JP2003519470A - 組換え抗ｃｄ４０抗体およびその使用 - Google Patents

組換え抗ｃｄ４０抗体およびその使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、癌、炎症性疾患、および免疫系の障害または不全を予防および治療するための方法ならびに組成物に関する。本発明の方法は、CD40のCD40リガンドへの結合を高めるCD40結合タンパク質を投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】1．発明の分野 本発明は、癌、炎症性疾患もしくは障害および免疫系の疾患もしくは障害を含
む疾患および障害を治療するための方法および組成物であって、CD40リガンドと
CD40の結合を増強するCD40結合タンパク質を投与することを含んでなることを特
徴とする上記方法および組成物に関する。CD40結合タンパク質としては、モノク
ローナル抗体S2C6およびその誘導体の組換え体／変異体が挙げられる。
【０００２】2．発明の背景 CD40は様々な細胞型、例えばB細胞、B細胞悪性腫、濾胞樹状細胞、基底上皮細
胞および癌腫上に発現される細胞表面リン酸化糖タンパク質である。CD40はCD40
リガンド（"CD40L"）と結合する。CD40Lは、炎症および癌に罹患中、活性化T細
胞上に発現される（Younesら, 1998, Br. J. Haematol. 100:135-141；レビュー
としてはGrewalおよびFlavell, 1998. Annu. Rev. Immunol. 16:111-135を参照
）。CD40のCD40Lとの相互作用はB細胞活性および正常B細胞の増殖をもたらす。
しかし、B細胞から誘導された腫瘍系におけるCD40介在シグナル伝達は活性化に
より誘導される細胞死をもたらし得る。活性化シグナルの強度が活性化誘導によ
る腫瘍細胞死の鍵となる（Graftonら, 1997, Cell. Immunol. 182:45-56）。従
って、受容体リガンド相互作用およびCD40とCD40Lの間の活性化シグナル強度を
増強する組成物および方法は、疾患を治療する上で大きな価値を有しうる。
【０００３】2.1 CD40とCD40L CD40はTNF受容体スーパーファミリーのメンバーである。このファミリーとし
ては、TNFrII、CD40、CD30、LMP-1、LTBr、ATAR、OX-40および4-1BB受容体が挙
げられる。CD40は、構成的にBリンパ球、マクロファージおよび樹状細胞上に発
現され、かつサイトカイン活性化によって繊維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞
上に誘導される（Van KootenおよびBancherau, 1997, Curr. Opin. Imunol., 9:
330-337）。CD40はまた、多くのヒトの癌、例えば肺、膀胱、胃、乳房および卵
巣の癌に高度に発現されることが示されている（Stamenkovicら, 1989, EMBO J.
8:1403-1410）。
【０００４】 CD40に対するリガンドは活性化T細胞上に発現される膜タンパク質である。CD4
0Lが受容体と結合すると、CD40多量体化、（樹状細胞、単球およびB細胞などの
抗原提示細胞に対して）活性化シグナル発生ならびに（サイトカイン活性化織維
芽細胞およびB細胞に対して）増殖および分化シグナル発生が起こる。CD40シグ
ナルは、多量体化した受容体から一連のTNF受容体関連因子（"TRAF"）の補充を
経由して伝達される（Kehry, 1996, J. Immunol. 156:2345-2348）。TRAFのサブ
セットは、CD40などのTNFファミリーメンバーと示差的に相互作用して非常に多
様な下流経路に刺激を与える。TRAF1およびTRAF2はアポトーシスの調節に関係す
る（Speiserら, 1997, J. Exp. Med. 185:1777-1783；Yehら, 1997, Immunity 7
:715-725）。TRAF2、5、および6は、NF-kBおよびc-Jun N末端キナーゼ活性化な
どの増殖および活性化事象に参加する。正常B細胞では、CD40の結合はTRAF2およ
びTRAF3を受容体複合体に補充しかつ他のTRAFのダウンレギュレーションを誘導
する（Kuhuneら, 1997, J. Exp. Med. 186:337-342）。CD40結合の効果はまた、
膜密度にも依存する（De Paoliら, 1997, Cytometry 30:33-38）。重要なことは
、正常な一次B細胞で見られる増殖応答と異なり、新生物B細胞上のCD40結合は増
殖阻害および活性化誘導による細胞死をもたらすことである（Funakoshiら, 199
4, Blood 83:2787-2794）。従って、様々な細胞型、形質転換、常在性TRAFおよ
び同時刺激の環境におけるCD40活性化は、活性化および増殖から増殖阻害および
アポトーシスにわたる範囲の応答を誘導しうる。
【０００５】2.2 抗CD40抗体 少なくとも1つの例外はあるが、現在記載されている抗CD40モノクローナル抗
体（"mAbs"）は次の3つの一般クラスである：(1)CD40／CD40L相互作用を少なく
とも90%ブロックしかつ抗新生物特性を有するクラス（Armitageら, 米国特許第5
,674,492号；Fanslowら, 1995, Leukocyte Typing V, Schlossmanら, 編, 1:555
-556）；(2)CD40からのシグナル伝達をアンタゴナイズするクラス（deBoerら,
米国特許第5,677,165号）；および(3)CD40からの刺激シグナルを送達するがCD40
とCD40Lの間の相互作用を増加しないクラス、例えば、G28-5（Ledbetterら, 米
国特許第5,182,368号；PCT公開WO 96/18413）。
【０００６】 或るmAb、CD40.4（5C3)（PharMingen, San Diego, California）は、CD40とCD
40Lの間の相互作用をほぼ30〜40%増加することが示されている（Schlossmanら編
, 1995, Leukocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens（白血球
分化抗原） 1:547-556）。
【０００７】 Armitageら（米国特許第5,674,492号）は、CD40を発現する新生物細胞により
特徴づけられる疾患を予防または治療するために、CD40と結合しかつCD40とCD40
Lの結合を阻害する能力のあるmAb、HuCD40-M2などのCD40結合タンパク質を利用
する方法を記載している。
【０００８】 DeBoerら（米国特許第5,677,165号）は、顕著なアゴニスト活性はなく、B細胞
上のCD40と結合してB細胞活性化をブロックする抗CD40 mAbsを記載している。米
国特許第5,677,165号の本質的な特徴は、抗CD40 mAbが正常ヒトB細胞表面上のヒ
トCD40と結合すると、正常ヒトB細胞の増殖または分化が阻害されることである
。
【０００９】 Ledbetterら（米国特許第5,182,368号）は、B細胞表面抗原Bp50（現在CD40と
呼ばれる）と結合し、細胞周期を横切って活性化B細胞を刺激し、B細胞増殖を増
加するリガンドG28-5を記載している。しかし、G28-5はCD40Lの存在のもとでB細
胞の活性化を増強しないし、CD40/CD40L相互作用を強化しない。
【００１０】 S2C6は、ヒト膀胱癌に対して調製された抗CD40 mAbである（Paulieら, 1984,
Cancer Immunol. Immunother. 17:165-179）。S2C6は、Bリンパ球、内皮および
上皮細胞を含む様々な細胞型上に発現されるCD40受容体と結合する。S2C6は、新
生物尿路上皮およびB細胞誘導悪性リンパ球に対する特異性を有することが示さ
れている。前立腺癌細胞系HSとの反応性、および黒色腫との弱い反応性も示され
ている（Paulieら, 1984, Cancer Immunol. Immunother, 17:165-179）。諸研究
は、S2C6のB細胞悪性腫に対する診断マーカーとしての利用も示唆している（Pau
lieら, 1984, Cancer Immunol. Immunother, 17:165-179；Paulieら, 1985, Eur
. J. Cancer. Clin. Oncol. 21:701-710）。B細胞悪性腫を検出することに加え
て、S2C6は、Bリンパ球に強い増殖促進シグナルを送達することが示されている
（Paulieら, 1989, J. Immunol. 142:590-595）。
【００１１】 S2C6はヒト末梢B細胞に対するアゴニスト活性を有することが、一次B細胞増殖
を用量依存的様式で刺激する能力により実証されている（Paulieら, 1989, J. I
mmunol. 142:590-595）。
【００１２】 競合研究は、G28-5およびS2C6が同じかもしくは近位のエピトープと結合する
ことを示しているが、これらの抗体は、予め刺激した扁桃腺B細胞に対するいず
れかのmAbにより達成される刺激の発現量に主に基づいて、機能的に異なること
が確認されている（ClarkおよびLedbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
83:4494-4498；Ledbetterら, 米国特許第5,182,368号）。特定の試験条件下で
扁桃腺B細胞活性化を達成するために、G28-5と比較して、100倍以上のS2C6が必
要であった（Ledbetterら, 米国特許第5,182,368号）。
【００１３】 当業界では、癌を治療もしくは予防する、免疫系を活性化もしくは増強する、
または免疫不全もしくは障害を治療もしくは予防するための治療薬の効能増強の
ニーズがあり、本発明はそのニーズの一つを提供する。
【００１４】 本明細書におけるいずれの文献の引用または確認も、文献が本発明の先行技術
として利用しうることを容認するものと解釈されるべきでない。
【００１５】3．発明の概要 本発明者らは、予期せざることに、新しいクラスの抗CD40抗体であって、刺激
シグナルを送達することに加えて、CD40とCD40Lの間の相互作用を増強し、CD40L
が介在する刺激を増大し、そしてin vivoで抗新生物活性を有することを特徴と
する上記抗体を発見した。これらの抗体および関係する分子の作製と利用は、mA
b S2C6の可変領域の本発明者らのクローニングおよび配列決定、ならびにそのCD
Rおよびフレームワーク領域の同定によって可能となった。
【００１６】 本発明は、新規の配列（配列番号3、4、8、9、または10）を有するmAb S2C6の
可変部またはそれらの1以上の相補性決定領域（CDR）を含んでなる分子であって
、(a)免疫特異的にCD40と結合し、かつ(b)ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指
定されたハイブリドーマにより分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6と比較
して一次アミノ酸配列に1以上の置換もしくは挿入を含んでなるか、またはATCC
に寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノ
クローナル抗体S2C6でなく、かつパパインもしくはペプシンによるS2C6の切断に
よって得られないことを特徴とする上記分子に関する。ある特定の実施形態にお
いては、該分子は天然のモノクローナル抗体S2C6でなくかつ上記モノクローナル
抗体S2C6の天然の重鎖または軽鎖を含有しない。他の特定の実施形態においては
、該分子は抗体である。他の実施形態においては、該抗体はアイソタイプIgG1で
ない。他の特定の実施形態においては、該分子は軽鎖可変ドメインである配列番
号2のアミノ酸配列、または重鎖可変ドメインである配列番号7のアミノ酸配列を
含んでなる。
【００１７】 本発明はさらに、第2のタンパク質のアミノ酸配列と融合したmAb S2C6の断片
を含んでなるキメラ／融合タンパク質ならびにmAb S2C6の断片が共有結合で（例
えば、架橋剤の利用により）他の化学構造と結合した分子に関する。ある特定の
実施形態においては、免疫特異的にCD40と結合する分子であって、ブリオジン（
bryodin）1（BD1）のアミノ酸配列を含む第2のタンパク質と融合したmAb S2C6の
重鎖および／または軽鎖可変ドメインを含んでなる上記分子が提供される。
【００１８】 本発明はさらに、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号7、配列番号8
、配列番号9または配列番号10に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸
配列を含んでなるタンパク質であって、(a)免疫特異的にCD40と結合し、かつ(b)
ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌される
天然のモノクローナル抗体S2C6と比較して一次アミノ酸配列に1以上の置換もし
くは挿入を含んでなることを特徴とする上記タンパク質に関する。ある特定の実
施形態においては、該タンパク質は天然のモノクローナル抗体S2C6でなくかつ上
記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖もしくは軽鎖を含有しない。
【００１９】 本発明はさらに、(a)CD40との結合について、ATCCに寄託され受託番号PTA-110
と指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6と競合し
、(b)CD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%増加し、そして(c)ATCCに寄託
され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌される天然のモノ
クローナル抗体S2C6と比較して一次アミノ酸配列に1以上の置換もしくは挿入を
含んでなるか、またはATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリド
ーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6でなく、かつパパインもしくはペ
プシンによるS2C6の切断によって得られない、精製タンパク質に関する。ある特
定の実施形態においては、該タンパク質は天然のモノクローナル抗体S2C6でなく
かつ上記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖または軽鎖を含有しない。
【００２０】 本発明はさらに、そのような分子およびタンパク質をコードするかまたはその
ようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列から成るDNAとハイブリダイズ
する核酸；そのような分子およびタンパク質を含んでなる組換え細胞；およびそ
のようなタンパク質を作製する方法に関する。
【００２１】 ある実施形態においては、単離した核酸は、(a)ATCCに寄託され受託番号PTA-1
10と指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6の重鎖
可変ドメイン、および(b)ヒトの定常領域を含んでなるタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２２】 ある実施形態においては、単離した核酸は、(a)ATCCに寄託され受託番号PTA-1
10と指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6の軽鎖
可変ドメイン、および(b)ヒトの定常領域を含んでなるタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含んでなる。
【００２３】 本発明はさらに、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる組換
え核酸ベクターを含有する組換え細胞であって、該タンパク質は、CD40との結合
について、ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより
分泌されるモノクローナル抗体S2C6と競合し、かつ該タンパク質はCD40リガンド
とCD40の結合を少なくとも45%増加することを特徴とする上記組換え細胞に関す
る。
【００２４】 本発明はさらに、配列番号1、配列番号6、配列番号11、配列番号12、配列番号
13、配列番号14、または配列番号15を含有する組換え核酸ベクターを含んでなる
組換え細胞、およびそれらの細胞を生育させてヌクレオチド配列によりコードさ
れたタンパク質を細胞により発現させ、そして発現したタンパク質を回収するこ
とを含んでなるタンパク質を作製する方法に関する。
【００２５】 本発明の分子および抗体を、好ましくは精製した形態で含有する医薬組成物も
提供される。特定の実施形態においては、本発明は、ある分子および製薬上許容
される担体を含んでなる医薬組成物であって、該分子は配列番号2、配列番号3、
配列番号4、配列番号7、配列番号8、配列番号9、または配列番号10を含有し、該
分子は(i)免疫特異的にCD40と結合し、(ii)CD40リガンドとCD40の結合を増強し
、そして(iii)ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマに
より分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6と比較して一次アミノ酸配列に1
以上の置換もしくは挿入を含んでなることを特徴とする、上記医薬組成物に関す
る。ある特定の実施形態においては、該分子は天然のモノクローナル抗体S2C6で
なくかつ上記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖または軽鎖を含有しない。
【００２６】 本発明はさらに精製タンパク質および製薬上許容される担体を含んでなる医薬
組成物であって、該タンパク質は(i)CD40との結合について、ATCCに寄託され受
託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌されるmAb S2C6と競合し
、(ii)CD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%増強し、そして(iii)ATCCに寄
託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌される天然のモ
ノクローナル抗体S2C6と比較して一次アミノ酸配列に1以上の置換もしくは挿入
を含んでなるか、またはATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリ
ドーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6でなくかつパパインもしくはペ
プシンによるS2C6の切断によって得られないことを特徴とする、上記医薬組成物
に関する。ある特定の実施形態においては、該タンパク質は天然のモノクローナ
ル抗体S2C6でなくかつ上記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖もしくは軽鎖を
含有しない。
【００２７】 ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、癌を治療もしくは予
防するために有効な量の、または免疫応答を活性化もしくは増強するために有効
な量の、または被験者の免疫応答を活性化もしくは増強する量の本発明の分子ま
たは抗体を含有する。
【００２８】 ある特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物はさらにCD40リガンドを
含有する。ある特定の実施形態においては、該医薬組成物は、癌もしくは免疫疾
患を治療もしくは予防するために、または免疫応答を活性化もしくは増強するた
めに有効な量の、(a)免疫特異的にCD40と結合する分子であって、CD40リガンド
とCD40の結合を増加する分子；(b)CD40リガンド；および(c)製薬上許容される担
体を含んでなる。この実施形態においては、例えば、該分子は天然のmAb S2C6ま
たは天然のmAb 5C3または本明細書に記載のS2C6誘導体であってもよい。
【００２９】 本発明はさらに、被験者の癌を治療もしくは予防するための、被験者の免疫応
