des/B26-30/HI	4,5
12. des/B27-30/EI	4,3
13. des/B29-30/EI	4,3
,14. des/B23-3O/EI	3,3

Tabulka III . _f

Rovnovážná denaturace

Střední bod /4/- 2 $/

1.	Asp/BlO/, des/B27-3O/BI	5,8
2t	Asp/BlO/, des/B26-30/HI	5,7
3.	Asp/BlO/, des/B30/HI	5,6
4.	Asp/BlO/, des/B23-3O/HI	5,6
5c	Asp/BlO/, des/B29-3O/HI	5,5
6.	As p/B10/, de s/B2 8-3 O/HI	5,5
7.	Asp/B10/HI	5,3
8.	des/B29-30/HI	5,2
9.	aes/B27-30/HI	5,1
10.	des/326-30/HI	5,1

11.	des/B30/HI	5,0
12.	des/B28-30/HI	5,0
13.	des/B23-3O/HI	4,7
14.	BHI /prostý zinku/	4,5

Příklad '5

Rovnovážné ultraodstředění

Stanovuje se agregační chování inzulinu sedimentačním rovnovážným ultraodstředěním. Měří se stav shlukování každého analogu za použití způsobu, který popsal Pekar A.H. a Frank P.H., 1972, Biochemistry 11, str. 4013 až 4016. Výsledky jsou uvedeny v tabulce IV pro inzulín a příbuzné sloučeniny při koncentraci bílkoviny 3,5 mg/ml, hodnotě pH 7,2, 0,05 íi chlorid sodný - 0,05 M fosforečnan sodný, teplota 22 °G. Hodnoty představují pozorovanou hmotnostní střední molekulovou hmotnost dělenou molekulární hmotností monomeru sloučeniny. Proto je tato hodnota indexem stupně agregace analogů inzulinu. Je uvedena rovněž hodnota BHI prostého zinku. Je zřejmé, že sloučeniny, které jsou předmětem zájmu, mají velmi slabé spontánně shlukovací chování ve srovnání s lidským inzulínem.

Tabulka IV

Rovnovážné ultraodstředění
Sloučenina	Mw/tCL
1. Asp/B10/, des/B27-30/HI	1,06
2. Asp/BlO/, des/B28-30/HI	1,20 -
3. des/B27-30/HI '	1,80
4. Asp/BlO/, aes/B29-3O/HI ς . _ Δ « n /M fvZu-T----—-----	2,00
6. des/B28-30/HI	«, 2,30
7. des/B,29-30/HI	4,60
8. BHI /prostý zinku/	6,60

- 20 Příklad 6

Receptorové vázání

Fyziologické působení analogů inzulínu podle vynálezu je zřejmé z následující zkoušky in vitro inzulínového receptorového vázání, mikrosomální membrány se získají z úplné lidské placenty způsobem, který popsal například Marshall a kol., 1974, Characterization of the Insulin and 3omatomedin-C . Receptors in Human Placental Cell Membranes, J. Clin, Endocrin. Metab., 39, str. 283 až 292/. Přibližně 30^yug bílkoviny se inkubuje s 45 000 až 50 000 cpm ^^^l/~A14_/lidského inzulinu a se vzrůstajícími dávkami studeného konkurenčního ligandu v Q,5 ml 100 mM Hepes, hodnota pH 7,6, 120 mM chloridu sodného, 5 mM chloridu draselného, 1,2 mM síranu hořečnatého, 8 mM glukózy a 0,25^ ΒΞΑ» Po 24 hodinách při teplotě 4 °C se membrány shromáždí na filtrech ze skleněných vláken za použití jednotky Skatron Cell Harvester a stanoví se vazba ⁷I. Pro srovnání různých analogů inzulinu s lidským inzulínem jakožto standardem /hodnoty v tabulce V/ se konstruují konkurenční křivky vazby ke stanovení efektivních koncentrací hormonu inzulínu. Asp/B10/, des/B27-3O/ lidský inzulín a Asp/B10/, des/B28-30/ lidský'inzulín se jeví jakožto obzvláště účinné při těchto zkouškách receptorového vázání.

