CN110452295B - 抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ ID NO.4所示；内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变。本发明的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在体内稳定，半衰期长、抗肿瘤生物活性高。

Description

抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物

本申请是申请号为201510761800.X的分案申请，申请日2015年11月10日，发明创造名称：抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用。

技术领域

本发明涉及一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物及应用，属于生物医药抗肿瘤药物领域。

背景技术

肿瘤生长依赖血管的形成，而血管的形成又受到血管生长因子和抑制因子的调节，抑制肿瘤血管的生长是治疗肿瘤的有效方法。内皮抑素(Endostatin)具有抑制血管生成的功能，所以在肿瘤的抗新生血管治疗中受到了重视。内皮抑素是胶原蛋白XVIII的水解而产生的C端184个氨基酸片断，它能有效抑制多种不同种类肿瘤，生物学作用呈广谱性，也无耐药性，是迄今发现的最好的血管生成抑制因子(Exp Cell Res,312,594-607,2006)。

但是，在猴子实验和人的临床试验中发现内皮抑素的半衰期很短，呈现指数级降解，10小时前后内皮抑素的体内含量递减百倍甚至接近为零(Acta Pharmacol Sin,26,124-128,2005；J Clin Oncol,20,3792-3803,2002)，表明它在动物体内很不稳定，这将大大影响内皮抑素的抗肿瘤治疗效果。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供半衰期长、抗肿瘤生物活性高的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物。

本发明的第二个目的是提供抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在制备抗癌药物的应用。

本发明的第三个目的是提供编码上述内皮抑素的衍生物的DNA片断在制备抗肿瘤药物的应用。

一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ.ID.NO4所示；所述衍生物包括：内皮抑素与抗体IgG不变区连接；或在内皮抑素的N端前面引入Arg；或在内皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位点的氨基酸短肽；或内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变、或Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变、或Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变的同时Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变。或内皮抑素与抗体IgG不变区连接，在内皮抑素的N端前面引入Arg，在内皮抑素的N端前面、或C端后面、或N端前面和C端后面引入糖基化位点的氨基酸短肽，内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变、或Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变、或Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变的同时Arg128Arg129其中一个Arg发生点突变。

IgG不变区为CH1、CH1CH2或CH1CH2CH3，所述内皮抑素与CH1连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO8；所述内皮抑素与CH1 CH2连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO10；内皮抑素与CH1CH2CH3连接的氨基酸序列为SEQ.ID.NO12。

内皮抑素的N端前面引入Arg为在内皮抑素的N端前面连接一个短肽，所述短肽中含有一个以上的Arg。

糖基化位点为Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中X为其它氨基酸。

Arg发生点突变为His。

抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的氨基酸序列最好是SEQ.ID.NO20所示。

编码权利要求6所述的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的核酸序列是SEQ.ID.NO19所示。

上述抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在制备抗癌药物的应用。

编码上述抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物的DNA片断在制备抗癌药物的应用。

本发明的优点

本发明的抗肿瘤蛋白内皮抑素衍生物在体内稳定，半衰期长、抗肿瘤生物活性高。

附图说明

图1是实施例1的前置序列-内皮抑素分别连接抗体IgG不变区CH1、不变区CH1CH2、不变区CH1CH2CH3所构建的融合蛋白的抗肿瘤活性的实验。图中1：生理盐水；2：前置序列-内皮抑素；3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1融合蛋白；4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1CH2融合蛋白；5：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白。

图2是实施例1的前置序列-内皮抑素分别连接抗体IgG不变区CH1、不变区CH1CH2、不变区CH1CH2CH3所构建的融合蛋白以及内皮抑素在小鼠体内半衰期的实验。图中样品(从上到下)，●前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白；▲前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1CH2融合蛋白；■前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1融合蛋白；◆前置序列-内皮抑素

图3是实施例2的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白中的内皮抑素N端前面短肽中的Arg的点突变的实验。图中：样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白；样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体1；样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体2；样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白N端的点突变体3；样品5：生理盐水(对照)。

图4是实施例3的引入糖基化位点短肽的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白的抗肿瘤活性的实验。样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQ IDNO.12)；样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体1(SEQ IDNO.14)；样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ IDNO.16)；样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(SEQ IDNO.18)

图5是实施例3的引入糖基化短肽的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)：●前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(SEQ ID NO.18)；▲前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ ID NO.16)；■前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体1(SEQ ID NO.14)；◆前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQ IDNO.12)。

图6是实施例4的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)在引入的糖基化位点(Asn210-Ser211-Thr212)上再进行点突变的各种点突变体的抗肿瘤活性的实验。样品1：点突变体Asn210-Ser211-Thr212；样品2：点突变体Asn210-Ala211-Thr212；样品3：点突变体Asn210-Tyr211-Thr212；样品4：点突变体Asn210-Ser211-Ser212；样品5：点突变体Asn210-Ala211-Ser212；样品6：没有引入糖基化位点的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白。

