CN1174558A - 肿瘤坏死因子－γ - Google Patents

Abstract

公开了一种人TNF－γ多肽和编码所述多肽的DNA(RNA)和通过重组技术生产所述多肽的方法。还公开了利用所述多肽抑制例如肿瘤或癌症的细胞生长,加快伤口愈口,提供对感染的抗性,诱导炎性,和刺激某些细胞类型的生长以治疗疾病,例如再狭窄的方法。还公开了在TNF－γ核酸序列中检测突变或TNF－γ多肽的过量表达的诊断方法,同时公开的还有抗所述多肽的拮抗剂,以及他们在治疗恶病质,败血休克,脑疟疾,炎症,关节炎和移植排斥中的用途。

Description

肿瘤坏死因子-γ

本发明涉及新鉴定的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸和多肽的应用以及所述的多核苷酸和多肽的生产。更详细地说，已经鉴定本发明的多肽为肿瘤坏死因子家族的一个新成员并在下文中称为“TNF-γ”。本发明还涉及抑制所述的多肽的作用。

人肿瘤坏死因子α(TNF-α)和β(TNF-β或淋巴细胞毒素)是指多种类别的多肽介体的成员，其中包括干扰素，白介素和生长因子，总称为细胞因子(Beutler，B.和Cerami，A，Annu.Rev.Immunol.，7：625-625(1989))。

最初肿瘤坏死因子(TNF-α和TNF-β)是由于其抗肿瘤活性而发现的。然而，现在它被看作是一个在免疫调节和炎症中起重要作用的多效性细胞因子。至今，有8种已知的TNF相关的细胞因子家族成员，TNF-α，TNF-β(淋巴细胞毒素α)，LT-β，和Fas配体，CD30，CD27，CD40和4-1BB受体。这些蛋白质有保守的C-末端序列和可变的N-末端序列，除了TNF-β，他们经常被用作膜锚着点。当他们与TNF受体结合时，TNF-α和TNF-β作为同型三联体而起作用。

TNF可由许多细胞类型，包括单核细胞，成纤维细胞，T细胞，天然杀伤(NK)细胞并主要由激活的巨噬细胞产生。已经有人报道TNF-α在肿瘤的快速坏死，免疫刺激，自动免疫疾病，移植排斥，抵抗寄生虫，产生抗病毒应答，败血休克，生长调节，血管内皮效应，和代谢效应中起作用。TNF-α还激发内皮细胞分泌各种因子，包括PAI-1，IL-1，GM-CSF和IL-6来促进细胞增殖。另外，TNF-α正调节各种细胞粘连分子象E-选择因子，ICAM-1和VCAM-1。又有人证明TNF-α和Fas配体能诱导编程性细胞死亡。

诱导由TNF或LT介导的各种细胞应答的第一步是他们与特异性细胞表面受体结合。已经鉴定了大约为55KDa(TNF-R1)和75KDa(TNF-R2)的两个独特的TNF受体(Hohman，H.P.etal，J.Biol.Chem.264：14927-14934(1989)，并已经分离了对应于两种受体类型的人和鼠cDNA并进行了定性(Loetscher，H.etal.，Cell，61：351(1990))。两个TNF-R_s共享典型的细胞表面受体结构包括细胞外，跨膜，细胞内区域。

根据结构上的氨基酸序列同源性和功能的相似性，已经鉴定本发明的多肽是TNF家族的一个新成员，例如，TNF-γ是一个促炎蛋白。

根据本发明的一个方面，提供了一种新的成熟多肽，它是TNF-γ，以及其生物学活性的和诊断学或治疗上有用的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽是人源的。

根据本发明的另一方面，提供了编码人TNF-γ的分离的核酸分子，包括mRNA，DNA，cDNA，基因组DNA及其类似物和生物活性的和诊断上或治疗上有用的片段及其衍生物。

根据本发明的另一方面，提供了通过重组技术生产所述多肽的方法，所述方法包括在促进所说的蛋白质表达的条件下，培养含有人TNF-γ核酸序列的重组原核和/或真核宿主细胞，随后回收所述蛋白质。

根据本发明的另一方面，提供了利用所述多肽或编码所述的多肽的多核苷酸的方法，以用于筛选激动剂和拮抗剂和用于治疗目的，例如创口愈合，抑制肿瘤再生，提供抵抗寄生虫，细菌和病毒的抗性，诱导炎症，诱导内皮细胞和某些生血细胞的增殖，治疗再狭窄和防止某些自体免疫疾病的方法。

根据本发明的另一方面，提供了包含其长度足以与人TNF-γ序列特异性杂交的核酸分子的核酸探针。

根据本发明的另一方面，提供了TNF-γ刺激剂，它模拟TNF-γ并结合于TNF-γ受体以引起TNF-γ型应答。

根据本发明的另一方面，提供了所述多肽的拮抗剂，它们可以用来抑制所述多肽的作用，例如，防止败血休克，炎症，脑疟疾，HIV病毒的活化，移植排斥，骨吸收和恶病质。

根据本发明的另一方面，提供了用于检测与TNF-γ多肽和编码这一多肽的核酸序列的表达不足和过度表达有关的疾病的诊断测定法。

本发明的这些和其他方面对于本领域的熟练技术人员根据本文的教导应该是显而易见的。

下面的附图示出了本发明的实施方案，并不意味限制如权利要求包括的本发明的范围。

图1说明了本发明的多肽的cDNA序列和对应的推断的氨基酸序列。最初的25个氨基酸(下划线)是推定的前导序列。用到了氨基酸的标准单字母缩写。

图2示出了TNF-γ和其它TNF家族成员之间的氨基酸序列对比。TNF-γ含有如阴影区所示的TNF家族的保守氨基酸残基。

图3A是一个显示表达TNF-γ的人组织的RNA印迹分析。用标记的TNF-γcDNA探测来自所指出的组织的RNA。由于图3A显示了一条独特的谱带，所以TNF-γmRNA主要存在于肾中。其他泳迹似乎显示了强烈杂交，但事实上，存在非特异性污迹。

图3B是表明TNF-γ主要在HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)表达(泳道9)的RNA印迹分析。第6泳道和第8泳道是非特异性污迹。用标记的TNF-γcDNA探测来自所指出的细胞系的RNA。泳道1是CAMA1(乳腺癌)；泳道2是AN3CA(子宫癌)；泳道3是SK.UT.1(子宫癌)；泳道4是MG63(成骨细胞瘤)；泳道5是HOS(成骨细胞瘤)；泳道6，MCF7(乳腺癌)；泳道7，OVCAR-3(卵巢癌)；泳道8，CAOV-3(卵巢癌)；泳道9，HUVEC；泳道10，AOSMIC(平滑肌)；泳道11，包皮成纤维细胞。

图4是将由细菌表达和纯化产生的TNF-γ电泳之后的凝胶照片。

图5是由杆状病毒表达的TNF-γ的凝胶照片。

图6A是WE HI 164细胞的照片，其中所述细胞包括未处理(左上角)和暴露于TNF-α，TNF-β和TNF-γ之后的。具有伸长的非圆形形态的细胞是已经溶解的。加入的TNF大约为0.5mg/ml。照片是在加入TNF后72小时拍摄的。

图6B示出了与TNF-α和TNF-β比较，TNF-γ抑制WE HI 164细胞生长的能力。

图7示出了重组TNF-γ，TNF-α和TNF-β诱导WE HI 164细胞死亡的能力。

图8示出了重组TNF-α，TNF-β，TNF-γ在L929细胞中诱导形态学变化的能力。形态学变化由黑圆细胞指示。用大约为0.5mg/ml的E.c oli产生的重组TNF处理细胞。照片是在加入TNF后72小时拍摄的。形态学变化指出细胞已经被杀死。

图9是TNF-γ，TNF-α和TNF-β对静脉内皮细胞的影响的图解说明。利用MTS测定方法对用商业获得的TNF-α和TNF-β从及大肠杆菌生产的TNF-γ处理静脉内皮细胞之后的细胞增殖进行定量测定。

图10是HL60细胞的照片，对照显示了分开的HL60细胞；在右下角，细胞粘连在一起的现象阐明了TNF-α和TNF-γ诱导细胞粘连和细胞-细胞接触。

图11说明TNF-γ不与两种已知的可溶性TNF受体即s TNF RI(p55)和s TNF RII(p75)明显地结合。

根据本发明的一个方面，提供了一种分离的核酸(多核苷酸)，它编码具有图1的推断的氨基酸序列的成熟多肽或由1994年10月26日以ATCC保藏号75927保藏的克隆的cDNA编码的成熟多肽。