答を活性化もしくは増強するための、または被験者の免疫不全もしくは障害を治
療または予防するための、治療上有効な量の本発明の分子または抗体、例えば、
配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号7、配列番号8、配列番号9または配
列番号10を被験者に投与することを含んでなる方法であって、該分子は(i)CD40
と免疫特異的に結合し、(ii)CD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%増加し
、そして(iii)ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマによ
り分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6と比較して一次アミノ酸配列に1以
上の置換もしくは挿入を含んでなることを特徴とする、上記方法に関する。ある
特定の実施形態においては、分子は天然のモノクローナル抗体S2C6でなくかつ上
記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖もしくは軽鎖を含有しない。
【００３０】 本発明はさらに、被験者の癌を治療もしくは予防するための、被験者の免疫応
答を活性化もしくは増強するための、または被験者の免疫不全もしくは障害を治
療または予防するための、精製タンパク質を被験者に投与することを含んでなる
方法であって、該精製タンパク質は(i)CD40との結合について、ATCCに寄託され
受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル
抗体S2C6と競合し、(ii)CD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%増強し、そ
して(iii)ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマにより分
泌される天然のモノクローナル抗体S2C6と比較して、一次アミノ酸配列に1以上
の置換もしくは挿入を含んでなるか、またはATCCに寄託され受託番号PTA-110と
指定されたハイブリドーマにより分泌されるモノクローナル抗体S2C6でなく、か
つパパインもしくはペプシンによるS2C6の切断によって得られないことを特徴と
する、上記方法に関する。ある特定の実施形態においては、該タンパク質は天然
のモノクローナル抗体S2C6でなくかつ上記モノクローナル抗体S2C6の天然の重鎖
もしくは軽鎖を含有しない。
【００３１】 ある特定の実施形態においては、本発明の方法はさらにCD40リガンドを被験者
に投与することを含んでなる。
【００３２】 本発明はさらに、被験者の癌もしくは免疫疾患を治療もしくは予防するための
、上記治療もしくは予防に有効な量の、(a)免疫特異的にCD40と結合する分子で
あってCD40リガンドとCD40の結合を増加する分子、および(b)CD40リガンド、を
被験者に投与する方法であって、ここに該分子は天然のmAb S2C6または天然のmA
b 5C3または本明細書に記載のいずれかのS2C6誘導体であってもよいことを特徴
とする、上記方法に関する。
【００３３】 好ましい実施形態においては、被験者はヒトである。
【００３４】 本発明はさらに、タンパク質をコードする1以上のトランスジーンを含有する
トランスジェニック非ヒト動物、植物、または単離細胞であって、該タンパク質
が、CD40との結合について、ATCCに寄託され受託番号PTA-110と指定されたハイ
ブリドーマにより分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6と競合し、かつ該タ
ンパク質がCD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%増加することを特徴とす
る上記トランスジェニック非ヒト動物、植物、または単離細胞に関する。
【００３５】4. 図面の簡単な説明 本明細書の最後に記載する。
【００３６】5．詳細な説明 本発明は、S2C6遺伝子によりコードされたタンパク質およびS2C6遺伝子のヌク
レオチド配列に関する。本発明はさらに、そのようなS2C6タンパク質および核酸
の断片および他の誘導体および類似体に関する。様々な特定の実施形態において
は、本発明の分子（例えば、抗体）は、その分子がATCCに寄託され受託番号PTA-
110と指定された天然のmAb S2C6またはその重鎖もしくは軽鎖でない限りにおい
て、mAb S2C6の全部または一部分（軽鎖および/または重鎖、または軽鎖CDR １
（配列番号3）および/または2（配列番号4）、および/または重鎖CDR 1（配列番
号8）、2（配列番号9）、および/または3（配列番号10）、または軽鎖CDR3（配
列番号5）を、他のCDRおよび/または1以上の4つの重鎖フレームワーク領域およ
び4つの軽鎖フレームワーク領域との組み合わせで含んでなる。そのような分子
は、配列においておよび/または翻訳後修飾（グリコシル化、アミド化、非S2C6
へのペプチド結合または架橋など）においてS2C6と異なってもよい。様々な特定
の実施形態においては、本発明の分子は免疫特異的にCD40と結合し（または多量
体化時に免疫特異的にCD40と結合し）、CD40との結合について、天然のS2C6と競
合し、および/またはCD40リガンドとCD40の結合を少なくとも45%、50%、60%また
は65%増加する。そのような分子、例えば、S2C6断片または誘導体をコードする
核酸もまた、天然のmAb S2C6をコードする核酸と同様に、本発明の範囲内である
。以上のタンパク質の、例えば組換え法による、作製が提供される。
【００３７】 本発明はまた、S2C6タンパク質および誘導体に関し、限定されるものでないが
、機能的に活性な、すなわち、全長S2C6 mAbに関連する1以上の公知の機能活性
を提示することができる融合／キメラタンパク質が挙げられる。そのような機能
活性としては、限定されるものでないが、CD40と結合する能力、CD40シグナル伝
達経路への刺激シグナルの送達（例えば、B細胞増殖を起こすための）、CD40Lと
CD40の相互作用の強化；腫瘍増殖を阻害する能力；および免疫応答を誘導する能
力が挙げられる。
【００３８】 S2C6、その誘導体および類似体を含んでなるCD40に対する抗体がさらに提供さ
れ、限定されるものでないが、ヒト化抗体；一本鎖抗体；二重特異的抗体；およ
び化学療法剤もしくは生物学的応答調節剤にコンジュゲートされた抗体が挙げら
れる。
【００３９】 本発明はさらに、本発明の組成物を単独でまたはCD40Lと組み合わせて投与す
ることを含んでなる、癌、炎症性疾患、および免疫系の障害を治療または予防す
る方法に関する。
【００４０】 本発明を以下の第6〜9節に記載した実施例を用いて説明するが、これらの実施
例は、とりわけ、S2C6遺伝子のクローニングおよび特性決定；CD40／CD40L相互
作用の強化；腫瘍増殖の阻害；および一本鎖抗CD40免疫毒素とCD40-Igの結合を
開示する。
【００４１】 限定としてでなく、開示を明確にするため、本発明の詳細な説明を以下の小節
に分割した。
【００４２】5.1 S2C6遺伝子の単離 本発明はS2C6核酸のヌクレオチド配列に関する。特定の実施形態においては、
S2C6核酸は、配列番号1および6のcDNA配列、またはS2C6タンパク質（例えば、配
列番号2および7の配列を有するタンパク質）をコードする核酸を含んでなる。本
発明は少なくとも8個のヌクレオチド（すなわち、ハイブリダイズ可能部分）か
らなる精製核酸を提供する；他の実施形態においては、該核酸は、S2C6配列の少
なくとも25個の（連続した）ヌクレオチド、50個のヌクレオチド、100個、また
は200個のヌクレオチド、または全長S2C6可変部コード配列から成る。同じまた
は他の実施形態においては、核酸は、長さが50、75、100、または200または5000
ヌクレオチドより小さい。核酸は一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい
。本発明はまた、以上の配列もしくはそれらの逆相補体とハイブリダイズし得る
かまたは相補的である核酸で、特に、CD40と結合するタンパク質をコードし、CD
40との結合についてS2C6と競合し、および／またはCD40リガンドとCD40の結合を
少なくとも45%、50%、60%、または65%増加する核酸に関する。特定の態様におい
ては、S2C6可変部遺伝子の少なくとも10、25、50、100、もしくは200ヌクレオチ
ドまたは全コード領域を含んでなる核酸が提供される。
【００４３】 さらに、S2C6タンパク質の誘導体および類似体をコードする核酸が提供される
。明らかであるように、本明細書で用いられる「S2C6タンパク質の断片または一
部分をコードする核酸」は、S2C6タンパク質の記述した断片または一部分だけを
コードする核酸を意味するのであって、連続した配列としてのS2C6タンパク質の
他の連続部分を意味するのではないと解釈されるべきである。
【００４４】5.2 クローニング方法 S2C6遺伝子のクローニングのための特定な実施形態は次のとおりである。特定
の1実施形態においては、モノクローナル抗体S2C6産生ハイブリドーマから総RNA
を単離し、所望の可変領域配列を増幅するために、本明細書に開示した配列に基
づくプライマーを用いたPCRを行う。説明のための例としては、以下の第6節を参
照されたい。別の例では、モノクローナル抗体S2C6産生ハイブリドーマからmRNA
を分離し、cDNAを作り、発現ベクター(例えばバクテリオファージ由来のもの)中
に連結して、そのベクターが導入される宿主細胞中で発現されるようにする。次
いで、発現した産物を選択するために種々のスクリーニングアッセイ法を用いる
ことができる。1実施形態においては、選択はS2C6遺伝子の一部もしくはそのRNA
もしくはそれらの断片を代表する標識プローブとのハイブリダイゼーションをベ
ースとしたものである(BentonとDavis, 1977, Science 196:180; GrunsteinとHo
gness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961)。用いたプローブと実
質的に相同なDNA断片がハイブリダイズする。制限酵素で消化し、既知の制限酵
素地図がある場合にはそれから期待されるものと断片のサイズを比較することに
よって適切な断片を同定することも可能である。さらに該遺伝子の特性に基づい
て選択を行うこともできる。
【００４５】 あるいはまた、所望の遺伝子の存在をそれの発現産物の物理的、化学的、もし
くは免疫学的性質に基づいたアッセイ法で検出することができる。例えば、適切
なmRNAをハイブリダイズすることによって選択するcDNAクローン、もしくはDNA
クローンを選択し発現させて、S2C6タンパク質の性質として知られている、例え
ば、電気泳動の移動度、等電点電気泳動での挙動、タンパク分解酵素消化地図、
もしくは機能的活性などが類似もしくは同一のタンパク質を産生させることがで
きる。例えば、CD40との結合能はELISA(酵素免疫定量法)タイプの方法で検出す
ることができる。
【００４６】 S2C6遺伝子はまた、核酸ハイブリダイゼーションを用いてmRNAを選択した後in
vitroで翻訳することによって同定することができる。この方法では、断片をハ
イブリダイゼーションによって相補的mRNAを単離するために用いられる。単離し
たmRNAのin vitroでの翻訳産物を機能アッセイ(例えば、CD40への結合など)する
ことによってそのmRNAが同定され、従って所望の配列を含んでいる相補的DNA断
片が同定される。
【００４７】 別の1実施形態においては、S2C6 cDNAは本明細書に開示した配列から化学的に
合成することができる。S2C6遺伝子を単離するために、当業者には既知のその他
の方法を用いることができる。
【００４８】 次いで、同定され単離されたS2C6遺伝子/cDNAを適切なクローニングベクター
中に挿入することができる。当業界では既知の、非常に多数のベクター−宿主系
を用いることができる。用いうるベクターとしては、限定はされないが、プラス
ミドもしくは改変したウイルスを挙げることができるが、ベクター系は用いる宿
主と共存可能なものでなければならない。そのようなベクターとしては、限定は
されないが、λファージ派生体などのバクテリオファージ、またはpBR322もしく
はpUCプラスミド派生体などのプラスミド、またはBluescriptベクター(Stratage
ne)が挙げられる。クローニングベクター中への挿入は、例えば、そのDNA断片を
相補的な付着末端を有するクローニングベクター中に連結することによって行う
ことができる。しかし、そのクローニングベクター中にDNAを断片化するために
用いた制限酵素と同じ相補的制限酵素部位が存在しない場合にはそのDNAの末端
はおそらく酵素的に改変されるであろう。あるいはまた、所望のいかなる部位で
もヌクレオチド配列(リンカー)をDNA末端に連結することによって産生させるこ
とができる；これらの連結されたリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列
をコードする特異的な化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを含むことができ
る。あるいはまた別の方法では、開裂させたベクターおよびS2C6遺伝子をホモポ
リマーテーリングによって、もしくは適切な配列を含んでいるプライマーを用い
たPCRによって改変することができる。組換え分子を形質転換、トランスフェク
ション、感染、電気穿孔法、その他を用いて宿主細胞中に導入してその遺伝子配
列の多数のコピーが作成されるようにすることができる。
【００４９】 あるいはまた別の方法では、「ショットガン」法で適切なクローニングベクタ
ー中に挿入した後に所望の遺伝子を同定し単離することができる。所望の遺伝子
をクローニングベクター中に挿入する前に、たとえば大きさによって分画するこ
とにより、濃縮することができる。
【００５０】 特定の実施形態においては、単離されたS2C6遺伝子、cDNA、もしくは合成DNA
配列を組換えDNA分子での宿主細胞の形質転換によってその遺伝子の多数のコピ
ーの作成が可能となる。その遺伝子は、形質転換体を増殖させ、その形質転換体
から組換えDNA分子を単離し、必要に応じて、その単離された組換えDNAから挿入
された遺伝子を回収することによって、大量に得ることができる。
【００５１】 本発明で提供されるS2C6配列には、天然のS2C6可変領域に認められるアミノ酸
配列と実質的に同じものをコードするヌクレオチド配列、および機能的に等価な
アミノ酸を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびにほかの
S2C6誘導体もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列が含まれ、S2C6誘導体
および類似体については下記のとおりである。
【００５２】5.3 S2C6遺伝子の発現 S2C6タンパク質、または機能的に活性な類似体もしくは断片、またはそれらの
他の誘導体(第5.6節を参照)をコードするヌクレオチド配列は適切な発現ベクタ
ー、すなわち挿入されたタンパク質をコードする配列の転写および翻訳のために
必要なエレメントを含んでいるベクター中に挿入することができる。必要とされ
る転写および翻訳シグナルも天然のS2C6遺伝子および/もしくはその隣接領域か
ら供給することができる。タンパク質コード配列を発現するために種々の宿主−
ベクター系を用いることができる。そのような系としては限定はされないが、ウ
イルス(例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)を感染させた哺乳動物
細胞系；ウイルス(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系；酵母ベク
ターを含んでいる酵母、などの微生物；バクテリオファージ、DNA、プラスミドD
NA、もしくはコスミドDNAで形質転換させた細菌；トランスジェニック植物もし
くはヒト以外のトランスジェニック動物が挙げられる。ベクターの発現エレメン
トはその強度と特異性が様々である。用いる宿主−ベクター系の如何によって多
数の適切な転写および翻訳エレメントのうちのどのようなものでも用いることが
できる。
【００５３】 適切な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質をコードする配列を含んでい
るキメラ遺伝子を含有している発現ベクターを構築するために、DNA断片をベク
ター中に挿入するための方法として既に報告されている方法のいかなるものでも
用いることができる。そのような方法にはin vitroの組換え技法、および合成技
法、ならびにin vivoでの組換え法(遺伝的組換え)が含まれる。S2C6タンパク質
もしくはペプチド断片をコードする核酸配列の発現は、S2C6タンパク質もしくは
ペプチドが該組換えDNA分子で形質転換された宿主細胞中で発現されることとな
るように第2の核酸配列によって調節することができる。例えば、S2C6の発現は
当業界で既知のいかなるプロモーター/エンハンサーエレメントでも制御するこ
とができる。天然のS2C6遺伝子プロモーターではないがS2C6遺伝子発現の制御に
用いることのできるものとしては限定はされないが、SV40初期プロモーター領域
(BenoistとChambon, 1981, Nature 290:304-310)、ラウス肉腫ウイルスの3'長末
端反復(LTR)中に含まれるプロモーター(Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797)、
ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A. 78:1441-1445)、メタロチオネイン遺伝子の調節配列(Brinsterら, 1
982, Nature 296:39-42)；β-ラクタマーゼプロモーター(Villa-Kamaroffら, 19
78, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731)、もしくはlacプロモーター
(Deboerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25)などの原核生物発
現ベクター、；「組換え細菌から得られる有用なタンパク質」"Useful proteins
from recombinant bacteria", Scientific American, 1980, 242:74-94をも参
照せよ；ノパリン合成酵素プロモーター領域(Herrera-Estrellaら, Nature 303:
209-213)もしくはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター(Gardner
ら, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871)、および光合成酵素リブロース二リン酸カ
ルボキシラーゼ(Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310:115-120)を含む植物発
現ベクター；Gal 4 プロモーター、ADC(アルコールデヒドロゲナーゼ)プロモー
ター、PGK(ホスホグリセロールキナーゼ)プロモーター、アルカリホスファター
ゼプロモーターなどの酵母もしくはその他の真菌のプロモーターエレメント、お
よび次の動物転写制御領域で組織特異性を示しトランスジェニック動物に用いら
れているもの：膵臓の腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift
ら, 1984, Cell 38:639-646; Ornitzら, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quan
t. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515)； 膵臓のβ細
胞中で活性な遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315:115-122)、リンパ細
胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedlら, 1984, Cell 38:647
-658; Adamesら, 1985, Nature 318:533-538; Alexanderら, 1987, Mol. Cell.
