FI76375B

FI76375B - Foerfarande foer framstaellning av ett fibrinolytiskt enzym.

Info

Publication number: FI76375B
Application number: FI834042A
Authority: FI
Inventors: Anthony Atkinson; Asgar Electricwala; John Bryan Griffiths; Amy Latter; Patrick Anthony Riley; Peter Morgan Sutton
Original assignee: Health Lab Service Board; Univ London
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1983-11-03
Publication date: 1988-06-30
Also published as: CA1213231A; DK506683D0; EP0104194A1; SU1507204A3; AU567491B2; EP0104194B1; DK163134C; BR8306108A; NO834024L; JPS59500351A; ZA831399B; IE54593B1; AU1214688A; DE3375491D1; WO1983003101A1; NO161445C; FI76375C; DK506683A; AU1337783A; NO161445B

Description

76375

Menetelmä fibrinolyyttisen entsyymin valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää fibrinolyyttisen entsyymin valmistamiseksi.

Tromboottinen vaskulaariokkluusio, joka aiheuttaa usein pit-käaiaisia vaurioita suonien seinämiin, on pääasiallinen kuolemansyy Yhdistyneessä kuningaskunnassa, ja sen tiliin voidaan laskea ainakin kaksi viidestä kuolemantapauksesta. Tässä sairauksien ryhmässä jo sepelvaltimon tromboosi yksinään tappaa yhtä paljon ihmisiä kuin kaikki syöpälajit yhteenlaskettuina. Ei ole olemassa mitään vertailukelpoisia lukuja tromboosisai-rauden morbiditeetistä (sairaaloissa oleva potilaat, tai kotonaan sairastavat), mutta lukujen täytyy olla valtavan suuria. Tilanne on samanlainen Länsi-Euroopassa ja Pöhjois-Amerikassa ja eräässä "Time"-lehden artikkelissa kerrottiin, että kar-diovaskulaarisairauden tiliin on pantava puolet vuosittain kirjatuista kuolemantapauksista USA:ssa (Time, kesäkuu 1. päivänä 1981, 43).

Sen vuoksi tarvitaan todella näiden tavallisten tautien tehokasta hoitokeinoa. Tämän alan lääkehoidon harvoille mahdollisuuksille on kuitenkin oireellista, että kirurgialla on tärkeä osa nykyisessä käytännössä, mitä todistaa Amerikassa suoritettujen ohitusleikkausten lukumäärän ilmiömäinen nousu. Tähän asti (paitsi sellainen ei-spesifinen iskeemisen sydämen hoitotapa kuin digitalis) ovat antikoagulantit olleet eniten käytetty lääkitystyyppi. Mutta parhaimmillaankin antikoagulantit pystyvät ainoastaan inhiboimaan uusia trombooseja, ja mahdolliset hemorragiakomplikaatiot ja erehdykset tarkoin kontrolloiduissakin kliinisissä kokeissa ovat estäneet niiden laajemman käytön paitsi joissakin harvoissa selvästi määritellyissä tilanteissa (esimerkiksi pieni hepariiniannostus menetelmänä kirurgisten toimenpiteiden jälkeisten syvien las-kimotromboosien insidenssin vähentämiseksi).

2 76375

Kaikkein rationaalisin lääketieteellinen hoitotapa, teoriassa, olisi tietenkin liuottaa selektiivisesti haitallinen veritulppa. Koeputkessa pystyvät monet proteolyyttiset entsyymit liuottamaan koaguloituneen veren, mutta nämä entsyymit, esimerkiksi trypsiini, hajoittaisivat myös useita muita veren proteiineja ja olisivat pian kohtalokkaita (tilanne, joka toisinaan on nähtävissä äkillisessä hemorragisessa pankreatii-tissä). Siis tarvittaisiin sellainen entsyymi, jolla on erittäin suuri spesifisyys fibriinin suhteen ja ainoastaan minimaalisen pieni yleinen proteolyyttinen vaikutus. Luonnollisena esiintyvä entsyymiplasmiini ihmisruumiissa omaa nämä ominaisuudet .

Plasmiini on normaalisti verenkierrossa inaktiivisena esiasteenaan, plasminogeeninä. Verihyytymän liuottaa plasminogee-ni, joka on jo sitoutuneena trombissa ja sen aktivoivat plas-miiniksi viereisestä vaurioituneesta suonen seinämästä erittyvät aineet, jotka tunnetaan nimellä vaskulaariset plasminogee-nin aktivaattorit. Tällä tavoin ei-fataaliset veritulpat vähitellen saadaan uudelleen auki, vaikka prosessi on hidas ja tehoton, ja vie usein kuukausia tai vuosia. On siis ilmeistä, että plasminogeenin aktivaattoreiden käyttäminen, jotka olisivat sopivia potilaille annettaviksi, voisi olla tromboottisten vaskulaariokkluusioiden sopiva hoitomenetelmä.

Vuonna 1933 Tiilet keksi, että eksotoksiini, jota saatiin hemo-lyyttisten streptokokkien viljelyistä, oli voimakas plasminogeenin aktivaattori; hän kutsui sitä streptokinaasiksi (SK).

Se ei ole koskaan saanut yleistä kliinistä hyväksymistä fibrinolyyttisenä aineena käytettäväksi koska a) se on voimakkaasti antigeeninen (kuten voitiin odottaa bakteerialkuperää olevasta eksotoksiinista) ja on ilmoitettu useita pyrogeeni-siä reaktioita ja joitakin anafylaktisia shokkeja ja b) koska sen antamiseen lääkkeeksi liittyy huomattava yleisen verenvuodon riski, koska SK aktivoi sekä verenkierrossa olevan plasminogeenin että veritulppaan sitoutuneen plasminogeenin ja edellinen aiheuttaa normaalin veren useiden koagulaatiotekijäin 3 76375 hajoamisen, joita ovat esimerkiksi: tekijä I (fibrinogeeni), tekijä II (protrombiini), tekijä V (labiili tekijä) ja tekijä VIII (anti-hemofiilinen globuliini).

Kymmenkunta vuotta myöhemmin löydettiin eräs toinen plasmino-geenin aktivaattori normaalista humaaniuriinista ja sitä kutsuttiin urokinaasiksi (UK). Tämä on paljon vähemmän (mikäli lainkaan) antigeeninen, mutta siihenkin liittyy plasminogee-ninen aktivoituminen veressä ja siitä syystä samanlainen vaikean hemorragian riski, mikä rajoittaa sen kliinistä käyttökelpoisuutta .

Useita vuosia on epäilty, että muutkin kudokset kuin verisuonet sisältävät plasminogeenin aktivaattoreita. Näitä kutsutaan kollektiivisesti "kudosaktivaattoreiksi", mutta kudos-aktivaattoreista tiedetään paljon vähemmän kuin streptokinaa-sista ja urokinaasista. Saattaa olla, että kudosaktivaatto-rit ovat kemiallisesti hajanainen aineryhmä, jota yhdistää ainoastaan niiden kyky konvertoida plasminogeeni plasmiiniksi. Mutta useimmat tutkijat uskovat, että kaikki kudosaktivaatto-rit erittyvät niiden kudosten verisuonista, joista ne löydetään (so. vaskulaari-endoteelistä) ja sen vuoksi ne ovat identtisiä vaskulaarisen plasminogeenin aktivaattorin kanssa, jonka mole-kyylipaino on 72 000. Edelleen väitetään, että muihin kudoksiin tulee plasminogeenin aktivaattoria, jos ne tulevat maligneik-si, ja että tähän perustuvat malignien solujen jotkut invaasio-ominaisuudet .