图7是实施例4的图6中的各种点突变体融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)x点突变体(Asn210-Tyr211-Thr212)；+点突变体(Asn210-Ser211-Ser212)；■点突变体(Asn210-Ser211-Thr212)；▲点突变体(Asn210-Ala211-Thr212)；●点突变体(Asn210-Ala211-Ser212)；◆没有引入糖基化位点的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白。

图8是实施例5的以前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQID NO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料，对于Arg85-Arg86位置进行点突变的各种点突变体的抗肿瘤活性的实验。1：点突变体1(Ala85-Arg86)；2：点突变体2(Ser85-Arg86)；3：点突变体3(His85-Arg86)；4：点突变体4(Arg85-Ala86)；5：点突变体5(Arg85-Ser86)；6：点突变体6(Arg85-His86)；7：没有突变融合蛋白(SEQ ID NO.12)。

图9是实施例5的图8中的各种点突变体融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)，+点突变体6(Arg85-His86)；x点突变体3(His85-Arg86)；▲点突变体2(Ser85-Arg86)；●点突变体5(Arg85-Ser86)；■点突变体1(Ala85-Arg86)；*点突变体2(Ser85-Arg86)；◆没有突变融合蛋白(SEQ ID NO.12)。

图10是实施例5的以前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQID NO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料，对于Arg151-Arg152位置进行点突变的各种点突变体的抗肿瘤活性的实验。1：点突变体7(Ala151-Arg152)；2：点突变体8(Ser151-Arg152)；3：点突变体9(His151-Arg152)；4：点突变体10(Arg151-Ala152)；5：点突变体11(Arg151-Ser152)；6：点突变体12(Arg151-His152)；7：没有突变融合蛋白(SEQ ID NO.12)。

图11是实施例5的图10中的各种点突变体融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)，x点突变体9(His151-Arg152)；+点突变体12(Arg151-His152)；*点突变体10(Arg151-Ala152)；■点突变体7(Ala151-Arg152)；▲点突变体8(Ser151-Arg152)；●点突变体11(Arg151-Ser152)；◆没有突变融合蛋白(SEQ ID NO.12)。

图12是实施例6的内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点以及内皮抑素内的2组ArgArg的改造的融合蛋白的抗肿瘤活性的实验。样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)；样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体1(His85-Arg86和His151-Arg152)；样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体2(Arg85-His86和Arg151-His152)；样品4：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.18)；样品5：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白点突变体1(Arg94His95和Arg160His161)；样品6：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)。

图13是实施例6的图12中的各种突变体的融合蛋白在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)，●内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；+内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白点突变体1(Arg94His95和Arg160His161)；■前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体1(His85-Arg86和His151-Arg152)；x内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白(SEQ ID NO.18)；▲前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体2(Arg85-His86和Arg151-His152)；◆前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)。

图14是肿瘤模型的小鼠解剖的照片，图中1：实施例1中的作为对照的注射生理盐水的小鼠；2：实施例6中的注射样品6融合蛋白(内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白点突变体2)(SEQ ID NO.20)的小鼠；箭头所指的是肿瘤。

图15是实施例7的内皮抑素及各种内皮抑素衍生物抗肿瘤的实验。1：内皮抑素；2：前置序列-内皮抑素蛋白(内皮抑素的N端前面有2个Arg)；3：糖基化位点短肽-内皮抑素-糖基化位点短肽蛋白；4：发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素；5：内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白；6：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；7：生理盐水。

图16是实施例7的图15中的内皮抑素及各种内皮抑素衍生物在小鼠体内半衰期的实验。样品(从上到下)，●前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)；+内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白；▲糖基化位点短肽-内皮抑素-糖基化位点短肽蛋白；x发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素；■前置序列-内皮抑素蛋白(内皮抑素的N端前面有2个Arg)；◆内皮抑素。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

改造方法一：内皮抑素衍生物包括内皮抑素与抗体不变区连接而构建的融合蛋白，本发明把内皮抑素与抗体不变区连接，特别是IgG抗体的不变区CH1、CH1CH2或CH1CH2CH3。同时在内皮抑素的前面连接一个前置序列，它是由人白蛋白的信号肽和成熟后白蛋白的N端的5个氨基酸短肽组成，信号肽是为了让表达的融合蛋白能够分泌到动物细胞外。这样，通过增加蛋白的分子量来提高内皮抑素衍生物的半衰期。

改造方法二：内皮抑素衍生物是以前置序列-内皮抑素-IgG抗体不变区CH1CH2CH3融合蛋白为实验材料，在内皮抑素的N端前面引入精氨酸(Arg)，通过额外的Arg来加强内皮抑素的抗肿瘤的生物活性。

改造方法三：内皮抑素衍生物是以前置序列-内皮抑素-IgG抗体不变区CH1CH2CH3融合蛋白为实验材料，在内皮抑素的前面或后面引入糖基化位点。包括动物在内的真核生物的蛋白的糖链发生在Asn-X-Ser/Thr位置上，其中X是除了Pro、Asp或Glu以外的氨基酸，糖链是连接在Asn上。为了提高前置序列-内皮抑素-IgG抗体不变区CH1CH2CH3融合蛋白的半衰期，本发明在前置序列-内皮抑素-IgG抗体不变区CH1CH2CH3融合蛋白中的内皮抑素的N端前面或C端后面引入糖基化位点或N端前面和C端后面同时引入糖基化位点，选择的糖基化位点的氨基酸是AsnSerThr，在这个位点的前后再加入额外的短肽GlyAlaSer，这样最后的结构是GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer，其中AsnSerThr是糖基化位置。