可以从人肾和脐状静脉内皮细胞获得编码本发明的多肽的多核苷酸。本发明的多核苷酸是在起源于人脐静脉内皮细胞的一个cDNA文库中发现的。它与TNF家族有结构相关性。它含有一个编码具有174个氨基酸残基的蛋白质的开放读框，其中该蛋白质的大约开始25个氨基酸残基为推定的前导序列，所以成熟蛋白质含有149个氨基酸。蛋白质与兔TNF-α在C-末端有最高程度的同源性，在111个氨基酸跨度中具有38％的同一性和58％的相似性。在TNF家族成员中保守的序列在TNF-γ中也同样存在(参见图2)。黑体字母表示保守的氨基酸残基。正如图3B的RNA印迹分析中显示，TNF-γmRNA在人脐静脉内皮细胞中特异地表达。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式或是DNA形式，其中DNA包括cDNA，基因组DNA，和合成DNA。DNA可以是双链或单链，并且如果是单链可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以相同于图1显示的编码序列或保藏克隆的编码序列或者可以是一个不同的编码序列，其中由于遗传密码的丰余或简并的结果，该不同的编码序列编码相同于图1的DNA或保藏cDNA编码的成熟多肽。

编码图1的成熟多肽或保藏cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸包括，但不限于：只有成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和附加编码序列如前导或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选地包括附加编码序列)和非编码序列，如内含子或成熟多肽的编码序列的5’或3’非编码序列。

所以，木语“编码多肽的多核苷酸”包括仅包括多肽编码序列的多核苷酸以及包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明进一步涉及上文中叙述的多核苷酸的变异体，它编码具有图1推断的氨基酸序列的多肽或保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段，类似物和衍生物。多核苷酸的变异体可以是天然存在的等位多核苷酸变异体或多核苷酸的非天然存在的变异体。

所以，本发明包括编码相同于图1中所示的成熟多肽或保藏克隆cDNA编码的相同的成熟多肽的多核苷酸以及这样的多核苷酸的变异体，其中变异体编码图1中的多肽或保藏克隆cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物。这样的核苷酸变异体包括缺失变异体，取代变异体和添加或插入变异体。

正如上文中指出的，多核苷酸可以具有是图1所示的编码序列或保藏克隆的编码序列的天然存在的等位变异体的编码序列。正如本领域技术人员已知，等位变异体是多核苷酸序列的另一种可选择形式，它可以有一个或多个核苷酸的取代，缺失或叠加，它基本上不改变所编码的多肽的功能。

本发明还包括这样的多核苷酸，其中成熟多肽的编码序列可以在同样的读码框架与一个多核苷酸序列融合，这个多核苷酸序列帮助多肽从宿主细胞表达和分泌，例如，前导序列，它的功能是作为控制多肽从细胞转移的分泌序列。具有前导序列的多肽是前蛋白并可以由宿主细胞切除前导序列形成成熟形式的多肽。多核苷酸还可以编码蛋白原，它是成熟蛋白加上附加的5’氨基酸残基。具有序列原的成熟蛋白质是蛋白原，是蛋白质的非活性形式。一旦序列原被切除，则留下有活性的成熟蛋白质。

所以，例如，本发明的多核苷酸可以编码成熟蛋白质，或者一具有序列原的蛋白质，或者具有序列原和前序列(前导序列)的蛋白质。

本发明的多核苷酸也可以具有与标记序列在读码框架中融合的编码序列，该标记序列能使本发明的多肽纯化。标记序列可以是pQE-9载体提供的一个六组氨酸标志，从而便于在细菌宿主中纯化与标记融合的成熟多肽，或者例如，当用到哺乳动物宿主，例如COS-7细胞时，标记序列可以是一个血细胞凝集素(HA)标志。HA标志对应于起源于流感血细胞凝集素蛋白质的抗原决定基(Wilson，L.，etal.，细胞37：767(1984))。

本发明进一步涉及这样的多核苷酸，如果序列之间至少有50％并优选地有70％的同一性，那么所述多核苷酸与上文叙述的序列杂交。本发明特别涉及在严格条件下与上文叙述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用，术语“严格条件”是指只有当序列之间至少有95％和优选地至少有97％的同一性才发生杂交。在一个优选实施方案中，与上文叙述的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本上保留了与图1的cDNA或保藏cDNA编码的成熟多肽相同的生物学功能或活性。

本文所指保藏物是按照关于国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约而保藏的。这些保藏物仅仅作为便利于本领域熟练技术人员而提供，而不是对根据35U.S.C.1.2对保藏物的要求的许可。包括在保藏材料中的多核苷酸序列，以及由此编码的多肽的氨基酸序列，被编入本文作为参考文献并且在与本文叙述的序列出现任何冲突时进行对照。制造，利用或销售保藏材料必须得到许可，但本文不授予这样的许可。

本发明进一步涉及TNF-γ多肽，它具有图1推断的氨基酸序列或保藏cDNA编码的氨基酸序列，本发明还涉及这一多肽的片段，类似物及衍生物。

当指图1或保藏cDNA编码的多肽时，术语“片段”，“衍生物”和“类似物”是指基本保留了与这一多肽相同的生物学功能或活性的多肽，所以类似物包括蛋白原，它能通过切下蛋白原部分而活化产生一个有活性的成熟多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽，天然多肽或合成多肽，优选的是重组多肽。

图1的多肽或保藏cDNA编码的多肽的片段，衍生物或类似物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代并且这样的被取代氨基酸残基可以是或不是遗传密码所编码的，或(ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或(iii)其中成熟多肽与另一个化合物融合，如增加多肽半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)，或(iv)其中附加氨基酸与成熟多肽融合，如前导或分泌序列或用于成熟多肽纯化的序列或蛋白原序列。这些片段，衍生物和类似物被认为是在本领域熟练技术人员根据本文教导可知的范畴之内的。

优选地，本发明的多肽和多核苷酸可以以分离形式提供，并优选地纯化到同质。

术语“分离的”是指从它的原始环境(如果是天然存在，也即天然环境)中移走该物质。例如，存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，但是，从天然系统中的一些或所有共存材料中分开的同样的多核苷酸或多肽是分离的。这样的多核苷酸可以是一个载体的部分和/或这样的多核苷酸或多肽可以是一个组合物的部分。并且如果这样的载体或组合物不是它的天然环境的部分，则其仍然是分离的。

本发明还涉及包括本发明多核苷酸的载体，用本发明的载体进行遗传工程加工的宿主细胞和通过重组技术生产本发明多肽。

利用本发明的载体对宿主细胞进行遗传工程化(转导或转化或转染)，载体可以是例如，克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等等形式。遗传工程化的宿主细胞可以在为适合于激活启动子，筛选转化体或扩增TNF-γ基因而修饰的传统营养培养基中培养。培养条件，如温度，PH诸如此类，是先前用于宿主细胞表达筛选的，将是普通技术熟练人员显而易见的。

通过重组技术本发明的多核苷酸可以用于生产多肽。所以，例如，为了表达多肽，多核苷酸可以包含在各种各样的表达载体的任何一种中。这样的载体包括染色体，非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；起源于质粒和噬菌体DNA的组合的载体；病毒DNA如痘病毒，腺病毒，禽痘病毒和拟狂犬病病毒。然而，任何其它载体只要它在宿主中可复制和存活就可以利用。

通过各种方法可以把适当的DNA序列插入载体。总的来说，通过本领域技术人员已知的方法可将DNA序列插入一个适当的限制性内切酶位点。这样的方法和其它的方法被认为是在本领域熟练技术人员已知的范围之内。

表达载体中的DNA序列可操作地与一个适当的表达控制序列(启动子)连接以指导mRNA合成。作为这些启动子的代表例子，可以提到：LTR或SV40启动子，大肠杆菌Lac或trp，噬菌体λP_L启动子和其它已知在原核生物或真核生物细胞或它们的病毒中可控制基因表达的启动子。表达载体还含有翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体还可以包括适当用于扩增表达的序列。

另外，表达载体优选地含有一个或多个可选择标记基因，以提供一个用于筛选转化的宿主细胞的表型特性，如用于真核生物细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或者如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。

如上文中叙述的含有适当DNA序列以及适当启动子或控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主以使宿主表达该蛋白质。

作为适当宿主的代表例子，可以提到：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇属S2和Sf9；动物细胞如CHO，COS或Bowes黑素瘤；腺病毒；植物细胞等等。选择一个合适的宿主被认为是在本领域技术人员根据本文教导已知的范围内。

更详细地说，本发明还包括含有上面叙述的一个或多个序列的重组构建体。这些构建体包含载体，如质粒或病毒载体，其中已经以正向或逆向插入本发明的序列。这一构建体进一步含有包括例如一个可操作地与序列相连的启动子的调节序列。大量的合适载体和启动子对于本领域技术熟练人员是已知的，并且是商业途径可获得的。下面的载体是举例性的。细菌的：pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pBS，pD10，phagescript，pSIX174，pbluescript SK，pbsks，pNH 8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，真核的：pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用任何其他质粒或载体，只要它宿主中是可复制的和可存活的。