Eräästä äskettäin keksitystä kudosaktivaattorista (jota nimitetään Human extrinsic plasminogen activator-HEPArksi) on tehty hiljattain julkaisusarja. Tätä kudosaktivaattoria erittyy (maligneista) humaanimelanomasolulinjasta ja sen molekyyli-paino on myös 72 000 daltonia. Kun läsnä on pelkistäviä aineita, se hajoaa kahdeksi aliyksiköksi, joiden molekyylipaino on 39 000 ja 33 000 daltonia. Tätä kudosaktivaattoria on testattu sekä kokeellisesti (kaneilla) että kahteen potilaaseen, 4 76375 mutta aineen malignin alkuperän täytyy rajoittaa sen käyttöä kliinisesti, koska on selvästi epäedullista käyttää terapeuttista ainetta, joka on peräisin maligneista soluista. Todellisuudessa olivat ne kaksi potilasta, joihin tätä kudosakti-vaattoria testattiin, toivottoman sairaita, ja he olisivat melko varmasti kuolleet ilman hoitokäsittelyä. HEPA on kuitenkin osoittautunut (sekä kliinisesti että kokeellisesti) tehokkaammaksi ja paljon turvallisemmaksi verihyytymän liuottajaksi kuin urokinaasi. Tämä johtuu siitä, että HEPA aktivoi selektiivisesti plasminogeeniä, joka on sitoutunut trombiin ja säästää verenkierrossa olevan plaminogeenin.

Artikkelissa "Absence of Fibronectln and Presence of Plasminogen Activator in both Normal and Malignant Epithelial Cells in Culture", N.-S. Yang et al. (J. Cell Biology 84 (1980) 120-130), kuvataan ihmisen epiteelisolujen viljelmissä olevia plasminogeeniaktivaattoreita, jotka viljelmät ovat joko primäärisiä tai varhaisten siirrostusvaiheiden viljelmiä tai ma-lignantteja.

Artikkelissa "Properties of Epithelial Cells Cultured from Human Carcinomas and Non-Maiignant Tissues", H.S. Smith et al. (J. Supramolecular Structure 11 (1979) 147-166), kuvataan myöskin plasminogeeniaktivaattorin tuottamista malignanteilla tai primäärisillä epiteelisoluviljelmillä.

Nyt on havaittu, että tietyt pysyvät epiteelisolulinjät kykenevät tuottamaan kudosviljelmässä entsyymejä, joilla on plasminogeeniä aktivoiva vaikutus. Myöskin ainakin yhdestä solu-linjasta saadun entsyymin on havaittu omaavan fibrinolyyttis-tä aktiivisuutta per se, eli toisin sanoen entsyymi itse on aktiivinen fibriinin hajottaja ilman plasminogeenia.

5 7 6 3 7 5

Kyseessä olevan keksinnön erään aspektin mukaan on tarjolla menetelmä entsyymin valmistamiseksi, jolla on fibrinolyytti-nen vaikutus itsessään ja/tai plasminogeenin aktivoimiskyky, ja menetelmässä viljellään pysyvän epiteelisolulinjän, nimeltään GPK (CNCMI-222), soluja tai pysyvän epiteelisolulinjän, nimeltään BEB (CNCMI-221), soluja ja eristetään entsyymiä sisältävä fraktio viljelystä, jolla entsyymillä on molekyyli-paino määrättynä SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin avulla pelkistävissä olosuhteissa 62 000 + 3 000 ja ei-pelkistävissä olosuhteissa noin 56 000 + 2 000. Entsyymiä sisältävä fraktio voidaan saada ottamalla talteen joko päällä oleva fraktio, joka sisältää entsyymin, tai entsyymiä sisältävä fraktio voidaan uuttaa soluista.

Kun valmistetaan keksinnön mukaista entsyymiä, voidaan haluttuja soluja viljellä sarjaviljelyissä normaalia kudosviljely-tekniikkaa noudattaen, esimerkiksi seerumia sisältävässä ela-tusaineessa. Kun sopiva solujen proliferoituminen on saatu aikaan, voidaan seerumia sisältävä elatusaine korvata seerumiva-paalla elatusaineella. Soluja voidaan sitten pitää yllä fysiologisesti sopivissa olosuhteissa, kunnes on valmistettu sopiva määrä entsyymiä ja entsyymi voidaan sitten ottaa talteen päällä olevasta nesteestä tai suoraan uuttamalla soluista.

Mitä tahansa sopivaa talteenottotekniikkaa voidaan käyttää, mutta entsyymi otetaan edullisimmin talteen yhdistetyistä päälläolevan nesteen tasamääristä sentrifugoimalla suspendoi-tuneiden solujen poistamiseksi, jota seuraa metallikelaatti, ioninvaihto- ja/tai erotuskromatografia. Proteiinia sisältävät fraktiot voidaan identifioida mittaamalla U.V.-absorptio aallonpituudella 280 nm ja analysoimalla proteiinia sisältävät fraktiot fibrinolyyttisen ja/tai plasminogeeniä aktivoivan vaikutuksen suhteen fibriinilevymenetelmän avulla ja/tai fibriinihyytymän liuotusajan määräämismenetelmän avulla.

Keksinnön mukaan on eristetty edellä mainituista pysyvistä 6 76375 solulinjoista entsyymejä, joilla on molekyylipaino määrättynä natriumdodekyyli-sulfaatti-polyakryyliamidigeelin elektroforeesin (SDS-PAGE) avulla pelkistävissä olosuhteissa, 62 000 + 3 000 daltonia, molekyylipaino ei-pelkistävissä olosuhteissa suunnilleen 56 000 daltonia ja isoelektrinen piste 4,6. Entsyymeillä on aminohappoanalyysin tulos pääasiallisesti sellainen kuin on esitetty taulukossa 3.

Näiden entsyymien uskotaan olevan uusia ja ne muodostavat keksinnön lisäaspektin, samoin kuin näiden entsyymien eristäminen edellä selostettujen menetelmien avulla ja farmaseuttiset seokset, joissa on entsyymejä ja farmaseuttisesti sopivaa laimennusainetta tai kantaja-ainetta. Kantaja-aineen valinta riippuu aiotusta lääkkeenantotiestä ja parenteraalista antotapaa varten on sopiva kantaja-aine steriili, pyrogeenivapaa normaali suolaliuos. Entsyymejä voidaan antaa myös oraalisesti ja oraalista antoa varten voidaan käyttää konventionaalisia lääkeaineiden kantaja-aineita. Kliinisiä indikaatioita keksinnön mukaisten entsyymien käytölle ovat diagnoosi, laski-motromboosien ehkäisy ja hoito (myös syvät laskimo- ja verkkokalvon tromboosit), pulmonaariembolit, intrakardiaalitukok-set, valtimotromboembolit, mikrovaskulaaritromboembolit, inflammatoriset eksudaatiotilat ja veren esiintyminen ruumiinonteloissa kuten hemothoraksissa.

Edellä mainittua ensimmäistä solulinjaa säilytetään University College'n viljelykokoelmissa, Lontoossa hakumerkillä GPK ja toista solulinjaa University College'n viljelykokoelmissa, Lontoossa hakumerkillä BEB; kummatkin on talletettu (kansainvälisesti tunnustettuun) Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, helmikuun 25 päivänä 1983 numerolla I 221 BEB:lie, ja numerolla I 222 GPK:lie.