Biol. 7:1436-1444)、精巣、乳房、リンパ球およびマスト細胞で活性なマウス乳
腺腫瘍ウイルス制御領域(Lederら, 1986, Cell 45:485-495)、肝臓で活性なアル
ブミン遺伝子制御領域(Pinkertら, 1987, Genes and Devel. 1:268-276)、肝臓
中で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域(Krumlaufら, 1985, Mol.Cell. B
iol. 5:1639-1648; Hammerら, 1987, Science 235:53-58)、肝臓で活性なα1-ア
ンチトリプシン遺伝子制御領域(Kelseyら, 1987, Genes and Devel. 1:161-171)
、骨髄細胞中で活性なβ-グロビン遺伝子制御領域(Mogramら, 1985, Nature 315
:338-340; Kolliasら, 1986, Cell 46:89-94)、脳のオリゴデンドロサイト細胞
中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら, 1987, Cell
48:703-712)；骨格筋内で活性なミオシン軽鎖2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nat
ure 314:283-286)、および視床下部で活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子
制御領域(Masonら, 1986, Science 234:1372-1378)を挙げることができる。
【００５４】 特定の1実施形態においては、S2C6遺伝子核酸と機能しうる形で連結されたプ
ロモーター、1個以上の複製起点、および任意で、1個以上の選択マーカー(例え
ば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターが用いられる。
【００５５】 S2C6遺伝子挿入物を含んでいる発現ベクターは3種類の一般的なアプローチで
同定することができる：(a) 核酸ハイブリダイゼーション；(b) マーカー遺伝子
機能の存在または不在；および(c) 挿入された配列の発現。第1のアプローチで
は発現ベクター中に挿入されたS2C6遺伝子の存在は、挿入されたS2C6遺伝子と相
同な配列を含んでいるプローブを用いる核酸ハイブリダイゼーションによって検
出することができる。第2のアプローチでは、組換えベクター/宿主系は、S2C6遺
伝子をそのベクター中に挿入したことによって生ずる特定のマーカー遺伝子機能
(例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質耐性、形質転換後の表現型、バキュ
ロウイルスでの封入体形成、その他)の存在もしくは不在に基づいて同定および
選択することができる。たとえば、S2C6遺伝子がベクターのマーカー遺伝子配列
の内部に挿入された場合には、S2C6インサートを含んでいる組換え体はマーカー
遺伝子機能の不在によって同定することができる。第3のアプローチでは、組換
え発現ベクターは、その組換え体で発現されるS2C6産物をアッセイすることによ
って同定することができる。そのようなアッセイ法は、例えば、in vitroアッセ
イ系、例えばCD40LのCD40との結合の増強；正常なB細胞の増殖の刺激；腫瘍増殖
の阻害、などにおける、S2C6タンパク質の物理的もしくは機能的性質に基づいた
ものとすることができる。
【００５６】 ひとたび特定の組換えDNA分子が同定され、単離されれば、それを増やすため
には当業界で既知のいくつかの方法を用いることができる。適切な宿主系と増殖
条件が確立されれば、組換え発現ベクターを増やし、多量を調製することができ
る。前述のとおり、用いることのできる発現ベクターとしては、限定はされない
が、下記のベクターもしくはそれらの派生体が挙げられる：ワクシニアウイルス
もしくはアデノウイルスなどのヒトもしくは動物ウイルス；バキュロウイルスな
どの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター(例えば、λフ
ァージ)、ならびにプラスミドおよびコスミドDNAベクター、などを多数あるうち
の少数ながら挙げることができる。
【００５７】 さらに、挿入された配列の発現をモジュレートする、もしくは所望の特別な様
式に遺伝子産物を改変およびプロセシングするような宿主株を選択することがで
きる。特定のプロモーターからの発現を特定のインデューサーを存在させて増大
させることができる；このようにして、遺伝子操作されたS2C6タンパク質の発現
を制御することができる。さらに、様々な宿主細胞は翻訳時および翻訳後のプロ
セシングと改変のための特徴的で特異的な機作を有している(例えば、グリコシ
ル化、タンパク質のリン酸化)。発現される外来タンパク質の所望の改変および
プロセシングを確保するために適切な細胞系統もしくは宿主系を選択することが
できる。例えば、細菌系での発現はグリコシル化されていないコアのタンパク質
産物を産生させるために用いることができる。酵母中で発現させればグリコシル
化された産物が産生される。哺乳動物細胞中での発現は、異種タンパク質の「天
然の」グリコシル化を確保するために用いることができる。さらに、様々なベク
ター/宿主発現系がプロセシング反応に様々な程度に影響を及ぼすことができる
。
【００５８】 特定の実施形態においては、発現されるS2C6関連タンパク質は抗体もしくはフ
ラグメントもしくはそれらの誘導体である。組換え抗体には組換え軽鎖可変ドメ
イン、組換え重鎖可変ドメイン、もしくはその双方を含ませることができる。特
定の1実施形態においては、軽鎖および重鎖の双方、もしくはそれらの誘導体を
組換えによって1つの細胞で発現される(例えば、Bossらによる1989年3月28日付
の米国特許第4,816,397号を参照せよ)。タンパク質をコードする配列の発現のた
めには種々の宿主/ベクター系を用いることができる。そのようなものとしては
、限定はされないが、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス
、その他)を感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス(例えば、バキュロウイルス)
を感染させた昆虫細胞；酵母ベクターを含んでいる酵母、もしくはバクテリオフ
ァージ、DNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換した細菌などの
微生物；トランスジェニック植物もしくはヒト以外のトランスジェニック動物が
挙げられる。
【００５９】5.4 遺伝子産物の同定と精製 特定の態様においては、本発明は、相補性決定領域(CDR)を含むか、もしくは
その他の点では機能的に活性であるS2C6タンパク質および断片およびそれらの誘
導体のアミノ酸配列、ならびにそのアミノ酸配列をコードする核酸配列を提供す
る。本明細書中で用いている「機能的に活性な」S2C6物質とは完全長の(天然の)
S2C6タンパク質が持つ機能的活性、例えばCD40への結合；正常なB細胞の増殖の
刺激；腫瘍増殖の阻害；CD40リガンドのCD40への結合の少なくとも45%の増大な
どの活性の1つ以上を示す物質を意味する。
【００６０】 特定の実施形態においては、本発明は、少なくとも6個のアミノ酸、10個のア
ミノ酸、20個のアミノ酸、50個のアミノ酸、75個のアミノ酸、もしくは少なくと
も100個のアミノ酸を含むS2C6タンパク質の断片、およびそれををコードする核
酸を提供する。
【００６１】 S2C6遺伝子配列を発現している組換え体が同定されれば、遺伝子産物を分析す
ることができる。このことは、その産物を放射活性標識した後、ゲル電気泳動、
イムノアッセイ、正常B細胞増殖の刺激、CD40結合アッセイ、CD40リガンドのCD4
0への結合の促進、腫瘍増殖の阻害、その他で分析することを含む。
【００６２】 S2C6タンパク質がひとたび同定されれば、クロマトグラフィー(例えば、イオ
ン交換、アフィニティー、サイズ排除カラムクロマトグラフィー)、遠心、溶解
度の差を含む標準的な方法、もしくはタンパク質精製のためのその他の標準的な
技法のいずれかによって単離し精製することができる。機能的な特性については
適切なアッセイ法のいかなるものを用いても評価することができる(第5.7節を参
照)。
【００６３】 あるいはまた、S2C6タンパク質もしくはその誘導体は本明細書に開示した配列
に基づいて当業界では既知の標準的な化学的方法によって合成することができる
(例えば、hunkapillerら, 1984, Nature 310:105-111を参照)。
【００６４】 本発明の特定の1実施形態においては、そのようなS2C6タンパク質は、それが
組換えDNA技法によって産生されたもの、もしくは化学合成法によって作成され
たもの、もしくは天然のタンパク質を精製したもののいずれにせよ、限定はされ
ないが、一次アミノ酸配列として、図3A-3Bに実質的に示すアミノ酸配列の全て
もしくは一部(配列番号2および7)、ならびにその断片および他の誘導体、ならび
にそれに対して相同なタンパク質を含む類似体を含んでいる。
【００６５】5.5 S2C6遺伝子およびタンパク質の構造 本発明のS2C6遺伝子およびタンパク質の構造は当業界では既知の種々の方法に
よって分析することができる。そのような方法のいくつかの例を下記に述べる。
【００６６】5.5.1 遺伝子解析 S2C6遺伝子に対応するクローン化したDNAもしくはcDNAを分析することができ
、その方法としては、限定はされないが、サザンハイブリダイゼーション法(Sou
thern, 1975, J. Mol. Biol. 98:503-517)、ノーザンハイブリダイゼーション法
(例えば、Freemanら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4094-4098を参
照せよ)、制限エンドヌクレアーゼマッピング(Maniatis, 1982, Molecular Clon
ing, A Lamoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, 米国ニューヨーク州)、およびDNA配列分析が挙げられる。従って、
本発明はS2C6遺伝子を認識する核酸プローブを提供する。例えば、ポリメラーゼ
連鎖反応法(PCR; 米国特許第4,683,202号、第4,683,195号、および第4,889,818
号；Gyllensteinら, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7652-7656; Och
manら, 1988, Genetics 120:321-623; Lohら, 1989, Science 243:217-220)の後
にサザンハイブリダイゼーションをS2C6遺伝子特異的プローブを用いて行うこと
によって、細胞(例えばハイブリドーマ)から得たDNAもしくはcDNA中のS2C6遺伝
子を検出することができる。PCR以外の増幅方法としては当業界で一般的に知ら
れているものを用いることができる。サザンおよびノーザンハイブリダイゼーシ
ョンの双方でのハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーは、用いた特
異的S2C6遺伝子プローブに対する関連性の所望の程度を有する核酸の検出を確保
するために操作することができる。これらの方法の改変および当業界で一般的に
知られているその他の方法を用いることができる。
【００６７】 制限エンドヌクレアーゼマッピングはS2C6遺伝子の遺伝子構造を概略的に決め
るために用いることができる。制限エンドヌクレアーゼ開裂によって作成した制
限酵素地図はDNA配列分析によって確認することができる。
【００６８】 DNA配列分析は当業界では既知のいかなる技法によっても行うことができ、そ
のような方法としては、限定はされないが、マクサム・ギルバート法(MaxamとGi
lbert, 1980, Meth. Enzymol. 65:499-560)、サンガージデオキシ法(Sangerら,
1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463)、T7 DNAポリメラーゼの使用(T
aborとRichardson, 米国特許第4,795,699号)、もしくは自動DNA配列決定装置の
使用(例えば、Applied Biosystems, Foster City, 米国カリフォルニア州)が挙
げられる。
【００６９】5.2.2 タンパク質分析 S2C6タンパク質のアミノ酸配列は該DNA配列から推論によって得ることができ
、あるいはまた、該タンパク質の直接的配列分析、例えば自動アミノ酸配列決定
装置を用いて得ることができる。
【００７０】 S2C6タンパク質配列はさらに親水性分析(HoppとWoods, 1981, Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 78:3824)によって特性を明らかにすることができる。親水性の
プロフィールはS2C6タンパク質の疎水性および親水性(免疫原性の可能性のある)
領域、ならびにそのような領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定す
るために用いることができる。
【００７１】 第2に、構造分析(ChouとFasman, 1974. Biochemistry 13:222)はまた、特異的
2次構造を呈するS2C6タンパク質の領域を同定するために行うことができる。
【００７２】 操作、翻訳、および2次構造予測、オープンリーディングフレームの予測、お
よびプロッティング、ならびに配列相同性の決定もまた当業界で利用可能なコン
ピュータソフトウエアを用いて行うことができる。
【００７３】5.6 mAB S2C6抗体誘導体 本節では、免疫特異的にCD40に結合しうるS2C6抗体誘導体の製造方法について
記載する。
【００７４】 そのような抗体としては、以下に限定されないが、モノクローナル抗体、ヒト
化抗体、キメラ抗体、1本鎖抗体、二重特異的抗体、Fab断片抗体、F(ab')2断片
抗体、Fab発現ライブラリーによって製造される断片抗体、抗イディオタイプ（a
nti-Id）抗体、及び上記いずれかのエピトープ結合性断片が挙げられる。ある実
施形態におけるS2C6誘導体は、S2C6の一次アミノ酸配列に対して一次アミノ酸配
列中に、１以上の欠失、付加及び／又は置換を含んでなる。別の実施形態におけ
るS2C6誘導体は、パパイン又はペプシンによるS2C6の開裂によって生じたもので
はない。さらに別の実施形態におけるS2C6誘導体は、S2C6の一次アミノ酸配列に
対して一次アミノ酸配列中に１以上の欠失、付加及び／又は置換を含み、且つ、
パパイン又はペプシンによるS2C6の開裂によって生じたものではない。本節及び
下記第5.7節では、適当な欠失体、付加体及び／又は置換体の選択のためのガイ
ダンスを提供する。
【００７５】 CD40に対するさらなるモノクローナル抗体の製造のために、培養液中の連続細
胞系による抗体分子の製造を与える任意の技術を用いることができる。これらの
技術としては、以下に限定されないが、Kohler及びMilsteinのハイブリドーマ技
術（1975、Nature 256, 495-497；及び米国特許第4,376,110号）、ヒトB細胞ハ
イブリドーマ技術（Kozborら、1983, Immunology Today 4, 72；Coleら、1983,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2026-2030）、及びヒトモノクローナル抗体を
製造するためのEBV−ハイブリドーマ技術（Coleら、1985, Monoclonal Antibodi
es And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。この
ような抗体又は当業界で利用可能な他の抗CD40抗体は、例えば、S2C6の重鎖が組
み換え発現される場合、その抗体に由来する基礎原料（basis）として用いてク
ローニングし、相補的な軽鎖を供給することができ（2つの鎖は、同じ細胞中で
組み換え発現することができるか、又は個別に発現させ精製した後にin vitroで
組み合わせることができる）；あるいは、任意の特異性を有する抗体由来の軽鎖
を用いることができる。S2C6重鎖をコードするか又はS2C6重鎖の可変ドメインを
含む分子をコードする核酸類（例えば、プラスミド）を、抗体軽鎖又は抗体軽鎖
を含む分子を発現する細胞中にトランスフェクトさせ、多量体タンパク質を発現
させることができ；この抗体軽鎖は組み換え体又は非組み換え体であり得、そし
て抗CD40特異性を有し得るか又は有し得ない。あるいは、S2C6重鎖又はその可変
領域若しくはそのCDRを含む分子は任意に発現させることができ、相補的軽鎖又
は軽鎖可変領域の存在無しに使用することができる。種々の実施形態において、
本発明は、CD40結合親和性を有するS2C6重鎖、又は重鎖CDR 8、9、及び／又は10
の１以上のコピーからなるか若しくは（あるいは）これらを含む分子、又はその
配列がCDR 8、9、及び／又は10の１以上のコピーからなるか若しくはこれらを含
むタンパク質（ペプチド又はポリペプチド）を提供する。特定の実施形態では、
そのようなタンパク質は、例えば、C末端アミド化又はN末端アセチル化によって
そのN又はC末端修飾することができる。
【００７６】 さらに、適当な抗原特異性を有するマウス抗体分子由来の遺伝子を、適当な生
物学的活性を有するヒト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすることに
よって「キメラ抗体」を製造するために開発された技術（Morrisonら、1984, Pr
oc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855；Neubergerら、1984, Nature 312, 604-
608；Takedaら、1985, Nature 314, 452-454）を用いることができる。キメラ抗
体は、それぞれの部分が異なる動物種から誘導されている分子、例えば、ネズミ
のmAB由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域とを有する分子である。（
例えば、Cabillyら、米国特許第4,816,567号；及びBossら、米国特許第5,816,39
7号を参照されたい。）特定の実施形態では、キメラ抗体は、ATCCに寄託され、
受託番号PTA-110を付与されたハイブリドーマによって分泌されるモノクローナ
ル抗体S2C6の可変ドメイン、及びヒト定常領域を含む。特定の実施形態では、キ
メラ抗体の可変ドメインは、図3Aに示されるS2C6 VL（配列番号２）及び／又は
図3Bに示されるS2C6 VH（配列番号７）を含む。
【００７７】 さらに、ヒト化抗体の製造のための技術が開発されてきた。（例えば、Queen
、米国特許第5,585,089号及びWinter、米国特許第5,225,539号を参照されたい。
）免疫グロブリン軽鎖又は重鎖可変領域は、相補性決定領域（CDR）と呼ばれる
、3つの超可変領域によって中断される「フレームワーク」領域からなる。フレ
ームワーク領域及びCDRの範囲は、精密に定義されてきた（「免疫学的重要性を
有するタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest
）」、Kabat, E.ら、米国保険社会福祉省（1983）を参照されたい）。簡単に言
うと、ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１以上のCDR及びヒト免疫グロブリン分子
由来のフレームワーク領域を有する非ヒト種由来の抗体分子類である。
【００７８】 本発明は、重鎖又は軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその誘導体を包含し、該
可変ドメインは、(a)モノクローナル抗体S2C6由来の3つで一組の相補性決定領域
（CDR）、及び(b)一組のモノクローナル抗体S2C6のフレームワーク領域とは異な
り、該抗体又はその誘導体が免疫特異的にCD40と結合する、4つで一組のフレー
ムワーク領域を含む。一組のフレームワーク領域は、ヒトモノクローナル抗体、
例えば、CD40に結合しないヒトモノクローナル抗体に由来することが好ましい。
【００７９】 特定の実施形態では、本発明は、軽鎖可変ドメインを含む抗体又はその誘導体
を包含し、該可変ドメインは、(a)配列番号３又は配列番号４を含む、3つで一組
