WO2014002836A1 - Ｅｇｆｒ結合性ペプチド - Google Patents

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WO2014002836A1
WO2014002836A1 PCT/JP2013/066762 JP2013066762W WO2014002836A1 WO 2014002836 A1 WO2014002836 A1 WO 2014002836A1 JP 2013066762 W JP2013066762 W JP 2013066762W WO 2014002836 A1 WO2014002836 A1 WO 2014002836A1
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asn
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ser
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祐介 飯森
瑞恵 山形
智隆 塩野
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Hoya株式会社
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
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    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to a peptide that specifically binds to an epidermal growth factor receptor (EGFR) and a pharmaceutical containing the same.
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EGFR is a receptor that recognizes epidermal growth factor that controls cell proliferation and growth and performs signal transduction, and plays an important role in cell functions such as cell proliferation, differentiation, and migration. EGFR signals promote cell proliferation, suppress apoptosis, increase tumor cell motility and angiogenesis.
  • EGFR is tumor specific and includes human non-small cell lung cancer (NSCLC), breast cancer, head and neck cancer (SCCHN), gastric cancer, colon cancer, esophageal cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, spleen, ovarian cancer Strong expression has been observed in a wide range in epithelial tumors. These findings have positioned EGFR as an important target for drug and gene receptor mediated delivery systems in cancer therapy.
  • EGF which is a ligand for EGFR
  • Ligand peptides with the advantage of easy diffusion and low immunogenicity and the ability to easily incorporate gene transport vectors are used to selectively deliver therapeutic genes for radionuclides, cytokines, chemical drugs, and tumors. It has been studied as a target part. Recently, research results have been reported that peptide ligands were obtained using phage library screening (Non-patent Document 1).
  • the EGFR family member of the receptor protein is one of the best-characterized targets of cancer cells.
  • the EGF family including HER1, ErbB1 known as EGFR, ErbB2 or neu known as HER2, HER3 (ErbB3), HER4 (ErbB4), is important in cell survival, differentiation and proliferation.
  • increased EGFR signal associates with oncogenic transformation, resulting in independent cell survival, tumor invasion, angiogenesis, and metastasis.
  • EGFR expression and strong expression have been reported in a variety of tumor types, and it is known that EGFR expression levels are high in one third of epithelial cancers, and strong EGFR expression is often associated with poor prognosis.
  • Cetuximab (IMC-C225, Erbitux), one of the inhibitors of EGFR, is a monoclonal antibody that has been approved by the FDA as a treatment for metastatic colorectal cancer. Cetuximab is a chimeric human-mouse antibody that targets the extracellular domain of EGFR. Cetuximab binds to EGFR with stronger affinity than the original ligands EGF and TGF- ⁇ , competitively inhibits the binding of EGFR, and suppresses the activity (Non-patent Document 2 and Patent Document 1). Another human anti-EGFR monoclonal antibody is panitumumab (Vectibix (registered trademark)) (Patent Document 2).
  • EGFR peptide ligands that have already been reported have insufficient binding properties to EGFR, and anti-EGFR antibodies have problems such as high molecular weight, limited administration means, and occurrence of side effects.
  • an object of the present invention is to provide a new substance that binds specifically and with high affinity to EGFR, and a medicine containing the same.
  • the present inventors searched for phages that display peptides that specifically bind to EGFR using the phage display method, and found that peptides having specific amino acid sequences specifically bind to recombinant human EGFR protein, and It has been found that cells or tissues expressing EGFR can be specifically detected using this peptide or its label. Furthermore, since the peptide or its label competitively inhibits the binding between EGFR and EGF, the peptide or its label was found to be useful as a cancer therapeutic agent, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following [1] to [19].
  • X 1 represents Trp or Phe
  • X 2 represents Leu, Met, Ile or Val
  • X 3 represents Ser, Ala, Thr, Gly, Asn, Asp, Glu, Arg or Lys
  • X 4 represents Leu, Met, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr, Trp, His or Cys
  • X 5 represents Trp, Phe or Tyr
  • X 6 represents Gln, Asn, Asp, Glu, Ala, Ser, Thr, Leu, Met, Lys or Arg
  • X 7 represents Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys or Arg
  • X 8 represents Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Val or Cys
  • X 11 represents Leu, Met, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr, Trp, His, or Cys.
  • X 12 represents Glu, Asp, Gln, Asn, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His
  • X 13 represents Val, Ala, Leu, Ile, Met, Thr, Cys or Asn;
  • X 14 represents Ser, Ala, Thr, Gly, Asn, Asp, Glu, Arg or Lys
  • X 15 represents Pro, Val, Ile, Lys, Ala, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys or Phe,
  • X 16 represents Pro, Val, Ile, Lys, Ala, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys or Phe,
  • X 17 represents Asp, Glu, Asn, Gln, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His.
  • X 21 represents Gln, Asn, Asp, Glu, Ala, Ser, Thr, Leu, Met, Lys or Arg
  • X 22 represents Glu, Asp, Gln, Asn, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His
  • X 23 represents Tyr, Phe, Trp, His, Leu, Met, Ile, Val, Cys or Ala
  • X 24 represents Val, Ala, Leu, Ile, Met, Thr, Cys or Asn
  • X 25 represents Asp, Glu, Asn, Gln, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His
  • X 26 represents Ile, Val, Leu, Met, Ala, Phe, Tyr, Trp or Gly
  • X 27 represents His, Tyr, Phe, Lys, Arg, Leu, Met or Ala.
  • X 1 is Trp or Phe
  • X 2 is Leu, Met, Ile or Val
  • X 3 is Ser, Ala, Thr, Gly or Asn
  • X 4 is Leu , Met, Ile, Val or Ala
  • X 5 is Trp or Phe
  • X 6 is Gln, Asn or Ala
  • X 7 is Asn, Gln or Ala
  • X 8 is Ala, Gly, Ser Or the peptide of [1] which is Thr.
  • X 1 is Trp or Phe
  • X 2 is Leu, Met, Ile or Val
  • X 3 is Ser or Ala
  • X 4 is Leu or Ala
  • X 11 is Leu, Met, Ile, Val or Ala
  • X 12 is Glu, Asp, Gln, Asn or Ala
  • X 13 is Val, Ala, Leu or Ile.
  • X 14 is Ser, Ala, Thr, Gly or Asn
  • X 15 is Pro, Val, Ile or Ala
  • X 16 is Pro, Val, Ile or Ala
  • X 17 is Asp, Glu
  • the peptide of [1] which is Asn, Gln or Ala.
  • X 11 is Leu or Ala
  • X 12 is Glu or Ala
  • X 13 is Val or Ala
  • X 14 is Ser or Ala
  • X 15 is Pro or The peptide according to [1], which is Ala
  • X 16 is Pro or Ala
  • X 17 is Asp or Ala.
  • X 21 is Gln, Asn, or Ala
  • X 22 is Glu, Asp, Gln, or Ala
  • X 23 is Tyr, Phe, Trp, His, or Ala
  • X 24 Is Val, Ala, Leu or Ile
  • X 25 is Asp, Glu, Asn, Gln or Ala
  • X 26 is Ile, Val, Leu, Met or Ala
  • X 27 is His, Tyr, Phe, The peptide according to [1], which is Lys, Arg, or Ala.
  • X 21 is Gln or Ala
  • X 22 is Glu or Ala
  • X 23 is Tyr or Ala
  • X 24 is Val or Ala
  • X 25 is Asp or The peptide according to [1], which is Ala
  • X 26 is Ile or Ala
  • X 27 is His or Ala.
  • the peptide according to any one of [1] to [7] wherein the upper limit of the number of amino acids is 30.
  • the peptide according to any one of [1] to [8] which has EGFR binding properties.
  • a medicament comprising the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled form thereof.
  • a cancer cell or cancer tissue detection agent comprising the peptide according to any one of [1] to [9] or a label thereof.
  • a cancer diagnostic agent comprising the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled form thereof.
  • a cancer therapeutic agent comprising the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled form thereof.
  • [16] Use of the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled product thereof for producing a cancer cell or cancer tissue detection drug.
  • [17] Use of the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled product thereof for the manufacture of a cancer diagnostic agent or a cancer therapeutic agent.
  • a method for detecting a cancer cell or cancer tissue comprising using the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled product thereof.
  • a method for diagnosing or treating cancer comprising using the peptide according to any one of [1] to [9] or a labeled form thereof.
  • this peptide of the present invention has a specific and strong binding property to EGFR, this peptide or its label is a detection agent for cells or tissues expressing EGFR, particularly various cancer cells or cancer tissues, ie, cancer. Useful as a diagnostic agent. Moreover, since the peptide of this invention competitively inhibits the coupling
  • the output titer / input titer ratio of the panning experiment with D12 library is shown.
  • the output titer / input titer ratio of the panning experiment with C7C library is shown.
  • recovered by 3 rounds of EGFR target panning displays is shown.
  • the binding test results of the I-1010, I-1012 and I-1015 phages to the immobilized protein are shown.
  • the binding test results of the I-1010, I-1012 and I-1015 phages to the immobilized protein are shown.
  • the competition test result of I-1010 phage and peptide Pep055 or peptide Pep018 is shown.
  • the competition test result of I-1012 phage and peptide Pep056 or peptide Pep018 is shown.
  • the competition test result of I-1015 phage and peptide Pep057 or peptide Pep018 is shown.
  • the display peptide sequence of I-1010 alanine-substituted phage is shown.
  • the display peptide sequence of I-1012 alanine-substituted phage is shown.
  • the display peptide sequence of I-1015 alanine-substituted phage is shown.
  • the binding test result of rhoEGFR of I-1010 alanine-substituted phage is shown.
  • the binding test result of rhoEGFR of I-1012 alanine substituted phage is shown.
  • the binding test result of rhoEGFR of I-1015 alanine substituted phage is shown.
  • the display peptide sequence of I-1010 amino acid substitution phage is shown.
  • the binding test result for rhEGFR of a 1-1010 amino acid substituted phage is shown.
  • the binding test result for rhEGFR of I-1001 amino acid 2-substituted phage is shown.
  • the EGFR expression level (Western blot) of A-431 cells and MCF7 cells is shown.
  • the binding test result of I-1010 phage to A-431 cells is shown.
  • the staining property of A-431 cells with Pep055-F is shown.
  • the staining property of A-431 cells with Pep032-F is shown.
  • the staining property of MCF7 cells by Pep055-F is shown.
  • the staining property of MCF7 cells by Pep032-F is shown.
  • the competition test result of rhEGF and I-1010 phage is shown.
  • the peptide of the present invention is a peptide having 12 to 50 amino acids having an amino acid sequence represented by at least the following formula (1), (2) or (3).
  • X 1 represents Trp or Phe.
  • X 2 represents Leu, Met, Ile or Val.
  • X 3 represents Ser, Ala, Thr, Gly, Asn, Asp, Glu, Arg or Lys, preferably Ser, Ala, Thr, Gly or Asn, and more preferably Ser or Ala.
  • X 4 represents Leu, Met, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr, Trp, His or Cys, preferably Leu, Met, Ile, Val or Ala, more preferably Leu or Ala.
  • X 5 represents Trp, Phe or Tyr, preferably Trp or Phe, more preferably Trp.
  • X 6 represents Gln, Asn, Asp, Glu, Ala, Ser, Thr, Leu, Met, Lys or Arg, preferably Gln, Asn or Ala, more preferably Gln or Ala.
  • X 7 represents Asn, Gln, Asp, Glu, Ser, Thr, Ala, Gly, Lys or Arg, preferably Asn, Gln or Ala, and more preferably Asn or Ala.
  • X 8 represents Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Val, or Cys, preferably Ala, Gly, Ser, or Thr, and more preferably Ala.
  • X 1 is Trp or Phe
  • X 2 is Leu, Met, Ile or Val
  • X 3 is Ser, Ala, Thr, Gly or Asn
  • X 4 is Leu.
  • X 5 is Trp or Phe
  • X 6 is Gln, Asn or Ala
  • X 7 is Asn, Gln or Ala
  • X 8 is Ala, Gly, Ser
  • a peptide having 12 to 50 amino acids, which is Thr is preferable.
  • X 1 is Trp or Phe
  • X 2 is Leu, Met, Ile or Val
  • X 3 is Ser or Ala
  • X 4 is Leu or Ala. More preferably, the peptide having 12 to 50 amino acids, wherein X 5 is Trp, X 6 is Gln or Ala, X 7 is Asn or Ala, and X 8 is Ala.
  • X 11 represents Leu, Met, Ile, Val, Ala, Phe, Tyr, Trp, His or Cys, preferably Leu, Met, Ile, Val or Ala, more preferably Leu or Ala.
  • X 12 is Glu, Asp, Gln, Asn, Ala, Ser, Thr, Lys, show Arg or His, Glu, Asp, Gln, preferably Asn or Ala, Glu or Ala are more preferred.