改造方法四：内皮抑素衍生物是以前置序列-内皮抑素-IgG抗体不变区CH1CH2CH3融合蛋白为实验材料，改造内皮抑素(SEQ ID NO.4)中的2组ArgArg，即Arg62Arg63和Arg128Arg129。碱性氨基酸常常是蛋白酶的底物，本发明是在这2组ArgArg中只保留一个Arg，以提高内皮抑素的稳定性。虽然Arg被认为对于肝素结合很重要，但是为了降低内皮抑素被蛋白酶水解的数量，这样的改造还是有助于提高内皮抑素的生物活性。

各种蛋白的核酸和氨基酸序列的基本信息

SEQ ID NO.2是人白蛋白的信号肽和成熟后人白蛋白的N端5个氨基酸的序列，其中1-18是信号肽，19-23是成熟后人白蛋白的N端5个氨基酸，SEQ ID NO.1是SEQ ID NO.2的核酸编码序列，GenBank数据库中的信息是NP_000468.1和NM_000477.5，SEQ ID NO.2这个序列称为前置序列。

SEQ ID NO.4是人来源的内皮抑素的氨基酸序列，SEQ ID NO.3是它的核酸编码序列，GenBank数据库中的信息是NP_569712.2和NM_130445.3，这里的内皮抑素共有183个氨基酸。

SEQ ID NO.6是人抗体IgG不变区的氨基酸序列，SEQ ID NO.5是它的核酸编码序列，GenBank数据库中的信息是M87789.1，其中，根据氨基酸序列，1-118是CH1片断，119-225是CH2片断，226-330是CH3片断。

实验材料和方法

动物表达载体采用宝生物公司(Takara)的pHEK293 Ultra Expression VectorII，含有外源基因片断插入位置即限制内切酶位点SmaI-XhoI-BamHI-XbaI-SalI-PstI-SphI-HindIII，这里选择的插入切酶位点是XhoI-BamHI-XbaI和SphI-HindIII，即基因片断的前端含有XhoI-BamHI-XbaI，后端含有SphI-HindIII，另外在SphI-HindIII前面增加一个His-tag以及终止信号tag，即catcatcatcatcatcattag。表达载体的构建在大肠杆菌中筛选完成，然后可转染到HEK293细胞进行各种蛋白的瞬时表达。这些载体中的基因片断的合成是由宝生物公司和上海生物工程公司等完成的。

HEK293细胞的培养基是10％胎牛血清的DMEM培养基。

关于蛋白的分离纯化，由于蛋白拥有信号肽，所以表达是分泌型的，蛋白的分离纯化是利用His-tag方法，即将培养基离心，除去细胞，然后利用His·Bind PurificationKit试剂盒(Novagen公司)对于上清液进行纯化，上柱前先加入Binding Buffer，然后将蛋白样品上柱，用Wash Buffer漂洗，再用Elute Buffer洗脱。如果融合蛋白含有抗体IgG不变区，就可以采用ProteinA柱，即使用GE Healthcare公司的HiTrap Protein A HP或HiTraprProtein A FF，漂洗液是PBS，洗脱液是0.1M柠檬酸(pH2.7)。用His-tag或ProteinA柱方法得到的蛋白都用蛋白电泳进行鉴定，将纯度为一条带的蛋白用于以后的实验。

关于肿瘤模型，小鼠是C57BL/6，约20-24克，每次实验的小鼠数为30只，肿瘤细胞是小鼠肺癌Lewis lung carcinoma(LLC)细胞株，先将LLC细胞进行体外培养，然后注射到C57BL/6小鼠腹腔进行大规模培养，最后取出腹腔内的LLC肿瘤细胞，将2x10⁶肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下。

蛋白的生物活性是用小鼠肿瘤生长抑制率和小鼠体内半衰期等来评价，蛋白剂量都是50pmol。

实施例1一种抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，衍生物包括内皮抑素与抗体IgG不变区连接的融合蛋白，其抗肿瘤活性以及该融合蛋白在小鼠体内的半衰期。

蛋白样品

样品1：前置序列-内皮抑素；SEQ ID NO.4所示的内皮抑素前面连接SEQ ID NO.2所示的前置序列，前置序列中的信号肽是为了让表达的内皮抑素能够分泌到细胞外。

样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1的融合蛋白(SEQ ID NO.8所示，编码SEQ ID NO.8的核酸序列是SEQ ID NO.7所示)。

样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG部分不变区CH1CH2融合蛋白(SEQ ID NO.10所示，编码SEQ ID NO.10的核酸序列是SEQ ID NO.9所示)。

样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12所示，编码SEQ ID NO.12的核酸序列是SEQ ID NO.11所示)。