の相補性決定領域（CDR）、及び(b)モノクローナル抗体S2C6の軽鎖のフレームワ
ーク領域とは異なり、該抗体又はその誘導体が免疫特異的にCD40と結合する、4
つで一組のフレームワーク領域を含む。
【００８０】 特定の実施形態では、本発明は、重鎖可変ドメインを含む抗体又はその誘導体
を包含し、該可変ドメインは、(a)配列番号８、配列番号９、又は配列番号10を
含む、一組の3つの相補性決定領域（CDR）、及び(b)該フレームワーク領域はモ
ノクローナル抗体S2C6の一組のフレームワーク領域とは異なり、該抗体又はその
誘導体がCD40に免疫特異的に結合する、一組の4つのフレームワーク領域を含む
。
【００８１】 あるいは、1本鎖抗体の製造について記載された技術（米国特許第4,946,778号
；Bird、1988, Science 242, 423-426；Hustonら、1988, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 85, 5879-5883；及びWardら、1989, Nature 334, 544-546）を適用してS
2C6配列を用いて1本鎖抗体を製造することができる。1本鎖抗体は、Fv領域の重
鎖及び軽鎖断片をアミノ酸架橋を介して結合させ、1本鎖ポリペプチドを生じさ
せることによって形成される。特定の実施形態では、1本鎖抗体は、図3A及び3B
に示されるアミノ酸配列（それぞれ、配列番号２及び７）を含む。
【００８２】 特定の実施形態では、配列番号１若しくは配列番号６の全部又は一部を含む、
CD40のポリペプチド、ペプチド若しくは他の誘導体、又はそれらの類似体に対す
る抗体は、二重特異的抗体（一般的には、例えば、Fanger及びDrakeman、1995,
Drug News and Perspectives 8: 133-137を参照されたい）である。このような
二重特異的抗体は、(1)エピトープ、及び(2)細胞傷害性T細胞に特定の標的を破
壊させうるものとして同定されてきた、多様な「トリガー（trigger）」分子の
１つ（例えば、骨髄細胞上のFcレセプター、並びにT細胞上のCD3及びCD2）の両
者を認識するように遺伝子操作されている。このような二重特異的抗体は、当業
者に公知の化学結合技術、ハイブリドーマ技術、又は組換え分子生物学的技術の
いずれかによって製造できる。特定の実施形態では、二重特異的抗体は、S2C6重
鎖又は軽鎖可変ドメイン又はそのCDR配列を含む分子を含有し、その分子は、抗
体の重鎖又は軽鎖の構造を有しているが本来のS2C6重鎖又は軽鎖とは（例えば、
フレームワーク領域又はヒト定常ドメインにおいてアミノ酸置換を有する点で）
異なっている。
【００８３】 CD40を認識する能力を保持している抗体断片は、公知の方法によって生産でき
る。例えば、そのような断片としては、以下に限定されないが、抗体分子をペプ
シン消化することによって製造できるF(ab')2断片及びF(ab')2断片のジスルフィ
ド架橋を還元することによって生産できるF(ab')断片が挙げられる。あるいは、
所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速且つ容易な同定を可能にす
る、Fab発現ライブラリーを構築することができる（Huseら、1989, Science 246
, 1275-1281）。
【００８４】5.7 S2C6タンパク質、誘導体及び類似体 上記第5.6節に記載した抗体分子／変異体に加えて、本発明はさらに、S2C6タ
ンパク質、（断片類に限定されないが、断片を含む）誘導体、類似体、及びS2C6
タンパク質の分子に関する。S2C6タンパク質誘導体及びタンパク質類似体をコー
ドする核酸も提供される。ある実施形態では、S2C6タンパク質は、上記第5.1節
に記載の核酸によってコードされる。特定の態様では、タンパク質、誘導体、又
は類似体は、配列番号１又は配列番号６の配列によってコードされる。
【００８５】 S2C6タンパク質に関係する誘導体及び類似体の製造及び使用は、本発明の範囲
内である。特定の実施形態では、誘導体又は類似体は、機能的に活性、すなわち
、全長のS2C6タンパク質と関連する１以上の機能的活性を示すことができる。１
つの例として、所望の結合特異性を有する該誘導体又は類似体は、イムノアッセ
イ、又は腫瘍増殖の阻害のためなどに治療的に用いることができる。特定の実施
形態は、CD40と結合し、CD40LのCD40への結合を強化するS2C6タンパク質断片に
関する。以下に限定されないが、ラジオイムノアッセイ、酵素結合抗体免疫吸着
アッセイ（ELISA）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、ウエスタンブロット、
免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイ、免疫電気泳動アッセイ等の技術を用
いた競合アッセイ系及び非競合アッセイ系を含む、当業界で公知の種々のイムノ
アッセイによってS2C6タンパク質の誘導体又は類似体の所望の活性を試験するこ
とができる。
【００８６】 さらに、当業界で公知のアッセイを用いて、in vivo又はin vitroでの、細胞
増殖を阻害する能力（例えば、腫瘍細胞増殖の阻害）又は細胞増殖を刺激する能
力（例えば、B細胞の増殖）を検出又は測定することができる。
【００８７】 特に、S2C6誘導体は、機能的に同等な分子を提供する置換、付加（例えば、挿
入）又は欠失によってS2C6配列を改変することによって製造できる。配列をコー
ドするヌクレオチドの縮合のため、S2C6遺伝子と実質的に同一のアミノ酸配列を
コードする他のDNA配列を、本発明を実施するために用いることができる。これ
らとしては、以下に限定されないが、その配列内において機能的に同等なアミノ
酸残基をコードし、それ故サイレントな変化を生じる異なるコドンでの置換によ
って改変されているS2C6遺伝子の全部又は一部を含むヌクレオチド配列が挙げら
れる。同様に、本発明のS2C6誘導体は、以下に限定されないが、一次アミノ酸配
列として、機能的に同等のアミノ酸残基が、その配列内の残基と置換されており
、サイレントな変化を生じる、改変された配列を含むS2C6タンパク質のアミノ酸
配列の全部又は一部を含有するものが挙げられる。例えば、配列内の１以上のア
ミノ酸残基を、機能的同等物として挙動し、サイレントな改変をもたらす、類似
の極性を有する別のアミノ酸によって置換することができる。配列内のアミノ酸
の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択されてもよい。
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、
バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ
る。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロ
シン、アスパラギン、及びグルタミンが含まれる。正電荷を持つ（塩基性）アミ
ノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負電荷を持つ（酸性
）アミノ酸には、アスパラギン酸、及びグルタミン酸が含まれる。このような置
換は、一般に保存的置換であると理解されている。
【００８８】 本発明の特定の実施形態では、S2C6タンパク質の10個以上の（連続した）アミ
ノ酸からなるS2C6タンパク質の断片からなるか又はこれを含むタンパク質が提供
される。他の実施形態では、断片は、S2C6タンパク質の20個以上又は50個以上の
アミノ酸からなる。特定の実施形態では、該断片は、50、75、100、又は200個以
下のアミノ酸である。S2C6タンパク質の誘導体又は類似体としては、以下に限定
されないが、S2C6タンパク質又はその断片と実質的に相同な（例えば、種々の実
施形態において、挿入又は欠失の無い同一サイズのアミノ酸配列と、又はそのア
ライメントが当業界で公知のコンピューターホモロジープログラムによって為さ
れるアラインされた配列と比較したときに、60％又は70％又は80％又は90％又は
95％以上同一である）領域又はそれをコードしている核酸が、高ストリンジェン
シー、中程度のストリンジェンシー、又は低ストリンジェンシー条件下で、S2C6
コード遺伝子配列とハイブリダイズできる領域を含む分子が挙げられる。
【００８９】 具体的には、例えば、相同性を決定するコンピュータープログラムとしては、
以下に限定されないが、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TEASTA、及びCLUSTALW（Pear
son及びLipman、1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(8):2444-8；Altschulら
、1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10；Thompsonら、1994, Nucleic Acids Res
. 22(22):4673-80；Higginsら、1996, Methods Enzymol. 266:383-402；Altschu
lら、1990, J. Mol. Biol. 215(3):403-10）を挙げることができる。こららのコ
ンピュータープログラムの各々に対する初期設定（default）パラメーターは、
周知であり、利用することができる。
【００９０】 具体的には、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)（www.ncbi.nlm.ni
h.gov）（Altschulら、1990, J. of Molec. Biol., 215:403-410、「BLASTアル
ゴリズム（The BLAST Algorithm）」；Altschulら、1997, Nuc. Acids Res. 25:
3389-3402）は、Karlin及びAltschul、1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:
2264-68；1993, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-77の統計的方法を用いた
有意性に起因する配列類似性検索用の帰納的検索アルゴリズムである。５種類の
特定のBLASTPプログラムが、次のタスクを実行する：１）BLASTPプログラムはア
ミノ酸のクエリー配列をタンパク質配列データベースと比較する；２）BLASTNプ
ログラムはヌクレオチドのクエリー配列をヌクレオチド配列データベースと比較
する；３）BLASTXプログラムはヌクレオチドのクエリー配列（両方の鎖）の６フ
レームの概念上の翻訳生成物（6-frame conceptual translation products）を
タンパク質配列データベースと比較する；４）TBLASTNプログラムはタンパク質
のクエリー配列を６つ全てのリーディングフレーム（両方の鎖）で翻訳されたヌ
クレオチド配列データベースと比較する；５）TBLASTXプログラムはヌクレオチ
ドのクエリー配列の６フレーム翻訳物（translations）をヌクレオチド配列デー
タベースの６フレーム翻訳物と比較する。
【００９１】 Smith-Waterman（データベース：Europeean Bioinformatics Institute www.e
bi.ac.uk/bic_sw/）（Smith-Waterman、1981, J. of Molec. Biol., 147:195-19
7）は、配列アライメントのための数学的に厳密なアルゴリズムである。
【００９２】 FASTA（Pearsonら、1988, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 85:2444-2448を参照
されたい）は、Smith-Watermanアルゴリズムに対する帰納的近似である。BLAST
アルゴリズム、Smith-Watermanアルゴリズム及びFASTAアルゴリズムの手順及び
利点についての一般的考察については、Nicholasら、1998,「配列検索データベ
ース及び配列計数方法に関する手引き（A Tutorial on Searching Sequence Dat
abases and Sequence Scoring Methods）」（www.psc.edu）及びその中で引用さ
れている文献を参照されたい。
【００９３】 本発明のS2C6誘導体及び類似体は、当業界で公知の種々の方法によって製造で
きる。それらを製造させる操作は、遺伝子レベル又はタンパク質レベルで起きう
る。例えば、クローン化S2C6遺伝子配列は、当業界で公知の多数のストラテジー
のいずれかによって改変されうる（Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A L
aboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York）。配列を制限エンドヌクレアーゼ（類）によって適当な
部位で開裂し、次いで、必要であれば、さらに酵素的に改変し、in vitroで連結
することができる。S2C6タンパク質の誘導体又は類似体をコードする改変された
遺伝子の製造においては、改変された遺伝子が、所望のS2C6タンパク質活性がコ
ードされている遺伝子領域が翻訳停止シグナルによって中断されていない、本来
のタンパク質と同一の翻訳リーディングフレーム内に確実に残存していることに
留意すべきである。
【００９４】 さらに、S2C6核酸配列は、in vitro又はin vivoで突然変異されて、翻訳、開
始、及び／又は停止配列を生成及び／又は破壊するか、又はコード領域中に変異
を生成し及び／又は新たな制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するか若しくは前
から存在する制限エンドヌクレアーゼ部位を破壊して、in vitroでの改変をさら
に容易にすることができる。以下に限定されないが、化学的突然変異誘発、in v
itro部位特異的突然変異誘発（Hutchinsonら、1978, J. Biol. Chem. 253:6551
）、突然変異を含むプライマーを用いたPCRなどを含む、当業界で公知の突然変
異誘発のためのいずれかの技術を用いることができる。
【００９５】 また、S2C6タンパク質配列の操作は、タンパク質レベルで行ってもよい。本発
明の範囲内に包含されるのは、S2C6タンパク質断片類又は例えば、グリコシル化
、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の基の保護／ブロッキングによる誘導
体化、タンパク質分解性開裂、抗体分子若しくは他の細胞性リガンドへの連結な
どによる、翻訳の間又は後で差別的に改変される他の誘導体若しくは類似体であ
る。多数の化学的改変のいずれかは、以下に限定されないが、臭化シアン、トリ
プシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4、アセチル化、ホ
ルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン存在下での代謝合成等を含む、公知の方
法によって行うことができる。
【００９６】 さらに、S2C6タンパク質の類似体及び誘導体は、化学的に合成することができ
る。例えば、所望のドメインを含んでいるか、又はin vitroでの所望の活性を仲
介するS2C6タンパク質の一部分に対応するペプチドは、ペプチド合成機を用いて
合成できる。さらに、所望ならば、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体
を、置換又は付加として、S2C6配列中に導入することができる。非古典的アミノ
酸としては、以下に限定されないが、共通のアミノ酸類のD−異性体、α−アミ
ノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、アミノ酪酸、２−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、
ε−アミノヘキサン酸、６−アミノヘキサン酸、アミノイソ酪酸、２−アミノイ
ソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒ
ドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシ
ン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−ア
ラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Cα−メチルアミノ酸、Nα−
メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体が挙げ
られる。さらに、該アミノ酸はD（右旋性）又はL（左旋性）でありうる。
【００９７】 他の特定の実施形態では、S2C6タンパク質、断片、類似体、又は誘導体は、融
合物（fusion）、又は（ペプチド結合を介して異なるタンパク質である異種タン
パク質配列に連結されたタンパク質、断片、類似体、又は誘導体を含む）キメラ
タンパク質生成物として発現されうる。異種タンパク質配列は、以下に限定され
ないが、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２
、インターロイキン−４、インターロイキン−６，及び腫瘍壊死因子を含む、生
物学的応答調節剤、又はその機能的に活性な部分を含むことができる。あるいは
、異種タンパク質配列は、β−ラクタマーゼ又はカルボキシルエステラーゼなど
の酵素若しくはブリオジン１、シュードモナス・エキソトキシンＡもしくはゲロ
ニンなどの毒素類、又はそれらの機能的に活性な部分を含むことができる。さら
に、S2C6タンパク質は、以下に限定されないが、アルキル化剤（例えば、ナイト
ロジェンマスタード、ニトロソウレア、トリアゼン（triazenes））；代謝拮抗
物質（例えば、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体）；天然物（例え
ば、抗生物質、酵素、生体応答調節剤）；その他の物質（例えば、置換尿素、白
金配位錯体）；並びにホルモン及びアンタゴニスト（例えば、エストロゲン、ア
ンドロゲン、抗アンドロゲン、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体）；又はそれ
らの機能的に活性な部分を含む、化学療法剤に化学的に結合させることができる
（例えば、Goodman及びGilman、治療法の薬理学的基礎（The Pharmacological B
asis of Therapeutics）、第９版、McGraw-Hill, pp. 1225-1287, 1996を参照さ
れたい）。該キメラ生成物は、所望のアミノ酸配列をコードする適当な核酸配列
を、当業界で公知の方法によって、適切なコードフレーム中で互いに連結し、当
業界で一般的に知られている方法によってキメラ生成物を発現することによって
製造できる。あるいは、該キメラ生成物は、例えば、ペプチド合成機を用いるタ
ンパク質合成法によって製造してもよい。別の実施形態では、異種タンパク質配
列は、ペプチド結合以外の、例えば、当業界で周知の化学的架橋試薬を用いて、
S2C6関連配列に共有結合されうる。
【００９８】 特定の実施形態では、S2C6誘導体は、ペプチド結合を介してそのアミノ末端又
はカルボキシ末端で別のタンパク質のアミノ酸配列と結合されているS2C6タンパ
ク質又はその断片を含む（好ましくは、少なくともS2C6タンパク質のドメイン若
しくはモチーフ、又はS2C6タンパク質の10、50若しくは100個以上のアミノ酸か
らなる）キメラタンパク質又は融合タンパク質である。特定の実施形態では、別
のタンパク質は、毒素、酵素又は生体応答調節物質である。
【００９９】 特定の実施形態では、別のタンパク質のアミノ酸配列は、別のタンパク質の6
、10、20若しくは30個以上の連続したアミノ酸又は別のアミノ酸の機能的に活性
な部分である。ある実施形態では、該キメラタンパク質は、フレーム内で別のタ
ンパク質のコード配列に結合されたS2C6コード配列を含むタンパク質をコードす
る核酸の組換え発現によって製造される。該キメラ生成物は、所望のアミノ酸配
列をコードする適当な核酸配列を、当業界で公知の方法によって、適切なコード
フレーム中で互いに連結し、当業界で一般的に知られている方法によってキメラ
生成物を発現することによって製造できる。あるいは、該キメラ生成物は、タン
パク質合成法、例えば、ペプチド合成機を用いて製造してもよい。任意の異種タ
ンパク質コード配列に融合されたS2C6遺伝子の部分を含むキメラ遺伝子を構築し