  • X 13 represents Val, Ala, Leu, Ile, Met, Thr, Cys or Asn, preferably Val, Ala, Leu or Ile, more preferably Val or Ala.
  • X 14 represents Ser, Ala, Thr, Gly, Asn, Asp, Glu, Arg or Lys, preferably Ser, Ala, Thr, Gly or Asn, and more preferably Ser or Ala.
  • X 15 represents Pro, Val, Ile, Lys, Ala, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys or Phe, preferably Pro, Val, Ile or Ala, and more preferably Pro or Ala.
  • X 16 represents Pro, Val, Ile, Lys, Ala, Met, Trp, Tyr, Ser, Thr, Cys or Phe, preferably Pro, Val, Ile or Ala, more preferably Pro or Ala.
  • X 17 represents Asp, Glu, Asn, Gln, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His, preferably Asp, Glu, Asn, Gln or Ala, and more preferably Asp or Ala.
  • X 11 is Leu, Met, Ile, Val or Ala
  • X 12 is Glu, Asp, Gln, Asn or Ala
  • X 13 is Val, Ala, Leu or Ile.
  • X 14 is Ser, Ala, Thr, Gly or Asn
  • X 15 is Pro, Val, Ile or Ala
  • X 16 is Pro, Val, Ile or Ala
  • X 17 is Asp, Glu, Peptides having 12 to 50 amino acids which are Asn, Gln or Ala are preferred.
  • X 11 is Leu or Ala
  • X 12 is Glu or Ala
  • X 13 is Val or Ala
  • X 14 is Ser or Ala
  • X 15 is Pro or More preferred is a peptide having 12 to 50 amino acids, which is Ala
  • X 16 is Pro or Ala
  • X 17 is Asp or Ala.
  • X 21 represents Gln, Asn, Asp, Glu, Ala, Ser, Thr, Leu, Met, Lys or Arg, preferably Gln, Asn or Ala, and more preferably Gln or Ala.
  • X 22 represents Glu, Asp, Gln, Asn, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His, preferably Glu, Asp, Gln or Ala, more preferably Glu or Ala.
  • X 23 is Tyr, Phe, Trp, His, Leu, Met, Ile, Val, show Cys or Ala, Tyr, Phe, Trp, preferably His or Ala, Tyr or Ala are more preferred.
  • X 24 represents Val, Ala, Leu, Ile, Met, Thr, Cys or Asn, preferably Val, Ala, Leu or Ile, more preferably Val or Ala.
  • X 25 represents Asp, Glu, Asn, Gln, Ala, Ser, Thr, Lys, Arg or His, preferably Asp, Glu, Asn, Gln or Ala, more preferably Asp or Ala.
  • X 26 represents Ile, Val, Leu, Met, Ala, Phe, Tyr, Trp or Gly, preferably Ile, Val, Leu, Met or Ala, more preferably Ile or Ala.
  • X 27 is His, Tyr, Phe, Lys, Arg, Leu, show Met or Ala, His, Tyr, Phe, Lys, preferably Arg or Ala, His or Ala are more preferred.
  • X 21 is Gln, Asn or Ala
  • X 22 is Glu, Asp, Gln or Ala
  • X 23 is Tyr, Phe, Trp, His or Ala
  • X 24 Is Val, Ala, Leu or Ile
  • X 25 is Asp
  • X 26 is Ile, Val, Leu, Met or Ala
  • X 27 is His, Tyr, Phe, A peptide having 12 to 50 amino acids which is Lys, Arg or Ala.
  • X 21 is Gln or Ala
  • X 22 is Glu or Ala
  • X 23 is Tyr or Ala
  • X 24 is Val or Ala
  • X 25 is Asp or More preferred is a peptide having 12 to 50 amino acids, which is Ala
  • X 26 is Ile or Ala
  • X 27 is His or Ala.
  • the number of amino acids of the peptide of the present invention is 12 to 50, but the upper limit of the number of amino acids is preferably 40, more preferably 30, more preferably 20, and particularly preferably 18.
  • any amino acid may be added to either the N-terminal side or the C-terminal side of Formula (1), (2), or (3).
  • substitution of X 1 to X 8 , X 11 to X 17 and X 21 to X 27 of the peptide of the present invention has the same activity as long as it is a conservative substitution and a semi-conservative substitution as a result of the binding test described in Examples below. It is based on showing. Here, typical conservative and semi-conservative substitutions are shown in Table 1.
  • the peptide of the present invention can be produced by a recombinant technique using DNA encoding the amino acid sequence, but can also be produced by an organic synthetic chemical peptide synthesis method.
  • Organic synthetic chemical peptide synthesis methods are performed by means of general protection of functional groups, activation of carboxyl groups, formation of peptide bonds, and deprotection of protecting groups. These reactions are preferably carried out by a solid phase method.
  • peptides represented by SEQ ID NOs: 2, 4 and 7 are EGFR by phage display method from a phage library displaying random peptide sequences. Can be selected by screening peptides having binding properties. D12 is preferable as the phage used in the phage display method. To select those that bind strongly to EGFR from the phage library, the phage population is incubated with EGFR, the phage that did not bind to EGFR are washed away, and the bound phage is recovered. To determine what sequence of peptides the recovered phage displays, the relevant part of the phage genome may be sequenced.
  • a phage having a weak binding force is attached as a background. Therefore, after a series of flows of binding ⁇ washing ⁇ recovery, E. coli is again infected, a secondary library is prepared, and a panning operation is repeated by repeating the series of operations using this library. In the library obtained by repeating panning, the number of phages having high binding ability to EGFR increases. In this way, a phage having a strong binding property with the target EGFR can be selected.
  • the peptide of the present invention specifically binds to EGFR. Therefore, the peptide of the present invention or a labeled form thereof is useful as a reagent for detecting EGFR or a cell or tissue expressing EGFR.
  • the label of the peptide of the present invention may be any label capable of detecting a peptide bound to EGFR, such as a radioisotope, an affinity label (for example, biotin, avidin, etc.), and an enzyme label (for example, horseradish). Peroxidase, alkaline phosphatase, etc.), fluorescent labels (eg, FITC, rhodamine, etc.), paramagnetic atoms and the like. Of these labels, fluorescent labels and positron nuclide labels are more preferable for detecting cancer cells or cancer tissues in which EGFR such as colorectal cancer is expressed.
  • the labeled form of the peptide of the present invention is useful for diagnosis of cancer expressing EGFR, for example, early cancer diagnosis.
  • diagnosis for the purpose of confirming the presence or absence of cancer tissue after contacting the target site with, for example, the fluorescently labeled peptide by means such as spraying or injection, after removing the excess fluorescent component by washing treatment By irradiating the relevant site with excitation light, the presence or absence of fluorescently stained tissue can be confirmed macroscopically or microscopically.
  • the fluorescently labeled peptide of the present invention is used as a fluorescent contrast agent for cancer diagnosis by an endoscope.
  • the fluorescently labeled peptide is contacted with a tissue by means of endoscopic spraying or the like. After that, a cleaning process is performed, and an excitation light is irradiated onto the corresponding part with an endoscope light source, and the presence or absence of the fluorescently stained tissue may be confirmed endoscopically.
  • a cleaning process is performed, and an excitation light is irradiated onto the corresponding part with an endoscope light source, and the presence or absence of the fluorescently stained tissue may be confirmed endoscopically.
  • the type of endoscope is not particularly limited, but a fluorescent endoscope capable of irradiating excitation light for fluorescein as an endoscope light source or a confocal endoscope having an enlargement capability is preferable.
  • the fluorescent dye to be modified is not limited to fluorescein, and fluorescent dyes having different excitation wavelengths such as cyanine compounds may be used.
  • a cyanine compound such as indocyanine green
  • the excitation wavelength is further shifted to the longer wavelength side compared to fluorescein, which is effective in confirming deeper lesions.
  • the positron nuclide is modified with the peptide of the present invention, it can be detected by PET, SPECT or the like.
  • the peptide of the present invention can be used not only for cancer at sites that can be reached endoscopically, such as digestive organs, but also for cancer lesions throughout the body.
  • the peptide of the present invention or a labeled product thereof competitively inhibits the binding between EGFR and EGF, it can be used not only for cancer cell detection and cancer diagnosis as described above, but also for cancer treatment.
  • the cell or tissue that can detect, diagnose or treat the peptide of the present invention may be any cell or tissue expressing EGFR, such as cancer cells or cancer tissues, specifically non-small cell lung cancer, breast cancer, Head and neck cancer (SCCHN), colon cancer, gastric cancer, esophageal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer and the like.
  • cancer cells or cancer tissues specifically non-small cell lung cancer, breast cancer, Head and neck cancer (SCCHN), colon cancer, gastric cancer, esophageal cancer, ovarian cancer, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer and the like.
  • the peptide of the present invention or a labeled form thereof can be used as it is, but various administration forms together with a pharmaceutically acceptable carrier. It can be set as the composition suitable for. Examples of the composition include injectable agents, spray agents, oral administration agents, rectal agents and the like. Examples of the pharmaceutically acceptable carrier include water, physiological saline, various buffers, excipients, disintegrants, binders, lubricants, and the like.
  • the dose when the peptide of the present invention or a labeled product thereof is used as a cancer therapeutic agent varies depending on symptoms, body weight, etc., but is usually preferably 0.1 mg to 1000 mg per day for an adult.
  • Example 1 (phage display) [procedure] 1. Panning experiment-round 1 Add 5 ⁇ g / mL Recombinant human IgG 1 Fc (rhIgG 1 , R & D Systems), Recombinant human EGFR / Fc Chimera (rhEGFR, R & D Systems) to each 96-well plate, 1 ⁇ l each, 4 ⁇ l / well Incubated stationary (immobilization on a plate).
  • Blocking buffer (5 mg / mL BSA (bovine serum albumin) / TBS (50 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl) was added at 300 ⁇ L / well, and allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Incubation was followed by 3 washes with 200 ⁇ L / well of 0.1% TBST (0.1% Tween20 / TBS).
  • BSA bovine serum albumin
  • TBS 50 mM Tris-HCl / 150 mM NaCl
  • the peptide-displaying phage library utilizes two types, and the D12 library displays a 12-residue linear random peptide, and 2.7 ⁇ 10 9 different peptide sequences. It has a phage library.
  • the C7C library displays a 7-residue cyclic random peptide and is a phage library having 1.2 ⁇ 10 9 different peptide sequences.
  • phages peptide-displayed phages
  • the phage solution was removed and washed 10 times with 0.1% TBST 200 ⁇ L / well. Phage was eluted by adding 100 ⁇ L of 1 mg / mL BSA / 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) and incubating at room temperature for 10 minutes. The eluate was recovered and neutralized by adding 15 ⁇ L of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to the recovered solution. A part of the collected eluate was used to measure the phage titer.
  • the phage eluate obtained by the operation 1 was subjected to logarithmic growth of ER2738 [F'lacl q ⁇ (lacZ) M15 proA + B + zzf: Tn10 (Tet R ) / fhuA2 supE thi ⁇ ( lac-proAB) ⁇ (hs- dMS-mcrB) 5 (r k - m k - McrBC -)] were infected with, using a shaker with vigorous stirring at 37 ° C., and incubated for 4 hours 30 minutes .
  • the culture solution of phage-infected bacteria was transferred to a 50 mL centrifuge tube, and the sample was centrifuged at 8,900 ⁇ g at 4 ° C. for 10 minutes using a high-speed cooling centrifuge. After centrifugation, the supernatant was collected in a new tube for the purpose of removing ER2738 bacteria.
  • Add 3.6 mL (1/5 volume) of PEG / NaCl (20% Polyethylene glycol 6,000, 2.5 M NaCl) solution to the recovered phage solution, stir well with a mixer, and incubate at 4 ° C. for 16 hours. Then, phages were precipitated.
  • the supernatant was removed by centrifugation at 8,900 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. in a high-speed cooling centrifuge. In order to completely remove the supernatant, it was centrifuged once more and the supernatant was removed. 1 mL of ice-cold TBS was added to the precipitated phage, suspended, and transferred to a microtube. The phage suspension was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 5 minutes at 4 ° C. using a high-speed cooling centrifuge.
  • the supernatant was collected in another tube, the residue that was not suspended was removed, 200 ⁇ L of PEG / NaCl was added to the collected solution, and the mixture was stirred with a mixer. The solution was incubated on ice for 1 hour to precipitate the phage. The solution was centrifuged at 16,000 ⁇ g for 10 minutes at 4 ° C. in a high-speed cooling centrifuge to precipitate phages and remove the supernatant. This centrifugation step was performed again, and the supernatant was completely removed. To the obtained phage precipitate, 200 ⁇ L of 0.02% NaN 3 (Wako) / TBS was added, completely suspended, and centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes at 16,000 ⁇ g in a high-speed cooling centrifuge. The residue that was not suspended was removed by collecting the supernatant. The titer of the recovered phage concentrate was measured.