Tabulka V . > '

Relatívníúóinnost vázání na receptor^3, lidského inzulinu Sloučenina lidský inzulín /Hl/

Asp/B10/ Hl des/B28-30/ Hl des/327-30/ Hl Asp/B10/, aeš/B28-3Ó/HÍ Asp /BIO/, des/B27-30/ Hl Asp/B10/, des/B26-30/ Hl /ED₅₀/ pro 50/c ; náhredu

Střed - S.E.M. .

100 jž /n - 2/

175 t 17 /n - 2/ 69 í 2 % /a - 3/ 125 - 14 % /n - 2/ '309 - 1'9‘ $ /a i ²/' 275 í 15 $ /a _z ²/ 172 ± .95 /a - 2/ ^&EC5O pro lidský inzulín je 0,29 nM

- 21 Příklad 7

Studie na krysách

Fyziologické působení analogů inzulinu podle vynálezu dokládají zkoušky sy3ternu in vivo.

Normální samci krysy Sprague Dawley z laboratoře Charles Piver Laboratories /Portage, Ml/ se použijí jakožto pokusná zvířata. Mají hmotnost 160 až 130 g a udržují se po dobu jednoho týdne v prostoru pro zvířata při teplotě 24 °C 2a.řízeného cyklu 3větla /rozsvícení od 7:00 dopoledne do 7:00 odpoledne, zhasnutí od 7:00 odpoledne do 7:00 dopoledne/. Zvířatům se podle libosti podává krmivo Purina rat chov/ 5001”. Před použitím pro zkoušku se každá krysa nechá hladovět 16 hodin. Před prvním použitím je hmotnost přibližně 200 g. Při dosazení hmotnosti vyhladovělé krysy přibližně 275 g /v průběhu tří týdnů/ se krys již více nepoužívá.Jedna skuoina 10 krysích samr ců se použije každý den pro každou zkoušenou sloučeninu /bio-'” syntetický lidský insulin, vepřový inzulin a analog lidského inzulinu/. Každé skupiny se použije pouze jednou v průběhu týdne. Deset krys se rozdělí do dvou skupin vždy po pěti krysách. Jedna skupina je jako kontrolní a podává se jí samotný nosič subkutánně, Druhé skupině zkoušených krys se podává .

íy zkoušená sloučenina, Bílkoviny se rozpustí, v 0,05 N kyselině chlorovodíkové /hodnota pH 1,6/ za získání zásobního roztoku

100 /Ug na ml. Z- tohoto zásobního roztoku se připraví četná zředění v normálním fyziologickém roztoku, který se krysám vstřikuje subkutánně. Odebírá se 100 yul vzorek krve z ocasní žíly každé krysy v době nula a 30 minut, 1 hodina, 2 hodiny, 3 hodiny a 4 hodiny po podání. Glukóza se stanovuje kolorimetricky glukozooxidazovým způsobem /Sigma Chemical Co./. Procentová změna koncentrace glukózy v krvi od chvíle nula. se vypočítává pro každou krysu a konečné hodnoty se vyjadřujdjáEožto střTdní'pročěňťová’^měna - SEM u experimentální ' skupiny korigovaná pro střední změnu kontrolní skupiny pro příslušný den.

Ze zkoušek se konstruuje křivka dávka - odezva se 4 až 7 různými koncentracemi zkoušené sloučeniny za použití maximální odezvy v dané době /zpravidla jednu nebo dvě hodiny po podání bílkoviny/. Z. této křivky se stanoví hodnota ED^q jakožto subkutánní dávka //Ug/kg/ bílkoviny, která poskytuje s polovinu maximální hypoglycemické odezvy. Výsledky jsou uve- | děny v tabulce VI Tabulka VI^a

Sloučenina lidský inzulín /El/^	Relativní hypoglycemická	ř $ ‘1 ’·# ii
7,75	účinnost /$/ 0 100
Asp/B10/ Hl		9,80	79
des/B28-30/ HI		8,10	36
des/B27-30/ HI		12,70	61	ί
Asp/310/, des/B2S-30/	HI	7,70	' 101	ft £
Asp/B10/, des/B27-5O/	HI	11,90	65
Asp/B10/, des/326-30/	HI	11,00	70	X

^a všechny hodnoty se vztahují na vzorky krve, odebraná jednu ř^- hodinu po podání zkoušené sloučeniny i .1 b exprese v /ug/kg, subkutánně ;

^c ve vztahu k lidskému inzulínu biosyntetický lidský inzulín ’ l

!