てもよい。特定の実施形態は、6又は15又は50個以上のアミノ酸からなるS2C6タ
ンパク質の断片、又はS2C6タンパク質の１以上の機能的活性を示す（例えば、1
個以上のCDRのコピーを含む）断片を含むキメラタンパク質に関する。
【０１００】 特定の実施形態では、S2C6タンパク質又はその誘導体は、以下に限定されない
が、ドキソルビシン、パクリタキセル又はドセタキセル（docetaxel）を含む化
学療法薬に化学的に結合されている。該S2C6−薬物結合体は、CD40を発現してい
る細胞に薬物を送達することができる。１以上の薬物分子を、S2C6タンパク質又
は誘導体に結合させることができる。結合としては、以下に限定されないが、ヒ
ドラゾン結合、ペプチド結合又は炭化水素結合が挙げられる。
【０１０１】 別の特定の実施形態では、誘導体は、S2C6タンパク質との相同性を有する領域
を含む分子である。種々の実施形態において、一例として、（如何なる挿入も欠
失もない）第１の領域に含まれるのと同数のアミノ酸からなる第２の領域中の任
意の配列と比較した場合、又は当業界で公知のコンピューターホモロジープログ
ラムによってアラインされた第２の領域のアラインされた配列と比較した場合に
、第１のタンパク質領域のアミノ酸配列が30％、40％、50％、60％、70％、75％
、80％、90％、又は95％以上同一であるとき、第１のタンパク質領域は第２のタ
ンパク質領域と「相同である」と考えることができる。
【０１０２】5.8 ハイブリダイゼーション条件 特定の実施形態では、低ストリンジェンシー条件下で、（例えば、配列番号１
又は６に示す配列を有する）S2C6核酸、若しくはその逆相補体、又はS2C6誘導体
をコードする核酸、若しくはその逆方向の相補物にハイブリダイズしうる核酸が
提供される。一例であって限定ではないが、そのような低ストリンジェンシー条
件を用いる方法は、以下のとおりである（Shilo及びWeinberg、1981, Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A. 78, 6789-6792も参照されたい）。DNAを含有するフィル
タを、35％ホルムアミド、5X SSC、50 mMトリス−塩酸（pH 7.5）、5 mM EDTA、
0.1％ PVP、0.1％ Ficoll、１％ BSA、及び500μg/ml変性サケ精子DNAを含有す
る溶液中、40℃で６時間前処理する。以下のように改変された上記溶液中でハイ
ブリダイゼーションを行う：0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.2％ BSA、100μg/m
lサケ精子DNA、10％（重量／容量）硫酸デキストラン、及び5-20 X 106 cpm 32P
−標識プローブを用いる。フィルタを、ハイブリダイゼーション混合物中、40℃
で18-20時間インキュベートし、次いで、2X SSC、25 mMトリス−塩酸（pH 7.4）
、5 mM EDTA、及び0.1％ SDSを含む溶液中、55℃で1.5時間洗浄する。洗浄液を
新たな溶液に取り替え、60℃で1.5時間さらにインキュベートする。フィルタを
ブロッティングして乾燥させ、オートラジオグラフィーを感光させる。必要なら
ば、65-68℃で３回目のフィルタの洗浄を行い、フィルムに再露光させる。用い
ることができる、（例えば、異種間ハイブリダイゼーションに用いるような）低
ストリンジェンシーの他の条件は、当業界で周知である。
【０１０３】 特定の実施形態では、高ストリンジェンシー条件下で、（例えば、配列番号１
又は６で示される配列を有する）S2C6核酸、若しくはその逆相補鎖、又はS2C6誘
導体をコードする核酸、若しくはその逆相補鎖にハイブリダイズしうる核酸が提
供される。一例であって限定ではないが、そのような高ストリンジェンシー条件
を用いる方法は以下のとおりである。6X SSC、50 mMトリス−塩酸（pH 7.5）、
１mM EDTA、0.02％ PVP、0.02％ Ficoll、0.02％ BSA、及び500μg/ml変性サケ
精子DNAからなるバッファー中、65℃で８時間〜一晩、DNAを含有するフィルタの
プレハイブリダイゼーションを行う。100μg/ml変性サケ精子DNA及び5-20 X 106 cpmの32P−標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、65
℃で48時間、フィルタをハイブリダイズさせる。2X SSC、0.01％ PVP、0.01％ F
icoll、及び0.01％ BSAを含有する溶液中、37℃で１時間、フィルタの洗浄を行
う。次いで、オートラジオグラフィーの前に、0.1X SSC中、50℃で45分間洗浄す
る。用いることができる、高ストリンジェンシーの他の条件は、当業界で周知で
ある。
【０１０４】 特定の実施形態では、中程度のストリンジェンシー条件下で、（例えば、配列
番号１又は６で示される配列を有する）S2C6核酸、若しくはその逆相補鎖、又は
S2C6誘導体をコードする核酸、若しくはその逆相補鎖にハイブリダイズしうる核
酸が提供される。このようなストリンジェンシーについての適当な条件の選択は
、当業界で周知である（例えば、Sambrookら、1989, Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring
Harbor, New Yorkを参照されたい；また、Ausubelら編集、実験室技術マニュア
ルシリーズの分子生物学の最新プロトコール中の、「1987-1997年最新プロトコ
ール」、（著作権）1994-1997、John Wiley and Sons, Inc.も参照されたい）。
【０１０５】5.9 治療用途 本発明は治療化合物(本明細書では「治療薬」と呼ぶ)の投与による種々の疾病
または疾患の治療または予防を提供する。かかる治療薬としては、限定されるも
のではないが、S2C6抗体およびその誘導体(例えば本明細書で上記されたもの)、
ならびにかかるS2C6抗体および誘導体(例えば本明細書で上記されたもの)をコー
ドする核酸が挙げられる。本明細書において「治療薬」とは、限定されるもので
はないが、1以上の症状の緩和、進行の緩解、遅延または停止などを含む、疾病
または疾患に対する臨床上望ましいまたは有益な作用を含むものと考えるべきで
ある。
【０１０６】 本発明の特定の実施形態において、治療薬は悪性腫瘍(限定するものではない
が癌腫および血液性悪性腫瘍を含む)、炎症性疾患、および免疫系疾患の治療ま
たは予防のために単独で投与しても、あるいはCD40Lと組み合わせて投与しても
よい。該治療薬およびCD40Lは、必ずしも必要ではないが同一製剤に含めてもよ
く、すなわち治療薬およびCD40の投与は個別にではあるが同時に、または同じ治
療過程において投与してもよい。特定の実施形態では、悪性腫瘍細胞はCD40を発
現する。あるいは、悪性腫瘍と関連する血管系の内皮細胞はCD40を発現するはず
であるので、悪性腫瘍細胞は必ずしもCD40を発現する必要はなく、本発明の治療
薬はCD40を発現しない腫瘍に対しても治療効果を提供するはずである。好ましい
実施形態では、治療薬はCD40LとCD40との結合を少なくとも45%、50%、60%または
65%増加する。
【０１０７】 特定の実施形態では、該治療薬は後天性免疫不全症候群患者、悪性腫瘍患者ま
たは小児もしくは高齢者などの免疫が抑制された患者の免疫応答を増強するのに
用いられる。
【０１０８】 本発明のその他の実施形態では、該治療薬はそれが結合する細胞が死滅するよ
うに化学修飾されていてもよい。かかる細胞としては、限定されるものではない
が、多発性骨髄腫細胞、リンパ腫細胞または癌腫が挙げられる。すべてのB細胞
はCD40を発現するので、このアプローチは免疫応答の抑制をもたらす。例えば、
S2C6配列と連結された細胞傷害薬(例えば融合タンパク質)は、移植患者において
組織適合性の障壁を越えるためにin vivoにおいて免疫抑制をもたらすのに用い
てもよく、あるいはこれらの改変リガンドは自己免疫疾患を制御するのに用いて
もよい。
【０１０９】 その他の実施形態では、該治療薬は悪性腫瘍を直接治療する手段として、ある
いは化学療法の補助剤として、B細胞でないCD40担持細胞、例えば肺癌腫細胞の
増殖および／または分化を促進するために使用できる。
【０１１０】 本発明の治療薬を用いて治療または予防され得る悪性腫瘍としては、限定され
るものではないが表1のものが挙げられる。
【０１１１】
【表１】悪性腫瘍および関連疾患 白血病 急性白血病 急性リンパ性白血病 急性骨髄性白血病 骨髄芽球性 前骨髄球性 骨髄単球性 単球性 赤白血病 慢性白血病 慢性骨髄性(顆粒球性)白血病 慢性リンパ性白血病 赤血球増加症 リンパ腫 ホジキン病 非ホジキン病 多発性骨髄腫 ワルデンシュトレームマクログロブリン血症 Ｈ鎖病 固形癌 肉腫および癌腫 繊維肉腫 粘液肉腫 脂肪肉腫 軟骨肉腫 骨原性肉腫 骨肉腫 脊索腫 血管肉腫 内皮肉腫 リンパ管肉腫 リンパ管内皮肉腫 滑膜肉腫 中皮腫 ユーイング腫 平滑筋肉腫 横紋筋肉腫 大腸癌 結腸直腸癌 膵臓癌 乳癌 卵巣癌 前立腺癌 扁平上皮細胞癌 基底細胞癌 腺癌 汗腺癌 皮脂腺癌 乳頭状癌 乳頭状腺癌 嚢胞腺癌 髄様癌 気管支原性癌 腎細胞癌 肝癌 胆管癌 絨毛上皮癌 精上皮癌 胎生期癌 ビルムス腫 子宮頚癌 子宮癌 精巣癌 肺癌 小細胞肺癌 非小細胞肺癌 膀胱癌 上皮細胞癌 神経膠腫 星状細胞腫 骨芽細胞腫 頭蓋咽頭腫 上衣細胞腫 松果体腫 血管芽腫 聴神経腫 乏突起神経膠腫 髄膜腫 黒色腫 神経芽腫 網膜芽腫 鼻咽頭癌 食道癌
【０１１２】 本発明の治療薬を用いて治療または予防され得る炎症性疾患および免疫不全ま
たは免疫疾患としては、限定するものではないが表2のものが挙げられる。
【０１１３】
【表２】炎症性疾患および免疫不全 全身性紅斑性狼瘡(SLE) 硬皮症(例えば、CRST症候群) 炎症性筋炎 シェーグレン症候群(SS) 複合膠原病(例えば、MCTD、シャープ症候群) 慢性関節リウマチ 多発性硬化症 炎症性庁疾患(例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病) 急性呼吸困難症候群 肺炎症 骨粗鬆症 遅延型過敏症 喘息 原発性胆汁性肝硬変(PBC) 特発性血小板減少性紫斑病(ITP)
【０１１４】5.9.1 有効用量 かかる治療薬の毒性および治療効力は、例えばLD50(その集団の50%に致死的な
用量)およびED50(その手段の50%に治療上有効な用量)を決定するための細胞培養
および試験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒
性作用と治療作用の間の用量比は治療指数といい、LD50/ED50比として表すこと
ができる。大きな治療指数を示す治療薬が好ましい。有毒な副作用を示す治療薬
を使用してもよいが、非罹患細胞に対する損傷の可能性を最小限にするにはかか
る化合物を罹患組織部位にターゲッティングすることで副作用を軽減する送達系
を設計するように注意を払わなければならない。
【０１１５】 細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータはヒトに向けた一定の範
囲の用量を処方する際に使用できる。用量例としては、限定されるものではない
が、1ng/kgないし100mg/kgが挙げられる。かかる治療薬の用量ははほとんど、ま
たは全く毒性のないED50を含む一定範囲の循環濃度内にあることが好ましい。用
量は用いられる投与形および用いられる投与経路にもよるが、この範囲内で様々
であってよい。治療薬としては、治療上有効な量は好ましくはまず細胞培養アッ
セイから評価できる。細胞培養で求められたIC50(すなわち、症状の最大半分阻
害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するには動物モ
ルのおいて用量を処方すればよい。このような情報を用いてヒトで有効な用量を
より正確に求めることができる。血漿レベルは例えば高性能液位クロマトグラフ
ィーによって測定できる。
【０１１６】5.9.2 製剤 本発明に従って用いられる医薬組成物は、医薬上許容される1以上の担体また
は賦形剤を用い常法にて処方できる。
【０１１７】 従って、該治療薬およびそれらの医薬上許容される塩および溶媒和物は吸入も
しくは通気(経口もしくは経鼻)、または経口、口内、非経口もしくは直腸投与に
よって投与するために処方してもよい。
【０１１８】 経口投与については、医薬組成物は例えば結合剤(例えば、アルファー化トウ
モロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス)；増量剤(例えば、ラクトース、マイクロクリスタリンセルロースまたはリン
酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたは
シリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸ナトリウムデ
ンプン)；または湿潤剤(ラウリル硫酸ナトリウム)などの医薬上許容される賦形
剤を用いて常法により製造された錠剤またはカプセル剤の形態をとってもよい。
錠剤は当技術分野で十分公知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与
用液体製剤は例えば溶液、シロップまたは懸濁剤の形態をとってもよく、あるい
はそれらは使用前に水またはその他の好適なビヒクルで構成する乾燥製品として
提供してもよい。かかる液体製剤は沈殿防止剤(例えば、ソルビトールシロップ
、セルロール誘導体または硬化食用油)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアラビ
アガム)；非水性ビヒクル(例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコ
ールまたは精留食用油)；および保存剤(例えば、メチルまたはプロピル-p-ヒド
ロキシベンゾエートまたはソルビン酸)などの製薬上許容される添加剤を用いて
常法により製造すればよい。これらの製剤はまた、要すれば緩衝塩、香味剤、着
色剤および甘味剤を含んでもよい。
【０１１９】 経口投与用製剤は有効化合物の徐放性を得るために適宜処方してもよい。
【０１２０】 口内投与については、これらの組成物は常法で処方された錠剤またはトローチ
剤をとってもよい。
【０１２１】 吸入による投与では、本発明に従って用いられる治療薬は便宜には、好適な噴
射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロ
テトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の好適なガスを用い、予圧パッ
クまたはネブライザーからエアゾルスプレーを提供する形態で送達される。予圧
エアゾールの場合、単位用量は計量量を送達するバルブを設けることで定めても
よい。ゼラチンなど吸入または通気で用いられる例えばゼラチンのカプセルおよ
びカートリッジは化合物と、ラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基剤の
粉末混合物を含むように処方すればよい。
【０１２２】 該治療薬は注射、例えばボーラス注射または点滴による非経口投与用に処方し
てもよい。注射用製剤は単位投与形、例えばアンプルまたは複用量容器で投与し
てもよく、保存剤を添加しても添加しなくともよい。これらの組成物は油性また
は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションなどの形態をとってもよく
、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤を含んでもよい。ある
いは有効成分は使用前に好適なビヒクル、例えばパイロジェンフリー滅菌水で構
成する粉末の形態であってもよい。
【０１２３】 該治療薬はまた、カカオ脂またはその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を
含む坐剤または滞留浣腸などの直腸組成物として処方してもよい。
【０１２４】 これまでに記載した製剤の他、該治療薬はまたデポー製剤として処方してもよ
い。かかる長時間作用製剤は移植(例えば、皮下もしくは筋肉内)または筋肉注射
によって投与してもよい。このように例えば該治療薬は好適なポリマー物質また
は疎水性物質(例えば、許容される油中のエマルションとして)、イオン交換樹脂
を用いて処方してもよいし、あるいは難溶性誘導体、例えば難溶性塩として処方
してもよい。
【０１２５】 これらの組成物は要すれば有効成分を含有する1以上の単位投与形を含み得る
パックまたはディスペンサーデバイスで提供してもよい。このパックは例えばブ
リスターパックのような金属またはプラスチックホイルからなってもよい。かか
るパックまたはディスペンサーデバイスは好ましくはヒトに向けた投与のための
投与に関する説明書を添付するものであってもよい。
【０１２６】 特定の実施形態では、本発明は治療上有効量の治療薬をCD40リガンドと組み合
わせて含んでなる医薬組成物を提供する。
【０１２７】 以下の実施例において本発明をさらに説明するが、本発明の範囲を何ら限定す
るものではない。
【０１２８】6. 実施例： S2C6可変領域のクローニング 6.1 材料および方法 実質的にGillilandら, 1996, Tissue Antigens 47:1-20に記載の方法を用いて
S2C6軽鎖および重鎖可変領域をクローニングした。S2C6ハイブリドーマから全RN
Aを単離した。逆転写酵素およびJC接合部の約100塩基対下流でアニーリングした
アンチセンスプライマーを用い、マウスκ軽鎖および重鎖可変領域に対して第１
鎖相補DNA(cDNA)を作製した。ターミナルトランスフェラーゼを用いてポリG尾部
をcDNA鎖へ付加した後、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いて二本鎖DNAを合成し
た。ポリG尾部に特異的なPCRプライマー、または軽鎖または重鎖に対するcDNAの
約50塩基内側の配列が独自の制限部位を含むように設計した。増幅後、PCR産物
をEcoRIおよびHindIIIで消化し、同じ制限酵素で消化したpUC19にクローニング
した。これらの反応物を連結し、大腸菌DH5αにトランスフェクトし、得られた
クローンを制限解析によりスクリーニングした。制限消化解析で陽性であったク
ローンをLi-Corフルオレッセンス・シーケンサーによりDNA配列を決定した。軽
鎖可変領域(VL)のヌクレオチド配列(配列番号1)およびアミノ酸配列(配列番号2)
は図1に示されている。重鎖可変領域(VH)のヌクレオチド配列(配列番号6)および
アミノ酸配列(配列番号7)は図2に示されている。図3A-3BはS2C6 VLおよびS2C6 V H のアミノ酸配列を示している(それぞれ3Aおよび3B)。CDRには下線が施されてい
る。VL CDR1〜3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号3〜5に対応している。VH CDR
1〜3のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号8〜10に対応している。
【０１２９】 次ぎに得られたDNA配列を同じアイソタイプのその他のネズミ抗体の軽鎖およ
び重鎖可変領域と比較し、S2C6から単離された遺伝子のリーディングフレームお
よび対応するアミノ酸配列を求めた。アミノ酸配列を確認するには、S2C6 mAbの
軽鎖および重鎖可変領域をN末端アミノ酸解析にかけた。
【０１３０】 NRデータベース(すべて重複のないGenBank CDR翻訳+PDB+SwissProt+PIR+PRF)
およびKabatデータベース(Kabatの免疫学上対象となる配列のデータベース)の双
方を用いる、1999年4月21日のBLAST検索のために、S2C6 VL、S2C6 VHならびにVL およびVH双方のCDRのアミノ酸配列を提出した。NRデータベースを用いて見出さ
れた配列はhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.で受託番号を用いて検索できる。Kaba
tデータベースを用いて見出された配列はおよびSEQHUNT IIで受託番号を用いて
検索できる。これらの検索の結果は以下に示されている。
【０１３１】NRデータベースを用いたBLASTP検索 S2C6 VL(配列番号2)： S2C6 VLをクエリーとするNRデータベースのBLASTP検
索では100%同一なものはヒットせず、94%(106/112)同一なものは6件ヒットした