  • Panning experiment-Round 2 3 Second and third panning experiments were performed using the concentrated phage solution.
  • the second panning experiment differs from the first operation in that the amount of added phage was 2 ⁇ 10 11 PFU / well and the washing solution was 0.3% TBST (0.3% Tween 20 / TBS).
  • the third panning experiment differs from the first operation in that the amount of added phage was 2 ⁇ 10 11 PFU / well and the washing solution was 0.5% TBST (0.5% Tween 20 / TBS).
  • ER2738 bacteria were cultured in 3 mL of LB until reaching the logarithmic growth phase (OD600; to 0.5), and 10 ⁇ L of a phage solution diluted to a required concentration was added to 200 ⁇ L of ER2738 culture solution.
  • the mixed solution was thoroughly stirred with a mixer, incubated at room temperature for 5 minutes, mixed with 4 mL of dissolved top agar solution, and seeded on an LB / IPTG / Xgal plate. After incubating the phage-infected E. coli seed plate at 37 ° C. for 16 hours, the number of blue plaques obtained was counted. The number of phages was calculated using the phage dilution factor (count plaque number ⁇ dilution factor / 10 ⁇ L).
  • Example 2 (sequence analysis) [procedure] Phage obtained in 3 rounds of panning experiment using D12 library was cloned according to a conventional method (Page Display A Laboratory Manual, Cole Spring Harbor Laboratory Press, 2001), and the nucleotide sequence of the displayed peptide portion of the phage was determined. .
  • a primer corresponding to the complementary strand of the base sequence located 96 residues downstream from the presented peptide region [-96 gIII sequencing primer (5′- HO CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3 ′) (SEQ ID NO: 1), S1259A , NEB] and determined by the dideoxyterminate method.
  • a capillary sequencer was used for electrophoresis of reaction products and data analysis.
  • the presented peptide sequence predicted from the determined nucleotide sequence is shown in FIG. Among them, the peptide sequence (SEQ ID NO: 2) displayed by the obtained I-1010 phage was 6 clones having the same sequence among 15 clones examined in 3 rounds (40%) . Two clones were obtained for phage I-1012 (SEQ ID NO: 4) and phage I-1015 (SEQ ID NO: 7) (13.3%).
  • I-1011 phage (SEQ ID NO: 3), I-1013 phage (SEQ ID NO: 5), I-1014 phage (SEQ ID NO: 6), I-1016 phage (SEQ ID NO: 8), I-1017 phage (SEQ ID NO: 9)
  • I-1010 phage, I-1012 phage, and I-1015 phage were selected as the number of pannings increased.
  • the reason why a specific phage clone is selected is that the phage clone shows a strong binding property to the target molecule.
  • Example 3 (Phage binding test (protein immobilization condition-1)) [procedure]
  • the target protein rhEGFR and rhEGFR 1 which is labeled with rhEGFR, and BSA as a standard protein are added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. did.
  • the protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour. After removing the blocking buffer, the wells were washed three times with 200 ⁇ l of a washing solution 0.5% TBST, and finally 100 ⁇ l of 0.5% TBST was added.
  • Amplification phage solutions (I-1010, I-1012, I-1015 phage, and M13KE (peptide non-displaying phage)) were added to the wells to 1 ⁇ 10 10 PFU and mixed by pipetting. The reaction was gently shaken for 1 hour at room temperature. After removing the reaction solution and washing the well 10 times with 200 ⁇ l of 0.5% TBST, 100 ⁇ l of 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) was added to the well, and the mixture was stirred by pipetting, and then at room temperature for 10 minutes. Shake gently.
  • the eluate was collected from the wells into a microtube and neutralized by adding 15 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to obtain a target-binding phage solution.
  • the binding ability of the recovered phage was determined by titration.
  • FIG. 4 shows the input titer / output titer ratio in the binding test by the solid phase method using I-1010, I-1012, and I-1015. It was revealed that the binding of I-1010 phage to rhEGFR was 1665 times higher than rhIgG 1 as the Fc region and 3809 times higher than BSA as the standard protein. It was revealed that the binding of I-1012 phage to rhEGFR was 3420 times higher than rhIgG 1 as the Fc region and 3095 times higher than BSA as the standard protein.
  • I-1010, I-1012, and I-1015 phages specifically bind to rhEGFR under protein-immobilized conditions.
  • I-1010 phage was 52235 times higher.
  • the binding to rhEGFR was 16301 times higher for I-1012 phage and 86592 times higher for I-1015 phage than M13KE phage. From these results, it was shown that peptide sequences displayed by I-1010, I-1012, and I-1015 phages are involved in binding to rhEGFR.
  • Example 4 (Phage binding test (protein immobilization condition-2)) [procedure]
  • the target protein rhEGFR the HER2 protein belonging to the same ErbB family as EGFR, Recombinant human ErbB2 (rhErbB2, PROSPEC), the extracellular protein IGF-1R protein Recombinant human IGF-1R, CF (rhIGF-1, R & D Systems) was added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand overnight at 4 ° C. for immobilization. The protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour.
  • Amplification phage solutions (I-1010, I-1012, I-1015 phage, and M13KE (peptide non-displaying phage)) were added to the wells to 1 ⁇ 10 10 PFU and mixed by pipetting. The reaction was gently shaken for 1 hour at room temperature. After removing the reaction solution and washing the well 10 times with 200 ⁇ l of 0.5% TBST, 100 ⁇ l of 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) was added to the well, and the mixture was stirred by pipetting, and then at room temperature for 10 minutes. Shake gently.
  • the eluate was collected from the wells into a microtube and neutralized by adding 15 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to obtain a target-binding phage solution.
  • the binding ability of the recovered phage was determined by titration.
  • FIG. 5 shows the input titer / output titer ratio of the binding test by the solid phase method using I-1010, I-1012, and I-1015 phages.
  • the result of M13KE phage as a comparison is also shown in FIG. It was revealed that the binding of I-1010 phage to rhEGFR was 1764 times higher than rhErbB2 and 2827 times higher than rhIGF-1R. It was revealed that the binding of I-1012 phage to rhEGFR was 1581 times higher than rhErbB2 and 4345 times higher than rhIGF-1R.
  • I-1010, I-1012, and I-1015 phages specifically bind to rhEGFR under protein-immobilized conditions. Further, when the binding properties of I-1010 phage and M13KE phage to rhEGFR were compared, it was revealed that I-1010 phage was 34439 times higher. In addition, binding to rhEGFR was 13934 times higher for I-1012 phage and 30806 times higher for I-1015 phage than M13KE phage. From these results, it was shown that peptide sequences displayed by I-1010, I-1012, and I-1015 phages are involved in binding to rhEGFR.
  • Example 5 (competitive test) [procedure]
  • the target protein rhEGFR was added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize.
  • the protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour. After removing the blocking buffer, the wells were washed three times with 200 ⁇ l of a washing solution 0.5% TBST, and finally 100 ⁇ l of 0.5% TBST was added.
  • I-1010 amplified phage solution was added to the well so as to be 1 ⁇ 10 10 PFU, and then a synthetic peptide Pep055 (purity 89%, Synthetic peptide Pep018 (GAASRTYLHELI: SEQ ID NO: 10) (purity 90% ⁇ , HPLC grade, AnyGen, Korea) unrelated to the binding to rhEGFR so that each concentration is HPLC grade, Hokkaido System Science) Added and mixed by pipetting. Neither was added, and only the reaction of I-1010 phage was used as a control.
  • a synthetic peptide Pep055 purity 89%, Synthetic peptide Pep018 (GAASRTYLHELI: SEQ ID NO: 10) (purity 90% ⁇ , HPLC grade, AnyGen, Korea) unrelated to the binding to rhEGFR so that each concentration is HPLC grade, Hokkaido System Science) Added and mixed by pipetting. Neither was added, and only the reaction of I-1010 phage was
  • synthetic peptide of I-1012 phage display peptide (SEQ ID NO: 4) Pep056 (purity 86.7%, HPLC grade, Hokkaido System Science), synthetic peptide of I-1015 phage display peptide (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4) 7) Pep057 (purity 83.7% ⁇ , HPLC grade, Hokkaido System Science) was also used. The reaction was gently shaken for 1 hour at room temperature. The reaction solution was removed, and the wells were washed 10 times with 200 ⁇ l of 0.5% TBST.
  • FIG. 6 shows the change of the input titer / output titer ratio value of the competition test between I-1010 phage and Pep055, and the results of I-1010 phage and Pep018.
  • the input titer / output titer ratio of I-1010 phage dropped to the right when 1 ⁇ M of Pep055 was added, and the concentration of I-1010 phage binding to rhEGFR was reduced. It became clear that it inhibited in a dependent manner.
  • the input titer / output titer ratio of phage I-1010 when Pep018 is added remains high even when Pep018 is added at a concentration of 100 ⁇ M.
  • Pep018 was not involved in the binding of I-1010 phage and EGFR at all, and thus the input titer / output titer ratio of I-1010 phage did not decrease even at high concentrations, but the peptide displayed by I-1010 phage It was revealed that the synthetic peptide Pep055 having the sequence inhibits the binding of I-1010 phage and EGFR in a concentration-dependent manner. From these results, it is considered that even if the peptide displayed by the I-1010 phage is a single peptide, it binds to the same site where the I-1010 phage binds to rhEGFR.
  • the synthetic peptides Pep056 and Pep057 having peptide sequences displayed by I-1012 and I-1015 phages also inhibit the binding of each phage to EGFR. Became clear. Therefore, even if the peptide displayed by phages I-1012 and I-1015 is a single peptide, it is considered that each phage binds to the same site where each phage binds to EGFR.
  • Example 6 (Alanine-substituted phage production) [procedure] 1. Site-directed mutagenesis Using a KOD-Plus-Mutageness kit (SMK-101, TOYOBO), a phage in which the amino acid in the peptide display portion of M13KE phage was substituted with alanine was prepared. An oligonucleotide primer containing a desired mutation in the nucleotide sequence of the displayed peptide sequence was commissioned and synthesized (Nippon Gene Research Laboratories). The synthetic primer is a desalted oligonucleotide purified by HPLC.
  • the primer synthesized this time was designed to have a length of 18 to 34 bp and a GC content of 50 to 60%.
  • the phosphorylation of the PCR product can be carried out simultaneously with the self-ligation of the PCR product, so that the primer is not phosphorylated.
  • Template plasmid DNA was purified from I-1010, I-1012, and I-1015 phage-infected ER2738 bacteria using QIAGEN Plasmid kit (QIAGEN).
  • PCR reaction utilized a thermal cycler (PCR Thermal Cycler Dice, TAKARA). PCR reaction conditions were set based on the amplification size.
  • the template plasmid was digested by DpnI treatment, and the PCR product was self-ligated by T4 Polynucleotide Kinase treatment.
  • Transformation XL-1 Blue competent cells were lysed on ice. 15 ⁇ L of the Self-ligation treated solution was added to 60 ⁇ L of XL-1 Blue competent cells and mixed. After incubating on ice for 30 minutes, it was incubated on a heat block at 42 ° C. for 90 seconds and incubated on ice for 2 minutes. In a 15 mL conical tube, 1 ⁇ L of the XL-Blue bacterium was added to 100 ⁇ L of ER2738 O / N culture and mixed. In a 15 mL conical tube, 74 ⁇ L of XL-1 Blue bacteria was placed. 4 mL of top agar was added to each of the above samples and mixed by vortexing. The E. coli sample was seeded on an LB / IPTG / Xgal plate and incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • the alanine-substituted phages of SEQ ID NOs: 11 to 21 shown in FIG. 9 were obtained.
  • the alanine-substituted phages of SEQ ID NOs: 22 to 33 shown in FIG. 10 were obtained for the I-1012 phage
  • the alanine-substituted phages of SEQ ID NOs: 34 to 45 shown in FIG. 11 were obtained for the I-1015 phage.
  • Example 7 (Alanine-substituted phage binding test) [procedure]
  • the target protein rhEGFR was added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize.
  • the protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour. After removing the blocking buffer, the wells were washed three times with 200 ⁇ l of a washing solution 0.5% TBST, and finally 100 ⁇ l of 0.5% TBST was added.
  • Amplified phage solution (I-1010, I-1012, and I-1015 phages or alanine-substituted phage prepared in Example 6) was added to the wells to 1 ⁇ 10 10 PFU, and mixed by pipetting. The reaction was gently shaken for 1 hour at room temperature. After removing the reaction solution and washing the well 10 times with 200 ⁇ l of 0.5% TBST, 100 ⁇ l of 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) was added to the well, and the mixture was stirred by pipetting. Shake gently for minutes.