利用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它具有选择标记的载体可以从任何期望的基因中筛选启动子区。两个合适的载体是pKK232-8和PCM7。特别提及的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，λPR，PL和trp。真核启动子包括CMV即早期，HSV胸苷激酶，早期和晚期SV40，来自逆转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择适当的载体和启动子是在普通技术人员的水平中的。

在另一个实施方案中，本发明涉及含有上面叙述的构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，或者低等真核生物细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核生物细胞，如细菌细胞。通过磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，或电穿孔方法可将构建体导入宿主(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。

宿主细胞中的这些构建体可以常规方式用于生产由重组序列编码的基因产物。或者，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪合成生产。

在合适的启动子的控制下，成熟蛋白可以在哺乳动物细胞，酵母，细菌或其他细胞中表达。利用起源于本发明的DNA构建体的RNA，无细胞翻译系统也可以用于生产这样的蛋白质。Sambrook，etal.，分子克隆实验手册，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)叙述了与原核和真核宿主一起使用的适当的克隆和表达载体，所述出版物引入作为参考方献。

在载体中插入增强子序列可以提高高等真核生物对编码本发明多肽的DNA的转录。增强子是DNA的顺式作用因子，通常为10到300个bp，作用于启动子以增强它的转录。例子包括在复制源点晚期一侧的bp100到270的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制源点晚期一侧的多瘤增强子，和腺病毒增强子。

一般来说，重组表达载体包括复制源点和允许宿主细胞转化的可选择标记，如，大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因和啤酒酵母TRP1基因，和一个起源于高表达基因的启动子来指导下游结构基因的转录。这样的启动子可以起源于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油激酶(PGK)，α-因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白等。异源结构序列在合适相与翻译起始和终止序列装配，并优选地，与能引导所翻译的蛋白质分泌进入胞质空间或细胞外培养基中的前导序列装配，任选地，异源序列能编码包括能赋予所期望特性，例如表达的重组产物的稳定性或纯化简便性的N-末端识别肽的融合蛋白质。

通过在具有一个功能启动子的可操作读码相插入编码所期望蛋白质的结构DNA序列以及合适的翻译起始和终止信号可以构建细菌所用的有用的表达载体。载体包含一个或多个表型选择标记和一个保证载体生存和如果需要，提供在宿主内的扩增的复制源点。合适的转化用原核生物宿主包括大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，鼠伤寒沙门氏菌和假单胞菌属，链霉菌属，和葡萄球菌属内的各个种，当然其它的也可以选择来使用。

作为一个代表性但非限制的例子，用于细菌的有用的表达载体可以包含来源于包含已知克隆载体PBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商业途径可获得的载体的选择标记和细菌复制源点。这样的商业载体包括例如，p KK223-3(PharmaciaFine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEMI(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子和待表达的结构序列结合。

在合适宿主菌株转化和宿主菌株生长到合适的细胞密度之后，通过合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导所选择的启动子并且将细胞培养另外一段时间。

通常通过离心收集细胞，通过物理或化学方法破碎细胞，并且保留得到的粗提取物以进一步纯化。

可以通过任何常规的方法来破碎用于表达蛋白质的微生物细胞，包括冻融循环，超声波处理，机械破碎，或用细胞裂解剂，这些方法是本领域技术人员熟知的。

各种哺乳动物细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括猴肾成纤维细胞的COS-7系，如Gluzmam，细胞，23：175(1981)所叙述，和其它能表达相容载体的细胞系，例如，C127，3T3，CHO，HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含复制源点，合适的启动子和增强子，还有任何必要的核糖体结合位点，聚腺苷化位点，拼接供体和受体位点，转录终止序列，和5’侧接非转录序列。来源于SV40拼接和聚腺苷化作用位点的DNA序列可以用于提供所需要的非转录遗传元件。

通过多种方法可以从重组细胞培养物中回收和纯化TNF-γ多肽，所述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟基磷灰石层析和植物凝集素层析。如果需要，在完成成熟蛋白质构型时可以用到蛋白质再折叠步骤。最后，高效液相层析(HPLC)可以用于最后的纯化步骤。

本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或者化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核生物或真核生物宿主(例如，细菌，酵母，高等植物，培养的昆虫和哺乳动物细胞)产生。依据在重组生产过程中所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的多肽可以包括一个起始甲硫氨酸氨基酸残基。

本发明的TNF-γ多肽可以用于抑制肿瘤细胞生长或瘤形成。TNF-γ多肽可能对通过编程性细胞死亡的肿瘤的破坏有作用，其特征在于膜blebbin(Zeiosis)，细胞质浓缩和内源核酸内切酶的活化(图7)。正如表1所示，TNF-γ对所测试的细胞系具有强烈的细胞毒活性，所测细胞系有异常的细胞繁殖和调节，例如，纤维肉瘤和癌细胞系。这一点在图6A，6B和8中也可看出，其中示出TNF-γ有能力通过细胞毒活性抑制L929和WEHI164细胞生长。WEHI164细胞是鼠纤维肉瘤细胞。优选的TNF-γ的给药方法是通过直接注射进入肿瘤。

TNF-γ的细胞粘连活性可以用于伤口愈合。如表1和图9所示，TNF-γ有强烈的内皮细胞增殖作用，它是TNF-γ在伤口愈合中起作用的一个标志。TNF-γ的细胞粘连作用也可以在伤口愈合中起作用。

TNF-γ也可以用于治疗需要生长促进活性的疾病，例如，再狭窄。如上所述，TNF-γ对内皮细胞生长显示了强烈的增殖作用。因此，TNF-γ也可以用于调节血生成和内皮细胞发育。

通过它的刺激T-细胞活化的能力，TNF-γ多肽是免疫反应的一个重要介质。因此，这一多肽可以用于刺激抗各种寄生虫，细菌和病毒感染的免疫反应。TNF-γ可以溶解病毒感染细胞，所以，可以用于捕获HIV感染细胞。

TNF-γ多肽通过增强T-细胞增殖应答可以用于治疗自身免疫疾病如I型糖尿病。

       表1

   TNF-γ活性概述细胞系       来源和类型                     活性

                              细胞毒性 增殖  分化  粘连L929       小鼠成纤维细胞             +     -     -     -WEHI164    小鼠纤维肉瘤              +++    -     -     -NRK-54E    大鼠肾类上皮               +     -     -     -THP-1      人单核细胞白血病           +     -     ++    ++HL-60      人前骨髓细胞白血病         -     -     -     ++Raji       人Burkitt淋巴瘤            -     -     -     -Jurkat     人T细胞白血病              ++    -     -     -Primary    人静脉内皮细胞             -     ++    -     ？Primary    人小动脉内皮细胞           +*    ++    -     ？A-431      人表皮癌                   ++    -     -     -293        人胚胎肾                   -     ++    -     -*只在高剂量时。+号数指活性相对水平。-号指在测试浓度范围没有检测到活性。

本发明的多核苷酸和多肽可以用作发现人疾病的治疗和诊断的研究试剂和材料。

本发明提供了TNF-γ受体的鉴定方法。通过许多本领域技术熟练人员已知的方法可以鉴定编码受体的基因，例如，配体选择和FACS分类术(Coligan，etal，Current Protocols in Immun.，1(2)Chapter 5，(1991))。优选地，利用了表达克隆，其中从对TNF-γ产生应答的细胞制备聚腺苷化RNA，并且把从这一RNA产生的cDNA文库分成集合体。并用于转染COS胞或其它对TNF-γ没有反应的细胞。把生长在玻璃片上的转染细胞暴露于标记的TNF-γ，TNF-γ可以通过各种方法标记，包括碘化或引入位点特异性蛋白质激酶的识别位点。在固定和温育之后，对玻片进行放射自显影分析。鉴定了阳性集合并利用重复亚集合和再筛选方法制备和再转染亚集合体，最终产生一个编码推定受体的单克隆。

作为受体鉴定的另一个可选择途径，标记TNF-γ可以与表达受体分子的细胞膜或提取制剂光亲和连接。通过PAGE分离交联连接的材料并暴露于X-射线胶片。含有TNF-γ受体的标记复合物可以被切下，分解成肽片段，并进行蛋白质微测序分析。微测序分析获得的氨基酸序列将用于设计一套简并寡核苷酸探针来筛选cDNA文库，以便鉴定编码推定的受体的基因。

TNF-γ与两个可溶TNF受体，sTNF-RI(p55)和sTNF-RII(p75)没有明显结合。因此，TNF-γ可能具有已知TNF蛋白质的活性及除已知TNF蛋白质活性之外的活性(参见图11)。