^ak shora, uvedeno, analogy inzulínu podle vynálezu mají snížený sklon k dimerizaci nebo k jinému samovolnému shlu- i kování na formy s větší molekulovou hmotností. Proto po podá- J ní jednoho nebo několika takových- analogů se dosahuje rychlé- j ho účinku. Analogy inzulínu podle vynálezu jsou účinné při ' ' ošetřování hyperglykeaie podáváním nemocným v případě potře- ΐ by účinného množství analogu inzulíno obejaého vzorce I. Výra- i zem' účinné množství“ se zde vždy míní množství jednoho nebo * J několika analogů inzulínu podle vynálezu, potřebné ke snížení nebo k udržení koncentrace cukru v krvi bud terapeuticky .

nebo brofylakticky.’ Toto množství je zpravidla přibližně 10 ... .....

až 60 jednotek nebo i více jednotek na den /nebo přibližně

0,3 až přibližně 2,0 mg za předpokladu přibližně 29 jednotek na mg/. Toto množství analogu nebo analogů inzulínu, které se má podávat, však musí stanovit lékař se zřetelem na příslušné okolnosti včetně ošetřovaného stavu /to je příčina hyperglykemie/, podávaného určitého analogu, způsobu paren- 23 terálního podání, věku, hmotnosti a odezvy jednotlivých nemocných a závažnosti symptomů nemocného jedince. Proto se dávka analogu inzulínu podle vynálezu neomezuje na žádné podávané rozmezí.

Analogy insulinu podle vynálezu se podávají případným nemocným /to je nemocným trpícím hyperglykemií/ ve formě farmaceutických prostředků, obsahujících účinné množství alespoň jednoho analogu inzulínu podle vynálezu obecného vzorce I spolu s jedním nebo s několika farmaceuticky vhodnými excipienty nebo nosiči* Pro tyto účely se farmaceutické prostředky mohou typicky formulovat tak, aby obsahovaly přibližně 100 jednotek na ml nebo podobné koncentrace obsahující účinné množství alespoň jednoho analogu insulinu. 'řyto prostředky jsou· zpravidla, nikoliv však nutně pro parenterální podání a mohou se připravovat jakýmkoliv způsobem z četných možných,způsobů za použití běsných excipientů nebo nosičů pro parenterální produkty, které jsou v oboru.obecně známy. /Například Remington'» Pharmaceutical Sciences, 17· vydání. Mack Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985./ Například se dávkovači formy pro pa-, renterální podání mohou připravovat suspendováním nebo rozpuštěním žádaného množství alespoň jednoho analogu inzulínu obecného vzorce .1 v netoxickém kapalném nosiči, vhodném pro vstřikování, jako je vodné prostředí a sterilizací suspenze nebo roztoku. Pro účely míšení před podáním se mohou připojovat fioly nebo nosič. Farmaceutické prostředky pro parenterální podání používají ředidla, excipienty nebo nosič, jako je například voda a jako jsou s vodou mísitelná rozpouštědla, například glycerin, sezamový olej, podzemnicový olej, vodný propylenglykol, N,N'-dimethylformamid a jako jsou podobná

A.rt.w a*.. n-^-Tyé· --^.->^.4· středků se uvádějí sterilní, isotonické, vodné solankové roztoky analogů inzulínu' obecného vzorce I, která se mohou pufrovat farmaceuticky vhodným pufrem a které jsou prosté pyrogenu. Parenterální farmaceutické prostředky mohou dále obsahovat konzervační přísady, jako je fenol nebo m-kresol.

Také mohou obsahovat činidla k nastavení hodnoty pH konečného produktu, jako je hydroxid sodný nebo kyselina chlorovodíková.