  • the eluate was collected from the wells into a microtube and neutralized by adding 15 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to obtain a target-binding phage solution.
  • the binding ability of the recovered phage was determined by titration.
  • FIG. 12 Changes in the input titer / output titer ratio values in the alanine-substituted phage binding test are shown in FIG. 12 for the I-1010 phage, FIG. 13 for the I-1012 phage, and FIG. 14 for the I-1015 phage. Shown in As can be seen from FIG. 12, there are seven types of phages with reduced binding compared to the I-1010 phage, the first, seventh, eleventh W (Trp), second, twelfth H (His), third This is a phage in which L (Leu) and fifth D (Asp) are substituted with alanine (Ala).
  • the binding properties of phages obtained by substituting 1st, 7th W (Trp), 2nd H (His), 3rd L (Leu) with alanine (Ala) of the peptide displayed by I-1010 phage Decreased significantly.
  • the amino acids thought to contribute to the binding between I-1010 phage and EGFR are 1, 7, 11th W, 2, 12th H, 3rd L, 5th D. It became clear.
  • amino acids considered to be particularly involved in binding to rhEGFR were the 1st, 7th W, 2nd H, 3rd L.
  • phages there are five types of phages that have decreased binding compared to the I-1015 phage.
  • the binding property of the phage in which the 4th S and 6th W of the peptide displayed by phage I-1015 were substituted with alanine was significantly reduced. From the above results, it is clear that the amino acids thought to contribute to the binding between I-1015 phage and rhEGFR are the first L, the second H, the fourth S, the sixth W, and the seventh M. It became. Among them, amino acids considered to be particularly involved in binding to rhEGFR were the fourth S and the sixth W.
  • Example 8 (Production of amino acid-substituted phage) [Working procedure] By the same procedure as in Example 6, a mutant phage in which the amino acid in the peptide display portion of M13KE phage was substituted with another amino acid was prepared. Hereinafter, the procedure for alanine scanning is referred to.
  • Example 9 (Binding test of amino acid-substituted phage) [procedure]
  • the target protein rhEGFR was added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize.
  • the protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer (5 mg / mL BSA / TBS) was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour. After removing the blocking buffer, the wells were washed three times with 200 ⁇ l of a washing solution 0.5% TBST (0.5% Tween20 / TBS), and finally 100 ⁇ l of 0.5% TBST was added.
  • Amplified phage solution was added to the wells to 1 ⁇ 10 10 PFU and mixed by pipetting. The reaction was gently shaken for 1 hour at room temperature. After removing the reaction solution and washing the well 10 times with 200 ⁇ l of 0.5% TBST, 100 ⁇ l of 0.2 M Glycin-HCl (pH 2.2) was added to the well, and the mixture was stirred by pipetting. Shake gently for minutes. The eluate was collected from the wells into a microtube and neutralized by adding 15 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to obtain a target-binding phage solution. The binding ability of the recovered phage was determined by titration.
  • FIG. 16 shows the change in the ratio of the input titer and the output titer in the binding test of the single amino acid-substituted phage.
  • a phage exhibiting a binding capacity that is about 1 to 1/10 times that of I-1010 phage has F as the first W and M (Met), I (Ile), and V (third as L). Val), and the seventh W was replaced with F and Y (Tyr) (SEQ ID NOs: 46 to 51).
  • FIG. 17 shows the change in the ratio between the input titer and the output titer in the binding test of the amino acid 2-substituted phage.
  • the two amino acid substituted phages carried out this time are phages in which the first W is replaced with F and the eighth Q is replaced with A (W1F / Q8A, SEQ ID NO: 52), the third L is M and the eighth Q is The phages substituted with A (L3M / Q8A, SEQ ID NO: 53) all showed the same-fold to 1 / 10-fold binding compared to the binding of I-1010 phage.
  • Example 10 (Western blot) EGFR expression level was evaluated by Western blotting using human epidermoid carcinoma-derived A-431 cells (DS Pharma Biomedical) and human breast cancer-derived MCF7 cells (DS Pharma Biomedical). As a result, the EGFR expression level of each cell was evaluated by Western blot. As a result, it was revealed that the EGFR expression level was highly expressed in A-431 cells (FIG. 18).
  • Example 11 (Bindability test (in vitro)) From Example 10, the binding test of I-1010 phage was carried out targeting the A-431 cell line in which EGFR protein expression was observed.
  • A-431 cells were seeded at 40 ⁇ 10 4 cells / well in a 6-well culture plate and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 . After incubating the plate at 4 ° C. for 30 minutes, the medium in each well was removed and washed twice with 1 mL of 1% BSA / PBS. Phage I-1010 and M13KE were diluted in 1 mL of 10% FBS medium (growth medium) to a titer of 1 ⁇ 10 10 PFU, added to each well, and incubated at 4 ° C. for 60 minutes. After the reaction, the reaction solution was removed and washed 10 times with 1 mL of 1% BSA / PBS to remove unbound phage.
  • FIG. 19 shows the ratio between the input titer and the output titer of each phage in consideration of the number of recovered cells.
  • the titer ratio of I-1010 phage was 45 times higher than that of M13KE phage. From the above results, the I-1010 phage showed binding ability not only to the recombinant EGFR protein but also to the EGFR expressed by the cells.
  • Example 12 (In vitro imaging) [procedure] A-431 cells were seeded on a glass bottom dish at 20 ⁇ 10 4 Cells / Dish and MCF7 cells at 75 ⁇ 10 4 Cells / Dish, and cultured at 37 ° C. under CO 2 conditions for 24 hours. After culturing various cells, EGF was added to 100 ng / mL and cultured for 6 days. Thereafter, the culture medium of the dish was removed, and the dish was washed 10 times with 1000 ⁇ L of a growth medium at 37 ° C.
  • Peptides (Pep055-F, Pep032-F (YLPLWRLSESHM (peptides unrelated to binding to EGFR)): SEQ ID NO: 54 )) (Purity 80.6%, HPLC grade, AnyGen, Korea) was prepared to 100 ⁇ M in growth medium, 1 mL was added and incubated at 37 ° C. for 1 hour. The staining solution was removed, washed 3 times with 1 mL of growth medium at 37 ° C., and finally 1 mL of medium was added. Observation was carried out using a confocal microscope (Leica SP2), and the excitation light was irradiated with a laser wavelength of 488 nm, and fluorescence was observed.
  • FIG. 20 shows the staining of Pep055-F A-431 cells observed with a confocal microscope. It was observed that the cytoplasm of A-431 cells was stained. Nuclei are not stained.
  • FIG. 21 shows the staining of Pep032-F A-431 cells observed with a confocal microscope. The control peptide hardly stains A-431 cells.
  • FIG. 22 shows the staining properties of MEP7 cells of Pep055-F observed with a confocal microscope, and FIG. 23 shows the staining properties of MCF7 cells of Pep032-F observed with a confocal microscope. Both peptides scarcely stained MCF7 cells.
  • Example 13 (competition test between Recombinant human EGF and I-1010 phage) [procedure]
  • the target protein rhEGFR was added to a 96-well microplate at 1 ⁇ g / well and allowed to stand at 4 ° C. overnight to immobilize.
  • the protein solution was removed, 300 ⁇ l of Blocking buffer was added, and the wells were blocked by incubating at 37 ° C. for 1 hour. After removing the blocking buffer, the wells were washed three times with 200 ⁇ l of a washing solution 0.5% TBST.
  • the eluate was collected from the wells into a microtube and neutralized by adding 15 ⁇ l of 1M Tris-HCl (pH 9.1) to obtain a target-binding phage solution.
  • the binding ability of the recovered phage was determined by titration.
  • FIG. 24 shows the change of the input titer / output titer ratio value in the competition test of rhEGF and I-1010 phage.
  • rhEGF When rhEGF was added, the binding of I-1010 phage to rhEGFR decreased as the concentration added increased. From the above results, it was clarified that rhEGF inhibited the binding of I-1010 phage to rhEGFR because the binding of I-1010 phage decreased depending on the addition concentration of rhEGF. That is, it is considered that I-1010 phage can inhibit the binding of EGF to EGFR, and the peptide displayed by I-1010 phage can be an inhibitor of EGF.