。これら6つを以下に示す。 pir||PT0359 IgG κ鎖V領域(R4A.12)-マウス(フラグメント) gi|196660 (M59949)免疫グロブリンκ鎖VJ領域[Mus筋] gi|196954 (M12183)κ鎖V領域[Mus筋]>gi|2247[Mus筋] pir||B34904 Igκ鎖前駆体V領域(12-40および5-14)… emb|CAA80076| (Z22102)免疫グロブリン可変領域[Mus筋] abj|BAA22172| (AB006833)抗シュードウリジンモノクローナル抗体…
【０１３２】 VL CDR1(配列番号3)： VL CDR1をクエリーとするBLASTP検索では100%同一な
ものはヒットせず、93%(15/16)同一なものは多数ヒットした。これらのうち最初
の5つを以下に示す。 abj|BAA03480| (D14627)免疫グロブリンγ-3κ鎖[Mus筋] abj|BAA22172| (AB006833) 抗シュードウリジンモノクローナル抗体… gi|4101647 (AF005352)免疫グロブリンV領域軽鎖[Mus筋] gi|3377681 (AF07800)一本鎖抗HIV-1 Rev可変フラグメント… gi|1870366 (U55625)抗DNA免疫グロブリン軽鎖IgM[Mus筋]
【０１３３】 VL CDR2(配列番号4)： VL CDR2をクエリーとするNRデータベースのBLASTP検
索ではヒットしなかった。
【０１３４】 VL CDR3(配列番号5)： VL CDR3をクエリーとするBLASTP検索ではヒットしな
かった。
【０１３５】 S2C6 VH(配列番号7)： S2C6 VHをクエリーとするNRデータベースのBLASTP検
索では100%同一なものはヒットせず、88%同一なものは多数ヒットした。これら
のうち最初の5つを以下に示す。 gi|3561044 (AF083186)抗HIV-1 p24抗体D2重鎖[Mus筋] pdb|1A6T|B B鎖、Mabl-Iaモノクローナル抗体のFabフラグメント gi|2895955 (AF045895) IgG1重鎖mABl-IA[Mus筋] emb|CAA80023| (Z22049)免疫グロブリン可変領域[Mus筋] gi|194510 (M91695)免疫グロブリンγ-1鎖[Mus筋]
【０１３６】 VH CDR1(配列番号8)： VH CDR1をクエリーとするNRデータベースのBLASTP検
索ではヒットしなかった。
【０１３７】 VH CDR2(配列番号9)：VH CDR2をクエリーとするNRデータベースのBLASTP検索
では100%同一なものはヒットせず、94%同一(16/17)のものは1件ヒットし、94同
一より低いものは多数ヒットした。94%同一の1件を示す。 gi|3561044 (AF083186)抗HIV-1 p24抗体D2重鎖[Mus筋]
【０１３８】 VH CDR3(配列番号10)： VH CDR3をクエリーとするNRデータベースのBLASTP検
索ではヒットしなかった。
【０１３９】Kabatデータベースを用いたBLAST検索 S2C6 VL(配列番号2)： S2C6 VLをクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索では100%同一なものはヒットせず、クエリーに対して89-91%同一のものは多
数ヒットした。最初の5件を示す。 KADBID 005591, マウスIGκ軽鎖可変領域(5-14…) KADBID 005594, マウスIGκ軽鎖可変領域(10VA…) KADBID 005593, マウスIGκ軽鎖可変領域(12-4…) KADBID 005603, マウスIGκ軽鎖可変領域(17s…) KADBID 005588, マウスIGκ軽鎖可変領域(TEPC…)
【０１４０】 VL CDR1(配列番号3)： VL CDR1をクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索では100%同一なものはヒットせず、93%同一(15/16)のものは多数ヒットした
。最初の5件を示す。 KADBID 005720, マウスIGκ軽鎖可変領域(BW24…) KADBID 005614, マウスIGκ軽鎖可変領域(PME7…) KADBID 005624, マウスIGκ軽鎖可変領域(C5-7…) KADBID 005621, マウスIGκ軽鎖可変領域(40-6…) KADBID 005640, マウスIGκ軽鎖可変領域(40-9…)
【０１４１】 VL CDR2(配列番号4)： VL CDR2をクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索ではヒットしなかった。
【０１４２】 VL CDR3(配列番号5)： VL CDR3をクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索では100%同一なものは1件ヒットした。 KADBID 005681, マウスIGκ軽鎖可変領域(NC10…)
【０１４３】 S2C6 VH(配列番号7)： S2C6 VHをクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索では100%同一なものはヒットせず、クエリーに対して79-85%同一のものは多
数ヒットした。そのヒットのうち最初の5件を以下に示す。 KADBID 001498, マウスIGκ重鎖可変領域(HDEX24) KADBID 001498, マウスIGκ重鎖可変領域(HDEX5) KADBID 001529, マウスIGκ重鎖可変領域(163.72’CL) KADBID 001500, マウスIGκ重鎖可変領域(HDEX37) KADBID 001597, マウスIGκ重鎖可変領域(BB128’CL)
【０１４４】 VH CDR1(配列番号8)： VH CDR1をクエリーとするKabatデータベースのBLASTP
検索ではヒットしなかった。
【０１４５】 VH CDR2(配列番号9： VH CDRをクエリーとするKabatデータベースのBLASTP検
索では100%同一なものはヒットせず、クエリーに対して87-88%同一のものは10件
ヒットした。最初の5件を示す。 KADBID 001535, マウスIGκ重鎖可変領域(H10’’CL) KADBID 001534, マウスIGκ重鎖可変領域(HS1’CL) KADBID 001533, マウスIGκ重鎖可変領域(H50’CL) KADBID 019741, マウスIGκ重鎖可変領域(クローンF’CL) KADBID 001529, マウスIGκ重鎖可変領域(163.72’CL)
【０１４６】 VH CDR3(配列番号10)： VH CDR3をクエリーとするKabatデータベースのBLAST
P検索ではヒットしなかった。
【０１４７】7. 実施例： S2C6の生物学的活性 7.1 材料および方法 7.1.1 抗CD40抗体の作製 S2C6ハイブリドーマは、10%ウシ胎児血清(FBS)、100ユニット/mlのペニシリン
および100mg/mlのストレプトマイシンを含む完全IMDM(Gibco BRL, Grand Island
, NY)で37℃にて培養した。培養物を遠心分離により回収し、0.2ミクロンのフィ
ルターを用いて濾過することで上清を回収した。次ぎにこの上清をGammaBind(商
標)でセファロースカラム(Pierce)に装填し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄
し、0.1MグリシンpH2.5で溶出した。溶出後直ちに抗体を1M Tris pH8.0で中和し
、PBS中で透析し、濾過滅菌した。mAb調製物をサイズ排除クロマトグラフィーに
より分析した。99%を越える単量体タンパク質サンプルだけを本明細書に記載の
試験に供した。
【０１４８】7.1.2 ヒト腫瘍異種移植モデル 6〜8週齢のNinety雌C.B.-17 SCIDマウスを入手し(Taconic Labs, Germantown,
NY)、2週間隔離した。対照マウス群にヒトB細胞腫瘍系統：Ramos(非ホジキンリ
ンパ腫)、HS Sultan(多発性骨髄腫)またはIM-9(多発性骨髄腫)細胞（1x106〜2x1
06細胞）を静注(i.v.)した。残りのマウスを2群に分け、半分に腫瘍細胞を注射
する1日前に200μlの1:10希釈抗アシアロ-GM1(Wako Chemicals, Richmond, VA)
で処理(i.v.)して宿主のナチュラルキラー細胞を除去した(Murphy et al., 1992
, Eur. J. Immunol. 22:241)。2群のマウスにRamos、HS SultanまたはIM-9細胞
（1x106〜2x106細胞）を静注した。次ぎに試験群のマウスに、以下の計画に従い
腫瘍移植後1日目または5日目から始め、第7.1.2節に記載したようにして作製し
た1mg/mlのS2C6 IgGを腹腔内(i.p.)注射し、局部麻痺その他の病徴をモニタリン
グした。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】7.1.3 末梢血B細胞の単離 末梢血B細胞はCD19およびCD20の両者に対する固定化抗体を用いて陽性選択に
より単離した。最終の単離細胞調製物はフローサイトメトリーで測定したところ
85%を越えるB細胞を含んでいた。保存の場合は、10%ジメチルスルホキシドを含
むウシ胎児血清(FBS)中に4x107細胞/mlに希釈し、液体窒素フリーザーで保存し
た。
【０１５１】7.1.4 B細胞増殖アッセイ ヒト末梢血B細胞を融解させ、これを96ウェル組織培養プレート中に1ｘ105／
ウェルで、5 ng/mlの組換えヒトIL-4（Biosource）および抗CD40 mAb：S2C6、G2
8-5（Bristol-Myers Squibb）もしくはM3（Genzyme #80-3702-04）の各種希釈物
を存在させたIMDM培地＋10％FBS中で、インキュベートした。対照として、細胞
をIL-4および無関係な対照mAbのEXA2-1H8（抗Pseudomonasエキソトキシン）とと
もにインキュベートした。プレートを37℃で3日間インキュベートし、その後0.5 mCi 3H-チミジン／ウェルで16時間パルスした。Filtermate 196 HarvesterTM（
Packard Instrument）を使用して、細胞を96ウェルガラスファイバーフィルター
上にとり、シンチレーション液と混合した。Topcount LSCTM（Packard Instrume
nt）を使用する液体シンチレーションカウントによって、形成期のDNA中に取り
込まれた3H-チミジンの量を測定した。
【０１５２】 構成性の高レベルのCD40Lを発現させるために選別したJurkat細胞系（「Jurka
t/CD40L」）をCD40L刺激体細胞として使用した（Malikら、1996,J.Immunol.156:
3952-60）。刺激体細胞の増殖を排除するために、これらをB細胞と混合する前に
、37℃で20分、PBS中のマイトマイシンC（50 mg/ml）で処理し、その後PBSで3回
洗浄した。B細胞（1ｘ105／ウェル）をJurkat/CD40L細胞と混合して、上記のよ
うにアッセイした。B細胞およびIL4を最初に直接刺激体細胞（2.5ｘ104／ウェル
）と混合し、その後抗CD40 mAbを添加した。一定の濃度の刺激体細胞によってモ
ノクローナル抗体を力価測定するか、または一定の濃度のmAbによって刺激体細
胞を力価測定した。
【０１５３】7.1.5 CD40/CD40L結合アッセイ これらのアッセイでは、標的細胞系として、Jurkat/CD40L細胞系を使用した。
各サンプルについて50μlで、2ｘ107/mlの密度になるように細胞を調整した。RP
MI 1640培地（Gibco）＋10％FBS中で結合を実施した。受容体飽和を判定するた
めに、濃度を漸増させたCD40-Ig（CD40とヒトイムノグロブリンの可溶性融合タ
ンパク質）（Noelleら、1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6550-6554）とともに
、Jurkat/CD40L細胞をインキュベートし、洗浄し、抗ヒト免疫グロブリンに結合
させたフルオレセインイソチオシアネート（「FITC-抗ヒトIg」）とともにイン
キュベートした。FacScanTMフローサイトメーター（Becton Dickinson）を使用
して、形成された結合を評価した。組換え可溶性CD40-Ig（25μg/ml）を、濃度
を漸増させたmAb S2C6とともに、氷上で１時間、プレインキュベートした。比較
のために、抗CD40 mAb G28-5；M3；およびアイソタイプ対照の１種、抗Pseudomo
nasエキソトキシンを使用した。マウスCD8との融合タンパク質として製造し、か
つFITCで標識した、組換えヒト可溶性CD40リガンド（CD154-muCD8）をResearch
Diagnostics, Inc.（Flanders, NJ）から取得した。可溶性CD40-Igおよび抗CD40
mAbを最終濃度が4倍になるように希釈し、氷上で１時間、予備インキュベート
し、その後氷上で１時間、Jurkat細胞と混合した。細胞を洗浄し、FITC-ヤギ抗
ヒトF(ab')2'（Jackson Labs, Fc-特異性 #109-096-098）で標識した。フローサ
イトメトリーによって、CD40の結合の程度を判定した。
【０１５４】7.2 結果 7.2.1 in vitro研究：mAb S2C6はCD40/CD40L相互作用を促進する 活性化されたT細胞の表面で発現したCD40Lへの可溶性CD40の結合に対する抗CD
40 mAbの影響を評価するため、濃度を漸増させた各種CD40 mAbを、25μg/ml 可
溶性CD40-Igとともに予備インキュベートし、その後この複合体をJurkat/CD40L
細胞とともにインキュベートした。選択されたCD40L+ Jurkat T細胞上のCD40Lの
発現を、FITC標識抗CD40Lでのフローサイトメトリーによって最初に確認した（
データは示していない）。次に、これらの標的細胞上のCD40LへのCD40の結合を
、FITCヤギ抗ヒトIgを使用して結合したCD40-Igを検出する、Jurkat/CD40L細胞
のフローサイトメトリーによって、判定した。CD40-Igでの力価測定から、およ
そ25μg/ml CD40-Igでの受容体の飽和が示された。飽和濃度の可溶性CD40を使用
したとき、0.25〜2：1（質量：質量）の範囲の割合でCD40と複合体化したS2C6は
、CD40Lに対するCD40の結合が用量に比例して増加する結果となった（それぞれ
約6μg/ml、13μg/ml、25μg/mlおよび50μg/mlの濃度で、約50％、100％、146
％および220％）（図４）。阻害性抗体 M3による同様の力価測定では、用量依存
様相でCD40/CD40L結合をブロックした。mAb G28-5は、25μg/mlの濃度まではCD4
0/CD40L結合に何ら影響を示さず、また試験した最大濃度（50μg/ml）でのみ、
対照 EXA2-1H8 Igに比較して、わずかに刺激性だった。
【０１５５】 これらのデータは、mAb S2C6がCD40/CD40L相互作用を促進することを明確に示
している。さらに、S2C6はCD40/CD40L相互作用を増加させる能力において、G28-
5およびM3とは異なっている。
【０１５６】 相互アッセイにおいて、B細胞の表面で発現した膜結合CD40への可溶性CD40Lの
結合に対する抗CD40 mAbの影響を評価した。可溶性CD40Lでの力価測定から、お
よそ10μg/mlでのRamos B細胞表面CD40の飽和が示された。濃度を漸増させた各
種抗CD40 mAbを、CD40を発現するB細胞とともにプレインキュベートし、その後
この細胞をFITC標識可溶性CD40Lとともにインキュベートした。次に、標的B細胞
上のCD40への標識CD40Lの結合を、Ramos細胞のフローサイトメトリーによって、
判定した。飽和濃度の可溶性CD40Lを使用したとき、CD40L発現性細胞と複合体化
したmAb S2C6が、0.04〜2μg/mlの濃度範囲で、CD40Lの結合が約51％から68％の
最大増加を示す結果となった（図５）。
【０１５７】 mAb G28-5がCD40/CD40L相互作用にほとんど影響を与えなかった可溶性CD40の
場合の上記の結果とは対照的に、試験したすべての濃度において、G28-5はCD40
に対する可溶性リガンド結合の阻害を示した。阻害性mAb M3による同様の力価測
定でも、用量依存的様式でCD40L/CD40結合をブロックした。
【０１５８】 これらのデータは、CD40L/CD40相互作用を増加させる能力において、S2C6がG2
8-5およびM3とは驚くほど異なっていることを示している。さらに、こうした条
件下では、mAb G28-5およびmAb M3の両者が、40 ng/mlの低濃度で、可溶性CD40L
のCD40との相互作用を阻害する。
【０１５９】7.2.2 in vitro研究： mAb S2C6はCD40/CD40Lに対するB細胞の応答を増加させ る 一次末梢B細胞のCD40L発現細胞に対する増殖応答を、抗CD40 mAb（S2C6、G28-
5またはM3）の存在下で測定した。最初に一定レベル（30 ng/ml）の各種mAbの存
在下または不在下で、数を漸増させた非増殖性Jurkat/CD40L細胞とB細胞を混合
した。次に、この処置に応答したB細胞の活性化を、刺激後72時間の3H-チミジン
の取込みによって測定した。mAb M3の存在下でのT細胞力価測定では、対照Igで
見られるものと同様のB細胞の増殖の結果となった（図６）。
【０１６０】 mAb G28-5はリガンドの不在下でいく分かのB細胞を活性化した（図７）が、G2
8-5の存在下でのCD40L+T細胞力価測定では、28-5のみで見られるレベルよりもご
くわずかばかりのB細胞増殖の増加（1.3倍）を示した。対照的に、S2C6の存在下
では、B細胞の増殖は、T細胞刺激体細胞の数の増加とともに用量依存的様式で増
加し、T細胞刺激体に対するB細胞の比率が4：1のとき、mAbのみの刺激よりも3倍
大きかった。
【０１６１】 これらのデータは、M3およびG28-5とは異なって、S2C6はCD40Lと驚異的に相乗
作用して、CD40を介してB細胞の増殖を促進することができることを、証明して
いる。
【０１６２】 このタイプの第２のアッセイにおいて、B細胞を抗CD40 mAbで力価測定するか
、または非増殖性CD40L+ T刺激細胞と4：1（B：T）の一定の比率で混合し、そし
て抗CD40 mAbで力価測定した（図７）。
【０１６３】 これらの結果は、これらの条件下で、10μg/mlのmAb G28-5およびリガンドで
、G28-5のみに比較して、一次ヒト末梢血B細胞の活性化が２倍増加したことを証
明している。S2C6は驚くほど顕著にさらに活性であって、リガンドの存在下では
、用量依存様相でB細胞の増殖を増加させ、10μg/ml（試験した最高レベル）でS
2C6のみに比較して、16.2倍までになった。
【０１６４】 総合すると、これらのデータは、CD40と複合体化したS2C6がCD40Lの結合を増
加させることを示している。S2C6自体もG28-5と同様の様相でB細胞の増殖を刺激
すると考えられるが、S2C6はCD40Lとの結合の能力およびそれにともなうCD40Lが
仲介する活性化シグナルの大きさにおいて、G28-5とは識別される。
【０１６５】８．実施例： モノクローナル抗体S2C6は腫瘍の増殖を阻害する 天然のmAb S2C6の抗腫瘍活性を評価するために、雌 C.B.-17 SCIDマウスを２
つのグループ（20マウス／グループ）に分けた。宿主のナチュラルキラー細胞活
性の効果を消すため、各グループのマウスの半数を抗アシアロ-GM1で処理した（
Murphyら、1992,Eur.J.Immunol.22:241）。翌日、マウスにRamos、HS Sultanま
たはIM-9細胞（1ｘ106細胞）を静脈内注入した。次に、上記第７節の材料および
方法に記載したようにして、マウスに1 mg/kgの mAb S2C6 IgGを腹腔内注入し、
部分的な麻痺または疾病開始のその他の徴候をモニターした。
【０１６６】 RamosヒトB細胞リンパ腫（図8A）、HS Sultan多発性骨髄腫（図8B）またはIM-
9多発性骨髄腫（図8C）を保有する動物のモノクローナル抗体S2C6処置は、腫瘍
の大きさおよびその後の腫瘍に関連する罹患率および死亡率の有意な減少の結果
となった。並行させた研究において、効力は抗アシアロ-GM1の存在下で維持され
、mAb S2C6の存在下での生存力の増加が非特異的NK活性によるものではないこと
が示唆された。IM-9細胞系は多発性骨髄腫と同様に、疾病の代用マーカーとして
ヒトIgを分泌する、攻撃的な腫瘍モデルの１つである。
【０１６７】 IM-9疾患があるマウスのmAb S2C6による処置は動物の生存力を有意に増加させ
た。これらの結果は、S2C6がマウス中に移植されたヒト腫瘍に対して強力な抗腫