将上面的基因合成片断插入pHEK293 Ultra Expression Vector II质粒，

样品1和样品2用His-tag方法纯化，样品3和样品4用ProteinA柱方法纯化。

对照样品是注射生理盐水。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及对照样品生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。图1是抗肿瘤的实验结果，表明随着融合蛋白的分子量增加，肿瘤抑制效果越好。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素或内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图2是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，分子量越大则体内含量越高。

由于前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白在体内更稳定，所以抑制肿瘤的效果最好。

实施例2内皮抑素衍生物即内皮抑素N端前面的新引入的Arg的评估

选择实施例1样品4的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料，用氨基酸序列(SEQ ID NO.12)来说明，1-23氨基酸来源于白蛋白，1-18是白蛋白的信号肽，19-23是成熟后的白蛋白的N端的5个氨基酸，其中有两个Arg，24-206是内皮抑素，207-536是抗体IgG不变区，它由CH1、CH2和CH3组成。各种实验蛋白：

样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白，由SEQ ID NO.12所示，其中19-23是Arg-Gly-Val-Phe-Arg。

样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体1，其中19-23是Ala-Gly-Val-Phe-Arg，将第19的Arg的agg点突变成gcg；

样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2，其中19-23是Arg-Gly-Val-Phe-Ala，将第23的Arg的cgt点突变成gct；

样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体3，其中19-23是Ala-Gly-Val-Phe-Ala，将第19的Arg的agg点突变成gcg及将第23的Arg的cgt点突变成gct。

注射生理盐水作为对照。

选择实施例1中表达前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQID NO.12所示，编码SEQ ID NO.12的核酸序列SEQ ID NO.11)的质粒(pHEK293 UltraExpression Vector II)进行各种点突变就得到上面各种内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白突变体。

各种融合蛋白用ProteinA柱方法纯化。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。图3是抗肿瘤的实验结果，N端有2个Arg的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白抑制肿瘤的效果最好。

实施例3检查糖基化位点对于内皮抑素融合蛋白活性的影响

以实施例1的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料构建衍生物，即在内皮抑素的N端前面或C端后面加入糖基化的氨基酸短肽Gly-Ala-Ser-Asn-Ser-Thr-Gly-Ala-Ser，其中Asn-Ser-Thr是糖基化的位置，糖链是连接在Asn上。选择实施例1中表达前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.12所示，编码SEQ ID NO.12的核酸序列SEQ ID NO.11)的质粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)进行各种基因操作，也可以直接合成这些突变体的基因片断，然后插入质粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)进行各种蛋白的表达。

样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQ ID NO.12)，内皮抑素的N端前面或C端后面没有糖基化的氨基酸短肽；

样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体1(SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14)，内皮抑素N端前面加入一个糖基化位点的氨基酸短肽；

样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16)，内皮抑素C端后面加入一个糖基化位点的氨基酸短肽；

样品4：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18)，内皮抑素的N端前面和C端后面各加入一个糖基化位点的氨基酸短肽。

各种融合蛋白用ProteinA柱方法纯化。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。图4是抗肿瘤的实验结果，表明内皮抑素前后都有糖基化位点的氨基酸短肽的融合蛋白的抑制肿瘤的效果最好。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图5是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，内皮抑素前后都有糖基化位点的融合蛋白在小鼠体内含量最高。

这里的实验表明由于内皮抑素衍生物即前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体3(内皮抑素N端前面和C端后面都有糖基化位点)在体内更稳定，所以抑制肿瘤的效果最好。

实施例4对于同一糖基化位点的氨基酸再进行点突变

包括动物在内的真核生物的蛋白的糖链发生在Asn-X-Ser/Thr位置上，其中X是除了Pro、Asp或Glu以为的氨基酸，糖链是连接在Asn上。这里，以实施例3中的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)即内皮抑素后面加入一个糖基化位点的氨基酸短肽的融合蛋白为材料进行新的点突变，它的糖基化位点是Asn210-Ser211-Thr212，核酸序列是aacagcacg(628-636)，新增加的点突变体作为实验样品。

样品1：点突变体Asn210-Ser211-Thr212(SEQ ID NO.16)

样品2：点突变体Asn210-Ala211-Thr212(将编码Ser211的agc点突变为gcc)

样品3：点突变体Asn210-Tyr211-Thr212(将编码Ser211的agc点突变为tac)

样品4：点突变体Asn210-Ser211-Ser212(将编码Thr212的acg点突变为tcg)

样品5：点突变体Asn210-Ala211-Ser212(将编码Ser211的agc点突变为gcc以及将编码Thr212的acg点突变为tcg)

样品6：没有引入糖基化位点的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(SEQID NO.12)

以含有实施例3中的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白糖基化位点突变体2(SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16)即内皮抑素后面加入一个糖基化的氨基酸短肽的融合蛋白的表达质粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)进行各种突变体点的基因操作。各种融合蛋白用ProteinA柱方法纯化。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。

图6是抗肿瘤的实验结果，显示在同一位置上进行糖基化位点改造的融合蛋白都有很好的抑制肿瘤的效果。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图7是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，经过糖基化位点改造的融合蛋白在小鼠体内的含量都很高，这表明只要引入Asn-X-Ser/Thr特征的糖基化的修饰就可以提高融合蛋白的抑制肿瘤活性和蛋白在体内的稳定性。