本发明还涉及筛选鉴定那些模仿TNF-γ(刺激剂)或阻碍TNF-γ的作用的化合物方法。这样一种方法的例子利用了TNF-γ在存在促分裂原Con A时能显著刺激人内皮细胞增殖的能力的优点。得到内皮细胞并在存在2μg/ml的Con-A(Calbiochem，LaJolla，CA)时培养于具有补充了10％热失活胎盘牛血清(Hyclone Labs，Logan，UT)，1％L-谷氨酸，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素，0.1％庆大霉素(Gibco Life Technologies，Grand Island，NY)的RPMI1640的96孔平底培养板中(Costar，Canbridge，MA)。加入Con-A和待筛选的化合物至终体积为0.2ml。37℃60小时后，用1μCi的³H胸腺嘧啶(5Ci/mmol；1Ci＝37BGq；NEN)脉冲12-18小时，并收获在玻璃纤维滤膜上(PhD；Cambridge Technology，Watertown，MA).利用一个液体闪烁计数器(Beckman仪器，Irvine，CA)确定三个重复培养物的平均³H胸腺嘧啶掺入量(cpm)。显著的³H胸腺嘧啶掺入指示对内皮细胞增殖的刺激作用。

另一种可选择方法，在TNF-γ和受体的相互作用之后在存在或缺乏该化合物下对已知的第二信使系统的应答进行测定和比较。所述第二信使系统包括但不限于cAMP鸟苷酸环化酶，离子通道或磷酸肌醇水解。

为了测定拮抗剂，进行了上面叙述的测试，但是在这个测试中，TNF-γ与待筛选的化合物一起加入并且化合物在存在TNF-γ时抑制[³H]胸腺嘧啶的掺入的能力表明该化合物是TNF-γ的一个拮抗剂。另一种可选择的方法，通过在合适进行竞争性抑制测试条件下，把TNF-γ和潜在的带有膜结合的TNF-γ受体或重组受体的拮抗剂结合起来可以测定TNF-γ拮抗剂。可将TNF-γ标记，如通过放射性标记，以便根据与受体结合的TNF-γ分子的数目可以确定潜在拮抗剂的效力。

另一种可选择的方法，将表达TNF-γ受体的哺乳动物物细胞或膜制备物与标记TNF-γ在存在该化合物时一起温育。然后测定化合物增强或阻止这一作用的能力。

通过与TNF-γ结合和阻止它与它的受体结合可将特异于TNF-γ的抗体用作拮抗剂。关于这一点单克隆抗体特别有效。但是，特异于TNF-γ受体的抗体可以介导独特的细胞应答，这种应答趋向于刺激TNF-γ与其受体的相互作用。

潜在的TNF-γ拮抗剂还包括TNF-γ突变体，它与TNF-γ受体结合并不会引起有效阻止受体与它的天然配体结合的第二信使应答。特别设计的寡核苷酸和小分子也可以与TNF-γ受体结合并且阻止它与TNF-γ结合。小分子的例子包括但不限于小肽或类肽分子。

另一个潜在的TNF-γ拮抗剂是TNF-γ受体的可溶形式，它与TNF-γ结合并防止它与膜结合的TNF-γ受体相互作用。在这种方式中，受体不受TNF-γ的刺激。

另一个潜在TNF-γ拮抗剂是利用反义技术制备的反义结构。通过三重螺旋的形成或反义DAN或RNA，可将反义技术用于控制基因表达，两种方法都是以多核苷酸与DNA或RNA的结合为基础的。例如，编码本发明的成熟多肽的多核苷酸序列的5’编码区被用来设计一个长度大约从10到40个碱基对的反义RNA寡核苷酸。设计一个DNA寡核苷酸使之与参与转录的基因的一个区互补(三重螺旋一参见Lee etal.，Nucl.Acids Res.，6：3073(1979)；Cooneyetal，Science，241：456(1988)；Dervan etal.，Science，251：1360(1991))，从而阻止TNF-γ的转录和生产。反义RNA寡核苷酸与mRNA在体内杂交并阻止了mRNA分子翻译成TNF-γ多肽(反义-Okamo，J，Neurochem.，56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸，CRC Press Boc a Raton，FL(1988))。上面叙述的寡核苷酸也可以传送到细胞以便反义RNA或DNA可以在体内表达来抑制TNF-γ的生产。

TNF-γ拮抗剂也可以用以治疗恶病质，它是由被TNF-γ抑制的脂蛋白脂酶的系统缺陷产生的脂类清除缺陷型。TNF-γ拮抗剂还可以用于治疗脑疟疾，其中TNF-γ似乎起致病的作用。拮抗剂还可以通过抑制TNF-γ诱导的炎性细胞因子如滑液细胞中的IL-1的产生而用于治疗类风湿性关节炎。当治疗关节炎时，优选的是关节内注射TNF-γ。

TNF-γ拮抗剂还可以通过在存在移植物时防止TNF-γ刺激免疫系统而用于阻止移植排斥。

由于TNF-γ可以诱导骨吸收，TNF-γ拮抗剂还可以用于治疗骨质疏松症。

由于TNF-γ介导增强的炎性应答，因而TFN-γ拮抗剂还可以用作抗炎剂。

拮抗剂还可用于治疗内毒素休克，也称作败血休克。这一重症是由对细菌或其它类型的感染的过度应答引起的。这一应答导致TNF-γ水平的升高从而引起休克和组织损伤。

拮抗剂可以用在含有药学可接受载体(例如下文所述)的组合物中。

全长TNF-γ基因的片段可以用作cDNA文库的杂交探针来分离全长基因和分离与该基因有高度序列相似性或相似的生物学活性的其它基因。这一类型的探针可以是，例如在20和2000碱基之间。但是，优选的是探针具有30到50碱基对。探针也可以用来鉴定一个对应于全长转录物的cDNA克隆和含有包括调节和启动子区，外显子，内含子的完整TNF-γ基因的基因组克隆。作为筛选的一个例子包括利用已知的DNA序列合成一个寡核苷酸探针分离TNF-γ基因的编码区。具有与本发明的基因互补的序列的标记的寡核苷酸被用于筛选人cDNA，基因组DNA或mRNA文库来决定探针与文库中哪个成员杂交。

本发明的TNF-γ多肽和刺激剂和拮抗剂可以与合适的药学载体联合应用。这样的组合物包括治疗有效量的化合物，和药学可接受载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，及其组合。配制的药剂应该适于给药方式。

本发明还提供了药物包或药盒，它们含有一或多个装填有本发明药物组合物成份的一种或多种成份的容器。附在这样的容器中的是由控制药物或生物学产品制造，使用或销售的政府部门规定的通告。这样的通知反映出制造，使用或销售该药供人使用得到政府部门同意。另外，本发明的药物组合物可以与其它治疗用的化合物结合使用。

药物组合物可以方便的方法如通过局部，静脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，鼻内或皮内途径给药。该药物组合物可以治疗和/或预防特定疾病的有效量使用。一般来说，它们以至少大约10μg/kg体重的量给药，在大多数情况下，它们以每天不超过8mg/kg体重的量给药。大多数情况下，考虑给药的途径，症状等等，剂量大约是每天10μg/kg到1mg/kg体重。

根据本发明通过在体内表达所述多肽来利用TNF-γ多肽和属于多肽的剌激剂和拮抗剂，这经常被称为“基因疗法”。

所以，例如，可以在体外用编码多肽的多核苷酸(DNA或RNA)对来自病人的细胞进行遗传工程处理，随后将工程细胞提供给待用多肽治疗的病人。这些方法都是本领域技术人员已知的，并且根据本文的教导显而易见的。例如，可以利用含有编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒对细胞进行遗传工程处理。

同样地，为了在体内表达多肽，可以通过本领域技术人员已知的程序在体内对细胞进行基因工程操作。例如，为了在体内工程化细胞和在体内表达多肽，可以给病人施用生产含有编码本发明多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产细胞。根据本发明的教导，通过这样方法给予本发明的多肽的这些和其他方法，本领域熟练技术人员显而易见的。例如，用于工程细胞的表达载体除逆转录病毒外，例如，可以是腺病毒，它在与合适的运送载体结合后可以用于体内工程化细胞。

本发明还涉及利用TNF-γ基因检测与突变TNF-γ的存在有关的疾病或疾病易感性的诊断测试方法。这些疾病与TNF-γ的表达不足有关，例如，异常的细胞增殖如肿瘤和癌症。

通过各种技术可以在DNA水平检测人TNF-γ基因中带有突变的个体。为了诊断可以从病人的细胞，如血液，尿，唾液，组织活体检查和尸体剖检的材料得到核酸。基因组DNA可以直接用于检测或可以在分析之前利用PCR(Sai ki et al.，Nature，324：163-166(1986))进行酶促扩增。RNA或cDNA也可以用于同样目的。作为一个例子，互补于编码TNF-γ的核酸的PCR引物可以用于鉴定和分析TNF-γ突变。例如，与正常基因型相比扩增产物的大小的变化可以检测缺失和插入。通过把扩增的DNA与放射性标记TNF-γRNA或与放射标记的TNF-γ反义DNA序列杂交可以鉴定点突变。通过R Nase A消化或解链温度的差异可以把错配双螺旋与正确配对序列区别开来。