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Abstract

　ＥＧＦＲに特異的かつ高親和性で結合する物質及びそれを含む医薬の提供。　少なくとも下記式（１）、（２）又は（３）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１２～５０のペプチド。　X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His　(1) （式（１）中、X1はTrp又はPheを示し、　X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、　X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、　X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示し、　X5はTrp、Phe又はTyrを示し、　X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、　X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示し、　X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示す。）　Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17　(2) （式（２）中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示し、　X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、　X3はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、　X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、　X5はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、　X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、　X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示す。）　Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27　(3) （式（３）中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、　X22はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、　X23はTyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示し、　X24はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、　X25はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、　X26はIle、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示し、　X27はHis、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示す。）

Description

ＥＧＦＲ結合性ペプチド
　本発明は、上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）に特異的に結合するペプチド及びこれを含有する医薬に関する。
　ＥＧＦＲは、細胞の増殖及び成長を制御する上皮成長因子を認識し、シグナル伝達を行う受容体であり、細胞増殖、分化、移動などの細胞機能に重要な役割を担っている。ＥＧＦＲのシグナルとしては細胞増殖を促進し、アポトーシスを抑制し、腫瘍細胞の運動性と血管新生を増長する。ＥＧＦＲは腫瘍特異的であり、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）や乳癌、頭頸部癌（ＳＣＣＨＮ）、胃癌、大腸癌、食道癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、脾臓、卵巣癌を含むヒトの上皮組織の腫瘍において広い範囲で、その強発現が観察されている。
　これらの発見により、癌治療において薬物と遺伝子の受容体を介したデリバリーシステムにとって重要なターゲットとしてＥＧＦＲが位置づけられている。しかし、ＥＧＦＲのリガンドであるＥＧＦは強い有糸分裂と血管新生力を有しており、それゆえ、ＥＧＦのような基質を探すことは重要である。容易に拡散するようなアドバンテージや低い免疫原性を持ち、遺伝子輸送ベクターを容易に取り込む能力を持ったリガンドペプチドは、放射性核種、サイトカイン、化学薬物、腫瘍に対する治療遺伝子を選択的にデリバリーするための標的部として研究されている。最近、ファージライブラリースクリーニングを利用してペプチドリガンドを取得したという研究結果が報告されている（非特許文献１）。
　一方、受容体タンパクのＥＧＦＲファミリーメンバーは癌細胞のＢｅｓｔ－ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ　ｔａｒｇｅｔｓの１つである。ＨＥＲ１、ＥｒｂＢ１として知られるＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２もしくはｎｅｕとして知られるＨＥＲ２、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）、ＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）を含むＥＧＦファミリーは細胞生存、分化、増殖において重要である。特に、ＥＧＦＲシグナルが増大すると、発癌性形質転換とアソシエートし、結果として自立した細胞生存、腫瘍侵襲、血管新生、転移が誘導される。ＥＧＦＲの発現と強発現は多様な腫瘍タイプで報告されており、３分の１の上皮癌においてＥＧＦＲの発現レベルが高いことが知られており、ＥＧＦＲ強発現はしばしば予後不良と関連する。また、ＥＧＦＲは癌の発生と発達に関係していることが知られているので、ＥＧＦＲを標的とした化学療法薬の開発がなされている。ＥＧＦＲの阻害剤の１つであるセツキシマブ（ＩＭＣ－Ｃ２２５、アービタックス）は転移性大腸癌の治療薬としてＦＤＡで認可されているモノクローナル抗体である。セツキシマブはキメラヒト－マウス抗体であり、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを標的としている。セツキシマブはＥＧＦＲと本来のリガンドであるＥＧＦやＴＧＦ－αよりも強い親和性で結合し、ＥＧＦＲの結合を競合阻害し、活性を抑制する（非特許文献２、特許文献１）。他にヒト型抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体として、パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標））がある（特許文献２）。
国際公開第１９９６／０４０２１０号パンフレット 特許第４８０８４１２号公報
The FASEB Journal, 2005;19, 1978-1985 Journal of the National Cancer Institute, 2005; 97 (22), 1663-1670
　しかしながら、既に報告されたＥＧＦＲのペプチドリガンドは、ＥＧＦＲに対する結合性が不十分であり、また抗ＥＧＦＲ抗体については分子量が大きく、投与手段が限定される、副作用の発生等の問題がある。
　従って、本発明の課題は、ＥＧＦＲに特異的かつ高親和性で結合する新たな物質及びそれを含む医薬を提供することにある。
　そこで本発明者は、ファージディスプレイ法を用いてＥＧＦＲに特異的に結合するペプチドを提示するファージを探索したところ、特定のアミノ酸配列を有するペプチドがリコンビナントヒトＥＧＦＲタンパク質に特異的に結合すること、及びこのペプチド又はその標識体を用いてＥＧＦＲを発現する細胞や組織を特異的に検出できることを見出した。さらに、該ペプチド又はその標識体がＥＧＦＲとＥＧＦとの結合を競合的に阻害することから、該ペプチド又はその標識体は癌治療薬としても有用であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の〔１〕～〔１９〕を提供するものである。
〔１〕少なくとも下記式（１）、（２）又は（３）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１２～５０のペプチド。
　　X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His　　(1)
（式（１）中、X1はTrp又はPheを示し、
　　X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、
　　X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
　　X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示し、
　　X5はTrp、Phe又はTyrを示し、
　　X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
　　X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示し、
　　X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示す）
　　Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17　　(2)
（式（２）中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示し、
　　X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
　　X13はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
　　X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
　　X15はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
　　X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
　　X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示す。）
　　Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27　　(3)
（式（３）中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
　　X22：Glu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
　　X23：Tyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示し、
　　X24：Val、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
　　X25：Asp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
　　X26：Ile、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示し、
　　X27：His、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示す。）
〔２〕式（１）中、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X4がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X5がTrp又はPheであり、X6がGln、Asn又はAlaであり、X7がAsn、Gln又はAlaであり、X8がAla、Gly、Ser又はThrである〔１〕記載のペプチド。
〔３〕式（１）中、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer又はAlaであり、X4がLeu又はAlaであり、X5がTrpであり、X6がGln又はAlaであり、X7がAsn又はAlaであり、X8がAlaである〔１〕記載のペプチド。
〔４〕式（２）中、X11がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X12がGlu、Asp、Gln、Asn又はAlaであり、X13がVal、Ala、Leu又はIleであり、X14がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X15がPro、Val、Ile又はAlaであり、X16がPro、Val、Ile又はAlaであり、X17がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaである〔１〕記載のペプチド。
〔５〕式（２）中、X11がLeu又はAlaであり、X12がGlu又はAlaであり、X13がVal又はAlaであり、X14がSer又はAlaであり、X15がPro又はAlaであり、X16がPro又はAlaであり、X17がAsp又はAlaである〔１〕記載のペプチド。
〔６〕式（３）中、X21がGln、Asn又はAlaであり、X22がGlu、Asp、Gln又はAlaであり、X23がTyr、Phe、Trp、His又はAlaであり、X24がVal、Ala、Leu又はIleであり、X25がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaであり、X26がIle、Val、Leu、Met又はAlaであり、X27がHis、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaである〔１〕記載のペプチド。
〔７〕式（３）中、X21がGln又はAlaであり、X22がGlu又はAlaであり、X23がTyr又はAlaであり、X24がVal又はAlaであり、X25がAsp又はAlaであり、X26がIle又はAlaであり、X27がHis又はAlaである〔１〕記載のペプチド。
〔８〕アミノ酸数の上限が３０である〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のペプチド。
〔９〕ＥＧＦＲ結合性を有する〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のペプチド。
〔10〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する医薬。
〔11〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌細胞又は癌組織検出薬。
〔12〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌診断薬。
〔13〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌治療薬。
〔14〕癌細胞又は癌組織を検出するための〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
〔15〕癌診断又は癌治療のための〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
〔16〕癌細胞又は癌組織検出薬製造のための、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
〔17〕癌診断薬又は癌治療薬製造のための、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
〔18〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌細胞又は癌組織の検出方法。
〔19〕〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌の診断又は治療方法。
　本発明のペプチドは、ＥＧＦＲに特異的かつ強い結合性を有することから、このペプチド又はその標識体は、ＥＧＦＲを発現する細胞又は組織、特に種々の癌細胞又は癌組織の検出薬、すなわち癌の診断薬として有用である。また、本発明のペプチドは、ＥＧＦＲとＥＧＦとの結合を競合的に阻害することから、ＥＧＦＲを発現する癌治療薬として有用である。
Ｄ１２ライブラリーでのパニング実験のアウトプット力価／インプット力価比を示す。 Ｃ７Ｃライブラリーでのパニング実験のアウトプット力価／インプット力価比を示す。 ＥＧＦＲ標的パニング３ラウンドで回収したファージが提示しているペプチド配列を示す。 Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２及びＩ－１０１５ファージの固相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２及びＩ－１０１５ファージの固相化タンパクに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１０１０ファージとペプチドＰｅｐ０５５又はペプチドＰｅｐ０１８との競合試験結果を示す。 Ｉ－１０１２ファージとペプチドＰｅｐ０５６又はペプチドＰｅｐ０１８との競合試験結果を示す。 Ｉ－１０１５ファージとペプチドＰｅｐ０５７又はペプチドＰｅｐ０１８との競合試験結果を示す。 Ｉ－１０１０アラニン置換ファージの提示ペプチド配列を示す。 Ｉ－１０１２アラニン置換ファージの提示ペプチド配列を示す。 Ｉ－１０１５アラニン置換ファージの提示ペプチド配列を示す。 Ｉ－１０１０アラニン置換ファージのｒｈＥＧＦＲに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１０１２アラニン置換ファージのｒｈＥＧＦＲに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１０１５アラニン置換ファージのｒｈＥＧＦＲに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１０１０アミノ酸置換ファージの提示ペプチド配列を示す。 Ｉ－１０１０アミノ酸１個置換ファージのｒｈＥＧＦＲに対する結合性試験結果を示す。 Ｉ－１００１アミノ酸２個置換ファージのｒｈＥＧＦＲに対する結合性試験結果を示す。 Ａ－４３１細胞及びＭＣＦ７細胞のＥＧＦＲ発現量（ウエスタンブロット）を示す。 Ａ－４３１細胞に対するＩ－１０１０ファージの結合性試験結果を示す。 Ｐｅｐ０５５－ＦによるＡ－４３１細胞の染色性を示す。 Ｐｅｐ０３２－ＦによるＡ－４３１細胞の染色性を示す。 Ｐｅｐ０５５－ＦによるＭＣＦ７細胞の染色性を示す。 Ｐｅｐ０３２－ＦによるＭＣＦ７細胞の染色性を示す。 ｒｈＥＧＦとＩ－１０１０ファージとの競合試験結果を示す。