7 76375

Vastakohtana edellä mainitulle, aikaisemmin selostetulle humaani ekstrinsiIniselle plasminogeenin aktivaattorille (HEPA), keksinnön mukaisilla entsyymeillä on eri molekyylipaino ja aminohappokoostumus (katso taulukkoa 3). Ainakin GPK:sta johdetun entsyymin on myös havaittu olevan fibrinolyyttinen itsessään (eli se vaikuttaa suoraan entsymaattisesti fibriiniin eikä ainoastaan plasmiinin vapautumisen kautta, kts. kuviota 4).

Keksinnön mukaisten entsyymien valmistaminen ja niiden karakterisoiminen tullaan selostamaan yksityiskohtaisemmin esimerkeissä .

Kudosviljelyissä käytetyt solut

Talletettujen solulinjojen BEB ja GPK soluja käytettiin seu-ravissa menetelmissä: a) Rutiiniviljelymenetelmiä

Soluja hoidetaan rutiinin mukaisesti viikottaisessa subvilje-lyssä. Kun ne ovat juuri sub-konfluentteja, ne irrotetaan antamalla 10-prosenttisen trypsiinin dekstroosi-suolaliuokses-sa vaikuttaa niihin noin 2-3 min. ajan, siirretään sentrifu-giputkeen elatusaineen (noin 2 ml) kanssa ja niitä pyöritetään 800 kierr./min. 4 min. ajan. Solupelletti sen jälkeen suspendoidaan uudelleen 1 mitään elatusainetta. 20 ^ultn tasamäärä lasketaan Coulter-counterlaitteen avulla ja solut siirrostetaan puhtaisiin steriileihin viljelypulloihin, jotka sisältävät elatusainetta ja ne jätetään CO -inkubaattoriin o 2 37 Ctssa yhdeksi viikoksi kantalinjaksi. GPK-solujen nor- 3 maali surrostetiheys on 10 GPK-solua per ml. Kontammaa- tiotutkimuksia tehtiin autoradiografisesti (BEB-siirrostus- vaihe 19, GPK-siirrostusvaiheet 34 ja 50). Solut siirrostet- 3 tiin kuvalevyille ja ne merkittiin viiden tunnin ajan h- 8 76375 tymidiinillä, lopullinen konsentraatio 1,0 ^uCi/ml. Levyt päällystettiin Ilford K 2-emulsiolla geelimuodossa ja kuvale- ... .o vyjä pidettiin 4 C:ssa yhden viikon ajan, kehitettiin ja värjättiin Giemsa-värillä ja tutkittiin niiden ydinmerkki ja mahdollinen sytoplasma- tai ei-sellulaarinen merkki. Molemmat linjat näyttivät vain normaalin ydinmerkin. Mykoplasmakonta-minaatio oli myös poissuljettu elatusaineviljelyillä (BEB, 17 ja GPK-pasaasi 7).

EntsyymikokoelmtIn käytettiin siirrostusvaiheLta GPK (33-53) ja BEB (19-27) .

b) Varastointi nestemäisessä typessä

Trypsinisointi- ja laskemismenetelmien jälkeen, jotka on edellä selostettu, solut sentri fugoi.daan alas ja solupelletti suspendoidaan uudelleen elatusaineeseen, joka sisältää 7,5 % dimetyylisulfoksidia (DMSO), niin että solujen konsentraa- 6 tioksi tulee noin 2 x 10 solua/ml. Solususpensio pannaan ampulleihin polystyreenilaatikkoon, joka jäähdytetään vai-_ , . . o o heittam seuraavasti: 3 h +4 C:ssa, 30 min -18 C:ssa, yli o yön -17 C:ssa ja siirretään sitten typpijäähdyttämöön.

c) Rekonstituoiminen nestemäisessä typessä varastoinnin jälkeen

Ampullit, jotka sisältävät rekonstituoitavia soluja, poistettiin typestä ja niiden annettiin sulaa nopeasti laboratorioas-tiassa, jossa oli lämmintä vettä (35°c). Solut siirrettiin sen jälkeen viljelypulloon, joka sisälsi 10 ml elatusainetta ... o je jätettiin olemaan yli yön 37 C:ssa. Elatusaine vaihdettiin 76375 9 seuraavana päivänä DMSOrn poistamiseksi, d) Viljelyn koon suurentaminen

Entsyymituotokset solua kohti ovat äärimmäisen pieniä (0,1 pg/solu), tästä johtuu tarve käyttää suuren mittakaavan vil-jelysysteemejä solujen korkeiden konsentraatioiden mahdollistamiseksi prosessisysteemissä, jossa yksiköiden lukumäärää nostetaan vastakohtana useille pienen mittakaavan laitteille). On myös tärkeätä, että viljelysysteemi tuottaa niin konsentroitua tuotetta kuin on mahdollista puhdistusprosessin helpottamiseksi. Seuraavia viljelysysteemejä on käytetty solu- ja 2 entsyymituotannon kohottamiseksi 25 ja 75 cm :n pulloista: i) Pyörivä viljely. Erikokoisia polystyreeni- ja lasipulloja pyöritetään hitaasti (12 kierr./h) käyttäen standardi kudos-viljelypyörityslaitetta. Tuotto kasvaa, koska koko sisäpinnan alaa käytetään, eikä ainoastaan yhtä pintaa. Tuotetaan kon-sentroidumpia entsyymisaaliita, koska suhdetta solu/elatus-aine voidaan lisätä verrattuna paikallaan pysyviin viljelyihin.

ii) Levysarjaviljelyt. Viljelyn pinta muodostuu sarjasta litteitä, pyöreitä ruostumatonta terästä olevia levyjä, jotka on asennettu pystysuoraan sekoittajan varteen 2-4 mm:n päähän toisistaan. Koko yhdistelmä on pantu fermentoimisas- tiaan ja sitä sekoitetaan hiljakseen (korkeintaan 100 kierr./ 2 min). Viljelyn koko vaihtelee 5 litrasta (12 200 cm ) 210 2 litraan (330 000 cm ) viljelyn pinta-alaa ja vaikka sen ansiosta saadaan suurempi lisäys solukapasiteettiin yhdessä yksikössä, sen avulla ei saada aikaan konsentroidumpaa tuotteen valmistamista .

iii) Mikrokantajaviljelyt. Mikrokantajat Ovat pieniä pallosia, joiden pinnalla voidaan kasvattaa soluja ja joita voidaan sekoittaa suspensiossa. Tämä sallii suuren mittakaavan fer-mentoimislaitteiston käyttämisen, joka normaalisti sopii vain suspensiossa oleville soluille, myös soluille, jotka ovat kiinni substraatissa. Tämän systeemin etuina on täydellinen 76375 10 ympäristökontrolli, niin että voidaan pitää viljely homogeenisena ja optimiympäristössä, rajoittamaton mahdollisuus suurentaa mittakaavaa ja helppous muuttaa suhdetta solu/elatusaine konsentroidumman tuotteen saamiseksi. Mikrokantajilla saadaan 2 tyypillisesti 5000 cm :n viljelyala/g ja niitä käytetään konsentraatioilla 3-15 g/litra riippuen viljelylaitteen teknisistä hienouksista.

Soluviljelyn periaatteet ovat samat jokaiselle viljelyastia-tyypille ja koolle.