瘍活性を持つことを明確に証明している。
【０１６８】９．実施例： 一本鎖抗CD40免疫毒素融合タンパク質はCD40-Igと結合する BS1-S2C6 sFv（一本鎖抗CD40免疫毒素、モノクローナル抗体 S2C6の各種の領
域に融合させた、ブリオジン1(BD1)(Fransiscoら、1997, J. Biol. Chem. 272(3
9):24165-24169)のアミノ酸配列で構成される融合タンパク質）を封入体として
大腸菌中で発現させ、変性させ、再生させた。
【０１６９】 簡単に述べると、TRIZOL試薬（Life Technologies）を製造元の推奨にしたが
って使用して、S2C6ハイブリドーマ細胞から総RNAを単離した。Gillilandらによ
る記載（Tissue Antigens, 47:1-20(1996)）に基本的にしたがって、J-C接合部
のおよそ100塩基下流の配列に相補的なプライマーを使用して、軽鎖および重鎖
可変領域の第１鎖cDNA合成を実施した。次にこの第１鎖にポリG尾部をつけて、
ポリG尾部に相補的なポリCアンカープライマーおよび第１鎖合成に使用したもの
の約50塩基内側に相当するプライマーを使用するPCRによって増幅した。PCR産物
の5'および3'末端に独特の制限部位を形成するように、PCRプライマーを設計し
た。軽鎖および重鎖可変領域をコードする配列を含有する２つのPCR産物をEcoRI
およびHINDIIIで消化し、同一の酵素で消化しておいたpUC19中に連結した。生成
したプラスミド、pSG5およびpSG10はそれぞれS2C6 VLおよびS2C6 VHをコードす
るDNAを含有する。この両プラスミドのDNAを配列決定し、親モノクローナル抗体
の末端アミノ酸配列と一致することを立証した。
【０１７０】 S2C6のVHおよびVL断片をGillilandらによる記載のようにVH-VL方向で「縫い合
わせ(sewn)」て（オーバーラップ伸長PCR）、１クローニングベクター中に連結
した。次に、制限消化によって、pSE151から、BD1-G28-5 sFv（Fransiscoら、19
97, J. Biol. Chem. 272(39):24165-24169）のsFv断片を除去し、その位置にS2C
6 sFvを連結した。生成したプラスミド、pSG40は誘導性T7プロモーターの制御下
にあるBD1-S2C6 sFvをコードする遺伝子を含有する。
【０１７１】 発現のために、pSG40を受容能力がある大腸菌株BL21(DE3)pLysS細胞中に形質
転換し、細胞をTブロス中、37℃で増殖させた。培養がOD600＝1.0に到達したと
き、1 mMイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)で3時間、細胞を誘
導した。次に、細胞を遠心分離によって収穫し、音波処理によって溶解させ、遠
心分離によってBD1-S2C6 sFv融合物を不溶性封入体として単離し、これを以下の
ように変性させ、そして再生させた。すなわち、封入体を7 Mグアニジン中に 5
mg/ml になるように溶解させ、0.3 M L-アルギニンおよび 2 mM DTTを含有するP
BS中への急速希釈（1：100）によって再生させ、その後の精製のために20 mMリ
ン酸ナトリウムバッファー、pH 7.4に対して透析した。
【０１７２】 ブルーセファロースを使用し、次に固定化CD40-Igに対するアフィニティーク
ロマトグラフィーによって、再生したタンパク質を単離した。
【０１７３】 次にELISAにおいて、固定化CD40-Igへの結合性について、精製したタンパク質
を試験した。マイクロタイタープレートを0.5μg/mlのCD40-Igでコーティングし
た後、25μg/mlのS2C6 mAb（▲）、25μg/mlの対照抗体 BR96（●）の存在下で
、または過剰の抗体を添加せず（■）に、1％ウシ血清アルブミンおよび0.05％
Tween-20を含むPBS（pH 7.4）中の精製BD1-S2C6 sFvの希釈物を添加した。BD1-
特異的ウサギ抗血清（Seattle Genetics, Inc., Bothell, Washington）の添加
後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギIgの添加に
よって、固定化した受容体へのBD1-S2C6 sFvの結合を検出した。
【０１７４】 CD40-IgへのBD1-S2C6 sFvの結合は、過剰のS2C6 mAbの添加によって完全に阻
害されたが、対照 mAbの添加によっては阻害されなかった（図９）。
【０１７５】10．実施例： CD40陽性悪性腫瘍の治療における組換えS2C6の投与 非ホジキン性リンパ腫、多発性骨髄腫および大腸もしくはその他の癌腫などの
CD40陽性悪性腫瘍がある患者に、（マウスCDRおよびヒトフレームワーク領域を
持つ）組換えヒト化S2C6抗CD40モノクローナル抗体またはS2C6の可変領域および
ヒト抗体の定常領域を含む組換えキメラ抗体を注入する。組換え抗体はin vitro
で調製する。治療は、付随する化学療法の存在または不在下で、疾病の経過のど
の時点でも開始することができる。
【０１７６】 治療レジメには、生理食塩水またはその他の生理学的に適合する溶液中に希釈
した薬剤の毎週の注入が含まれる。
【０１７７】 組換えS2C6について使用する用量は（患者の体表面積について）0.1 mg/m2〜1
000 mg/m2の範囲であり、好ましい用量は100〜500 mg/m2である。
【０１７８】 注入の経路は末梢IVアクセスライン(access line)または中枢IVアクセスライ
ンのいずれかによる静脈内である。薬剤を点滴で、かつIV圧入ではなく、投与す
る。
【０１７９】 組換えS2C6による治療の効果を以下の測定によってモニターする：a) 末梢血
中の総リンパ球ならびにTおよびBリンパ球の計数；b) in vitroでのTリンパ球（
ヘルパーT4リンパ球および細胞溶解性T8リンパ球）の活性；および／またはコン
ピューター断層撮影（CT）スキャン、磁気共鳴画像（MRI）スキャン、X線画像化
、骨スキャン画像化および骨髄穿刺（BMA）を含む腫瘍生検サンプリングなどの
技法を使用する腫瘍の形態学的変化。
【０１８０】 得られた結果如何によって、免疫系の適合性に対する影響が最少で、腫瘍の退
行と腫瘍細胞の完全な根絶を達成する最終的なゴールが得られる、CD40陽性悪性
腫瘍を最適に治療するための治療方式が開発される。
【０１８１】11．微生物の寄託 天然モノクローナル抗体 S2C6を分泌するハイブリドーマS2C6は、「特許手続
上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項にしたがって、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）、10801 University B
oulevard, Manassass, Virginia 20110-2209に1999年5月25日に寄託され、受託
番号PTA-110と指定された。
【０１８２】12．特定の実施形態、参考文献の引用 本発明は本明細書中に記載した特定の実施形態によって範囲を限定されるもの
ではない。実際、前記および添付する図面から、本明細書中に記載されたものの
他に、各種の本発明の改変が当業者に明らかになるであろう。こうした改変は特
許請求の範囲の範囲内に入ることを想定している。
【０１８３】 特許出願、特許および科学的刊行物を含む各種の参考文献を本明細書中に引用
したが、その開示のすべては参考として本明細書中に組み込まれる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1. S2C6の軽鎖可変部の構造。軽鎖可変部（"VL"）のヌクレオチド（配列番
号1）およびアミノ酸（配列番号2）配列を示す。
【図２】 図2. S2C6の重鎖可変部の構造。S2C6の重鎖可変部（"VH"）のヌクレオチド（
配列番号6）およびアミノ酸（配列番号7）配列を示す。
【図３】 図3A-3B. S2C6の可変部の構造。 (A) S2C6 VLのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。 (B) S2C6 VHのアミノ酸配列（配列番号７）を示す。 相補性決定領域（"CDR"）に下線を引いた。各CDRに隣接する4つのフレームワー
ク領域の配列を示した。VL CDR 1〜3のアミノ酸配列は、配列番号3〜5にそれぞ
れ対応する。VH CDR 1〜3のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号8〜10に対応する
。
【図４】 図4. S2C6 mAbは、CD40Lを発現するJurkat T細胞へのCD40-Ig結合を増加する
。CD40-Ig（CD40とヒト免疫グロブリンとの可溶性融合タンパク質）の表面CD40L
への結合は、抗CD40モノクローナル抗体（"mAb"）の増加する濃度のもとで行っ
た。mAbを1時間、CD40-Igとプレインキュベートし、次いで1時間、CD40Lを発現
している標的細胞とインキュベートした。標的細胞へのCD40-Ig結合は、フロー
サイトメトリーにより、フルオレセインイソチオシアネート（"FITC"）標識抗ヒ
トIgを使って検出した。次いで、CD40/CD40L結合の程度を対数平均蛍光強度（"M
FI"）から決定した。それぞれの集団のMFIからバックグラウンドを差し引いた値
を示した。
【図５】 図5. S2C6 mAbは可溶性CD40LのB細胞表面CD40との結合を増加する。ヒトB細
胞リンパ腫のRamos B細胞を、増加する濃度の抗CD40 mAb、すなわち、S2C6、G28
-5、もしくはM3または無関係な対照mAbのEXA2-1H8の存在のもとでインキュベー
トした。mAbを1時間、CD40を発現する標的細胞とともにプレインキュベートした
。次いでFITC標識したCD40LのB細胞への結合をフローサイトメトリーによって直
接検出した。次いでCD40/CD40L結合の程度を対数平均蛍光強度から決定した。そ
れぞれの集団のMFIからバックグラウンドを差し引いた値を示した。
【図６】 図6. S2C6は、CD40L-刺激体（stimulator）細胞および抗CD40 mAbの存在のも
とで、一次ヒト末梢B細胞の増殖応答を増強する。末梢B細胞（1 x 105/ウエル）
を増加する数の非増殖性CD40L+ Jurkat T刺激体細胞および30 ng/mlの抗CD40 mA
b、すなわち、S2C6、G28-5、もしくはM3または対照mAbのEXA2-1H8と組み合わせ
た。B細胞増殖を、刺激を加えた72時間後に3H-TdR取込みにより測定した。
【図７】 図7. CD40Lの存在および不在のもとでの抗CD40 mAbに対する一次ヒト末梢B細
胞の比較増殖応答。末梢B細胞を、一定比4:1の非増殖性CD40L-刺激体細胞および
増加する濃度の抗CD40 mAb、すなわち、S2C6、G28-5、または対照抗体のEXA2-1H
8と組み合わせた。B細胞増殖を、刺激を加えた72時間後に3H-TdR取込みにより測
定した。
【図８】 図8A-8C. mAb S2C6のin vivo抗腫瘍活性。(A) 非Hodgkin'sリンパ腫のRamos
ヒトB細胞、(B)HS Sulatn多発性骨髄腫、または(C)IM-9多発性骨髄腫に対するS2
C6の抗腫瘍活性を評価した。SCIDマウス（1群5匹）をナチュラルキラー（"NK"）
活性を阻害するために抗アシアロGM1を用いて前処置するかまたは前処置せずに
、1x106〜2x106個の腫瘍細胞を注入した後、1日目または5日目にmAbを用いて処
置した。実線は経時的な生存マウス数を示す。
【図９】 図9. BD1-S2C6 sFvは、ELISAにおいて固定化CD40-Igと特異的に結合する。BD
1-S2C6 sFv（モノクローナル抗体S2C6の可変部と融合したブリオジン1（BD1）か
ら成る一本鎖抗CD40免疫毒素）を、封入体として大腸菌(E.coli)中に発現させ、
変性し、再生した。次いで再生したタンパク質をブルーセファロースを使って単
離し、次に固定したCD40-Ig上でアフィニティークロマトグラフィーにかけた。
次いで精製タンパク質をELISAにおいて固定化CD40-Igとの結合について試験した
。マイクロタイタープレートを0.5μg/mlのCD40-Igを用いてコートし、次いで25
μg/mlのS2C6 mAb（▲）、25μg/mlの対照抗体BR96（●）、または過剰抗体なし
（■）の存在のもとで、精製BD1-S2C6 sFvの希釈液を加えた。BD1-S2C6 sFvの固
定化受容体との結合を、BD1特異的ウサギ抗血清を加え、次いで西洋ワサビペル
オキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギIgを加えて検出した。BD1-S2C6 sFvとCD
40-Iｇの結合は、過剰のS2C6 mAbの添加により完全に阻害されたが、対照mAbの
添加によって阻害されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 7/00 ４Ｈ０４５ 1/16 11/00 7/00 11/06 11/00 17/00 11/06 19/02 17/00 19/10 19/02 21/00 19/10 25/00 21/00 29/00 25/00 １０１ 29/00 35/00 １０１ 35/02 35/00 37/02 35/02 37/04 37/02 37/08 37/04 Ｃ０７Ｋ 16/18 37/08 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/18 19/00 16/46 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｂ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ワウル，アラン，エフ． アメリカ合衆国 98040 ワシントン州 メーサー アイランド，イースト メーサ ー ウェイ 6150 (72)発明者 フランシスコ，ジョセフ，エイ． アメリカ合衆国 98020 ワシントン州 エドモンズ，92エヌディー アヴェニュー ダブリュ． 21705 (72)発明者 フェル，ヘンリー，ピー．，ジュニア アメリカ合衆国 98053 ワシントン州 レドモンド，218ティーエイチ プレイス エヌ．イー． 741 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 CA04 CA07 DA06 EA04 GA11 HA15 4B064 AG27 CA02 CA19 CC24 CE12 DA01 DA05 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC14 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA19 BA03 CA53 DC50 ZA02 ZA51 ZA59 ZA68 ZA75 ZA89 ZA94 ZA96 ZA97 ZB02 ZB09 ZB11 ZB13 ZB15 ZB26 ZB27 4C085 AA14 BB31 CC02 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA22 EA28 FA74 GA26

Claims (47)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、または
    配列番号10を含んでなる分子であって、(a) CD40と免疫特異的に結合し、かつ、
    (b) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌さ
    れる天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の
    置換または挿入を含むことを特徴とする、上記分子。
  2. 【請求項２】 配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、または
    配列番号10を含んでなる分子であって、(a) CD40と免疫特異的に結合し、かつ、
    (b) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌さ
    れるモノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプシンによる
    S2C6の切断から生じるものでもない、上記分子。
  3. 【請求項３】 配列番号２のアミノ酸配列、または配列番号７のアミノ酸配
    列、または配列番号２と配列番号７の両方のアミノ酸配列を含んでなる、請求項
    １または２に記載の分子。
  4. 【請求項４】 抗体である、請求項１または２に記載の分子。
  5. 【請求項５】 抗体ではない第２分子のアミノ酸配列を含む融合タンパク質
    である、請求項１または２に記載の分子。
  6. 【請求項６】 配列番号２に融合された配列番号７に融合されたブリオジン
    (BD1)のアミノ酸配列を含んでなる、請求項５に記載の分子。
  7. 【請求項７】 ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリド
    ーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6の可変ドメインと、ヒト定常領域と
    を含む抗体である、請求項１または２に記載の分子。
  8. 【請求項８】 精製されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子
    。
  9. 【請求項９】 配列番号２または配列番号７に対して少なくとも95％の同一
    性を有するアミノ酸配列を含んでなる精製されたタンパク質であって、(a) CD40
    と免疫特異的に結合し、かつ、(b) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定さ
    れたハイブリドーマから分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、
    一次アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を含むことを特徴とする、上記タ
    ンパク質。
  10. 【請求項１０】 (a) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイ
    ブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競
    合し、(b) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(c) AT
    CCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される天
    然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換ま
    たは挿入を含むことを特徴とする、精製されたタンパク質。
  11. 【請求項１１】 (a) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイ
    ブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競
    合し、(b) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(c) AT
    CCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌されるモ
    ノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプシンによるS2C6の
    切断から生じるものでもない、精製されたタンパク質。
  12. 【請求項１２】 配列番号１、配列番号６、配列番号11、配列番号12、配列
    番号13、配列番号14、または配列番号15を含んでなる、単離された核酸。
  13. 【請求項１３】 配列番号３、配列番号４、配列番号８、配列番号９、また
    は配列番号10を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単
    離された核酸。
  14. 【請求項１４】 (a) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイ
    ブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6の重鎖可変ドメインと、(b)