　本発明のペプチドは、少なくとも下記式（１）、（２）又は（３）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１２～５０のペプチドである。
　　X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His　　　　　(1)
　　Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17　　(2)
　　Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27　　(3)
　上記式（１）中、X1はTrp又はPheを示す。X2はLeu、Met、Ile又はValを示す。X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示すが、Ser、Ala、Thr、Gly又はAsnが好ましく、Ser又はAlaがより好ましい。X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示すが、Leu、Met、Ile、Val又はAlaが好ましく、Leu又はAlaがより好ましい。X5はTrp、Phe又はTyrを示すが、Trp又はPheが好ましく、Trpがより好ましい。X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示すが、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Gln又はAlaがより好ましい。X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示すが、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asn又はAlaがより好ましい。X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示すが、Ala、Gly、Ser又はThrが好ましく、Alaがより好ましい。
　式（１）のペプチドのうち、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X4がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X5がTrp又はPheであり、X6がGln、Asn又はAlaであり、X7がAsn、Gln又はAlaであり、X8がAla、Gly、Ser又はThrである、アミノ酸数１２～５０のペプチドが好ましい。
　また、式（１）のペプチドのうち、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer又はAlaであり、X4がLeu又はAlaであり、X5がTrpであり、X6がGln又はAlaであり、X7がAsn又はAlaであり、X8がAlaである、アミノ酸数１２～５０のペプチドがより好ましい。
　上記式（２）中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示すが、Leu、Met、Ile、Val又はAlaが好ましく、Leu又はAlaがより好ましい。X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Glu、Asp、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Glu又はAlaがより好ましい。X13はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示すが、Val、Ala、Leu又はIleが好ましく、Val又はAlaがより好ましい。X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示すが、Ser、Ala、Thr、Gly又はAsnが好ましく、Ser又はAlaがより好ましい。X15はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示すが、Pro、Val、Ile又はAlaが好ましく、Pro又はAlaがより好ましい。X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示すが、Pro、Val、Ile又はAlaが好ましく、Pro又はAlaがより好ましい。X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Asp、Glu、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asp又はAlaがより好ましい。
　式（２）のペプチドのうち、X11がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X12がGlu、Asp、Gln、Asn又はAlaであり、X13がVal、Ala、Leu又はIleであり、X14がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X15がPro、Val、Ile又はAlaであり、X16がPro、Val、Ile又はAlaであり、X17がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaである、アミノ酸数１２～５０のペプチドが好ましい。
　式（２）のペプチドのうち、X11がLeu又はAlaであり、X12がGlu又はAlaであり、X13がVal又はAlaであり、X14がSer又はAlaであり、X15がPro又はAlaであり、X16がPro又はAlaであり、X17がAsp又はAlaである、アミノ酸数１２～５０のペプチドがより好ましい。
　上記式（３）中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示すが、Gln、Asn又はAlaが好ましく、Gln又はAlaがより好ましい。X22はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Glu、Asp、Gln又はAlaが好ましく、Glu又はAlaがより好ましい。X23はTyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示すが、Tyr、Phe、Trp、His又はAlaが好ましく、Tyr又はAlaがより好ましい。X24はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示すが、Val、Ala、Leu又はIleが好ましく、Val又はAlaがより好ましい。X25はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示すが、Asp、Glu、Asn、Gln又はAlaが好ましく、Asp又はAlaがより好ましい。X26はIle、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示すが、Ile、Val、Leu、Met又はAlaが好ましく、Ile又はAlaがより好ましい。X27はHis、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示すが、His、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaが好ましく、His又はAlaがより好ましい。
　式（３）のペプチドのうち、X21がGln、Asn又はAlaであり、X22がGlu、Asp、Gln又はAlaであり、X23がTyr、Phe、Trp、His又はAlaであり、X24がVal、Ala、Leu又はIleであり、X25がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaであり、X26がIle、Val、Leu、Met又はAlaであり、X27がHis、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaであるアミノ酸数１２～５０のペプチド。
　式（３）のペプチドのうち、X21がGln又はAlaであり、X22がGlu又はAlaであり、X23がTyr又はAlaであり、X24がVal又はAlaであり、X25がAsp又はAlaであり、X26がIle又はAlaであり、X27がHis又はAlaである、アミノ酸数１２～５０のペプチドがより好ましい。
　また、本発明ペプチドのアミノ酸数としては、１２～５０であるが、当該アミノ酸数の上限は４０が好ましく、３０がより好ましく、２０がさらに好ましく、１８が特に好ましい。なお、式（１）、（２）又は（３）のＮ末側又はＣ末側のいずれに任意のアミノ酸が付加していてもよい。
　本発明ペプチドのX1～X8、X11～X17及びX21～X27の置換は、後記実施例記載の結合性試験結果、保存的置換及び半保存的置換であれば同様の活性を示すことに基づくものである。ここで典型的な保存的置換及び半保存的置換を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いる組み換え技術によって製造することもできるが、有機合成化学的ペプチド合成法によって製造することができる。有機合成化学的ペプチド合成法は、一般的な官能基の保護、カルボキシル基の活性化、ペプチド結合の形成、保護基の脱保護の手段によって行われる。これらの反応は固相法で行うのが好ましい。
　本発明のペプチドのうち、配列番号２、４及び７で示されるペプチド（Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２及びＩ－１０１５）は、ランダムなペプチド配列を提示させたファージライブラリーからファージディスプレイ法によってＥＧＦＲと結合性を有するペプチドをスクリーニングすることにより選択することができる。ファージディスプレイ法に用いられるファージとしてはＤ１２が好ましい。ファージライブラリーからＥＧＦＲと強く結合するものを選択するには、ファージ集団をＥＧＦＲとインキュベートし、ＥＧＦＲに結合しなかったファージを洗い流した後に、結合したファージを回収する。回収したファージがどのような配列のペプチドを提示しているかは、ファージゲノムの該当部分をシークエンスすればよい。ＥＧＦＲとペプチドの相互作用がそれほど強いものではない場合には、弱い結合力を持つファージがバックグラウンドとしてつきまとってしまう。そこで、結合→洗浄→回収の一連の流れの後に、再度大腸菌に感染させ、二次ライブラリーを調製し、このライブラリーを用いて再度一連の操作を繰り返すパニング操作を行う。パニングを繰り返していくことによって得られるライブラリーの中には、ＥＧＦＲに高い結合能力を持ったファージの数が増えてくる。このようにして、目的とするＥＧＦＲと強い結合性を有するファージが選択できる。
　本発明のペプチドは、ＥＧＦＲに特異的に結合する。従って、本発明のペプチド又はその標識体は、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲを発現している細胞若しくは組織を検出するための試薬として有用である。ここで本発明のペプチドの標識体としては、ＥＧＦＲに結合したペプチドを検出し得る標識体であればよく、放射性同位体、アフィニティー標識（例えば、ビオチン、アビジン等）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン等）、常磁性原子等が挙げられる。これらの標識体のうち、蛍光標識やポジトロン核種による標識は、例えば大腸癌等のＥＧＦＲが発現している癌細胞又は癌組織を検出するうえでより好ましい。
　本発明のペプチドの標識体は、ＥＧＦＲが発現している癌診断、例えば早期癌診断に有用である。例えば、癌組織の存在の有無の確認を目的とした診断においては、対象部位に例えば上記蛍光標識ペプチドを散布又は注射などの手段により接触させた後、洗浄処理により余剰な蛍光成分を除去した後、該当部位に励起光を照射し、蛍光染色された組織の有無を肉眼的又は顕微鏡的に確認することができる。
　より好ましい形態としては、本発明の蛍光標識ペプチドを蛍光造影剤として内視鏡による癌診断に用いることである、例えば、蛍光標識ペプチドを経内視鏡的に散布などの手段により組織に接触させた後、洗浄処理を行い、内視鏡光源により励起光を該当部に照射し、蛍光染色された組織の有無を内視鏡的に確認すればよい。これにより早期癌の発見診断に使用可能となるばかりではなく、通常内視鏡的に病変と疑われる部位を染色し、拡大蛍光観察をすることにより蛍光の有無による病変部位と非病変部位の境界を判別することにも使用可能となる。内視鏡の種類は特に限定されないが、内視鏡光源としてフルオレセインのための励起光を照射できる蛍光内視鏡又は、加えて拡大能を有する共焦点内視鏡が好ましい。
　また、修飾する蛍光色素はフルオレセインだけではなく、たとえばシアニン系化合物など励起波長の異なる蛍光色素を用いてもよい。蛍光剤としてインドシアニングリーンなどのシアニン系化合物を用いた場合、フルオレセインと比較して励起波長がさらに長波長側にシフトするため、より深部の病変の確認に有効である。またポジトロン核種を本発明ペプチドに修飾させた場合、ＰＥＴやＳＰＥＣＴなどにより検出可能となる。また、ガドリニウムを本発明ペプチドに修飾させた場合、ＭＲＩにより検出可能である。これにより主に消化器などといった経内視鏡的に到達可能な部位の癌のみならず、全身の癌病変において、本発明ペプチドが利用可能となる。
　また、本発明ペプチド又はその標識体はＥＧＦＲとＥＧＦとの結合を競合的に阻害することから、上記のような癌細胞検出、癌診断だけでなく、癌の治療にも用いることができる。
　本発明ペプチドが検出、診断又は治療可能な細胞又は組織としては、ＥＧＦＲを発現している細胞又は組織であればよく、例えば癌細胞又は癌組織、具体的には、非小細胞肺癌、乳癌、頭頚部癌（ＳＣＣＨＮ）、大腸癌、胃癌、食道癌、卵巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌等が挙げられる。
　本発明のペプチド又はその標識体を癌検出薬、癌診断薬、癌治療薬として用いる場合、本発明ペプチド又はその標識体はそのまま用いることもできるが、薬学的に許容される担体とともに各種投与形態に適した組成物とすることができる。該組成物としては、注射用剤、散布用剤、経口投与用剤、経直腸用剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体としては、水、生理食塩水、各種緩衝剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤等が挙げられる。
　本発明のペプチド又はその標識体を癌治療薬として用いる場合の投与量は、症状、体重等によっても異なるが、通常成人１日あたり０．１ｍｇ～１０００ｍｇが好ましい。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１（ファージディスプレイ）
［手順］
１．パニング実験－ラウンド１
　９６ｗｅｌｌプレートに５μｇ／ｍＬのＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ１　Ｆｃ（ｒｈＩｇＧ１、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦＲ／Ｆｃ　Ｃｈｉｍｅｒａ（ｒｈＥＧＦＲ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を個別に２００μＬずつ添加し（１μｇ／ｗｅｌｌ）、４℃、一晩、静置インキュベートした（プレートへの固相化）。ウェル内の非固相タンパクを除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ（牛血清アルブミン）／ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／１５０ｍＭ　ＮａＣｌ））を３００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、１時間、静置インキュベートし、その後、０．１％ＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）２００μＬ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。
　ｒｈＩｇＧ１個相化ウェルに０．１％ＴＢＳＴを１００μＬ添加し、Ｄ１２ファージライブラリー（１×１０13ＰＦＵ／ｍＬ）、Ｃ７Ｃファージライブラリー（２×１０13ＰＦＵ／ｍＬ）をそれぞれ１０μＬ添加した。ここで、ｒｈＥＧＦＲ固相化ウェルには、乾燥防止のため０．１％ＴＢＳＴを２００μｌ添加した。
　＊ＰＦＵ：ｐｌａｑｕｅ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｕｎｉｔｓ（プラーク形成単位）
　ペプチド提示ファージライブラリー（ＮＥＷ　ＥＮＧＬＡＮＤ　ＢｉｏＬａｂｓ　Ｉｎｃ．）は、２種類利用し、Ｄ１２ライブラリーは、１２残基の直線状ランダムペプチドを提示しており、２．７×１０9種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。Ｃ７Ｃライブラリーは、７残基の環状ランダムペプチドを提示しており、１．２×１０9種の異なるペプチド配列を持つファージライブラリーである。
　室温、１時間、シーソーを用いて振とうインキュベートし、ｒｈＥＧＦＲのＦｃ部位に結合すると予想されるペプチド提示ファージ（以下ファージと略す）を除去する目的で、固相化したｒｈＩｇＧ１に結合させた後、ファージ溶液を除去し、０．１％ＴＢＳＴ　２００μＬ／ｗｅｌｌで１０回洗浄した。１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ／０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）１００μＬ添加し、室温、１０分、振とうインキュベートしファージを溶出させた。溶出液を回収し、回収溶液に１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μＬ添加することで中和した。回収した溶出液の一部を用いてファージの力価を測定した。
２．回収ファージの増幅