实施例5内皮抑素衍生物即改造内皮抑素中的2组ArgArg

以实施例1的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料，然后对内皮抑素内部的2组ArgArg进行点突变。

前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12)中的内皮抑素内部的2组ArgArg在内皮抑素的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)中分别位于Arg62-Arg63和Arg128-Arg129，在前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)中分别位于Arg85-Arg86和Arg151-Arg152，在编码它的核酸序列(SEQ ID NO.11)中的位置是253-258(cgccgt)和451-456(cgcagg)。

首先对于第1组Arg85-Arg86，核酸位置253-258(cgccgt)进行点突变。

点突变体1：Ala85-Arg86(将编码前面Arg的cgc点突变为gcc)

点突变体2：Ser85-Arg86(将编码前面Arg的cgc点突变为agc)

点突变体3：His85-Arg86(将编码前面Arg的cgc点突变为cac)

点突变体4：Arg85-Ala86(将编码后面Arg的cgt点突变为gct)

点突变体5：Arg85-Ser86(将编码后面Arg的cgt点突变为agt)

点突变体6：Arg85-His86(将编码后面Arg的cgt点突变为cat)

然后对于第2组Arg151-Arg152，核酸位置451-456(cgcagg)进行点突变。

点突变体7：Ala151-Arg152(将编码前面Arg的cgc点突变为gcc)

点突变体8：Ser151-Arg152(将编码前面Arg的cgc点突变为agc)

点突变体9：His151-Arg152(将编码前面Arg的cgc点突变为cac)

点突变体10：Arg151-Ala152(将编码后面Arg的agg点突变为gcg)

点突变体11：Arg151-Ser152(将编码后面Arg的agg点突变为agc)

点突变体12：Arg151-His152(将编码后面Arg的agg点突变为cac)

选择实施例1中的前置序列-表达内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)的质粒(pHEK293 Ultra Expression Vector II)进行各种突变体点的基因操作。

各种融合蛋白用ProteinA柱方法纯化。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。

第1个实验是针对第1组Arg85-Arg86，核酸位置253-258(cgccgt)的基因片断(SEQID NO.11)进行，样品有点突变体1-6以及没有突变的融合蛋白(SEQ ID NO.12)作为对照样品。

图8是抗肿瘤的实验结果，表明点突变体3(His85-Arg86)和点突变体6(Arg85-His86)的融合蛋白的抑制肿瘤的效果很好。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图9是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，各种点突变体在体内的含量的差别不大，但比没有点突变的融合蛋白的体内含量都高。

这里的实验表明由于内皮抑素第1组Arg85-Arg86发生了改变，保持了蛋白的稳定性即不容易被蛋白酶降解，所以有了较高的抗肿瘤活性，点突变体3(His85-Arg86)和点突变体6(Arg85-His86)中，His代替了Arg，但仍然保持了碱性氨基酸的性质，所以体现了很高的抑制肿瘤的活性和很高的蛋白含量。

现在按照上面第1个实验方法开展针对第2组Arg151-Arg152，核酸位置451-456(cgcagg)的基因片断(SEQ ID NO.11)进行点突变,样品有点突变体7-12以及没有突变的融合蛋白(SEQ ID NO.12)作为对照样品。

图10是抗肿瘤的实验结果，表明点突变体9(His151-Arg152)和点突变体12(Arg151-His152)的融合蛋白的抑制肿瘤的效果很好。

图11是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，各种点突变体在体内的含量的差别不大，但比没有点突变的融合蛋白的体内含量都高。

再一次说明：以前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ IDNO.12)作为实验材料，融合蛋白中的内皮抑素内部的Arg85-Arg86和Arg151-Arg152分别对应于以SEQ ID NO.4所示内皮抑素序列中的Arg62-Arg63和Arg128-Arg129。

实施例6对于内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点以及内皮抑素内的2组ArgArg的改造的再评估

根据实施例5的实验结果，以前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12)作为实验材料，再构建2种点突变体：

点突变体1：His85-Arg86和His151-Arg152

将编码Arg85的cgc点突变为cac

将编码Arg151的cgc点突变为cac

点突变体2：Arg85-His86和Arg151-His152

将编码Arg86的cgt点突变为cat

将编码Arg152的agg点突变为cac

说明：以SEQ ID NO.12序列为实验材料融合蛋白中的内皮抑素内部的第85、第86、第151、第152的氨基酸位置分别对应于SEQ ID NO.4所示内皮抑素序列中的第62、第63、第128、第129。

根据实施例3的实验结果，以内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白(SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18)作为实验材料，对它的2组ArgArg进行改造，

第1组ArgArg的氨基酸位置是Arg94Arg95(SEQ ID NO.18)，核酸位置(SEQ IDNO.17)是280-285(cgccgt)；第2组ArgArg的氨基酸位置是Arg160Arg161(SEQ ID NO.18)，核酸位置(SEQ ID NO.17)是478-483(cgcagg)。