Jí, aí

- 24 ί ‘l·

Analogy inzulínu, poule vynálezu se také mohou formulovat | na farmaceutické prostředky vhodné pro intranasální podání. % íakové prostředky jsou podrobně popsány v evropském patento- | vém spise číslo 0 200383 A3· '^akové farmaceutické prostředky $ se formulují's jedním nebo š několika farmaceuticky vhodnými j nosiči, s farmaceuticky vhodným množstvím soli alkalického ko- * vu, amoniové soli nebo .volné kyseliny v. podstatě zinku prostého inzulínu a popřípadě s absorpci podporujícím množstvím a- % lespoň jednoho činidla podporujícího absorpci, voleného ze íj p' souboru zahrnujícího /1/ kyselinu olejovou nebo její ester ne- í γ» f?

bo sůl, /2/ kapalnou formu sorbitanového esteru mastné kyselí- >

- ~ '.ΐ vy, fo/ kapalnou formu polyoxyethylenového derivátu sorbitano- , | vého esteru mastné kyseliny a /4/ kapalnou formu hydroxypoly- | oxyethylen-polyoxypropylen-pclyoxyethylenového. kopolymeru, 3

i] d

Příklad 8 3

Studie na psech

Pro doložení účinnosti a rychlého působení subkutanního podání analogů inzulínu Asp/BlO/, des/B27-3O/ lidského insulinu a Asp/BlO/, des/B2.í-30/ lidského inzulínu ve srovnání s regulárním rozpustným prostředkem lidského inzulínu /Humulin R^/ se provádí následující zkouška. Samec psa beagle o . hmotnosti 10 až 12 kg se udržuje ve vynikající fyzické kondici před zkouškou a v průběhu zkoušky. Psi se nechají hladovět po dobu 16 hodin, ponechá se jim však přístup k vodě, aby nedošlo k neočekávanému kolísání hladiny- inzulínu, V průběhu celé zkoušky se psi anestetizují pentobarbitolem sodným a jejich tělesná teplota se udržuje vyhřívacími poduškami k minimalizaci kolísání glukózy. Formulují se inzulínové zkušební vzorky /to je Asp/BlO/, des/B27-30/ lidský inzulín a Asp/BlO/, des/B28-30/ lidský inzulín/ o koncentraci 3,5 mg/ml v témže ředidle, kterého se používá pro Humulin R , Pri teto zkoušce hypoglycemické účinnosti pro každý analog inzulínu se předpokládá stejné množství inzulínu na hmotnostní bázi; předpokládá se, že tyto zkušební roztoky obsahují 100 jednotek/ml. Všechny inzulínové zkušební roztoky se podávají subkutanně vstřikováním 0,1 jednotek na kg pod· epidsrmis vnější strany

- 25 slabiny každého,z osmi nebo deseti psů v závislosti na vzorku Vzorky krve se odebírají 30, 15 a 0 minut před podáním a 10, 20, 30, 45, 60, 90, 120, 160 a 240 minut po podání. Glukóza se stanoví kolorimetricky glukozoxydazevý fc*Í v obem. Výsledky této srovnávají zkoušky jsou uvedeny v tabulce VII.

Tabulka VII Koncentrace glukózy

Doba
ÍMin)	Humul:	in R®
		(n	= 8)
-30	102	±	1.6
-15	101	i	1,6
0	100
10	100	+	1,3
20	99	+	1,9
30	97	+	V
45	86	+	4.1
60	79	+	4/9
90	67	±	4,6 r
120	64	+	4/8
180	62	+	5,0
240	77	±	4.9 1
akoncentrace	s	lukoz.

Asp(BIO) des-ÍB27-30) hi (n = 8)

92	+	2rl
99	+	1.2 1
100
93	+	1.5 (
80	+'	-3,3
63	±	3,1
47	+	4/1
43	±	3,4
48	±	2,9
58	±	4Λ
87	+	2,6
89	+	2,0
rvi:	o	třed

v krvi: γ. se zřet len nu dobu³ 0

Asp(BIO) des(B28-30) HI (n = 10)

103 ± 2.9 101 ± 2.0 100 ± 1.8 .

± 2.0 81 + 2,9 67 ± 4.4 60 ± 4.8 67 ± 5.7 73 ± 4.9 ± 1.9 ±2.2

Průmyslová využitelnost ;oleze 10 3 a popřifyzikálně

Analogy lidského insulinu mající zbytek Asp v řetězce B a oklestěný karbo.xylový terminus řetězce radě modifikace v jiných polohách mají modifikované chemické vlastnosti a farmakologické vlastnosti. Tyto analogy jsou vhodné pro ošetřování hyperglykemie.