通过在有或没有变性剂时检测凝胶上DNA片段的电泳迁移率的改变可以完成基于DNA序列差异的遗传测试。通过高分辨凝胶电泳可以显现小序列缺失和插入。在变性的甲酰胺梯度胶上可以区别不同序列的DNA片段，其中根据它们特有的解链或部分解链温度，不同的DNA片段迁移停留在凝胶的不同位置(参见，即Myers et al.，Science，230：1242(1985))。

通过核酸酶保护测定，象RNase和S1保护或化学裂解方法也可以发现特定位置的序列变化(即Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401(1985))。

所以，通过如杂交，RNase保护，化学裂解，直接DNA序列分析或使用限制性酶(例如，限制片段长度多态性(RFLP)和基因组DNA的Southern印迹分析方法可以完成特定DNA序列的检测。

除了较方便的凝胶电泳和DNA序列分析，还可以通过原位分析检测突变。

由于与正常对照组织样品相比，TNF-γ蛋白质的过度表达可以检测疾病或疾病易感性例如，肿瘤和脑疟疾的存在，所以本发明还涉及用于检测各种组织中TNF-γ蛋白水平变化的诊断测试法。用于在来源于宿主的样品中检测TNF-γ蛋白质水平的测试方法是本领域技术熟练人员已知的并包括放射免疫测定，竞争结合测试，Western印迹分析，ELISA测试和“夹心”测试，ELIAS测试(Coligan，et al.，Current Protocols in Immunology，1(2)，Chapter6，(1991)首先包括制备一个特异于TNF-γ抗原的抗体，优选的是单克隆抗体。另外制备抗该单克隆抗体的报道抗体。附着于报道抗体是可检测试剂如放射性，荧光或在这个例子中的辣根过氧化物酶。现在，从宿主中取出样品并在一个固体支持物，例如聚苯乙烯皿上温育，皿与样品中的蛋白质结合。然后，通过与非特异蛋白质如BSA温育而覆盖任何游离蛋白质结合位点。接着，将单克隆抗体在盘中温育，在这个过程中单克隆抗体附着于任何与TNF-γ结合的单克隆抗体附着于聚苯乙烯盘的TNF-γ蛋白。所有未结合的单克隆抗体用缓冲液洗去。将与辣根过氧化物酶结合的报道抗体置于皿中，导致报道抗体与任何与TNF-γ结合的单克隆抗体结合，然后洗去未附着的报道抗体。过氧化物酶底物随后加到皿中，与标准曲线比较，根据在给定时期显现的颜色的量可以测定存在于给定量的病人样品中的TNF-γ蛋白的量。

可使用竞争性测试，其中特异于TNF-γ的抗体附着于一个固体支持物，标记的TNF-γ和来源于宿主的样品通过固体支持物，并且例如通过液体闪烁色谱检测到的标记的量与样品中TNF-γ的量相关。

“夹心”测试与ELISA测试相似。在“夹心”测试中，TNF-γ通过一个固体支持物并与附着于固体支持物上的抗体结合。第二个抗体然后与TNF-γ结合。然后，一个标记的并特异于第二个抗体的第三个抗体通过固体支持物并与第二个抗体结合，然后定量测定。

本发明的序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列可特异性地靶击并与独特的人染色体的特定位置杂交。此外，目前需要鉴定染色体上的特定位点。目前只有少数几个根据实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可用于标记染色体位置。本发明对染色体DNA的物理作图是将这些序列与疾病相关的基因相联的重要的第一步。

简言之，通过从cDNA制备PCR引物(优选地15-25bp)可以把序列定位于染色体上。这一序列的3′未翻译区的计算机分析被用于快速筛选引物，引物不跨越基因组DNA中一个以上外显子的长度从而使扩增过程复杂化。然后这些引物用于PCR筛选含有单个人的染色体的体细胞杂交体。只有那些含有对应于引物的人基因的杂交体将产生扩增片段。

体细胞杂交体的PCR作图是将特定DNA定位到特定染色体的快速方法。在本发明中利用同样的寡核苷酸引物，以类似的方法由一组染色体片段组或大基因组克隆库可以完成亚定位。可以同样用于对它的染色体作图的其它方法包括原位杂交，用标记的流式分类染色体的预筛选和通过杂交的预选择构建染色体特异cDNA文库。

cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用于提供一步的精确染色体定位。这项技术可以与短至500或600碱基的cDNA一起使用；但是，大于2000bp的克隆有与独特染色体位置结合的更高可能性，并具有使测定简单所需的足够的信号强度。FISH需要利用衍生表达序列标志(EST)的克隆，并且越长越好。例如，2,000bp是好的，4,000更好，超过4,000对于得到好的结果和合理的时间百分数可能是不必要的。回顾这项技术可以见Verma et al.，人染色体基本技术手册，Pergamon Press，New York(1988)。

一旦序列定位于精确的染色体位置，序列在染色体上的物理位置就可与遗传图谱数据相关。这样的数据可以在例如V.Jomh Hopkins大学Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(在线从约翰霍普金斯大学Welch医学图书馆)中找到。然后通过连锁分析(物理邻接基因的共遗传)鉴定定位于同一染色体区的基因和疾病的关系。

接着，必须确定感染和未感染的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部感染个体但不在任何正常个体中观察到突变，那么这个突变很可能是引起疾病的原因。

根据目前物理图谱的分辨率和遗传图谱分析技术，精确定位于与疾病相关的染色体区的cDNA可以是50-500个潜在致病基因中的一种。(这假定1兆碱基作图分辨率并且每20kb为一个基因)。

多肽，它们的片段或其它衍生物，或其类似物，或表达它们的细胞可以用作免疫原以生产抗体。这些抗体可以例如是多克隆或单克隆抗体。本发明还包括嵌合的，单链的和人源化的抗体，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。本领域已知的各种技术可以用于这些抗体和片段的生产。

通过把多肽直接注射进入动物或给动物(优选的是非人类)施用该多肽，可以获得针对相应于本发明序列的多肽的抗体。这样得到的抗体然后与多肽本身结合。以这种方式，即使是仅编码多肽的一个片段的序列也可以用于产生结合整个天然多肽的抗体。然后这样的抗体可以用于从表达这一多肽的组织中分离多肽。

为了制备单克隆抗体，可以利用任何能通过连续细胞系培养生产抗体的技术。例子包括杂交瘤技术(Kohler和Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)，产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，单克隆抗体和癌症治疗，Alan R.Liss，Ins.，PP，88-96)。

可采用生产单链抗体的技术(U.S.专利4,946,778)来生产本发明免疫原性多肽产物的单链抗体。同样，转基因鼠可用来表达本发明免疫原多肽产物的化的抗体。

参考下面的实施例将进一步叙述本发明；但是，应理解的是本发明并不局限于这些实施例。所有份或量，除非特别说明，均是按重量计算的。

为了有利于理解下面的实施例，将叙述某些经常出现的方法和/或术语。

“质粒”由前面的小写p和/或接着的大写字母和/或数字命名。，本文的起始质粒是商业可获得和不受限制的公众可获得的，或者可以根据公开出版的方法从可获得的质粒构建。另外，所描述的质粒的等同质粒是本领域已知的并将是普通熟练技术人员显而易见的。

DNA的“消化”指用限制酶催化切割DNA，限制酶仅在DNA的某些序列中起作用。本文所用的各种限制酶是商业可获得的并且他们的反应条件，辅助因子和其它要求是一般技术熟练人员已知的。为了分析目的，通常将1μg质粒或DNA片段与2单位的酶在大约20μl缓冲液溶液中一起使用。为了分离DNA片段来构建质粒，通常5到50μg DNA在较大体积中用20到250单位的酶进行消化。对于特定的限制酶的适当的缓冲液和底物量是由制造商特殊规定。温育时间一般使用1小时，37℃，但根据供应商的说明可以改变。消化后，直接在聚丙烯酰胺凝胺上电泳反应物以分离所需要的片段。

利用百分之八的聚丙烯酰胺凝胶进行裂解片段的大小分离，叙述于Goeddel，D，et al.，Nucleic Acids Res.，8：4-057(1980)。

“寡核苷酸”指可以化学合成的单链聚脱氧多核苷酸或两条互补脱氧多核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5′磷酸，所以在存在激酶时不添加ATP和磷酸就不能与另一个寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将连接到没有去磷酸化的片段上。

“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，P.146)。除非另外提供，利用已知的缓冲液和条件，每0.5μg的大约等摩尔量的待连接的DNA片段用10个单位的T4DNA连接酶可以完成连接。