另外构建2种点突变体：

点突变体1：Arg94His95和Arg160His161

将编码Arg95的cgt点突变为cat

将编码Arg161的agg点突变为cac

点突变体2：His94Arg95和His160Arg161

将编码Arg94的cgc点突变为cac

将编码Arg160的cgc点突变为cac

(核酸序列SEQ ID NO.19和氨基酸序列SEQ ID NO.20)

说明：以SEQ ID NO.18序列为实验材料融合蛋白中的内皮抑素内部的第94、第95、第160、第161的氨基酸位置分别对应于SEQ ID NO.4所示内皮抑素序列中的第62、第63、第128、第129。

现在实验所采用的样品：

样品1：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋(SEQ ID NO.12)

样品2：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体1(His85-Arg86和His151-Arg152)

样品3：前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋点突变体2(Arg85-His86和Arg151-His152)

样品4：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白(SEQ ID NO.18)

样品5：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白点突变体1(Arg94His95和Arg160His161)

样品6：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面的各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区CH1CH2CH3融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)

第1天接种LLC肿瘤细胞，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。

图12是抗肿瘤的实验结果，表明同时引入2个糖基化位点以及对2组2组ArgArg改造的样品5和样品6有着很好的抑制肿瘤效果。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图13是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，同时引入2个糖基化位点以及对2组ArgArg改造的样品5和样品6在体内的含量都很高。

图14是实施例1中的作为对照的注射生理盐水的小鼠和实施例6中的注射样品6融合蛋白(内皮抑素的N端前面和C端后面的各加入糖基化位点的融合蛋白点突变体2)(SEQID NO.20)的小鼠的解剖照片。

实施例7对于内皮抑素及各种内皮抑素衍生物的生物活性进行比较

对于所有插入质粒pHEK293 Ultra Expression Vector II的DNA合成片断，片断前端含有XhoI-BamHI-XbaI，后端含有SphI-HindIII，另外在SphI-HindIII前面增加一个His-tag以及终止信号tag，即catcatcatcatcatcattag。

样品1：内皮抑素

即把SEQ ID NO.1所示的核酸序列中编码信号肽的1-54的DNA片断的后面连接SEQID NO.3所示的编码内皮抑素的核酸序列，合成这样的DNA片断，然后把这个DNA片断插入到质粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到内皮抑素。

样品2：前置序列-内皮抑素蛋白(内皮抑素的N端前面有2个Arg)

即把SEQ ID NO.1所示的编码前置序列的核酸序列后面连接上SEQ ID NO.3所示的编码内皮抑素的核酸序列，合成这样的DNA片断，然后把这个DNA片断插入到质粒pHEK293Ultra Expression Vector II，得到前置序列-内皮抑素蛋白，在这个前置序列-内皮抑素蛋白中，内皮抑素的N端前面有2个Arg。

样品3：糖基化位点短肽-内皮抑素-糖基化位点短肽蛋白

首先设计下面的DNA片断：

片断1：SEQ ID NO.1所示的核酸序列中编码信号肽的1-54的DNA片断

片断2：ggggcctccaacagcacgggggcctcc(编码包含糖基化位点的短肽GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer)

片断3：SEQ ID NO.3所示的编码内皮抑素的核酸序列

合成这样的DNA序列：片断1-片断2-片断3-片断2，然后把这个DNA片断插入到质粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到糖基化位点短肽-内皮抑素-糖基化位点短肽蛋白。

样品4：发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素

SEQ ID NO.3所示是编码内皮抑素的核酸序列，第184-189是cgccgt，它所对应的氨基酸是Arg62Arg63，将第185的g突变为a，这样，第184-189变成caccgt，从而产生了His62Arg63；同样，第382-387是cgcagg，它所对应的氨基酸是Arg128Arg129，将第383g突变为a，这样，第382-387变成cacagg，从而产生了His128Arg129。把这个编码发生点突变内皮抑素的DNA片断的前面连接信号肽(SEQ ID NO.1所示的核酸序列中编码信号肽的1-54的DNA片断)，得到了发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)内皮抑素的DNA片断，合成这个片断并插入到质粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素蛋白。

样品5：内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白

首先设计下面的DNA片断：

片断1：SEQ ID NO.1所示的核酸序列中编码信号肽的1-54的DNA片断

片断2：SEQ ID NO.3所示的编码内皮抑素的核酸序列

片断3：SEQ ID NO.5所示的编码抗体IgG不变区的核酸序列

合成这样的DNA序列：片断1-片断2-片断3，然后把这个DNA片断插入到质粒pHEK293 Ultra Expression Vector II，得到内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白。

样品6：前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)。

对照样品是注射生理盐水。

样品1-4用His-tag方法纯化，样品5和样品6用ProteinA柱方法纯化。

第1天将2x10⁶LLC肿瘤细胞接种于小鼠的右腋下，第2天、第5天、第8天分别静脉注射各种蛋白(剂量都是50pmol)以及生理盐水，各组小鼠的数量是30只，第10天杀死小鼠，取出肿瘤并称重。