Esimerkki a) GPK-soluista peräisin olevan entsyymin (CDE) talteenotta- minen mikrokantajaviljelystä_

Cytodex-3 (Pharmacia Fine Chemicals) oli käytetty mikrokantaja ja konsentraatio oli lO g/litra. Viljelylaite oli 5 litran Biocul Fermenter (L.H. Fermentation Ltd.), jonka työskentely-kapasiteetti oli 4,5 litraa, ja joka oli kiinnitetty perfuusio-säiliöön, joka sisälsi 2 litraa elatusainetta. Suhde pinta-ala/ elatusaine oli yli 4 kertaa suurempi kuin pyörivissä astioissa kun käytetään tämän mittakaavan mikrokantajaa ja soluja voidaan pitää elinkelpoisina ja aktiivisina vain kontrolloimalla kriittisesti happea, pH:ta ja ravinnekonsentraatioita ja ylläpitämällä suuria perfuusionopeuksia. Viljelylaite, joka vastaa näitä vaatimuksia, on selostettu (Griffiths, J.B. ja Thornton B., J.Chem.Tech.Biotechnol. 1982, Ύ1_, 324-329).

9 2,5 x 10 solua valmistettiin kylvöä varten pyörivässä pullo-viljelyssä ja lisättiin viljelyyn, joka sisälsi Eagles (MEM)-elatusainetta, jota oli täydennetty lO-prosenttisella FBSrllä, 0,001-prosenttisella Tween 80:llä ja Hepes-puskurilla. Kun oli viljelty 72-96 h lämpötilassa 37°C, solut kasvoivat riittävästi peittämään noin 70 % käytettävissä olevasta substraatista (tyypillisesti noin 1,4 x 10^ solua). Elatusaine dekantoitiin, solut ja mikrokantaja pestiin kahdesti seerumivapaalla elatus-aineella ja sen jälkeen ne peitettiin seerumivapaalla MEM:llä. Inkubointi 37°C:ssa jatkui sitten ainakin 60 h, jotta solut n 76375 saivat kasvaa lisää ja entsyymiä erittyi.

Inkuboinnin lopulla kaadettiin päällä oleva neste pois ja sentrifugoitiin, 450 g, 10 min ajan suspensiossa olevien solujen poistamiseksi. Päällä oleva neste sentrifugoitiin sitten 40 000 g 30 min ajan 5°C:ssa. Otettiin 50 ^ul:n määrä fibriini-levykoetta varten, päällä oleva neste pakastettiin ja siirrettiin punnittuun pulloon ja varastoitiin nestemäisen typen jäähdyttämössä. Vaihtoehtoisesti voidaan päällä oleva neste konsentroida ultrasuodattamalla.

b) GPK-soluviljelyn päällä olevan nesteen puhdistaminen Konsentroitu viljelyn päällä oleva neste puhdistettiin osittain kromatografisesti sinkkikelaattiagaroosia sisältävän pylvään avulla (4,4 cm x 12 cm), joka oli etukäteen tasapainoitettu 4°C:ssa 0,02 M tris-HCl:n avulla, pH 7,5, ja joka sisälsi 1 M NaCl ja 0,01 % Tween 80:tä. 5 litraa tasapainoitettua elatusainetta pantiin tähän pylvääseen virtausnopeudella 120 ml/h. Pylväs pestiin 2 litralla tasapainotuspuskuria ja sen jälkeen eluoitiin sitoutuneet proteiinit lineaarigradientilla 0-0,5 M imidatsolia (kokonaisvolyymi 1 litra) tasapainoitus-puskurissa. Eluaatti kerättiin 8 ml:n fraktioihin. Kunkin fraktion ultravioletti(UV)-absorptiota monitoroitiin 280 nm:llä ja fibrinolyyttistä tehoa testattiin fibriinilevykokeen avulla (kuvio 1). Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja sen spesifinen aktiivisuus määrättiin fibriinihyytymän liuotusaikamenetelmällä.

Seuraavassa vaiheessa pantiin yhdistetyt fraktiot konkanavalii-ni-A-agaroosi-pylvääseen (2,2 x 15 cm), joka oli tasapainoitettu 0,01 M natriumfosfaattipuskurin avulla, pH 7,5, ja joka sisälsi 1 M NaCl ja 0,01 % Tween 80. Pylväs pestiin tasapainoi-tuspuskurilla virtausnopeudella 10 ml/h kunnes eluaatin UV-absorptio 280 nm:llä oli alle 0,15. Tasapainoituspuskurin (200 ml) lineaarigradienttia 0,01 M natriumfosfaattipuskuriin, pH 7,5, joka sisälsi 0,6 M α-D-metyylimannosidia, 2 M KSCN ja 0,01 % Tween 80, käytettiin eluoimaan absorboitu materiaali. Koottiin 5 ml:n fraktioita UV-absorption sekä fibrinolyyttisen 12 7 6 3 7b vaikutuksen mittaamista varten, kuten on aikaisemmin selostettu (kuvio 2). Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja KSCN-konsentraatio nostettiin 1,6 M:ksi lisäämällä kiinteää KSCN:ää yhdistettyihin fraktioihin. Liuos sen jälkeen konsentroitiin dialyysin avulla kiinteätä polyetyleeniglykolia vasten, molekyylipaino 15 000 - 20 000 daltonia.

Konsentroitu liuos (5-8 ml) sentrifugoitiin ja geelisuodatet- ® tiin Sephadex G 150 superfine-pylväässä (2,5 x 90 cm) 0,01 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,5, joka sisälsi 1,6 M KSCN ja 0,01 % Tween 80. Koottiin 3 ml:n fraktioita virtausnopeudella 9 ml/h. Aktiivinen entsyymi eluoitiin yksinkertaisena piikkinä, joka sattui yhteen pienen proteiinipiikin kanssa (kuvio 3). Fraktiot, jotka sisälsivät aktiivista entsyymiä, yhdistettiin, konsentroitiin dialyysissä polyetyleenigly-kolia vasten ja varastoitiin -80°C:ssa.

Vaihtoehtoisesti voidaan konkanavaliini-A-agaroosi-pylvään eluaatti puhdistaa edelleen affiniteetti-kromatografiän avulla ® ® lysiini-Sepharose'n tai fibriini-Sepharose'n avulla. GPK:sta peräisin olevan entsyymin puhdistuksen tulokset on koottu taulukkoon 1.

c) Entsyymikoe i) Fibriinilevykoe

Valmistettiin fibriinilevyjä seuraavasti. 52 mm:n läpimittaisessa polystyreenisessä Petri-maljassa hyydytettiin 3 ml fibrino-geeniä, 1 mg/ml, käyttäen Fibrin Plate Buffer (fibriinilevy-puskuria) 10 ^ul:n avulla trombiinia (250 yks./ml) ja annettiin seisoa vähintään 30 min huoneen lämmössä. 50 ^,ul päällä olevaa nestettä pantiin duplikaattina yhdelle levylle yhdessä 50 .ul:n kanssa plasmiini-standardia (10 ,ul/ml) ja levyä inkuboi-tiin 20 h 37 C:ssa. Liuennut alue mitattiin ortogonaalisina läpimittoina ja se ilmoitettiin "plasmiiniyksikköinä" (1 Pu = liukeneminen, jonka on saanut aikaan 1 ng plasmiinia).