    ヒト定常領域と、を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる
    、請求項13に記載の単離された核酸。
  15. 【請求項１５】 配列番号２または配列番号７に対して少なくとも95％の同
    一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
    んでなる、単離された核酸。
  16. 【請求項１６】 ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリ
    ドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し
    、かつ、CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加するタンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸。
  17. 【請求項１７】 配列番号２に融合された配列番号７に融合されたブリオジ
    ン(BD1)のアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
    含んでなる、単離された核酸。
  18. 【請求項１８】 配列番号２および配列番号７からなる群より選択されるア
    ミノ酸配列からなるタンパク質をコードするコードDNA配列からなるDNAの逆相補
    鎖と高ストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、CD40と免疫特異的に
    結合するタンパク質をコードする、単離された核酸。
  19. 【請求項１９】 ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリ
    ドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し
    、かつ、CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加するタンパク質をコ
    ードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸ベクターを含有する組換え細胞。
  20. 【請求項２０】 配列番号１、配列番号６、配列番号11、配列番号12、配列
    番号13、配列番号14、または配列番号15を含む組換え核酸ベクターを含有する組
    換え細胞。
  21. 【請求項２１】 タンパク質の産生方法であって、 (a) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌
    されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し、かつ、CD40リ
    ガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加するタンパク質をコードする組換え
    ヌクレオチド配列を含む細胞を生育させて、該細胞において該タンパク質を発現
    させ、 (b) 発現された該タンパク質を回収する、 ことを含んでなる、上記方法。
  22. 【請求項２２】 タンパク質の産生方法であって、 (a) 配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番
    号９、または配列番号10を含むタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列
    を含有する細胞を生育させて、該細胞において該ヌクレオチド配列によりコード
    されたタンパク質を発現させ、 (b) 発現された該タンパク質を回収する、 ことを含んでなる、上記方法。
  23. 【請求項２３】 (a) 癌の治療または予防に有効な量の、配列番号２、配列
    番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号10
    を含む分子であって、(i) CD40と免疫特異的に結合し、(ii) CD40リガンドのCD4
    0への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA
    -110と指定されたハイブリドーマから分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6
    に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を含む該分子、およ
    び、(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物。
  24. 【請求項２４】 (a) 癌の治療または予防に有効な量の精製されたタンパク
    質であって、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドー
    マから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し、(i
    i) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに
    寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される天然の
    モノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換または
    挿入を含む該タンパク質、および、(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬
    組成物。
  25. 【請求項２５】 (a) 癌の治療または予防に有効な量の精製されたタンパク
    質であって、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドー
    マから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し、(i
    i) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに
    寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌されるモノク
    ローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプシンによるS2C6の切断
    から生じるものでもない該タンパク質、および、(b) 製薬上許容される担体、を
    含有する医薬組成物。
  26. 【請求項２６】 (a) 免疫応答を活性化または増強するのに有効な量の、配
    列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、ま
    たは配列番号10を含む分子であって、(i) CD40と免疫特異的に結合し、(ii) CD4
    0リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託さ
    れて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される天然のモノク
    ローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を
    含む該分子、および、(b) 製薬上許容される担体、を含有する医薬組成物。
  27. 【請求項２７】 (a) 免疫応答を活性化または増強するのに有効な量の精製
    されたタンパク質であって、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定され
    たハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合につ
    いて競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ
    、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分
    泌される天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以
    上の置換または挿入を含む該タンパク質、および、(b) 製薬上許容される担体、
    を含有する医薬組成物。
  28. 【請求項２８】 (a) 免疫応答を活性化または増強するのに有効な量の精製
    されたタンパク質であって、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定され
    たハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合につ
    いて競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ
    、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分
    泌されるモノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプシンに
    よるS2C6の切断から生じるものでもない該タンパク質、および、(b) 製薬上許容
    される担体、を含有する医薬組成物。
  29. 【請求項２９】 CD40リガンドをさらに含む、請求項23〜28のいずれか１項
    に記載の医薬組成物。
  30. 【請求項３０】 被験者に、癌の治療または予防に有効な量の、配列番号２
    、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列
    番号10を含む分子を投与することを含んでなる、被験者の癌の治療または予防方
    法であって、該分子が、(i) CD40と免疫特異的に結合し、(ii) CD40リガンドのC
    D40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号P
    TA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される天然のモノクローナル抗体S2
    C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を含むものである
    、上記方法。
  31. 【請求項３１】 被験者に、癌の治療または予防に有効な量の精製されたタ
    ンパク質を投与することを含んでなる、被験者の癌の治療または予防方法であっ
    て、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイ
    ブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競
    合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii)
    ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される
    天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換
    または挿入を含むものである、上記方法。
  32. 【請求項３２】 被験者に、癌の治療または予防に有効な量の精製されたタ
    ンパク質を投与することを含んでなる、被験者の癌の治療または予防方法であっ
    て、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイ
    ブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競
    合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii)
    ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される
    モノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプシンによるS2C6
    の切断から生じるものでもない、上記方法。
  33. 【請求項３３】 被験者に、該被験者の免疫応答が活性化または増強される
    量の、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番
    号９、または配列番号10を含む分子を投与することを含んでなる、被験者の免疫
    応答を活性化または増強する方法であって、該分子が、(i) CD40と免疫特異的に
    結合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(ii
    i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌され
    る天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置
    換または挿入を含むものである、上記方法。
  34. 【請求項３４】 被験者に、該被験者の免疫応答が活性化または増強される
    量の精製されたタンパク質を投与することを含んでなる、被験者の免疫応答を活
    性化または増強する方法であって、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託
    番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C
    6と、CD40への結合について競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なく
    とも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定された
    ハイブリドーマから分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次
    アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を含むものである、上記方法。
  35. 【請求項３５】 被験者に、該被験者の免疫応答が活性化または増強される
    量の精製されたタンパク質を投与することを含んでなる、被験者の免疫応答を活
    性化または増強する方法であって、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託
    番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C
    6と、CD40への結合について競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なく
    とも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定された
    ハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパイ
    ンもしくはペプシンによるS2C6の切断から生じるものでもない、上記方法。
  36. 【請求項３６】 被験者に、免疫疾患の治療または予防に有効な量の、配列
    番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７、配列番号８、配列番号９、また
    は配列番号10を含む分子を投与することを含んでなる、被験者の免疫疾患の治療
    または予防方法であって、該分子が、(i) CD40と免疫特異的に結合し、(ii) CD4
    0リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し、かつ、(iii) ATCCに寄託さ
    れて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマから分泌される天然のモノク
    ローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中に１以上の置換または挿入を
    含むものである、上記方法。
  37. 【請求項３７】 被験者に、免疫疾患の治療または予防に有効な量の精製さ
    れたタンパク質を投与することを含んでなる、被験者の免疫疾患の治療または予
    防方法であって、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指
    定されたハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結
    合について競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し
    、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマ
    から分泌される天然のモノクローナル抗体S2C6に比較して、一次アミノ酸配列中
    に１以上の置換または挿入を含むものである、上記方法。
  38. 【請求項３８】 被験者に、免疫疾患の治療または予防に有効な量の精製さ
    れたタンパク質を投与することを含んでなる、被験者の免疫疾患の治療または予
    防方法であって、該タンパク質が、(i) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指
    定されたハイブリドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結
    合について競合し、(ii) CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加し
    、かつ、(iii) ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリドーマ
    から分泌されるモノクローナル抗体S2C6ではなく、また、パパインもしくはペプ
    シンによるS2C6の切断から生じるものでもない、上記方法。
  39. 【請求項３９】 被験者にCD40リガンドを投与することをさらに含む、請求
    項30〜38のいずれか１項に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記被験者がヒトである、請求項30〜38のいずれか１項に
    記載の方法。
  41. 【請求項４１】 アイソタイプIgG1ではない、請求項４に記載の抗体。
  42. 【請求項４２】 ATCCに寄託されて受託番号PTA-110と指定されたハイブリ
    ドーマから分泌されるモノクローナル抗体S2C6と、CD40への結合について競合し
    、かつ、CD40リガンドのCD40への結合を少なくとも45％増加するタンパク質をコ
    ードするトランスジーンを１個以上含有するトランスジェニック非ヒト動物、植
    物、または単離された細胞。
  43. 【請求項４３】 (a) CD40と免疫特異的に結合し、かつCD40リガンドのCD40
    への結合を増加する分子、(b) CD40リガンド、および(c) 製薬上許容される担体
    を、癌もしくは免疫疾患を治療または予防するのに有効な量、あるいは免疫応答
    を活性化または増強するのに有効な量で含有する医薬組成物。
  44. 【請求項４４】 被験者の癌または免疫疾患を治療または予防する方法であ
    って、該被験者に、該治療または予防に有効な量の、(a) CD40と免疫特異的に結
    合し、かつCD40リガンドのCD40への結合を増加する分子、および(b) CD40リガン
    ドを投与することを含んでなる、上記方法。
  45. 【請求項４５】 癌の治療のためである、請求項44に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 癌が固形の腫瘍である、請求項30〜32および45のいずれか
    １項に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 免疫疾患が慢性関節リウマチである、請求項36〜38のいず
    れか１項に記載の方法。
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