图15是内皮抑素及各种内皮抑素衍生物抗肿瘤的实验。结果显示内皮抑素及各种内皮抑素衍生物都有抗肿瘤的生物活性，样品6即前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)抗肿瘤的效果最好。

对于蛋白的小鼠体内的半衰期实验，给小鼠一次注射各种蛋白(100ug/0.2ml)，用抗内皮抑素抗血清来检测内皮抑素融合蛋白的含量，第1天的检测是在注射后2小时内进行，连续检测13天。图16是各种蛋白在小鼠体内13天的含量变化，结果显示，含有糖基化位点的内皮抑素(样品3)和发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素(样品4)始终保留较低的体内含量，内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白(样品5)具有相当高的体内含量，而前置序列-内皮抑素(N端前面和C端后面各加入糖基化位点)-抗体IgG不变区融合蛋白点突变体2(His94Arg95和His160Arg161)(SEQ ID NO.20)(样品6)的体内含量最高。

可见，同时拥有这些特点：内皮抑素的N端前面有2个Arg、内皮抑素的N端前面和C端后面各加入糖基化位点、发生点突变(His62Arg63和His128Arg129)的内皮抑素、内皮抑素与抗体IgG不变区连接而形成的融合蛋白，这样的内皮抑素衍生物例如SEQ ID NO.20序列所示的蛋白的抗肿瘤和半衰期的生物活性最好。

通过上面一系列实施例，内皮抑素衍生物的稳定性包括半衰期以及抗肿瘤的效果都得到了很大的提高，这些改造手段是：

内皮抑素衍生物一、前置序列-内皮抑素与抗体IgG不变区连接而形成的融合蛋白，增加了内皮抑素的分子量。值得指出的是，通过这里的案例，内皮抑素与白蛋白等大分子糖蛋白连接而构建的融合蛋白也可以得到类似的结果。

内皮抑素衍生物二、在内皮抑素的N端前面引入Arg，由于内皮抑素的Arg对于它的生物活性很重要，所以新增加的Arg可以提高内皮抑素的抗肿瘤活性。

内皮抑素衍生物三、在内皮抑素的N端前面和C端后面各引入糖基化位点的氨基酸短肽，这里是GlyAlaSerAsnSerThrGlyAlaSer，其中包含AsnSerThr，具有Asn-X-Ser/Thr特征，同时进行了点突变，表明有Asn-X-Ser/Thr特征的突变体具有很高的抗肿瘤活性和稳定性。

内皮抑素衍生物四、对于SEQ ID NO.4序列所示的内皮抑素中的2组ArgArg(Arg62Arg63和Arg128Arg129)进行点突变，可以避免蛋白酶的水解，这里的实验表明把ArgArg中的一个Arg点突变成其它氨基酸，就提高了内皮抑素融合蛋白的抗肿瘤活性以及稳定性，显然，正是由于提高了内皮抑素融融合蛋白的稳定性，也就是提高了体内内皮抑素融融合蛋白的含量，导致了内皮抑素融融合蛋白抗肿瘤效果的提高，同时实验显示了ArgHis或HisArg的组合拥有更好的抗肿瘤活性。

内皮抑素衍生物五、实施例6选择了一个最佳组合，构建一类内皮抑素衍生物，同时拥有：

(1)在内皮抑素N端前面和C端后面引入糖基化位点

(2)将内皮抑素中的2组ArgArg点突变成ArgHis或HisArg

具有上面2种特征的前置序列-内皮抑素-抗体IgG不变区融合蛋白显示了相当高的抗肿瘤活性以及在体内相当高的含量。

根据融合蛋白序列(SEQ ID No.11和SEQ ID No.12)为基础可以进行下面各种改造：

a)在内皮抑素N端前面和C端后面引入糖基化位点；

b)针对内皮抑素的内部ArgArg的点突变

c)在内皮抑素的N端前面引入新的Arg

SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示序列只是描述了具有上面各种优点的融合蛋白的一种。

这里还提供了一种制备方法：

a)表达的宿主细胞是动物细胞；

b)一种表达系统可以对于药物蛋白进行糖基化位点修饰；

c)由于是分泌型表达，可以从培养基中收集融合蛋白；

d)利用Protein A柱进行融合蛋白的分离纯化。

上面所述的内皮抑素融合蛋白以及它的一系列改造的突变体都可以应用于肿瘤癌症的治疗。

上面的各种内皮抑素融合蛋白的编码DNA序列都可以应用于抗肿瘤的基因治疗。

作为药物其剂型可以是乳化剂、脂质体、分散剂、稳定剂等一起制成各种注射、口服、敷贴以及手术处理等药物的给药形式。除了融合蛋白质本身可以作为药物外，编码融合蛋白质的核苷酸片断或载体还可以作为基因治疗形式来应用。

以上实施例和优选实施方式的描述属于对权利要求限定的本发明的示意性说明，而不是限制本发明。需要特别指出的是，只要不脱离本发明的宗旨，所有显而易见的改变以及具有等价代换的相似发明，均包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 孙嘉琳