除非另有陈述，转化将如Graham，F.和Van der Eb，A.，Virology，52：456-457(1973)的方法进行。

实施例1 TNF-γ的细菌表达和纯化

利用对应于TNF-γ蛋白质的5′-序列和TNF-γ基因3′的载体序列的PCR寡核苷酸引物首先扩增编码TNF-γ的DNA序列，ATCC#75927。将对应于TNF-γ的核苷酸各自加到5′和3′序列上。5′寡核苷酸引物序列为5′-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3′，它含有一个Bam HI限制酶位点，接着跟着开始于假定的被加工蛋白密码子的末端氨基酸的TNF-γ编码序列开头的24个核苷酸。3′序列为5′-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3′，其含有xbaI位点的互补序列，并且后接22个TNF-γ的核苷酸及位于TNF-γDNA插入物的3′的pQE-99载体序列的互补序列。限制酶位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen)中的限制酶位点。然后用Bam HI和XbaI消化pQE-9。将扩增序列连接进入pQE-9并插入具有编码组氨酸标志的序列和RBS的框架中。然后用Sambrook，J，et al.，分子克隆实验室手册，Cold Spring Laboratory Press(1989)叙述的方法将连接混合物转化从Qiagen以商标M15/rep4购得的E.coli菌株。M15/rep4含有质粒pREP4的多个拷贝，质粒pREP4表达lacI阻遏物并具有卡那霉素抗性(Kan^r)。通过其在LB平板上的生长能力鉴定转化体并且筛选氨苄青霉素/卡那霉素抗性菌落。分离质粒DNA并通过限制分析验证。含有所需构建体的克隆在补充了Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。O/N培养物用于接种一个大规模的培养物，比例为1∶100到1∶250。细胞生长到光密度600(0.D.⁶⁰⁰)为0.4和0.6之间。然后加入IPTG(“异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷”)到终浓度1mM。IPTG诱导使lacI阻遏物失活，清除P/O，导致提高基因表达。细胞再生长3到4小时，然后通过离心收获细胞。将细胞沉淀溶解于6摩尔盐酸胍离液剂中。澄清后，在允许含有6-His标志的蛋白质牢固结合的条件下通过在一个镍螯合柱上层析把溶解的TNF-γ从这一溶液中纯化出来(Hochuli，E.et al.，层析杂志411：177-184(1984))。由第二次通过镍螯合柱进一步纯化TNF-γ。用6摩尔盐酸胍pH 5.0从柱中洗脱TNF-γ(90％纯度)并为了复性，在PBS缓冲液中透析。通过SDS-PAGE电泳表达产物，结果可见图4，其中M是分子量标记；第1泳道为诱导的细胞溶解产物，第2泳道是未诱导的细胞溶解产物；第3泳道是两次镍螯合柱纯化后的TNF-γ蛋白质；第4泳道是1次柱纯化后的TNF-γ蛋白质。

实施例2 利用杆状病毒表达系统克隆和表达TNF-γ

利用对应于所述基因的5′和3′序列的PCR寡核苷酸引物，扩增了编码全长TNF-γ蛋白质的DNA序列，ATCC#75927。

5′引物具有序列5′-GCGCGGATCCACCATGAGACGCTTTTTAAGCAAAGTC-3′并含有一个BamHI限制酶位点(黑体)，后面接着24个TNF-γ基因的核苷酸(翻译起始密码子“ATG”底下划线)。

3′引物具有序列5′-CGCGTCTAGACTATAGTAAGAAGGCTCCAAAGAAGG-3′并含有限制核酸内切酶XbaI的切割位点和22个互补于TNF-γ基因3′-非翻译序列的核苷酸。利用商购试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从1％琼脂糖凝胶上分离扩增的序列。然后用内切酶BamHI和XbaI消化该片段，然后又一次在1％的琼脂糖凝胶上纯化。这个片段被命名为F2。

利用杆状病毒表达系统，载体pA2(修饰的pVL941载体，下面讨论)用于TNF-γ蛋白质的表达(有关综述参见：Summers，M.D.和Smith G.E，1987，杆状病毒载体和昆虫细胞培养程序的方法手册，Texas农业实验站简报No.1555)。这一表达载体含苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的强多角体启动子，后面跟随限制性内切酶BamHI和XbaI的识别位点。猿猴病毒(SV)40的聚腺苷化位点被用于有效的聚腺苷化作用。为了容易地筛选重组病毒，来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因以同样于多角体启动子的方向插入，多角体启动子后面接着多角体基因的聚腺苷化信号。为了进行细胞介导的共转染野生型病毒DNA的同源重组，多角体序列两侧接着病毒序列。许多其他杆状病毒载体可以用于代替pA2，如pRG1，pAc373，pVL941和pAcIM1(Luckow，V.A和Summers，M.D.，病毒学，170：31-39)。

用限制酶BamHI和XbaI消化质粒，然后用小牛肠磷酸酶及本领域技术人员已知的程序去磷酸化。然后利用商购的试剂盒(“Geneclean”BIO 101 Inc.，La Jolla，Ca.)从10％琼脂糖凝胶上分离该DNA。这一载体DNA被命名为V2。

用T4DNA连接酶连接片段F2和去磷酸化质粒V2。然后转化大肠杆菌XL1蓝细胞。通过DNA序列分析确定了克隆片段的序列。

利用脂转染方法(Felgner et al.Proc Natl.Acad.Sci.USA，84：7413-7417(1987))将1.0μg商业可获得线性杆状病毒(“BaculoGold^TM杆状病毒DNA”，Pharmingen，San Diego，CA.)与5μg质粒pBacTNF-γ一起共转染。

在含有50μl的无血清Grace′S培养基(Life Technologies Inc.，Gaithersburg，MD)的微滴板的无菌孔中将1μg的BaculoGoldTM病毒DNA和5μg的质粒pBacTNF-γ混合。之后将10μl Lipofectin和90μl Grace′s培养基加入，混合并在室温下温育15分钟。然后，把转染混合物滴加入种在具有1ml Grace′无血清培养基的35mm组织培养板中的Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)上。将平板前后轻摇，以便使新加入的溶液混合。然后平板在27℃温育5小时。5小时后，从平板中移去转染溶液，加入补充了10％胎牛血清的1ml Grace′s昆虫培养基。平板放回一个培养箱并在27℃继续培养4天。

4天后，收集上清液，并如Summers和Smith(上述)所述进行噬斑测定。作为一个修饰方案，使用了具有“Blue Gal”(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)的琼脂糖凝胶，它能使染蓝的噬斑易于分离。(“噬斑测试”的详细描述也可以参见Life Technolgies Inc.，Gaithesburg分发的昆虫细胞培养和杆状病毒学使用者指导，9-10页)。

连续稀释四天后，将病毒加入细胞，用一个Eppendorf吸管的管尖挑出染蓝的噬斑。然后将含有重组病毒的琼脂在一个含有200ml Grace′s培养基的Eppendorf管中重新悬浮。短时离心除去琼脂，含有重组杆状病毒的上清液用于感染播种于35mm皿中的Sf9细胞。四天后，收集这些培养皿中的清液，然后贮存于4℃。

Sf9细胞生长于补充了10％热失活FBS的Grace′s培养基中。用重组杆状病毒V-TNF-γ以感染复数(MI)为2感染细胞。六小时后除去培养基并重新加入没有甲硫氨酸和半胱氨酸的SF900II培养基(LifeTechnologies Inc.，Gaithersburg)。42小时后加入5μCi的³⁵S-甲硫氨酸与5μCi的³⁵S半胱氨酸(Amersham)。细胞进一步温育16小时，然后离心收集，通过SDS-PAGE和放射自显影可见标记蛋白质。图5显示了凝胶，其中泳道1和3是TNF-γ培养基和对照，泳道2和4是TNF-γ细胞溶解产物和对照。

实施例3 重组TNF-γ在COS细胞中的表达

表达质粒，TNF-γ HA来源于载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)，它含有1)SV40复制源点，2)氨苄青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制源点，4)CMV启动子，后面接着一个多接头区，一个SV40内含子和聚腺苷化位点。编码全长TNF-γ前体和融合在3′末端的HA标志的DNA片段被克隆进入该载体的多接头区，所以，重组蛋白的表达是在CMV启动子指导下进行的。HA标志对应于由先前叙述的流感血细胞凝集素蛋白质衍生的一个表位(I.Wilson H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，和R.Lerner，1984，Cell 37，767)。在我们的目标蛋白质中融入HA标志，使得能容易地用识别HA表位的抗体检测重组蛋白质。