13 7 63 75 ii) Fibriinihyytymän liukenemisaikamenetelmä

GPKrsta ja BEB:stä peräisin olevien entsyymien fibrinolyyttis-tä vaikutusta verrattiin standardi urokinaasiliuoksen vaikutukseen (ensimmäinen kansainvälinen humaaniurokinaasin vertai-luvalmiste, taltioitu v. 1966). Standardiampulli urokinaasia liuotettiin 50 mM natriumdietyylibarbituraattipuskuriin, pH

7,8, joka sisälsi 0,1 M NaCl ja 0,25 % paino/volyymi gelatiinia. Valmistettiin useita standardi urokinaasin ja fibrinolyyttisen entsyymin laimennuksia edellä mainitussa puskurissa. Kaikki muut aineet laimennettiin samaan puskuriin ja pidettiin jäissä ennen sekoitusta. 0,2 ml laimennettuja urokinaasin tai entsyymin liuoksia pantiin sarjaan 10 x 50 mm:n putkiin. Tätä seurasi 0,05 ml humaaniplasmogeeniä (3 mg/ml), 0,5 ml humaanitibrino-geeniä (0,25 % paino/volyymi) ja 0,05 ml trombiinia (40 NIH yksikköä/ml). Aineet sekoitettiin nopeasti ja putket pantiin 37,5°C vesihauteeseen. Pantiin sekunttikello käyntiin heti ja liukenemisajan loppuhetki saatiin kallistamalla putkea varovaisesti. Valmistettiin kalibrointikäyrä merkitsemällä log liuke-nemisaika (minuuteissa) log urokinaasikonsentraatiota vastaan hyytymässä. Sen entyymiliuoksen laimennuskerrointa, joka antaa saman liuotusajan kuin urokinaasin standardiliuos, jossa on 0,5 IU/ml, käytettiin ei-laimennetun entsyymiliuoksen vaikutuksen laskemiseen. Entsyymin fibrinolyyttinen vaikutus ilmaistiin sen vuoksi kansainvälisinä yksikköinä (IU).

GPK:sta peräisin olevan puhdistetun entsyymin keskimääräinen ominaisvaikutus (fibrinolyyttinen vaikutus/mg proteiinia) oli noin 12 500 IU/mg.

d) Proteiinin määritys

Proteiinin konsentraatio mitattiin Read & Northcote (Anal. Biochem. 116, 53-64, 1981) parannetun Coomassie Blue G värin-sitomiskokeen avulla käyttäen härän seerumialbumia, fraktiota V, standardina.

(e) Kontrollit

Valmistettiin 670 mg:n panos pakastekuivattua materiaalia 14 7 6 3 7 5 kohdassa a) edellä selostetulla tavalla, mutta ilman mukana olevia soluja. Tämä materiaali antoi negatiivisen tuloksen fibriinilevyanalyysissä. Tutkittiin myös päällä olevia nesteitä useista muista solulinjoista niiden fibrinolyyttisen vaikutuksen suhteen, mutta ne olivat joko negatiivisia tai ne osoittivat vain hivenen verran fibrinolyyttiStä vaikutusta. Tulokset esiintyvät taulukossa 2.

f) Kuumennuksen vaikutus (entsyymin inaktivointi)

Ennen soluista peräisin olevan materiaalin pakaste-kuivausta siitä otettiin kaksi 0,5 ml tasamäärää (GPK 37, panos 3) . Ibinen kuumennettiin kiehuvassa vesihauteessa viiden minuutin ajan, toista käytettiin normaalina kontrollina. Fibriini-levykokeessa oli keitetty näyte inaktiivinen.

4. Fysikokemialliset ominaisuudet a) Fibriinilevykoe GPK:sta peräisin olevien entsyymiliuosten fibrinolyyttiset vaikutukset määrättiin plasminogeeniä sisältävillä härän fibrii-nilevyillä. 3 ml fibrinogeeniliuosta (ex-Sigma, 1 mg/ml) hyydytettiin petrimaljassa (Cibco Europe Ltd.), 52 mm läpimitta, lisäämällä 2,5 yksikköä trombiinia 10 ^ulissa puskuria. Levyjen annettiin seisoa huoneen lämmössä ainakin 30 min ennen käyttöä.

50 yul:n volyymi testinäytteitä pantiin levyille, jotka sen jälkeen inkuboitiin 18 h ajan 37°C:ssa. Liuennut alue mitattiin ja ilmoitettiin prosenteissa kokonaan liuenneesta alueesta, jonka plasmiini sai aikaan (10 ^ug/ml).

b) Fibriinilevyjen esikäsittely

Fibriinikerroksen ominaisplasminogeenipitoisuuden inaktivoimis-ta varten fibriinilevyjä kuumennettiin 80°C:ssa 45 min ajan.

Sen jälkeen niiden annettiin jäähtyä huoneen lämpöön ennen käyttöä. Huolehdittiin siitä, ettei fibriinilevyn päälle päässyt kehittymään kondensoitumista.

Tämä menettely johti kontaminoivan plasminogeenin denaturoimiseen ja levyjen herkkyyden poistamiseen plasminogeeni-aktivaatto- is 7 6 3 7 5 reita kuten esimerkiksi urokinaasia kohtaan (ja se vähensi myös levyjen herkkyyttä proteolyysille).

Tulokset on esitetty kuviossa 4, ja niistä voidaan vertailla GPK:sta peräisin olevan entsyymin fibrinolyyttistä vaikutusta plasmiinin ja urokinaasin vastaavaan kuumennetuilla ja kuumentamattomilla fibriinilevyillä. Kuten oli odotettuakin, ei urokinaasin tapauksessa ollut lainkaan f ibrinolyyttistä vaikutusta kuumennetulla levyllä johtuen kontaminoivan plasminogeenin inaktivoinnista.

GPK:sta peräisin oleva entsyymi kuitenkin vielä kykeni liuottamaan kuumennetulla levyllä olevan fibriinikerroksen, vaikka vähemmässä määrin kuin kuumentamattomalla levyllä tapahtuva liuotus. Nämä tulokset ilmaisevat, että vastoin tunnettuja plasminogeenin aktivaattoreita GPK:sta johdetulla entsyymillä on sekä suora fibrinolyyttinen että plasminogeeniä aktivoiva vaikutus.

GPK:sta peräisin olevan entsyymin fibrinolyyttistä vaikutusta testattiin myös plasminogeenivapailla fibriinilevyillä, jotka oli valmistettu kaupallisesti saatavasta plasminogeenivapaasta fibrinogeenistä, ja sen todettiin olevan liuottavaa. Urokinaasi oli negatiivinen tässä testissä, eikä se liuottanut plasmingeeni-vapaita fibriinilevyjä.

c) Molekyylipainon arvioiminen GPK:sta peräisin olevan entsyymin molekyylipaino määrättiin lO-prosenttisessa polyakryyliamidi-1 ev ygeelissä natriumdode-kyylisulfaatissa pelkistävissä ja ei-pelkistävissä olosuhteissa Laemmli'n menetelmän mukaisesti (1973). /U.K. Laemmli ja M.Favre, J.Mol.Biol. 80, 575-599 (1973)_7.

Näytteitä kuumennettiin 90°C:ssa 5 min ajan ennen elektroforeesia ja käytettiin seuraavia vertailuproteiineja standardeina: Fosforylaasi b (92 500), härän seerumialbumi (67 000), ovalbu-miini (45 000), karboniini-anhydraasi (31 000), soijapapu- ie 7 6 3 7 5 trypsiinin inhibiittori (21 000) ja lysotsyymi (14 400).

Eräästä kokeesta saadun levy geelin densitometristä jälkeä käytettiin molekyylipainon laskemiseen. Välimatka, johon GPK:sta peräisin oleva entsyymi oli vaeltanut, piirrettiin standardikäyrälle, joka saatiin merkitsemällä graafisesti vertailuproteiinien suhteellinen vaeltaminen niiden log molekyylipainoihin nähden.