<120> 抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 69

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 1

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgt 69

<210> 2

<211> 23

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 2

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg

20

<210> 3

<211> 549

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 3

cacagccacc gcgacttcca gccggtgctc cacctggttg cgctcaacag ccccctgtca 60

ggcggcatgc ggggcatccg cggggccgac ttccagtgct tccagcaggc gcgggccgtg 120

gggctggcgg gcaccttccg cgccttcctg tcctcgcgcc tgcaggacct gtacagcatc 180

gtgcgccgtg ccgaccgcgc agccgtgccc atcgtcaacc tcaaggacga gctgctgttt 240

cccagctggg aggctctgtt ctcaggctct gagggtccgc tgaagcccgg ggcacgcatc 300

ttctcctttg acggcaagga cgtcctgagg caccccacct ggccccagaa gagcgtgtgg 360

catggctcgg accccaacgg gcgcaggctg accgagagct actgtgagac gtggcggacg 420

gaggctccct cggccacggg ccaggcctcc tcgctgctgg ggggcaggct cctggggcag 480

agtgccgcga gctgccatca cgcctacatc gtgctctgca ttgagaacag cttcatgact 540

gcctccaag 549

<210> 4

<211> 183

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 4

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln

20 25 30

Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala

35 40 45

Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala

50 55 60

Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe

65 70 75 80

Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro

85 90 95

Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro

100 105 110

Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg

115 120 125

Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser

130 135 140

Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln

145 150 155 160

Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn

165 170 175

Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys

180

<210> 5

<211> 990

<212> DNA

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 5

gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 990

<210> 6

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人种(Homo sapiens)

<400> 6

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

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<212> DNA

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Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn

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Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr

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<212> DNA

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<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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<212> PRT

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<400> 12

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<210> 13

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

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<210> 14

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Gly Ala Ser Asn Ser Thr Gly Ala Ser

20 25 30

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

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Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe

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Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro

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Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser

165 170 175

Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn

195 200 205

Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

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Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

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Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

245 250 255

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

260 265 270

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

275 280 285

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

290 295 300

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

305 310 315 320

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

325 330 335

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

340 345 350

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

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Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

370 375 380

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

385 390 395 400

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

405 410 415

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

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Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

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Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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Lys

545

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<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtc acagccaccg cgacttccag ccggtgctcc acctggttgc gctcaacagc 120

cccctgtcag gcggcatgcg gggcatccgc ggggccgact tccagtgctt ccagcaggcg 180

cgggccgtgg ggctggcggg caccttccgc gccttcctgt cctcgcgcct gcaggacctg 240

tacagcatcg tgcgccgtgc cgaccgcgca gccgtgccca tcgtcaacct caaggacgag 300

ctgctgtttc ccagctggga ggctctgttc tcaggctctg agggtccgct gaagcccggg 360

gcacgcatct tctcctttga cggcaaggac gtcctgaggc accccacctg gccccagaag 420

agcgtgtggc atggctcgga ccccaacggg cgcaggctga ccgagagcta ctgtgagacg 480

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ccatcggtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 720

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actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc 1020

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gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1140

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1200

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1260

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1320

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1380

gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1440

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tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 1560

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1620

ctgtctccgg gtaaa 1635

<210> 16

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val

20 25 30

Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly

35 40 45

Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala Arg Ala Val Gly

50 55 60

Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn

85 90 95

Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly

100 105 110

Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly

115 120 125

Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His

130 135 140

Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr

145 150 155 160

Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu

165 170 175

Gly Gly Arg Leu Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr

180 185 190

Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser Phe Met Thr Ala Ser Lys Gly Ala

195 200 205

Ser Asn Ser Thr Gly Ala Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

210 215 220

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

225 230 235 240

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

245 250 255

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

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Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

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Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

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Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

405 410 415

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

420 425 430

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

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Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

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Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

465 470 475 480

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

485 490 495

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

500 505 510

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

515 520 525

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

530 535 540

Lys

545

<210> 17

<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60

gtgtttcgtg gggcctccaa cagcacgggg gcctcccaca gccaccgcga cttccagccg 120

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agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 780

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ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1080

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1140

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<210> 18

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Gly Ala Ser Asn Ser Thr Gly Ala Ser

20 25 30

His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

35 40 45

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65 70 75 80

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260 265 270

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275 280 285

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

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Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

340 345 350

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405 410 415

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<211> 1662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

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<210> 20

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

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His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn

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65 70 75 80

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85 90 95

Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu Leu Leu Phe

100 105 110

Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro

115 120 125

Gly Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro

130 135 140

Thr Trp Pro Gln Lys Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly His

145 150 155 160

Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser

165 170 175

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180 185 190

Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn

195 200 205

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Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

245 250 255

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260 265 270

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

275 280 285

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

290 295 300

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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

325 330 335

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

340 345 350

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

355 360 365

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

370 375 380

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

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Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

405 410 415

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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450 455 460

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

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545 550

Claims (2)

1.抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物，所述内皮抑素的氨基酸序列用SEQ ID NO. 4所示；其特征是内皮抑素的氨基酸序列的Arg62Arg63其中一个Arg发生点突变；所述Arg发生点突变为His或Ala或Ser 。

2.权利要求1的抗肿瘤蛋白内皮抑素的衍生物在制备抗癌药物的应用。

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