- 26 Sékv?enení seznam /1/ Obecné informscer /i/ Přihlašovatel: Eli Lilly end Compeny /ii/ Název vynálezu: Analog inzulinu /iii/ Počet sekvencí: 2 /Iv/ Korespondenční adresa:

/A/ Adrese: Mř. C. Merk Hudson /B/ ulice: Erl Wood Manor /0/ město: Windleshanr.

/B/ stát: Surrey GU20 6PH /E/ kraj: Grande Bretagne /F/ ZIP:

/v/ Forma čitelná pro počítač /A/ střední typ: disketa, 3,5 palců, 1,0 Mb uložení /3/ počíteč: Macintosh· /0/ operační systém: Macintosh /D/ softwere: Microsoft Word.

/vi/ Data pro přihlášku vynálezu /A/ číslo přihlášky vynálezu:

/3/ den podání:

/0/ zatřídění:

/vii/ Data pro prioritní přihlášku vynálezu /A/ Číslo přihlášky vynálezu:

/B/ den podaní:

/viii/ Údaje o zástupci /A/ jméno: Mr C. Merk Hudson /3/ registrační číslo: 307 /0/ spisové číslo: ·χ8620 EPO /ix/ Telekomunikační informace /A/ telefon: 0276 78441 /3/ telefax: 858177 /C/ telex: ..... * /2/ Informace pro SEQ IB NO:1:

/i/ charakteristiky sekvence /A/ délka: 21 aminokyselin „ ^: /3/ typ: aminokyselina /C/ strandednesas·”:

- 27 /D/ topologie: lineární /ii/ molekulový typ: polypeptid /ix/ charakteristiky:

/A/ jméno/klíč: variabilní poloha /B:/ lokace: 21 /C/ identifikační způsob:

/D/ další informace: Tato aminokyselina je bud Asn, Asp Glu, Gin, Ala, Gly nebo Ser.

/xi/ popis; sekvence;: SEQ ID N0:1:

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu; lýr

5 10

Gin. Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa

20 /3/ Informace pro SEQ ID NO: 2:

/i/ charakteristiky sekvence;

/A/ délka: 27 aminokyselin /fe/ typ: aminokyselina /C/ stranďeduesss;: “ /D/ topologie: lineární /ii/ molekulový typ: polypeptid /ix/ charakteristiky /A/jjméno/klíč;: variabilní poloha /B/ lokace: 1 /0/ identifikační způsob:

/D/ další informace: Tato aminokyselina je buď Phe nebo Asp.

/ix/ charakteristiky /A/ jméno/klíč: variabilní poloha /B/ lokace: 3 /C/ identifikační způsob /D/ další informace: Tato aminokyselina je buď Ašn nebo Asp.

/xi/ popis sekvence.: SEQ ID NO:2:

Xaa Val Xas Gin His; Leu Cys Gly Ser Asp Leu Val Glu Ala

5 ¹⁰

Leu Tyr^- Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Ťhr

15: ²⁰

Claims (19)

1. Analog· inzulinu vzorce SEQ ID N0:1 řádně sesítěný me SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID'N0:1 je volen ze souboru, zahrnujícího Asn,

Asgs, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v/poloze 1 SEQ ID 140:2 je vo-. len ze souboru zahrnujícího Asp a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího'Asp a Asn.

2., Analog inzulinu podle nároku 1 , kde Xaa v poloze 21 SEQ ID N0:1 znamená Asn.

3. Analog inzulinu podle nároku 2, kde: Xaa v poloze 1 SEQ ID: NO: 2 znamená Phe·.

4·'. Analog inzulinu podle nároku 3, kde Xaa v poloze 3 SEQ'’ ID'N0:2 znamená Asn.