Tulokset näyttävät, että puhdistetun, GPK:sta peräisin olevan entsyymin molekyylipaino oli suunnilleen 56 000 _+ 2000 ei-pelkistävissä olosuhteissa ja 62 000 + 3000 pelkistävissä olosuhteissa (lisäämällä 2-merkaptoetanolia) josta voidaan päätellä disulfidisiltojen olemassaolo entsvymimolekyyIissä. Molekyylipaino on hyvin yhtäpitävä sen summittaisen molekyyli-painon 65 000 _+ 3000 kanssa, joka on laskettu geelisuodatuksen avulla Sephadex G 150-pylvään avulla. Samanlaisia tuloksia saatiin BEBrstä peräisin olevalle entsyymille.

d) Isoelektrinen fokusointi

Suoritettiin isoelektrinen fokusointi ohutlevy-LKB Ampholine-polyakryyliamidigeelilevyissä pH-alueella 3,5-9,5 käyttäen LKB Multiphor-yksikköä. 20 yUl:n määrä GPK-entsyymiä pantiin geeliin. Fokusointi suoritettiin vakioteholla 8 W, lähtövirran ollessa 20 mA ja jännitemaksimilla 1,1 KV. Fokusointilämpö-tila oli 10°C ja kokeen kestoaika 90 min.

pH-gradientti geelin läpi mitattiin huoneen lämmössä 0,5 cm:n välein käyttäen pienoiskombinaatiopintaelektrodia (Pye-Ingold tyyppi 403-30-M 3), jossa on 3 mm:n läpimittainen kärki ja pH-mittari (Corning malli 7030). Geeli värjättiin proteiinia varten käyttäen Coomassie brilliant blue R-250 väriä (Sigma Chemical Co) 10-prosenttiseen trikloorietikkahapon (TCA) liuokseen kiinnittämisen jälkeen.

Saadut tulokset on esitetty kuviossa 5. Isoelektriset pisteet (pl) GPKrsta peräisin olevilla puhdistetuilla entsyy meillä olivat 4,6.

17 ?63 7s e) Aminohappokoostumus GPK- ja BEB-entsyymien aminohappokoostumus määrättiin Locarte'n aminohappoanalyysilaitteella proteiininäytteen hydrolyysin jälkeen keittämällä jatkuvasti 6 M HCl (Aristar) vakuumissa lämpötilassa 110°C 20 h ajan.

Taulukossa 3 on esitetty entsyymien aminohappokoostumukset. Vertailun vuoksi on taulukkoon otettu myös plasminogeenin akti-vaattorin koostumus, joka on peräisin malignista humaanimelano-masta (HEPA). /D.C. Rijken ja D. Collen, J.Biol.Chem. 256, 7035-7048 (1981)7.

Voidaan havaita, että GPK- ja BEB-entsyymit ovat pohjimmiltaan samanlaiset koostumuksensa puolesta, ja joitakin vähemmän merkittäviä eroavaisuuksia oli odotettavissakin kahden eri solulinjan välillä. Sekä GPK:n että BEB:n aminohappo- koostumus on erilainen kuin HEPA:n julkaistu aminohappokoostumus.

f) Kineettiset tutkimukset GPK:sta peräisin olevan entsyymin amidolyyttinen vaikutus määrättiin käyttäen useita erilaisia kromogeenisiä aineita. Vaikutus mitattiin spektrofotometrisesti 1 cm:n kyvetis-sä 37°C:ssa Gilford-systeemi 2600 spektrofotometrillä, joka oli liitetty Hewlett Packard 7225 A Graphics Plotter-läitteeseen.

Osittain puhdistettua entsyymiä inkuboitiin eri konsentraation omaavien kromogeenisten substraattien kanssa 0,05 M Tris-HCl-puskurissa, ja pH-arvot ja ionivahvuus on ilmoitettu taulukossa 4, jossa esitetään GPK:sta peräisin olevan entsyymin kineettiset parametrit eri substraattien kanssa. p-nitroaniliinin vapautuminen alussa monitoroitiin aallonpituudella 405 nm. Käytettiin molaarista ekstinktiokerrointa 10 500 litra.mol 1 cm p-nitroaniliinille.

g) Fibriinin sitomistutkimukset GPKrsta ja BEB:stä peräisin olevien entsyymien absorboituminen fibriinihyytymiin määrättiin sekoittamalla 1 ml plasminogeeni- 18 76375 vapaata fibrinogeeniä (1,5 mg/ml) 25 ^ul GPK tai BEB (25 ^ug/ml) ja 50 yUl trombiinia (20 NIH U/ml). Yllä olevat seokset pantiin 0,05 M natriumdietyylibarbituraattipuskuriin, pH 7,8, joka sisälsi 0,1 M NaCl ja inkuboitiin 37°C:ssa 30 min ajan. Hyytymät otettiin talteen sentrifugoimalla, pestiin puskurilla ja uutettiin sitten 1 ml :11a 0,05 M natriumdietyylibarbituraatti-puskuria, pH 7,8, joka sisälsi 1 M KSCNiää. Hyytymän päällä olevasta nesteestä ja hyytymän uutteista otettuja tasamääriä testattiin plasminogeeniä sisältävillä fibriinilevyillä.

Tulokset osoittavat, että suurin osa lisätystä entsyymistä sitoitui fibriinihyytymiin ja vähän tai ei lainkaan aktiivista entsyymiä jäi päälläolevaan nesteeseen. Mutta samanlaiset kokeet urokinaasilla osoittivat, että tapahtui vain merkityksetöntä sitoutumista fibriinihyytymään.

h) GPK:sta peräisin olevan entsyymin sitoutuminen kokeelli- seen trombiin keinotekoisessa verenkiertosysteemissä_ GPK:sta peräisin olevan entsyymin kykyä sitoutua koko verihyy-tymään tutkittiin in vitro Chandler'in silmukan muotoisessa verenkiertosysteemissä. Valmistettiin kokeellinen verkkoutettu trombi polyetyleeniputkessa, jonka sisäläpimitta oli 3 mm (esi-pesty, 0,01-prosenttisella Tween'illä) sekoittamalla sitraattia sisältävää humaaniverta (1 ml) , 50 ^ul 0,05 M CaC^ ja 25 ^,ul trombiinia (100 NIH U/ml). Inkuboitiin 37°C:ssa 1 h ajan pyörivällä päytäalustalla (30 kierr./min) ja trombi kaadettiin Petri-maljaan ja pestiin kaksi kertaa 0,05 M natriumdietyyliä barbituraattipuskurilla, pH 7,8, joka sisälsi 0,25-prosenttista (paino/volyymi)gelatiinia ja 0,01 M NaCl. Sen jälkeen trombi imettiin takaisin putkeen yhdessä 0,9 ml:n kanssa autologista plasmaa tai puskuria. 100 ^.ul GPK:sta peräksin olevaa entsyymiä (noin 500 IU) lisättiin, silmukka pantiin takaisin pyörivälle pöydälle ja inkuboitiin vielä 2 h ajan 37°C:ssa. Hyytymät poistettiin, pestiin puskurilla kuten aikaisemmin ja sen jälkeen ne uutettiin 1 ml:n kanssa 0,05 M dietyylibarbituraattipuskuria, pH 7,8, joka sisälsi 1 M KSCN, 1 h ajan 4°C:ssa. 50 ^ul hyytymän uutetta ja hyytymän päällä olevaa nestettä putkesta pantiin 19 7 637 5 plasminogeeniä sisältäville fibriinilevyille ja inkuboitiin 18 h 37°C:ssa.