质粒构建方案叙述如下：

在用两个引物克隆的原始EST上通过PCR构建编码TNF-γ的DNA序列，ATCC#75927，两个引物为：5′引物(与杆状病毒实施例中的相同)含有一个BamHI位点，后面跟着开始于起始密码的TNF-γ编码序列的24个核苷酸；3′序列5′-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGATAGTAAGAAGGCTCCAAAG-3′含有与XbaI位点互补的序列，转译终止密码子，HA标志和TNF-γ编码序列最后的18个核苷酸(不包括终止密码子)。所以，PCR产物含有一个BamHI位点，TNF-γ编码序列，后面接着融合在框架中的HA标志，邻接HA标志的翻译终止密码子和一个XbaI位点。用BamHI和XbaI限制酶消化PCR扩增的DNA片段和载体pcDNAI/Amp，并连接。将连接混合物被转化进入大肠杆菌菌株SURE(从StratageneCloning Systems得到，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla CA 92037)，将转化培养物铺在氨苄青霉素培养基平板上培养，筛选出抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA并通过限制性分析检测合适片段的存在。为了表达重组TNF-γ，用表达载体和DEAE-DEXTRAN方法转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，分子克隆实验手册，Cold Spring Laboratory Press，(1989))。通过放射标记和免疫沉淀方法检测TNF-γ HA蛋白质的表达(E.Harlaw，D.Lane，抗体实验手册，Cold Spring Harbour Laboratory Press，(1989))。转染两天后用35S-半胱氨酸标记细胞8小时。然后收集培养基，用去污剂(RI PA缓冲液(150mm NaCl，1％ NP-40，0.1％ SDS，1％ NP-40，0.5％ DOC，50mM Tris，PH 7.5)溶解细胞。(Wilson，I.et al.，Id.37：767(1984))。细胞溶解产物和培养基用HA特异性单克隆抗体沉淀。在15％SDS-PAGE凝胶上分析沉淀的蛋白质。

实施例4 TNF-γ在人组织中的表达方式

进行RNA印迹分析来检查TNF-γ在人组织中的表达水平。用RNAzol ^TMB系统(Biotecx Laboratories Inc.6023 South Loop East，Houston，TX 77033)分离总细胞RNA样品。在1％琼脂糖-甲醛凝胶上分离从每个特定人组织中分离的大约2μg(由图3A的RNA印迹得出)的总RNA并影印在一个尼龙滤膜上(Sambrook，Fritsch，和Maniatis，分子克隆，，Cold SpringHarbar Press，(1989))。根据Stratagen Prime-It试剂盒，用50ngTNF-γcDNA进行标记反应以产生³²P-标记的TNF-γcDNA。用Select-G-50柱(5 Prime-3Prime，Inc.5603 Arapahoe Road，Boulder，CO 80303)纯化标记的DNA。在0.5M NaPO₄pH7.4和7％SDS中用1,000,000cpm/ml的放射性标记的全长TNF-γ基因与滤膜在65℃杂交过夜。用0.5XSSC，0.1％SDS在室温下和在60℃各洗两次之后，把滤膜置于-70℃增感屏下过夜。在肾中(图3A)有丰富的TNF-γ的mRNA。

进行同样的反应得到结果显示在图3B，唯一的变化是利用来自所指定的10μg poly A RNA。TNF-γ的mRNA主要在HUVEC细胞中表达(图3B)。

实施例5 重组TNF-γ抑制WEHI164和L929细胞生长，诱导HL-60细胞粘连和促进内皮细胞生长的能力

通过在PBS中胰酶消化从铺满的培养物中制备粘连的靶细胞，从静止培养物中收获不粘连靶细胞并用培养基洗一次。靶细胞以3×10⁵细胞/ml悬浮于含有10％FCS的培养基中。分配0.1ml等分试样到含有0.1ml连续稀释的细胞(WEHI164和L929)样品的96孔平底微量滴定板中。温育持续70小时。以0.5μg/ml的浓度加入TNF-α，TNF-β，TNF-γ。利用MTS测试定量检测细胞毒性和增殖活性，MTS测试是通过加20μl MTS和苯乙肼甲基硫酸盐(PMS)溶液到细胞中进行的。在3小时的温育之后，用ELISA平板读数器测定492nm处的OD值。OD₄₉₂与孔中存活的细胞数成比例。细胞毒性的百分比按如下计算：％细胞毒性＝(100-OC_实验/OD_对照×100。72小时后拍下照片，如图6A和图8所示，TNF-γ诱导了形态学变化，所述变化以黑圆细胞显示，这是被杀死的细胞。

在图6B中的照片中，测试是如上所述进行，但是，加入增加的TNF量。结果表明TNF-γ是WEHI164细胞的抑制物。

为了测定TNF-γ的粘连能力，使用了HL-60细胞，通过在显微镜下观察测定细胞粘连和细胞-细胞的接触，并主观地由两个独立的研究人员评定。图10说明了TNF-γ诱导细胞粘连的能力。

在测定TNF-γ促进内皮细胞生长的能力的测试中，增殖指数(PI)如下计算：PI＝OD_实验/OD_对照。图8说明TNF-γ是内皮细胞生长的促进剂。

实施例6 TNF-γ的编程性细胞死亡能力的测定

在第一个温育步骤中，抗组蛋白抗体吸附固定于微量滴定平板的壁上。随后，通过用温育缓冲液(即，封闭溶液)处理饱和壁上的非特异结合位点。在第二个温育步骤中，用TNF-α，TNF-β或TNF-γ处理的WEHI104细胞样品中含有的核小体通过它们的组蛋白成份结合于固定的抗组蛋白抗体上。在第三个温育步骤中，抗DNA过氧化物酶(POD)与核小体的DNA部分反应。在通过洗涤步骤除去所有未结合的过氧化物酶缀合物后，以ABTS(2，2′-连氮-二[3-乙基苯基噻唑磺酸]作为底物，用光度计测定免疫复合物中的保留的过氧化物酶的量。抗组蛋白抗体与样品中的组蛋白HI，H2A，H2B，H3和H4反应。抗DNA PQD抗体与单链和双链DNA结合。所以，ELISA能测定单核小体和寡核小体并可以应用于测量编程性细胞死亡。通过由A405nm/A490吸收值指示的与细胞质组蛋白结合的DNA片段的量测定细胞死亡的水平(参见Boehringer manheim Catalogue，0990C 93 2 1541170)(参见图7)。

实施例7 利用TNF-γ的受体结合测定

利用6-His标志进行Ni-NTA亲和层析纯化TNF-α和TNF-γ，并且加1μg/孔到一个Ni螯合包被的96孔平板(XenopokeCorp)温育2小时。洗三次后，向每孔中加入100ng人可溶TNF受体s TNF RI或s TNF RII并温育2小时。洗板三次后加入抗s TNFRI或s TNF R II的碱性磷酸酶标记的多克隆抗体(200μl)。在每个孔中加入200μl底物溶液，温育平板2小时。利用ELISA读数器测定OD值(测试波长450nm，校正波长590nm)。图11的结果表明TNF-γ与s TNF受体没有明显结合。

根据上述教导可对本发明进行大量的修饰和变化，所以，其也在所附权利要求书的范围内，本发明可以不同于以上所述的方式来实施。

序列表(1)一般信息：

(i)申请人：Yu，ETAL。

(ii)发明名称：人肿瘤坏死因子-γ

(iii)序列数目：2

(iv)通讯地址：

  (A)联系人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFI

             LLAN，CECCHI STEWART & OL

             STEIN

  (B)街道：6 BECKER FARM ROAD

  (C)城市：ROSELAND

  (D)州：新泽西州

  (E)国家：美国

  (F)邮编：07068

(v)计算机可读形式：

  (A)媒体类型：3.5英寸盘

  (B)计算机：IBM PS/2

  (C)操作系统：MS-DOS

  (D)软件：WORD PERFECT 5.1

(vi)现在申请资料：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

  (C)分类号：

(vii)在先申请资料：

  (A)申请号：

  (B)申请日：

(viii)代理人/律师资料：

  (A)姓名：FERRARO，GREGORY D

  (B)登记号：36,134

  (C)参考/档案号：325800-256

(ix)电信情况：

  (A)电话：201-994-1700

  (B)传真：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：2442个碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)链型：单链