3. Analog inzulinu vzorce. SEQ ID N0:1 řádně sesítěný na aminokkyselinový zbytek 1 až 26 SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky⁷ vhodné sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID N0:l je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID NC:2‘ je volen ze souborů zahrnujícího Asp a,

Ph:e; a Xaa v . poloze 3 SEQ: ID N0:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

6. Analog inzulinu podle nároku 5, kde Xaa v poloze 21 SEQ ID N0:1 znamená Asn.

7. Analog inzulinu podle nároku 6, kde Xaa v poloze 1 SEQ ID. NO:2 znamená Phe..

8. Analog inzulinu podle nároku kde Xaa v poloze: 3'

SEQ: ID NO :-2 znamená- Asn. ............... ....... . ^ ... ..

9* Analog inzulinu vzorce SEQ ID N0:1 řádně sesítený na aminokyselinové zbytky 2 až 27 SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodné sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ.ID N0:1 je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin,' Alaý Gly -a Ser, Xaa v ooloze 1 SEQ ID.NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a· i

iS l«-5 tt

Ě *

tt λΐ

-Λ íi íi

- 29 a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID' N0:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

10. Analog inzulínu vzorce SEQ ID' NOs 1 řádně sesítěný na. aminokyselinové zbytky 2 až 26 SEQ ID) NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ) ID NO:í je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser,

Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

11. Analog inzulínu vzorce SEQ ID' NO:1 řádně sesítěný na SEQ ID NO: 2 a jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID N0:1 je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala;, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:2 je volen, se souboru zahrnujícího Asp a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID,N0:2 je volen; ze. souboru zahrnujícího Asp a ásn, použitelný jakožto antihyperglycemické činidlo.

12. Analog podle nároku 11, přičemž Xaa v poloze. 21 SEQ ID N0:l znamená Asn, Xaa v poloze 1 SEQ ID' NO: 2 znamená Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID. NO:2 znamená-Asn, použitelný jakožto anti'hyperglycemické činidlo.

13. Analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 řádně sesítěný na aminokyselinové zbytky 1 až 26 SEQ ID NO:2 nebo jeho farmaceuticky vhodná sůl, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID NO:1 je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID N0:2 je volen ze souboru zahrnujícího: Asp a Phe a Xaa v poloze 3 SEQ ID NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn, použitelný jakožto antihyperglycemické činidlo.

14. Analog podle nároku 13, přičemž Xaa v poloze 21 SEQ

ID NO:1 znamená Asn, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 znamená Phe a' Xaa; v poloze 3 SEQ ID N0:2 znamená Asn, použitelný jakožto entihýperglycemické činidlo.

15. Způsob přípravy inzulínového analogu podle nároku . 1

- 30 -,- sž 10, vyznačující se tím, že se sesítuje sloučenina vzorce SEQ ID N0:1 se sloučeninou vzorce SEQ ID N0:2.

16, Analog inzulínu připravítelný způsobem podle nároku 15·

17, farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, še ve farmaceuticky vhodném ředidle obsahuje analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 řádě sesítěný na SEQ ID N0:2 nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl, přičemž Xaa v poloze ,21 SEQ ID NO:1 je volen' ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu,_r Gin, Ala, Gly a Ser, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Phe a Xaa v poloze-3 SEQ ID N0:2' je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

18., Farmaceutický prostředek podle nároku 17', vyznačující se t í m , Že Xaa v poloze: 21 SEQ ID NO:l znamená Asn, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO: 2' znamená Phe a Xaa v poloze: 3 SEQ ID NO:2 znamená Asn.

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m , že ve farmaceuticky vhodném ředidle, obsahuje analog inzulínu vzorce SEQ ID NO:1 řáděné sesítěný na aminokyselinové zbytky 1 až 26' SEQ. ID N0:2. nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl/ přičemž Xaa v poloze 21 SEQ ID NO:1 je volen ze souboru zahrnujícího Asn, Asp, Glu, Gin, Ala, Gly a Ser?, Xaa v poloze 1 SEQ ID NO:2 je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Phe a<

Xaa v poloze 3 SEQ ID: NO:2'. je volen ze souboru zahrnujícího Asp a Asn.

20, Farmaceutický prostředek podle nároku 19, vyzná čující se tím, že Xaa v poloze 21 SEQ ID NÓ:t. znamená Asn, Xaa v poloze 1 SEQ IĎ.Ň0:2 znamená Phe a Xaa' v poloze: 3 SEQ ID NO:2 znamená Asn.