Saadut tulokset osoittavat, että hyytymän uutteen fibrinolyytti-nen vaikutus ja siis sitoutuneen entsyymin määrä oli selvästi suurempi kuin hyytymän päällä olevan nesteen. Samankaltaisia tuloksia saatiin, kun koe toistettiin indium^^-merkityn entsyymin kanssa.

Näiden tulosten perusteella voitaisiin säteilymerkittyä entsyymiä käyttää diagnostiikassa tehokkaana keinona in vivo trombin paikallistamiseen.

i) Immunodiffuusioanalyysi

Antiseerumeita GPKrsta ja BEBrstä peräisin olevaa materiaalia ja humaani-urokinaasia vastaan kasvatettiin kanissa menetelmän mukaan, jonka ovat selostaneet Rijken & Collen (J.Biol.Chem.

256, 13, 7035-704.1 1981). Antiseerumeiden IgG-fraktiot eris- - ® tettiin affiniteetti-kromatografisesti proteiini-A-Sepharose- pylväässä.

Suoritettiin kaksoisimmunodiffuusioanalyysi 1,5-prosenttisissa agargeeleissä Ouchterlong ja Nilsson'in tekniikan mukaan (Handbook of Experimental Immunology, 2.painos, kappale 19, Blackwell, Oxford). Näytteet lisättiin rei'itettyyn syvennykseen ja niiden annettiin djffundoitua yli yön 4°C:ssa kosteassa atmosfäärissä. Kokeet osoittavat, että GPKrsta ja BEBrstä peräisin olevat entsyymit ovat immunologisesti samanlaisia ja että kanin anti-GPK IgG ja anti-BEB IgG eivät reagoineet uroki-naasin kanssa. Samaten ei kumpikaan ristireagoinut vasta-aineisiin urokinaasia vastaan.

j) GPKrsta peräisin olevan entsyymin vaikutuksen inhiboiminen 2-merkaptoetanolin avulla_

Valmistettiin useita 2-merkaptoetanolin varastoliuoksen laimennuksia 0,05 M natriumdietyylibarbituraattipuskurissa, pH 7,8, joka sisälsi 0,01-prosenttLsta Tween 80rtä. GPKrsta peräisin 20 7 6 3 7 5 olevaa entsyymiä (25 ^,ug/ml) sekoitettiin yhtä suuren tilavuuden kanssa laimennettua 2-merkaptoetanolin liuosta ja seosta inkuboitiin 37°C:ssa. Kontrollinäyte sisälsi entsyymiä saman tilavuuden kanssa puskuria. 15 min kuluttua pantiin 50 ^ul:n määrä seosta plasminogeeniä sisältävälle fibriinilevylle jäännös-entsyymivaikutuksen kokeilemiseksi. Entsyymin vaikutusta tutkittiin myös kvantitatiivisesti fibriinihyytymän liuotusaika-menetelmän avulla.

Saadut tulokset osoittavat, että huomattava osa (> 80 %) entsyymin vaikutuksesta inhiboitui inkuboitaessa 2-merkaptoetanolin kanssa konsentraatiolla 10 mM tai suuremmalla. Nämä tulokset yhdessä molekyylipainon määräyksen aikana saatujen kanssa osoittavat, että intramolekulaariset disulfidisillat ovat olennaisen tärkeät entsyymin vaikutustehokkuudelle.

k) Poly-D-lysiinin vaikutus GPKzsta peräisin olevan entsyy- min vaikutukselle_

Tutkittiin poly-D-lysiinin vaikutusta osittain puhdistetun, GPK:sta peräisin olevan entsyymin plasminogeenin aktivoimis-kykyyn, pääasiallisesti menetelmän mukaan, jonka on selosta-nyt Allen (Thromb.Haemostas. (Stuttgart) £7, 41-45, 1982). Reaktioseos muodostui 400 ^ul:sta 0,05 tris-HCl-puskuria, pH 7,5, 25 ^ulista Tween 80 (O,4-prosenttista), 125 ^ulzsta plasminogeeniä (200 ^ug/ml), 200 ^ul:sta kromogeenistä substraattia S-2251 (3,5 mM) ja 50 ^ulzsta poly-D-lysiiniä (5 yug/ml) tai vesikontrollia. Reaktio aloitettiin lisäämällä 200 ^,ul entsyymiä ja optisen tiheyden muutosta aallonpituudella 405 nm monitoroitiin 37°C:ssa 20 min ajan.

Havaittiin, että ilman poly-D-lysiiniä saatiin parabolinen käyrä, joka oli samanlainen kuin se, joka saatiin urokinaasin kanssa, kun läsnä oli poly-D-lysiiniä näissä olosuhteissa. Kuitenkin poly-D-lysiiniä lisättäessä reaktioseokseen, joka sisälsi GPKzsta peräisin olevaa entsyymiä liuos muuttui sameaksi aiheuttaen kompleksisen muutoksen optisessa tiheydessä ajan kanssa.

Nämä preliminääriset tulokset viittaavat siihen, että poly-D- 76375 21 lysiini reagoi GPK:sta peräisin olevan entsyymin kanssa erilailla kuin urokinaasin kanssa.

Edellä olevasta selostuksesta voidaan huomata, että keksinnön mukaisia entsyymejä voidaan käyttää terapeuttisiin, profylaktisiin ja diagnostisiin tarkoituksiin. Terapeuttista ja profylaktista käyttöä varten entsyymit voidaan formuloida farmaseuttisiksi seoksiksi, erikoisesti parenteraalisesti annettaviksi seoksiksi. Seoksissa voi siten olla mitä tahansa konventionaalista parenteraalista kantaja-ainetta kuten steriiliä, pyrogeenivapaata fysiologista suolaliuosta. Ihmiselle annettaessa on sopiva annostus noin 10 mg - noin 80 mg 24 h ajanjaksoa varten, etupäässä 2 tai 3 annosta intravenööttisesti annettuna. Diagnostisia tarkoituksia varten voidaan entsyymejä merkitä radioaktiivisiksi konventionaalisella merkitsemistek-niikalla, esimerkiksi I^^:n tai In^^in avulla. Radioaktiiviseksi merkittyä entsyymiä voidaan sitten panna vaskulaari-systeemiin, jota on määrä tutkia ja etsiä sen jälkeen kohtia, joissa radioaktiivisuus on kohonnut.