  (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CCCAATCAAG AGAAATTCCA TACTATCACC AGTTGGCCGA CTTTCCAAGT CTAGTGCAGA    60AATCCAAGGC ACCTCACACC TAGAGTTCCT ATACCTCTGA GACTCCAGAG GAAAGAACAA   120GACAGTGCAG AAGGATATGT TAGAACCCAC TGAAAACCTA GAAGGTTGAA AAGGAAGCAT   180ACCCTCCTGA CCTATAAGAA AATTTTCAGT CTGCAGGGGG ATATCCTTGT GGCCCAAGAC   240ATTGGTGTTA TCATTTGACT AAGAGGAAAT TATTTGTGGT GAGCTCTGAG TGAGGATTAG   300GACCAGGGAG ATGCCAAGTT TCTATCACTT ACCTCATGCC TGTAAGACAA GTGTTTTGTT   360CCAATTGATG AATGGGGAGA AAACAGTTCA GCCAATCACT TATGGGCACA GAATGGAATT   420TGAAGGGTCT GGTGCCTGCC CTTGTCATAC GTAAACAAGA GAGGCATCGA TGAGTTTTAT   480CTGAGTCATT TGGGAAAGGA TAATTCTTGC ACCAAGCCAT TTTCCTAAAC ACAGAAGAAT   540AGGGGGATTC CTTAACCTTC ATTGTTCTCC AGGATCATAG GTCTCAGGAT AAATTAAAAA   600TTTTCAGGTC AGACCACTCA GTCTCAGAAA GGCAAAGTAA TTTGCCCCAG GTCACTAGTC   660CAAGATGTTA TTCTCTTTGA ACAAATGTGT ATGTCCAGTC ACATATTCTT CATTCATTCC   720TCCCCAAAGC AGTTTTTAGC TGTTAGGTAT ATTCGATCAC TTTAGTCTAT TTTGAAAATG   780ATATGAGACG CTTTTTAAGC AAAGTCTACA GTTTCCCAAT GAGAAAATTA ATCCTCTTTC   840TTGTCTTTCC AGTTGTGAGA CAAACTCCCA CACAGCACTT TAAAAATCAG TTCCCAGCTC   900TGCACTGGGA ACTAGAACTA GGCCTGGCCT TCACCAAGAA CCGAATGAAC TATACCAACA   960AATTCCTGCT GATCCCAGAG TCGGGAGACT ACTTCATTTA CTCCCAGGTC ACATTCCGTG  1020GGATGACCTC TGAGTGCAGT GAAATCAGAC AAGCAGGCCG ACCAAACAAG CCAGACTCCA  1080TCACTGTGGT CATCACCAAG GTAACAGACA GCTACCCTGA GCCAACCCAG CTCCTCATGG  1140GGACCAAGTC TGTATGCGAA GTAGGTAGCA ACTGGTTCCA GCCCATCTAC CTCGGAGCCA  1200TGTTCTCCTT GCAAGAAAGG GACAAGCTAA TGGTGAACGT CAGTGACATC TCTTTGGTGG  1260ATTACACAAA AGAAGATAAA ACCTTCTTTG GAGCCTTCTT ACTATAGGAG GAGAGCAAAT  1320ATCATTATAT GAAAGTCCTC TGCCACCGAG TTCCTAATTT TCTTTGTTCA AATGTAATTA  1380TAACCAGGGG TTTTCTTGGG GCCGGGAGTA GGGGGCATTC CACAGGGACA ACGGTTTAGC  1440TATGAAATTT GGGGCCAAAA TTTCACACTT CATGTGCCTT ACTGATGAGA GTACTAACTG  1500GAAAAAGGCT GAAGAGAGCA AATATATTAT TAAGATGGGT TGGAGGTTTG GCGAGTTTCT  1560AAATATTAAG ACACTGATCA CTAAATGAAT GGATGATCTA CTCGGGTCAG GATTGAAAGA  1620GAAATATTTC AACACCTCCC TGCTATACAA TGGTCACCAG TGGTCCAGTT ATTGTTCAAT  1680TTGATCATAA ATTTGCTTCA ATTCAGGAGC TTTGAAGGAA GTCCAAGGAA AGCTCTAGAA  1740AACAGTATAA ACTTTCAGAG GCAAAATCCT TCACCAATTT TTCCACATAC TTTCATGCCT  1800TGCCTAAAAA AAATGAAAAG AGAGTTGGTA TGTCTCATGA ATGTTCACAC AGAAGGAGTT  1860GGTTTTCATG TCATCTACAG CATATGAGAA AAGCTACCTT TCTTTTGATT ATGTACACAG  1920ATATCTAAAT AAGGAAGTTT GAGTTTCACA TGTATATCCC AAATACAACA GTTGCTTGTA  1980TTCAGTAGAG TTTTCTTGCC CACCTATTTT GTGCTGGGTT CTACCTTAAC CCAGAAGACA  2040CTATGAAAAA CAAGACAGAC TCCACTCAAA ATTTATATGA ACACCACTAG ATACTTCCTG  2100ATCAAACATC AGTCAACATA CTCTAAAGAA TAACTCCAAG TCTTGGCCAG GCGCAGTGGC  2160TCACACCTGT AATCCCAACA CTTTGGGAGG CCAAGGTGGG TGGATCATCT AAGGCCGGGA    2220GTTCAAGACC AGCCTGACCA ACGTGGAGAA ACCCCATCTC TACTNAAAAT ACNAAATTAG    2280CCGGGCGTGG TAGCGCATGG CTGTAANCCT GGCTACTCAG GAGGCCGAGG CAGAANAATT    2340NCTTGAACTG GGGAGGCAGA GGTTGCGGTG AGCCCAGANC GCGCCATTGC ACTCCAGCCT    2400GGGTAACAAG AGCAAAACTC TGTCCAAAAA AAAAAAAAAA AA                       2442(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征

  (A)长度：174个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)链型：

  (D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2

Met Arg Arg Phe Leu Ser Lys Val Tyr Ser Phe Pro Met Arg Lys

-25                 -20                 -15

Leu Ile Leu Phe Leu Val Phe Pro Val Val Arg Gln Thr Pro Thr

-10                  -5                   1               5

Gln His Phe Lys Asn Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Gly His Glu

                 10                  15                  20

Leu Gly Leu Ala Phe Thr Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys

                 25                  3O                  35

Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln

                 40                  45                  5O

Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln

                 55                  60                  65

Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser Ile Thr Val Val Ile Thr

                 70                  75                  8O

Lys Val Thr Asp SEr Tyr Pro Glu PRo Thr Gln Leu Leu Met Gly

                 85                  90                  95

Thr Lys Ser Val Cys Gln Val Gly Ser Asn Trp Phe Gln Pro Ile

                100                 105                 110

Tyr Leu Gly Ala Met Phr Ser Leu Gln Glu Gly Asp Lys Leu Met

                115                 12O                 125

Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys Glu Asp

                130                 135                 14O

Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu

                145

Claims (25)

1、一种分离的多核苷酸，选自于下列组：

(a)编码具有图1的推断的氨基酸序列的多肽或所说的多肽的片段，类似物或衍生物的多核苷酸，

(b)编码具有由ATCC保藏号75927包含的cDNA编码的氨基酸序列的多肽或所说多肽的片段，类似物或衍生物的多核苷酸。

2、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸为DNA。

3、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸为RNA。

4、根据权利要求1所述的多核苷酸，其中多核苷酸为基因组DNA。

5、根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有图1的推断的氨基酸序列的多肽。

6、根据权利要求2所述的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码由ATCC保藏号75927的cDNA编码的多肽。

7、根据权利要求1所述的多核苷酸，它具有图1所示的多肽的编码序列。

8、根据权利要求2所述的多核苷酸，它具有以ATCC保藏号75927保藏的多肽的编码序列。

9、一种含有权利要求2所述的DNA的载体。

10、一种用权利要求9所述的载体遗传工程化的宿主细胞。

11、一种产生多肽的方法，包括：从权利要求10的宿主细胞表达所说DNA编码的多肽。

12、一种产生能够表达多肽的细胞的方法，包括用权利要求9的载体遗传工程化细胞。

13、一种可与权利要求2的DNA杂交并编码具有TNF-γ活性的多肽的分离的DNA。

14、一种多肽，选自于下列组(i)具有图1的推断的氨基酸的序列的多肽及其片段，类似物和衍生物，和(ii)由ATCC保藏号75927的cDNA编码的多肽和所说多肽的片段，类似物和衍生物。

15、根据权利要求14所述的多肽，其中所述多肽具有图1的推断的氨基酸序列。

16、一种抗权利要求14所述的多肽的抗体。

17、一种权利要求14所述多肽的刺激剂。

18、一种权利14所述多肽的拮抗剂。

19、一种用于治疗需要TNF-γ的病人的方法，包括：给病人施用治疗有效量的权利要求14的多肽。

20、一种用于治疗需要TNF-γ的病人的方法，包括：给病人施用治疗有效量的权利要求17的刺激剂。

21、一种用于治疗需要抑制TNF-γ的病人的方法，它包括：给病人施用治疗有效量的权利要求18的拮抗剂。

22、根据权利要求19所述的方法，其中通过给病人提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说多肽来施用所说的治疗有效量的多肽。

23、一种鉴别权利要求14所述的多肽的刺激剂和拮抗剂的方法，包括：

在存在或缺乏TNF-γ时有选择地将内皮细胞，Concavilin-A，待筛选的化合物，[³H]胸腺嘧啶结合；

测量内皮细胞掺入的[³H]胸腺嘧啶的量；和

确定该化合物是否增强或阻止[³H]胸腺嘧啶的掺入。

24、一种在病人中抑制肿瘤细胞生长的方法，包括：

在任选地存在药学可接受载体条件下，给病人施用治疗有效量的TNF-γ蛋白质。

25、诊断肿瘤或肿瘤易感性的方法，包括：

在来自于宿主的样品中检测编码TNF-γ的核酸序列的突变形式。

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