　１の操作で得られたファージ溶出液をＬＢ２０ｍＬ中で対数増殖中のＥＲ２７３８菌［Ｆ’ｌａｃｌqΔ（ｌａｃＺ）Ｍ１５　ｐｒｏＡ＋Ｂ＋ｚｚｆ：Ｔｎ１０（ＴｅｔR）／ｆｈｕＡ２　ｓｕｐＥ　ｔｈｉΔ（ｌａｃ－ｐｒｏＡＢ）Δ（ｈｓ－ｄＭＳ－ｍｃｒＢ）５（ｒk －ｍk －ＭｃｒＢＣ－）］に感染させ、振とう培養機を用いて、３７℃で激しく攪拌しながら、４時間３０分インキュベートした。ファージ感染菌培養液を５０ｍＬ遠心チューブに移し、上記サンプルを高速冷却遠心機を用いて、４℃、１０分、８，９００×ｇで遠心した。遠心後、ＥＲ２７３８菌を除去する目的で、上清を新しいチューブに回収した。回収ファージ溶液に３．６ｍＬ（１／５量）のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％　Ｐｏｌｙｅｈｔｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　６，０００、２．５Ｍ　ＮａＣｌ）溶液を添加し、ミキサーでよく攪拌して、４℃、１６時間、インキュベートして、ファージを沈殿させた。沈殿したファージを回収するために、高速冷却遠心機で４℃、１０分、８，９００×ｇで遠心して、上清を除去した。上清を完全除去する目的で、もう一度遠心し、上清を除去した。沈殿ファージに、氷冷ＴＢＳ　１ｍＬを加え、懸濁し、マイクロチューブに移した。ファージ懸濁液を、高速冷却遠心機を用いて、４℃、５分、１６，０００×ｇで遠心した。上清を別のチューブに回収し、懸濁されない残渣を取り除き、回収溶液に、２００μＬのＰＥＧ／ＮａＣｌを加えて、ミキサーで攪拌した。上記溶液を氷上、１時間、インキュベートしファージを沈殿させた。溶液を高速冷却遠心機で４℃、１０分、１６，０００×ｇ遠心してファージを沈殿させ上清を除去した。この遠心工程を再び行い、上清を完全に除去した。得られたファージ沈殿に、２００μＬの０．０２％ＮａＮ3（Ｗａｋｏ）／ＴＢＳを加え、完全に懸濁させ、高速冷却遠心機で、４℃、５分、１６，０００×ｇ、遠心し、上清を回収することで懸濁されなかった残渣を除去した。回収ファージ濃縮液の力価を測定した。
３．パニング実験-ラウンド２、３
　濃縮ファージ溶液を用いて、２、及び３回目のパニング実験を実施した。２回目のパニング実験において、１回目の操作と異なる点は添加ファージ量を２×１０11ＰＦＵ／ｗｅｌｌ、洗浄液を０．３％ＴＢＳＴ（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にしたことである。３回目のパニング実験では、１回目の操作と異なる点は添加ファージ量を２×１０11ＰＦＵ／ｗｅｌｌ、洗浄液を０．５％ＴＢＳＴ（０．５％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にしたことである。
４．力価測定
　ＬＢ　３ｍＬ内でＥＲ２７３８菌を対数増殖期（ＯＤ６００；～０．５）となるまで培養し、ＥＲ２７３８培養液２００μＬに、必要濃度となるよう希釈したファージ液を１０μＬ添加した。この混合溶液をミキサーでよく攪拌し、室温、５分間インキュベートした後、溶解したトップアガー溶液４ｍＬと混合させ、ＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上に播種した。
　ファージ感染大腸菌播種プレートを３７℃、１６時間、インキュベートした後、得られた青色プラークの数をカウントした。ファージ希釈倍率を用いて、ファージ数を算出した（カウントプラーク数×希釈倍率／１０μＬ）。
［結果］
　ファージライブラリーを用いた実験のインプット力価（標的分子に加えたファージ力値）とアウトプット力価（洗浄後の標的分子から溶出されたファージ力値）の比の値の変化について、Ｄ１２ライブラリーの結果を図１に、Ｃ７Ｃライブラリーの結果を図２に示す。
　Ｄ１２ライブラリーを利用した、ｒｈＥＧＦＲ標的パニング実験を３ラウンドまで進めた結果、アウトプット力価／インプット力価比を比較したところ、３ラウンドは２ラウンドの１３０倍程度の増加が観察された。したがって、ｒｈＥＧＦＲ特異結合性を示すファージがセレクションされたことが予想された。
　Ｃ７Ｃライブラリーを利用した、ｒｈＥＧＦＲ標的パニング実験も３ランドまで進めたが、アウトプット力価／インプット力価比の増加は観察されなかった。
実施例２（シークエンス解析）
［手順］
　Ｄ１２ライブラリーを用いたパニング実験の３ラウンドで得られたファージを、常法（Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、提示ペプチド領域から９６残基下流に位置する塩基配列の相補鎖に相当するプライマー［－９６ｇＩＩＩ　シーケンシングプライマー（５’－HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG－３’）（配列番号１）、Ｓ１２５９Ａ、ＮＥＢ］を用いて、ダイデオキシターミネイト法により決定した。反応産物の泳動とデータ解析には、キャピラリーシーケンサーを用いた。
［結果］
　決定した塩基配列から予想される提示ペプチド配列を図３に示す。
　この中で、得られたＩ－１０１０ファージの提示するペプチド配列（配列番号２）は、３ラウンドで調べた１５個のクローンの中に同じ配列を持つクローンが６個であった（４０％）。また、Ｉ－１０１２ファージ（配列番号４）とＩ－１０１５ファージ（配列番号７）は２クローンが得られた（１３．３％）。Ｉ－１０１１ファージ（配列番号３）、Ｉ－１０１３ファージ（配列番号５）、Ｉ－１０１４ファージ（配列番号６）、Ｉ－１０１６ファージ（配列番号８）、Ｉ－１０１７ファージ（配列番号９）は各１クローンしか得られなかった。
　したがって、パニングの回数が進むにつれ、Ｉ－１０１０ファージ、Ｉ－１０１２ファージ、及びＩ－１０１５ファージがセレクションされていることが明らかとなった。特定のファージクローンがセレクションされている理由として、そのファージクローンが標的分子に対し強い結合性を示していることが挙げられる。
実施例３（ファージ結合性試験（タンパク固相化条件－１））
［手順］
　標的タンパクであるｒｈＥＧＦＲとｒｈＥＧＦＲに標識されたＦｃ部位であるｒｈＩｇＧ１、標準タンパクとしてＢＳＡを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、Ｉ－１０１５ファージ、及びＭ１３ＫＥ（ペプチド非提示ファージ））を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
　Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、Ｉ－１０１５を用いた固相化法による結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比を図４に示す。
　Ｉ－１０１０ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性は、Ｆｃ部であるｒｈＩｇＧ1より１６６５倍高く、標準タンパクであるＢＳＡよりも３８０９倍高いことが明らかとなった。
　Ｉ－１０１２ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性は、Ｆｃ部であるｒｈＩｇＧ1より３４２０倍高く、標準タンパクであるＢＳＡよりも３０９５倍高いことが明らかとなった。
　Ｉ－１０１５ファージのｒｈＥＧＦＲの結合性は、Ｆｃ部であるｒｈＩｇＧ1より１９０１８倍高く、標準タンパクであるＢＳＡよりも１３９６４倍高いことが明らかとなった。
　Ｍ１３ＫＥファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
　図４の結果からＩ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージは、タンパク固相化条件においてｒｈＥＧＦＲに特異的に結合することが明らかとなった。
　また、Ｉ－１０１０ファージとＭ１３ＫＥファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性を比較すると、Ｉ－１０１０ファージの方が５２２３５倍高い事が明らかとなった。また、Ｍ１３ＫＥファージと比較してｒｈＥＧＦＲに対する結合はＩ－１０１２ファージでは１６３０１倍、Ｉ－１０１５ファージでは８６５９２倍高かった。この結果より、Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージの提示するペプチド配列がｒｈＥＧＦＲとの結合に関与していることが示された。
実施例４（ファージ結合性試験（タンパク固相化条件－２））
［手順］
　標的タンパクであるｒｈＥＧＦＲ、ＥＧＦＲと同じＥｒｂＢファミリーに属するＨＥＲ２タンパクとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥｒｂＢ２（ｒｈＥｒｂＢ２、ＰＲＯＳＰＥＣ）、細胞外タンパクの１つであるＩＧＦ－１ＲタンパクとしてＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＩＧＦ－１Ｒ，ＣＦ（ｒｈＩＧＦ－１Ｒ、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、Ｉ－１０１５ファージ、及びＭ１３ＫＥ（ペプチド非提示ファージ））を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
　Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージを用いた固相化法による結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比を図５に示す。比較としてのＭ１３ＫＥファージの結果も図５に示す。
　Ｉ－１０１０ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性は、ｒｈＥｒｂＢ２より１７６４倍高く、ｒｈＩＧＦ－１Ｒよりも２８２７倍高いことが明らかとなった。
　Ｉ－１０１２ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性は、ｒｈＥｒｂＢ２より１５８１倍高く、ｒｈＩＧＦ－１Ｒよりも４３４５倍高いことが明らかとなった。
　Ｉ－１０１５ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性は、ｒｈＥｒｂＢ２より４７４５倍高く、ｒｈＩＧＦ－１Ｒよりも７７０８倍高いことが明らかとなった。
　Ｍ１３ＫＥファージでは、固相化したタンパク間に結合性の差は見られず、どれも低い値であった。
　図５の結果からＩ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージは、タンパク固相化条件においてｒｈＥＧＦＲに特異的に結合することが明らかとなった。
　また、Ｉ－１０１０ファージとＭ１３ＫＥファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性を比較すると、Ｉ－１０１０ファージの方が３４４３９倍高い事が明らかとなった。また、Ｍ１３ＫＥファージと比較してｒｈＥＧＦＲに対する結合はＩ－１０１２ファージでは１３９３４倍、Ｉ－１０１５ファージは３０８０６倍高かった。この結果より、Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージの提示するペプチド配列がｒｈＥＧＦＲとの結合に関与していることが示された。
実施例５（競合試験）
［手順］
　標的タンパクｒｈＥＧＦＲを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルにＩ－１０１０増幅ファージ液を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、次に、Ｉ－１０１０ファージ提示ペプチド（配列番号２）を人工的に合成した合成ペプチドＰｅｐ０５５（純度８９％，ＨＰＬＣグレード，北海道システムサイエンス）を各濃度に、ｒｈＥＧＦＲとの結合には無関係な合成ペプチドＰｅｐ０１８（GAASRTYLHELI:配列番号１０）（純度９０％＜，ＨＰＬＣグレード，ＡｎｙＧｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を各濃度になるように添加し、ピペッティングで混合した。どちらも添加せず、Ｉ－１０１０ファージのみの反応をコントロールとした。Ｉ－１０１０ファージペプチド同様に、Ｉ－１０１２ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号４）Ｐｅｐ０５６（純度８６．７％，ＨＰＬＣグレード，北海道システムサイエンス）、Ｉ－１０１５ファージ提示ペプチドの合成ペプチド（配列番号７）Ｐｅｐ０５７（純度８３．７％＜，ＨＰＬＣグレード，北海道システムサイエンス）も用いた。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄した。その後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
　Ｉ－１０１０ファージとＰｅｐ０５５の競合試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化、及びＩ－１０１０ファージとＰｅｐ０１８の結果を図６に示す。
　図６からわかるように、Ｉ－１０１０ファージのインプット力価／アウトプット力価比がＰｅｐ０５５を１μＭ添加したときを境に右肩下がりに落ちており、Ｉ－１０１０ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合を濃度依存的に阻害していることが明らかとなった。しかし、Ｐｅｐ０１８を添加した場合のＩ－１０１０ファージのインプット力価／アウトプット力価比は、Ｐｅｐ０１８を１００μＭの濃度で添加しても高い値を保っている。
　Ｐｅｐ０１８は、Ｉ－１０１０ファージとＥＧＦＲの結合に全く関与しないため高濃度でもＩ－１０１０ファージのインプット力価／アウトプット力価比の低下が見られなかったが、Ｉ－１０１０ファージの提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドＰｅｐ０５５は、濃度依存的にＩ－１０１０ファージとＥＧＦＲの結合を阻害していることが明らかとなった。この結果から、Ｉ－１０１０ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、Ｉ－１０１０ファージがｒｈＥＧＦＲに結合するのと同じ部位に結合していると考えられる。
　同様に、図７、図８で示される結果より、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージが提示するペプチド配列を持つ合成ペプチドＰｅｐ０５６、及びＰｅｐ０５７も各ファージのＥＧＦＲとの結合を阻害していることが明らかとなった。したがって、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージの提示するペプチドはペプチド単体であっても、各ファージがＥＧＦＲに結合するのと同じ部位に結合していると考えられる。
実施例６（アラニン置換ファージ作製）
［手順］
１．部位特異的変異誘発
　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｋｉｔ（ＳＭＫ－１０１、ＴＯＹＯＢＯ）を用いて、Ｍ１３ＫＥファージのペプチド提示部分のアミノ酸をアラニンに置換したファージの作製を行った。提示ペプチド配列のヌクレオチド配列に所望の変異を含むオリゴヌクレオチドプライマーを受託合成した（日本遺伝子研究所）。合成プライマーは、ＨＰＬＣにて精製した、脱塩オリゴヌクレオチドである。今回合成したプライマーは、長さ１８～３４ｂｐであり、ＧＣ含量が５０－６０％となるよう設計した。今回使用したＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔでは、ＰＣＲ産物のセルフライゲーションと同時にリン酸化を行うことができるので、プライマーのリン酸化はしていない。鋳型プラスミドＤＮＡはＩ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージ感染ＥＲ２７３８菌より、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。
　鋳型プラスミドＤＮＡ、プライマー、ｄＮＴＰｓ、ＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いて、［９４℃、２分］→｛［９８℃、１０秒］→［６８℃、７．５分］｝×８サイクル→［４℃、Ｈｏｌｄ］条件でＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応はサーマルサイクラー（ＰＣＲ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ、ＴＡＫＡＲＡ）を利用した。ＰＣＲ反応条件は増幅サイズを基に設定した。
　ＤｐｎＩ処理により鋳型プラスミドの消化を行ない、Ｔ４　Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｋｉｎａｓｅ処理によりＰＣＲ産物のセルフライゲーションを行った。
２．形質転換
　ＸＬ－１Ｂｌｕｅコンピテント細胞を氷上で溶解した。６０μＬのＸＬ－１Ｂｌｕｅコンピテント細胞に対し、Ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｏｎ処理済み溶液を１５μＬ添加し、混合した。氷上、３０分間、インキュベートした後、４２℃、９０秒間、ヒートブロック上でインキュベートし、氷上で２分間、インキュベートした。１５ｍＬコニカルチューブ内で、ＥＲ２７３８菌のＯ／Ｎカルチャー１００μＬに、上記ＸＬ－Ｂｌｕｅ菌を１μＬ添加し、混合した。１５ｍＬコニカルチューブ内に、ＸＬ－１Ｂｌｕｅ菌を７４μＬ入れた。上記それぞれのサンプルに、トップアガーを４ｍＬ添加し、ボルテックスで混合した。上記大腸菌サンプルをＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上に播種し、３７℃、１６時間、インキュベートした。
３．変異体のシークエンス解析
　得られたＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘｇａｌプレート上の青プラークを、常法に（Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｎｕａｌ，Ｃｏｌｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，２００１）に従いクローン化し、ファージの提示ペプチド部分の塩基配列を決定した。
［結果］
　Ｉ－１０１０ファージについては、図９に示す配列番号１１～２１のアラニン置換ファージを得た。
　同様に、Ｉ－１０１２ファージについては図１０に示す配列番号２２～３３のアラニン置換ファージ、Ｉ－１０１５ファージについては図１１に示す配列番号３４～４５のアラニン置換ファージを得た。
実施例７（アラニン置換ファージの結合性試験）
［手順］
　標的タンパクｒｈＥＧＦＲを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液（Ｉ－１０１０、Ｉ－１０１２、及びＩ－１０１５ファージ又は実施例６で作製したアラニン置換ファージ）を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
　アラニン置換ファージの結合性試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化をＩ－１０１０ファージについては図１２に、Ｉ－１０１２ファージについては図１３に、Ｉ－１０１５ファージについては図１４に示す。
　図１２から分かるように、Ｉ－１０１０ファージに比べ結合性が低下したファージは７種存在し、１、７、１１番目のＷ（Ｔｒｐ）、２、１２番目のＨ（Ｈｉｓ）、３番目のＬ（Ｌｅｕ）、５番目のＤ（Ａｓｐ）をアラニン（Ａｌａ）に置換したファージである。