22 76375 tn 3 -PC co cn -h -HO 1— Γ- kD Γ- ιΟ i-t cn -*r

Ä h CO

3 CL)

(¾ AC

cn 0 -p O co Ό co Ο <#> Ο σι co ·ττ 3^ Ή

Eh 1 tn tn 3 ^

•rl +J tT

nj 3 e C M \ ko ^ o

•H -H CO ro kO kO O

C S C H rs in O) O > — co C rs

-H i—I

e

Iti I

-P tn cn

cn -h 3 o O O O

•H (ti -P —' O O oo

OC3D oo .H Ή O

x o λ; m 3 x -ri '— r- «a* com

Oi O 3 m m m cn « >

C

•H

ή ε >ι O >1 Λ! in I ·Η

AC -P tn C

3 C -H -H

iHtDlti-H—. kO m |H(N

3 C Q) Cn o O Ή

Iti C O -P S ko rs

En iti ϋ O '—’ Ή

> OP

a) «a

I—I

0 c -h tn tn 3 •H 3 ~ :iti > Ή O O cn γ- Ο iti S O co r-~ rs

QJ —I — O

01 -H m

En iti

-P

tn « 1¾

O

3 I I ©

-P -H C O

-P -p I m

QJ -P *H i—I

-P Iti C I

•H φ cd -H o

0 C Ή ·Η I

c -H Cl) -H i—I -H x •h to a; en iti tn cu <0 tn -ho >0 Ό 01 3 a; O Iti O (ti iti -p a; p a; p x tn iti cc cc o C H -H tn O Cn o

En CD WC WC CO

23 76375

Taulukko 2

Fibrinolyysi solujinjojen avulla

Solut Fibrinolyyttinen indeksi _+ S.D.

ilmoitettuna plasmiiniyksikköinä

Merkitsemis- Alkuperä Päällä kelluva Solu-uute tapa_ neste_ __ GPK CNCMI-222 643 + 101 787 + 69 BEB CNCMI-221 376 + 43 N.D.

HeLa Humaaniaivo- 34 _+ 8 karsinoma Ei MRC5 Humaanikeuhkon 30 _+ 8 fibroblastit Ei

Swiss 3T3 Hiiren endotee- 17+4 153 _+ 21 lisolut (?) RLC W Rotan maksan paremkyymisolut 56 13 96 _+ 13 FCC Simpanssin maksan 3 paremkyymisolut Ei GLV 3 Viherapinan mu- N.D.

nuaisen epitee- Ei lisolut SV40 3T3 Viruksen avulla 39 +_ 17 N.D.

muunnellut 3T3-solut N.D. = ei määrätty 24 7 637 5

Taulukko 3

Aminohappokoostumukset (ilmoitettuna jäännösten prosentuaali-sena määränä)_

Aminohappo Malignin melanoman GPK BEB

plasminogeenin akti- _ vaattori (HEPA) 1 2_ _ _

Kysteiini- N.D. 2,1 happo

Asp 9,8 10,9 9,8

Thr 5,4 5,1 4,6

Ser 9,2 6,4 6,4

Glu 13,1 10,1 11,5

Pro 7,1 6,1 4,3

Gly 10,4 8,4 7,1

Ala 6,6 7,8 8,3

Vai 4,1 6,0 6,7

Met 0,9 2,4 1,0 ILeu 3,0 4,8 3,5

Leu 8,1 9,7 13,9

Tyr 4,0 3,5 2,2

Phe 3,7 4,5 3,6

His 3,3 2,8 2,6

Lys 5,5 6,5 7,1

Arg 5,9 4,8 5,1

Datat ovat C.D. Rijken'in ja D.Collen'in, J.Biol.Chem.256, 7035-7041 (1981) 2 N.D. = Ei määrätty p 76375 d - I ^ < -3 m

P s s B

5 7 5 ! I t >i 'si ir 'ζ. o -3 ^ 2

in 2 rH g 2 X

V \ m m

q in X £ rH i—I m O

H ** ^ s v ·»

> O (NinOmO O

-P

|j q 8 8 o o o in O in O cn Q Ή +J m cn m Ο ή

S-H -ft rH

-H in -ft -p in — -ft +, 5 S -S 5 g g Λ -5 3 -ft d -ft -H C Ο Ή -ft ϋ ε _ i äl"iä § £ ~ § Λ 838 8 3 Λ 3 8

(¾ DCmEhD 2 g H

+, I § % in -5 x g -¾ & 3 g £ 5» 0 0 •H S Ή ·Η

,+ in rH rH -P l" -P

-N -P oo oo oo co iflooiö •P C r~· o ui m m Η>ί m n io 3 5) r r ·+ p ^ p

+J Γ"· ·Ρ< CN 04 in rH I—I -P I—I -P

. M M s s «li s s p- in S g O 0 0 3 * 2 p p 3 +i * ~ ^ ft ft in -XOcy oor-rrtnO U3 300 ¾ d rHC OOHinmoj cn ft Q ft (o

3-p £ --- ypo^rHrHoo m in ft O ft X

3,+ x g O n in t" r-~ rsi oo m cn n in “ “ S3” " ·§·§ 5 h ^to ^cn p, in >1 jj

>ι I r-~ m m G

in ft i£> ^rnmon 0 ft ro m Q m m Q Q m n Q m

¢0 ί> ft ο Ή ft o O OO Ο ft G

w '2 3H o 6 6 6 6 6 o' d o' o' -p 3 g 3

M

in x) 0) £

m I ^j· O n •«a· oo O

Q-ι 1--- «- v - v 3 0, n- r~· ¢-, oo oo oo cn 3 3 3 < < I . 33

Z Z Γ—I iti 4-J

Ώί Xij r—j rti *n Ή

I I cp > MW

W ζρ I I -rj o ^ id a -π oj ^ ^ pi < a m X 3 I I I > (¾ 3 ft rl 3 0 tT> I ft I ft ft 3 -P qj ft ft -ho -ft y g <δ -p pi p 3 h a η a <o m «S I I I >i · >1 j in , 10 rH 0) 3 >1 <C >.< , ft ft fO ft ft O Z ο z -p p ft > ft HP o in ft inap> m iu jlu T h -Pi -Pi p ft

Λ am am 3y c tn c fr U

3 I IN I CN rH S3 55 ft cλ m · m* o · ra < (2<·κ·ι«

Claims

26 7 6 3 7 5 latenttivaat imuke et ^ * Menetelmä, jonka avulla voidaan valmistaa entsyymiä, jolla on fibrinolyyttinen vaikutus itsessään ja/tai plasmino-geeniä aktivoiva vaikutus, tunnettu siitä, että viljellään pysyvän epiteelisolulinjan GPK <CNCMI-222) tai pysyvän epi-tee1isolulinjän BEB (CNCMI—221) soluja ja eristetään entsyymiä sisältävä fraktio viljelmästä, jolla entsyymillä on molekyy-lipaino määrättynä SDS-polyakryyliamidigeeli-elektroforeesin avulla pelkistävissä olosuhteissa 62 000 +_ 3 000 ja ei-pel-kistävissä olosuhteissa noin 56 000 +_ 2 000.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä sisältävä fraktio saadaan keräämällä talteen supernatanttifraktio, joka sisältää entsyymin.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymiä sisältävä fraktio saadaan uuttamalla entsyymiä sisältävä fraktio soluista.
4. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että soluja viljellään seerumia sisältävässä elatusaineessa, seerumia sisältävä ela-tusaine korvataan seerumivapaalla elatusaineella ja entsyymi otetaan talteen supernatanttifraktiosta, joka sisältää seeru-mivapaan elatusaineen, tai uutetaan suoraan soluista.
5. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymillä on fibrinolyyttinen vaikutus itsessään ja/tai plasminogeeniä aktivoiva vaikutus ja aminohappoanalyysi pääasiallisesti sellainen kuin on esitetty taulukossa 3 sarakkeessa, jonka päällä lukee GPK.
6. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymillä on fibrinolyyttinen vaikutus itsessään ja/tai plasminogeeniä aktivoiva vaikutus ja 27 7 6 3 7 5 aminohappoanalyysi pääasiallisesti sellainen kuin on esitetty taulukossa 3 sarakkeessa, jonka päällä lukee BEB.
7. Patenttivaatimuksen 5 tai 6 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että entsyymin isoelektrinen piste on 4,6.