　特に、Ｉ－１０１０ファージが提示しているペプチドの１、７番目のＷ（Ｔｒｐ）、２番目のＨ（Ｈｉｓ）、３番目のＬ（Ｌｅｕ）をアラニン（Ａｌａ）で置換したファージの結合性が顕著に低下した。
　上記結果より、Ｉ－１０１０ファージとＥＧＦＲとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、１、７、１１番目のＷ、２、１２番目のＨ、３番目のＬ、５番目のＤであることが明らかとなった。
　その中でも、特にｒｈＥＧＦＲとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、１、７番目のＷ、２番目のＨ、３番目のＬであった。
　次に、図１３よりＩ－１０１２ファージに比べ結合性が低下したファージは５種存在し、１番目のＦ（Ｐｈｅ）、２番目のＨ（Ｈｉｓ）、３番目のＤ（Ａｓｐ）、４番目のＷ（Ｔｒｐ）、６番目のＰ（Ｐｒｏ）をアラニンに置換したファージである。したがって、Ｉ－１０１２ファージとｒｈＥＧＦＲとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、１番目のＦ、２番目のＨ、３番目のＤ、４番目のＷ、６番目のＰであることが明らかとなった。
　その中でも、特にｒｈＥＧＦＲとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、１番目のＦ、２番目のＨ、４番目のＷであった。
　また、図１４よりＩ－１０１５ファージに比べ結合性が低下したファージは５種存在し、１番目のＬ（Ｌｅｕ）、２番目のＨ（Ｈｉｓ）、４番目のＳ（Ｓｅｒ）、６番目のＷ（Ｔｒｐ）、７番目のＭ（Ｍｅｔ）をアラニンに置換したファージである。特に、Ｉ－１０１５ファージが提示しているペプチドの４番目のＳ、６番目のＷをアラニンで置換したファージの結合性が顕著に低下した。
　上記結果より、Ｉ－１０１５ファージとｒｈＥＧＦＲとの結合に寄与すると考えられるアミノ酸は、１番目のＬ、２番目のＨ、４番目のＳ、６番目のＷ、７番目のＭであることが明らかとなった。
　その中でも、特にｒｈＥＧＦＲとの結合に関与していると考えられるアミノ酸は、４番目のＳ、６番目のＷであった。
実施例８（アミノ酸置換ファージ作製）
［作業手順］
　実施例６と同様の手順により、Ｍ１３ＫＥファージのペプチド提示部分のアミノ酸を他のアミノ酸に置換したミュータントファージの作製を行った。以下、アラニンスキャンの作業手順を参照とする。
［結果］
　図１５に示すペプチドを提示したＩ－１０１０アミノ酸置換ファージ（配列番号４６～５３）を得た。
実施例９（アミノ酸置換ファージの結合性試験）
［手順］
　標的タンパクｒｈＥＧＦＲを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ／ＴＢＳ）を３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ（０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）２００μｌでウェルを３回洗浄し、最後に０．５％ＴＢＳＴを１００μｌ添加した。上記ウェルに増幅ファージ液を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１時間、穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
アミノ酸１個置換ファージの結果
　アミノ酸１個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図１６に示す。
　Ｉ－１０１０ファージの結合性に比べ等倍から１／１０倍程度の結合性を示すファージは、１番目のＷをＦに、３番目のＬをＭ（Ｍｅｔ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｖ（Ｖａｌ）、７番目のＷをＦ、Ｙ（Ｔｙｒ）に置換した場合（配列番号４６～５１）の６種類存在した。
アミノ酸２個置換ファージの結果
　図１２のアラニン置換ファージの結合性および、図１６のアミノ酸１個置換ファージの結合性試験の結果から、Ｉ－１０１０ファージの結合性と比較して変化の低かったアミノ酸残基について、２か所同時に置換を実施した。
　アミノ酸２個置換ファージの結合性試験のインプット力価とアウトプット力価の比の値の変化を図１７に示す。
　今回実施したアミノ酸２個置換ファージは、１番目のＷをＦに８番目のＱをＡに置換したファージ（Ｗ１Ｆ／Ｑ８Ａ、配列番号５２）と、３番目のＬをＭに８番目のＱをＡに置換したファージ（Ｌ３Ｍ／Ｑ８Ａ、配列番号５３）であるが、いずれもＩ－１０１０ファージの結合性と比較して等倍から１／１０倍の結合性を示す結果であった。
実施例１０（ウェスタンブロット）
　ヒト類表皮癌由来Ａ－４３１細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）とヒト乳腺癌由来ＭＣＦ７細胞（ＤＳファーマバイオメディカル）を用いて、ウェスタンブロット法によりＥＧＦＲ発現量を評価した。
　その結果、各細胞のＥＧＦＲ発現量をウェスタンブロットで評価した結果、Ａ－４３１細胞で高発現していることが明らかとなった（図１８）。
実施例１１（結合性試験（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ））
　実施例１０より、ＥＧＦＲタンパクの発現が認められたＡ－４３１細胞株を標的として、Ｉ－１０１０ファージの結合性試験を実施した。
［手順］
　６ウェル培養プレートにＡ－４３１細胞を４０×１０4ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件で一晩培養した。プレートを４℃で３０分間インキュベートした後、各ウェルの培地を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　１ｍＬで２回洗浄処理を行った。Ｉ－１０１０ファージとＭ１３ＫＥファージを力価１×１０10ＰＦＵとなるように１０％ＦＢＳ培地（増殖培地）１ｍＬに希釈し、各ウェルに添加し、４℃で６０分間インキュベートした。反応後、反応液を除去し、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ　１ｍＬで１０回洗浄処理を行い、非結合のファージを除去した。０．０５％トリプシン／０．５３ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液を１００μｌ添加し、３７℃で１０分程度インキュベートし、増殖培地を９００μｌ添加し、回収ファージ液とした。各回収ファージ液の力価を測定した。
［結果］
　図１９に回収細胞数を考慮した各ファージのインプット力価とアウトプット力価の比を示す。Ｉ－１０１０ファージの力価比はＭ１３ＫＥファージと比較して４５倍高かった。
　以上の結果より、Ｉ－１０１０ファージは遺伝子組み換えＥＧＦＲタンパクだけでなく、細胞が発現するＥＧＦＲに対しても結合性を示した。
実施例１２（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏイメージング）
［手順］
　ガラスボトムディッシュにＡ－４３１細胞を２０×１０4Ｃｅｌｌｓ／Ｄｉｓｈ、ＭＣＦ７細胞は７５×１０4Ｃｅｌｌｓ／Ｄｉｓｈ　になるように播種し、３７℃、ＣＯ2条件下で２４時間培養した。各種細胞を明示した時間培養後にＥＧＦを１００ｎｇ／ｍＬとなるよう添加し、６日間培養した。その後、ディッシュの培養液を除去し、３７℃の増殖培地１０００μＬで１０回洗浄した。ペプチドのＮ末端にアミノカプロン酸リンカーを連結させて、連結されたリンカーの反対側にＦＩＴＣを標識したペプチド（Ｐｅｐ０５５－Ｆ、Ｐｅｐ０３２－Ｆ（ＹＬＰＬＷＲＬＳＥＳＨＭ（ＥＧＦＲとの結合に無関係のペプチド）：配列番号５４））（純度８０．６％，ＨＰＬＣグレード，ＡｎｙＧｅｎ，Ｋｏｒｅａ）を増殖培地で１００μＭに調製し、１ｍＬ添加して３７℃で１時間インキュベートした。染色液を除去し、３７℃の増殖培地１ｍＬで３回洗浄し、最後に培地を１ｍＬ添加した。観察は、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ　ＳＰ２）を用い、励起光のレーザー波長は４８８ｎｍを照射し蛍光観察を行った。
［結果］
　図２０に共焦点顕微鏡で観察した、Ｐｅｐ０５５－ＦのＡ－４３１細胞の染色性を示す。Ａ－４３１細胞の細胞質が染色されていることが観察された。核は染色されていない。
　図２１に共焦点顕微鏡で観察した、Ｐｅｐ０３２－ＦのＡ－４３１細胞の染色性を示す。コントロールペプチドはＡ－４３１細胞をほとんど染色していない。
　図２２に共焦点顕微鏡で観察した、Ｐｅｐ０５５－ＦのＭＣＦ７細胞の染色性、及び、図２３に共焦点顕微鏡で観察した、Ｐｅｐ０３２－ＦのＭＣＦ７細胞の染色性を示す。
　両ペプチドともに、ＭＣＦ７細胞をほとんど染色しなかった。
　上記結果より、Ａ－４３１細胞で見られたＰｅｐ０５５－Ｆによるドット状の染色は、Ａ－４３１細胞が発現するＥＧＦＲによるものであると考えられ、Ｐｅｐ０５５－Ｆは細胞が発現するＥＧＦＲに結合していると考えられる。
実施例１３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦとＩ－１０１０ファージの競合試験）
［手順］
　標的タンパクｒｈＥＧＦＲを１μｇ／ｗｅｌｌになるように９６ウェルマイクロプレートに添加し、４℃で一晩放置することで固相化した。タンパク溶液を除去し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを３００μｌ添加し、３７℃で１時間インキュベートすることでウェルをブロッキングした。Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを除去後、洗浄液０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを３回洗浄した。０．５％ＴＢＳＴで各濃度に希釈したＥＧＦＲのリガンドタンパクであるＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｈｕｍａｎ　ＥＧＦ（ｒｈＥＧＦ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１００μｌ添加し、室温で１時間穏やかに振とうさせた。上記ウェルにＩ－１０１０ファージ増幅液を１×１０10ＰＦＵになるように添加し、ピペッティングにより混合した。反応は、室温で１５分間穏やかに振とうさせた。反応液を除去し、０．５％ＴＢＳＴ　２００μｌでウェルを１０回洗浄した後、０．２Ｍ　Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）をウェルに１００μｌ添加し、ピペッティングで撹拌した後、室温下で１０分間穏やかに振とうさせた。溶出液をウェルからマイクロチューブへ回収し、１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．１）を１５μｌ添加することで中和し、標的結合ファージ液を得た。回収したファージの結合能は、力価測定により行った。
［結果］
　ｒｈＥＧＦとＩ－１０１０ファージの競合試験のインプット力価／アウトプット力価比の値の変化を図２４に示す。
　ｒｈＥＧＦを添加した場合、添加濃度が増加するにつれ、Ｉ－１０１０ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合性が減少した。
　上記結果より、Ｉ－１０１０ファージの結合性がｒｈＥＧＦの添加濃度依存的に減少している事から、ｒｈＥＧＦがＩ－１０１０ファージのｒｈＥＧＦＲへの結合を阻害している事が明らかとなった。つまり、Ｉ－１０１０ファージはＥＧＦのＥＧＦＲへの結合を阻害できると考えられ、Ｉ－１０１０ファージの提示するペプチドはＥＧＦの阻害剤になりうる。

Claims (19)

  1. 　少なくとも下記式（１）、（２）又は（３）で表されるアミノ酸配列を有するアミノ酸数１２～５０のペプチド。
    　　　X1-His-X2-X3-Asp-X4-X5-X6-X7-X8-Trp-His　　(1)
    （式（１）中、X1はTrp又はPheを示し、
    　　X2はLeu、Met、Ile又はValを示し、
    　　X3はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
    　　X4はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又はCysを示し、
    　　X5はTrp、Phe又はTyrを示し、
    　　X6はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
    　　X7はAsn、Gln、Asp、Glu、Ser、Thr、Ala、Gly、Lys又はArgを示し、
    　　X8はAla、Gly、Ser、Thr、Asn、Val又はCysを示す。）
    　　　Phe-His-Asp-Trp-X11-Pro-X12-X13-X14-X15-X16-X17　　(2)
    （式（２）中、X11はLeu、Met、Ile、Val、Ala、Phe、Tyr、Trp、His又Cysを示し、
    　　X12はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
    　　X3はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
    　　X14はSer、Ala、Thr、Gly、Asn、Asp、Glu、Arg又はLysを示し、
    　　X5はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
    　　X16はPro、Val、Ile、Lys、Ala、Met、Trp、Tyr、Ser、Thr、Cys又はPheを示し、
    　　X17はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示す。）
    　　　Leu-His-X21-Ser-X22-Trp-Met-X23-X24-X25-X26-X27　　(3)
    （式（３）中、X21はGln、Asn、Asp、Glu、Ala、Ser、Thr、Leu、Met、Lys又はArgを示し、
    　　X22はGlu、Asp、Gln、Asn、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
    　　X23はTyr、Phe、Trp、His、Leu、Met、Ile、Val、Cys又はAlaを示し、
    　　X24はVal、Ala、Leu、Ile、Met、Thr、Cys又はAsnを示し、
    　　X25はAsp、Glu、Asn、Gln、Ala、Ser、Thr、Lys、Arg又はHisを示し、
    　　X26はIle、Val、Leu、Met、Ala、Phe、Tyr、Trp又はGlyを示し、
    　　X27はHis、Tyr、Phe、Lys、Arg、Leu、Met又はAlaを示す。）
  2. 　式（１）中、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X4がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X5がTrp又はPheであり、X6がGln、Asn又はAlaであり、X7がAsn、Gln又はAlaであり、X8がAla、Gly、Ser又はThrである請求項１記載のペプチド。
  3. 　式（１）中、X1がTrp又はPheであり、X2がLeu、Met、Ile又はValであり、X3がSer又はAlaであり、X4がLeu又はAlaであり、X5がTrpであり、X6がGln又はAlaであり、X7がAsn又はAlaであり、X8がAlaである請求項１記載のペプチド。
  4. 　式（２）中、X11がLeu、Met、Ile、Val又はAlaであり、X12がGlu、Asp、Gln、Asn又はAlaであり、X13がVal、Ala、Leu又はIleであり、X14がSer、Ala、Thr、Gly又はAsnであり、X15がPro、Val、Ile又はAlaであり、X16がPro、Val、Ile又はAlaであり、X17がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaである請求項１記載のペプチド。
  5. 　式（２）中、X11がLeu又はAlaであり、X12がGlu又はAlaであり、X13がVal又はAlaであり、X14がSer又はAlaであり、X15がPro又はAlaであり、X16がPro又はAlaであり、X17がAsp又はAlaである請求項１記載のペプチド。
  6. 　式（３）中、X21がGln、Asn又はAlaであり、X22がGlu、Asp、Gln又はAlaであり、X23がTyr、Phe、Trp、His又はAlaであり、X24がVal、Ala、Leu又はIleであり、X25がAsp、Glu、Asn、Gln又はAlaであり、X26がIle、Val、Leu、Met又はAlaであり、X27がHis、Tyr、Phe、Lys、Arg又はAlaである請求項１記載のペプチド。
  7. 　式（３）中、X21がGln又はAlaであり、X22がGlu又はAlaであり、X23がTyr又はAlaであり、X24がVal又はAlaであり、X25がAsp又はAlaであり、X26がIle又はAlaであり、X27がHis又はAlaである請求項１記載のペプチド。
  8. 　アミノ酸数の上限が３０である請求項１～７のいずれかに記載のペプチド。
  9. 　ＥＧＦＲ結合性を有する請求項１～８のいずれかに記載のペプチド。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する医薬。
  11. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌細胞又は癌組織検出薬。
  12. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌診断薬。
  13. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を含有する癌治療薬。
  14. 　癌細胞又は癌組織を検出するための請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
  15. 　癌診断又は癌治療のための請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体。
  16. 　癌細胞又は癌組織検出薬製造のための、請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
  17. 　癌診断薬又は癌治療薬製造のための、請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体の使用。
  18. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌細胞又は癌組織の検出方法。
  19. 　請求項１～９のいずれかに記載のペプチド又はその標識体を使用することを特徴とする癌の診断又は治療方法。
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